CN101096703A - 一种非抗生素筛选小麦转基因植物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，与小麦转基因技术有关。公开了一种非抗生素筛选农杆菌介导的转基因小麦的方法，其步骤包括引物设计、PCR扩增、载体构建、遗传转化、筛选鉴定转基因植物等，本发明的特征在于，通过农杆菌将manA基因导入受体小麦，利用甘露糖替代抗生素作为选择剂，对转化后的受体细胞进行筛选，通过PCR检测和酶活鉴定，筛选获得转基因植株。本发明在植物转化及筛选程序中不需要添加抗生素或除草剂，转基因植物也不含抗生素或除草剂基因，本发明对环境安全，是一种绿色转基因植物的新方法。

Description

一种非抗生素筛选小麦转基因植物的方法

技术领域

本发明属于植物转基因技术领域，具体地说涉及一种非抗生素筛选转基因植物特别是一种小麦转基因的方法，本发明的方法在转基因植物转化及筛选程序中不需要添加抗生素或除草剂，筛选获得的转基因植物也不含抗生素或除草剂基因，因而对环境安全，是一种绿色转基因植物方法。

背景技术

自从1983年第一株转基因植物问世以来，植物基因工程取得了飞速发展。由于转基因可以将有益基因导入，使转基因植物同时具有高产、优质、抗逆境等多种优点，全世界范围内转基因作物的种类、产量都迅速增加。然而，随着转基因作物产品的商品化，转基因植物可能对环境及人类健康带来不良影响和损害的问题也日益突出，究其原因是由于人们对目前广泛应用于植物遗传转化的抗性标记基因的安全性心存疑虑。目前使用较多的标记基因主要包括抗生素抗性基因和除草剂抗性基因。

抗性标记基因的潜在危害主要表现在以下几个方面：(1)带有抗生素或除草剂抗性标记基因的转基因植物对多种植物病原菌和除草剂具有抗性，有可能会转变为有害杂草；(2)如果在转基因植物种植区存在可与其杂交的近缘野生种杂草，转基因植物中的除草剂抗性标记基因可能会经自然杂交转移到这些近缘野生杂草中，从而形成现有除草剂无法杀灭的“超级杂草”；(3)标记基因如果传播到其它生物体中，可能会引起生态失衡，如产生超级害虫；(4)存在于转基因食品中的抗性标记基因及其产物可能对人或动物的健康有害；(5)抗性标记基因可能被转移到人或动物肠道寄生菌中，使这些病原菌产生耐药性，降低抗生素的治疗作用。

中国发明专利申请(申请号为：97190983.0，美国孟山都公司)提出了一种名为“农杆菌介导转化法生产稳定转化的可育小麦的方法及其相关组分”的专利，其发明要点是在农杆菌介导下转化小麦，需要在整个筛选程序中添加抗生素，以筛选获得转基因植株；其不足之处是获得的转基因植株基因组中整合了抗生素基因，在小麦籽粒中表达累积的抗生素，直接进入食物链中；同时转基因植株推广种植过程中有可能将抗生素基因传播到其它生物群体。

因此，转基因植物中抗生素标记基因安全性问题一直是公众关注的焦点，也是影响转基因植物推广应用的主要难点。解决这一问题的主要途径是开发、利用安全标记基因，用于植物的遗传转化和转基因植物的筛选，培育对环境安全、无副作用的绿色优良转基因植物新品种。

以安全标记基因为选择标记的转化系统与传统转化系统不同，它不是将非转化细胞杀死，而是使转化细胞处于某个有利的代谢条件下，从而筛选出转化细胞。这种选择系统的主要优点在于选择剂无毒副作用，而且在多数情况下有利于转化植株的再生，从而提高转化率。以糖代谢酶基因为标记基因的转化系统，利用糖类作为筛选剂，根据植物细胞糖代谢能力的差异进行选择，即转化细胞由于获得了糖代谢能力而在筛选培养基上生长扩增，而非转化细胞因为不能正常代谢处于饥饿状态，生长被抑制但不被杀死，从而区分转化与非转化细胞。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提出一种不需要抗生素进行植物遗传转化，并能够快速准确筛选鉴定转基因植物的新方法。本方法由于不添加对环境及人畜具有潜在危害的抗生素或除草剂，而且能直接鉴定基因表达产物的功能，因此是一种快速、准确、低成本、对人畜及环境安全的筛选和鉴定转基因小麦植物的方法。

本发明是这样实现的：

一种农杆菌介导的小麦转基因植物的方法，其步骤包括PCR、基因克隆、载体构建和遗传转化，本发明的要点是，通过农杆菌将外源基因导入所述植物，利用非抗生素甘露糖替代抗生素作为选择剂，在小麦幼穗、幼胚作为转化受体的愈伤组织分化、再生和壮苗步骤中，将所述的选择剂按照由低到高的添加量分别添加到基本培养基中，筛选得到转基因植株；通过PCR检测和酶活性鉴定得到所述的转基因植株。

具体步骤如下：

1)根据Genebank公布的序列，设计一对大肠杆菌manA基因特异引物，该引物的编号及结构如下：PMIP1：5’-ATGGATCCATGCAAAAACTCATTAACTCA-3’和PMIP2：5’-AAGGATCCTTACAGCTTGTTGTAAACACG-3’，用于从大肠杆菌基因组中PCR扩增manA基因，测序后作为选择标记基因用于构建植株表达载体pMBL5，转化根癌农杆菌。

2)将培养的外植体如小麦幼穗及幼胚接种在诱导培养基上，从外植体诱导出所需要的愈伤组织；

本发明制备了以下两种专用愈伤组织诱导培养基，以适应不同外植体的需要：

用于小麦幼穗愈伤诱导的培养基(编号：L7)：250mg/L NH₄NO₃，1500mg/L KNO₃，200mg/L KH₂PO₄，350mg/L MgSO₄·7H₂O，450mg/L CaCl₂·2H₂O，11.61mg/L MnSO₄·4H₂O，5mg/LH₃BO₃，7.5mg/L ZnSO₄·7H₂O，0.75mg/L KI，0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O，0.025mg/L CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L CoCl₂·6H₂O，由27.8mg/LFeSO₄·7H₂O和37.3mg/L Na₂·EDTA·2H₂O配制成的铁盐，750mg/L谷氨酰胺，150mg/L脯氨酸，100mg/L天门冬酰胺，200mg/L肌醇，2mg/L 2，4-D，30g/L麦芽糖，pH5.7，8g/L琼脂。

用于小麦幼胚愈伤的诱导培养基(编号：L8)：MS基本培养基(Murashige T，Skoog F.A revisedmedium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.Physiol Plant，1962，15：473-497)，附加10mg/L thiamine-HCl，1mg/L pyridoxine-HCl，1mg/L烟酸，1mg/L Ca-pantothenate，200mg/L肌醇，200mg/L脯氨酸，300mg/L水解酪蛋白，2mg/L 2，4-D，30g/L麦芽糖，8g/L琼脂，pH5.8；

3)将步骤2)的愈伤组织置于浸染培养基(编号：L9)上，以农杆菌浸染愈伤组织，浸染条件及培养基配方如下：

1/10的L7培养基附加100mg/L抗坏血酸，0.02％Fluronic F68，1.95g/L乙磺酸，200μM/L乙酰丁香酮，10g/L葡萄糖，pH5.2，农杆菌的浸染时间为30min。

4)将步骤3)的愈伤组织转移到恢复培养基(编号：L10)上，其配方如下：

L7培养基附加500mg/L头孢霉素，pH5.8；

5)将步骤4)的材料转移到分化培养基(编号：L11)上，其配方如下：

L7培养基附加25g/L麦芽糖，5g/L甘露糖，500mg/L头孢霉素，pH5.8；

6)将分化好的材料转移到再生培养基(编号：L12)上，其配方如下：

MS基本培养基，附加10mg/L thiamine-HCl，1mg/L pyridoxine-HCl，1mg/L nicotinic acid，1mg/LCa-pantothenate，200mg/L肌醇，200mg/L脯氨酸，300mg/L水解酪蛋白，20g/L麦芽糖，10g/L甘露糖，0.5mg/L吲哚丁酸，300mg/L头孢霉素，8g/L琼脂，pH5.8。

7)将步骤6)的材料转移到壮苗生培养基(编号：L13)，其配方如下：1/2 MS培养基，附加10mg/Lthiamine-HCl，lmg/L pyridoxine-HCl，1mg/L nicotinic acid，1mg/L Ca-pantothenate，200mh/L肌醇，200mg/L脯氨酸，300mg/L水解酪蛋白，20g/L麦芽糖，0.5mg/L吲哚丁酸，1mg/L多效唑，2mg/L萘乙酸，15g/L甘露糖，300mg/L头孢霉素，8g/L琼脂，pH5.8。

上述培养基按照常规报道的方法，在高压蒸汽121℃下灭菌20min备用。

在上述制备的培养基中，本发明是以在各个步骤的培养基中逐步提高甘露糖的添加浓度以代替传统的使用抗生素作为筛选剂，从而完成了本发明的小麦转基因操作的。

在下面的步骤中，将重点描述本发明的具体过程：

8)将经过甘露糖梯度筛选的转基因植株进行PCR检测，方法和条件如下：

利用PCR分子鉴定技术(具体程序参见梁国栋主编，最新分子生物学实验技术，科学出版社，2001)，根据上述已经报道的manA基因序列，设计一对特异引物：PMIP2(引物如下：5’-AAGGATCCTTACAGCTTGTTGTAAACACG-3’)和PMIP4(引物如下：5’-CGCTGGAAGTGATGGCAAAC-3’)，在95℃4min一个循环，94℃1min，55℃50s，72℃1min35个循环，以及终延伸72℃5min的条件下，扩增manA基因羧基端的一个400bp特异DNA片段。

9)对转基因植物的6-磷酸甘露糖异构酶活性进行鉴定，步骤如下：

采用氯酚红显色法(Kramer等，Selection of transformed protoplast-derived Zea mays colonies withphosphinothricin and a novel assay using the pH indicator chlorophenol red.Planta，1993，190：454-458)功能鉴定6-磷酸甘露糖异构酶活性，其操作条件和方法如下：

取经过PCR鉴定的转基因植株(例如小麦幼苗)的叶片，用氯酚红显色法进行酶活性鉴定。氯酚红显色反应液按照以下配方制备：MS基本培养基+5g/L甘露糖+50mg/L氯酚红，pH值6.0，121℃灭菌20min；分装至96孔细胞培养板，每孔0.2ml，从壮苗培养基上取0.5厘米小麦叶片直接浸入氯酚红显色反应液中。黑暗条件下，25℃培养3-4天观察培养基颜色变化，以检测6-磷酸甘露糖异构酶活性，具有该酶活性的培养基为黄色或褐色，而没有该酶活性则为紫色。

本发明利用的磷酸甘露糖异构酶(phosphomannose isomerase，简称PMI)，尽管在自然界中广泛存在，然而除肉桂(Cinnamomum cassia)和一些豆类外，自然界的植物中大都没有编码该蛋白的manA基因，正是由于这个原因，以manA为标记基因的PMI/甘露糖选择系统在植物的遗传转化中的应用成为可能。该酶催化生物体内6-磷酸甘露糖和6-磷酸果糖之间的相互转化。其作用机理为：培养基中的甘露糖经植物体自身的己糖激酶磷酸化生成甘露糖-6-磷酸，在PMI的异构作用下生成果糖-6-磷酸从而进入糖酵解途径。在甘露糖筛选培养基上，转化与未转化植物细胞中的己糖激酶均能不断将甘露糖转化为甘露糖-6-磷酸。但在转化细胞中，manA基因编码的PMI蛋白能催化甘露糖-6-磷酸转变成果糖-6-磷酸，继而进入糖酵解途径；而非转化细胞由于没有PMI蛋白催化甘露糖-6-磷酸到果糖-6-磷酸的转变，导致糖酵解途径受阻。因此转化细胞可以利用甘露糖作为碳源正常生长，非转化细胞则不能利用甘露糖作为碳源，而且甘露糖-6-磷酸的积累又会抑制糖酵解，导致ATP新陈代谢受阻和磷酸根离子的大量消耗，从而使非转化细胞生长受到抑制。

下面的介绍有助于对本发明的技术方案进一步了解。

在本发明的实施过程中，申请人首先是利用Genebank数据库中已经公开发表的细菌基因组序列信息(http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html)，设计一对特异引物(如前所述)，从大肠杆菌基因组DNA中扩增manA基因序列，产物经凝胶电泳检测，根据预期的PCR片段大小长度，凝胶回收DNA片段，经酶切后克隆到pUC载体，经核酸序列测定后，用于构建植物表达载体，转化小麦，以PMI/甘露糖选择系统筛选小麦转基因植物。具体步骤如下：

1)利用申请人自己设计的特异引物PMIP1和PMIP2扩增的大肠杆菌(E.coli)manA基因，序列全长为1176bp，用于构建本发明表达载体pMBL5，该载体如图2所示。

2)扩增上述大肠杆菌manA基因的引物分别为：PMIP1(引物序列：5’-ATGGATCCATGCAAAAACTCATTAACTCA-3’)和PMIP2(引物序列：5’-AAGGATCCTTACAGCTTGTTGTAAACACG-3’)。

3)扩增上述大肠杆菌manA基因C端一个400bp片段的引物，分别为PMIP2(引物序列：5’-AAGGATCCTTACAGCTTGTTGTAAACACG-3’)和PMIP4(5’-CGCTGGAAGTGATGGCAAAC-3’)。

4)将质粒pMBL5转入根癌农杆菌C58(Cheng M等，Genetic transformation of wheat mediated byAgrobacterium tumefeciens.Plant Physiology，1997，115：971-980)，在YEB培养基上(Kapila J et al.AnAgrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves.Plant Science，1997，122：101-108)，选择分散的单个细菌菌落，用于PCR鉴定阳性根癌农杆菌细菌。

上述步骤4)的PCR反应步骤是：

扩增反应体系：在25μl PCR反应体积中，含有模板DNA液15μl煮沸的细菌细胞，2.5μl 10xPCR缓冲液(廖玉才等，四甲基氯化铵在PCR扩增小麦基因中的关键作用，遗传，1997，19(2)：1-4)，1.5μl 25mM MgCl₂，2μl 1.25mM dNTPs，利用上述步骤3)中扩增manA基因C端400bp片段的两个引物(PMIP2和PMIP4)：0.5μl Primer 1(10pmol/μl)和0.5μl Primer 2(10pmol/μl)，1 U Taq DNA聚合酶。

PCR反应条件如下：95℃4min，1个循环；94℃1min，55℃50s，72℃1min，35个循环；以及终延伸72℃5min。

反应完成后，取15μl PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统中紫外灯下照相，预期PCR产物的长度为400bp。

5)转化植物，将上述步骤4)筛选的阳性根癌农杆菌细胞，用于转化小麦，然后在含甘露糖的培养基中，筛选转基因植物；以步骤4)的PCR方法鉴定转基因植株(图3)后，再以氯酚红显色法鉴定PMI酶活性(图4)，从而不仅鉴定转基因植物基因组中是否整合了manA基因，还直接鉴定manA基因是否正确表达PMI酶。

很显然，应用以上描述的技术方案，本发明不需要利用任何抗生素，仅利用碳源即甘露糖代替具有抗性筛选作用的抗生素，就可以直接筛选鉴定转基因植物。

更详细的技术方案如下所述：

1.1  构建含manA基因的重组构建体

如图2所示，将manA基因全长序列克隆测序后，构建到植物表达载体pMBL5。将克隆到pUC18manA的基因，以BamHI酶切，同时从中间载体pMBL-3及pBAR(由德国马普研究所郭岩博士惠赠)中分别以HindIII及BamHI-HinIII酶切获得玉米泛素启动子及相关序列，克隆连接到以pUC8为基础的载体上，构建形成了pMBL5植物表达载体。

其上的酶切位点用于克隆其它目的基因。将构建体转入大肠杆菌，在报道的常用LB固体培养上选择单个分散的阳性克隆，接种于LB液体培养基中(每升培养基中含蛋白胨10克，酵母提取汁5克，NaCl 10克，pH7.0)、37℃培养过夜，提取质粒DNA，用于转化根癌农杆菌。

1.2根癌农杆菌转化、筛选及培养

将根癌农杆菌C58细胞在YEB固体培养基上培养，挑单菌落于YEB液体培养基(去掉琼脂)上、28℃培养过夜，第二天以1∶100(v/v)接种于同上的YEB液体培养基上，28℃培养至OD₆₀₀为1.0时，离心(6000g，5分钟)收集细菌细胞，以10％甘油溶液洗细胞2次，将根癌农杆菌感受态细胞按50μl分装在Eppendorf管中，于液氮中迅速冷冻，置于-80℃保存。

取1μg质粒DNA，与50μl根癌农杆菌感受态细胞混合，转入电转化杯中，置于电转化槽，电转化农杆菌，转化完成后加入500μl SOC液体培养基，置37℃培养1小时，涂平板于含抗生素的YEB培养基上，在28℃下培养2-3天，待菌落直径为1mm左右时，用牙签挑取单个独立分散的菌落的少许细胞，划线接种于YEB培养基中，并将其余细胞转入含有100μl无菌水的Eppendorf管中，离心2分钟(13000g)，弃上清，再加入无菌水100μl，轻微振荡悬浮细菌细胞，同上离心后加入无菌水30μl，同上振荡悬浮细胞后，煮沸5分钟，离心5秒(5000g)，置于冰上备用。

取15μl煮沸细菌细胞，按上述步骤4)PCR法鉴定阳性根癌农杆菌转化子，含manA基因的根癌农杆菌细胞在上述条件下可扩增一条400bp的DNA带。将经过PCR鉴定为阳性的细胞，在含抗生素的YEB液体培养基中过夜培养后，分装在25％甘油中，储于-80℃。

1.3愈伤组织诱导

小麦幼穗愈伤诱导：取小花原基形成期的小麦幼穗连同叶鞘一起剪下，剥去外层包叶，保留两层幼叶、长度为6cm左右的茎段，置于无菌三角瓶中，用70％的酒精消毒30s，无菌水冲洗一次，再用0.1％的升汞消毒5min，无菌水冲洗4-6次，置于无菌培养皿上，用镊子和解剖针将幼穗剥出，选取1cm长的幼穗，用解剖刀将幼穗均分为上中下三段，然后再将每一段分别切成1mm左右的穗段，接种在愈伤组织诱导培养基L7上。置于25℃暗培养21天。

小麦幼胚愈伤诱导：在小麦开花期，对开花单株挂牌记录，取开花后12-15天未成熟种子，在超净工作台上进行表面灭菌：先用70％酒精处理30s，无菌水冲洗一遍；再用0.1％升汞处理8min，无菌水冲洗3-5遍。将经过表面灭菌的未成熟种子放到无菌培养皿中，用解剖针挑出幼胚。选择直径0.8-1.5mm左右的幼胚，盾片朝上放置于诱导培养基L8。置于25℃暗培养，时间从0到30天。

1.4植物遗传转化

将保存在甘油中的根癌农杆菌菌株(C58)按照1∶100(v/v)的比例接种，于28℃(250r/min)过夜培养至OD₆₀₀值0.8左右，将菌液转入50ml离心管中，离心(5000g)10min收集菌体，重悬于MS液体培养基中，置于25℃下2h后用于转化。

将待转化的小麦幼穗或幼胚愈伤组织转入50ml三角瓶中，倒入20ml农杆菌菌液，用浸染培养基(L9)浸染30min；然后在共培培养基上、25℃共培养3天；共培培养基是不含Fluronic F68的浸染培养基。

将上述培养基得到的材料转移到添加500mg/L头孢霉素的恢复培养基(L10)上培养7-10天，再转移到分化培养基上(L1)培养20-25天，在再生培养基(L12)上培养30-35天，经过7-14天在壮苗培养基(L13)中培养获得转基因小麦植株。

1.5转基因植物的筛选与鉴定

PCR鉴定：取经过梯度甘露糖培养基筛选出来的转基因小麦植株的叶片，利用SDS法(Liao等，Characterization of a wheat class Ib chitinase gene differentially induced in isogenic lines by infection withPuccinia graminis.，Plant Science，1994，103：177-187)提取转基因植物叶片DNA，以manA基因特异引物PMIP2(5’-AAGGATCCTTACAGCTTGTTGTAA ACACG-3’)和PMIP4 (5’-CGCTGGAAGTGATGGCAAAC-3’)进行PCR扩增，鉴定转基因植物中的manA基因。结果表明，经过筛选的转基因小麦植株，其基因组中均已整合了manA基因，具有一条特异的400bp的DNA条带，而未转化的野生型植株对照则没有该DNA带(见图3所示)。

酶活性测定：氯酚红显色法鉴定PMI酶活性的基本原理是：当转基因植株含有manA基因，可以编码形成PMI酶，并具有异构酶功能，则转基因植株叶片在含甘露糖的溶液中保持3天后，表达PMI酶的叶片中将使培养基颜色变成红色或褐色；而没有PMI酶活性的植株叶片在相同溶液中则为紫色。因此这是一种基因产物的直接测鉴定，只有植物细胞具有manA基因并正确表达出具有功能的6-磷酸苷露糖异构酶，培养基颜色才能变红。

取经PCR鉴定的转基因小麦植株幼苗叶片，用氯酚红显色法检测PMI酶活性。氯酚红显色法检测条件如下：配制氯酚红溶液，即氯酚红钠盐用蒸馏水溶解，配制成12.5mg/ml贮存液。氯酚红显色反应液为，MS基本培养基+5g/L甘露糖+50mg/L氯酚红，pH6.0，121℃灭菌20min。灭菌后分装至96孔细胞培养板，每孔0.2ml，以非转基因植株叶片为对照，于黑暗条件下25℃培养3天后根据培养基颜色变化，来检测转基因植物的PMI酶活性。培养基颜色为黄色或褐色的表明具有PMI活性，而紫色的即没有该酶活性(图4)。结果表明，经PCR分析检测的转基因植株，均能表达具有功能的PMI酶。

本发明的有益的效果

利用本发明克隆的大肠杆菌6-磷酸甘露糖异构酶基因manA，构建成植物表达载体，用作小麦的植物转化的选择标记基因，在筛选转基因植物过程中，仅以甘露糖为筛选剂，筛选根癌农杆菌介导的小麦转基因植物。该选择系统完全不使用抗生素或除草剂，具有标记基因产物安全，筛选剂价格低廉，筛选程序简单，对人畜健康及生态环境没有影响等多种优点，是一种理想的植物遗传转化选择系统，可在植物遗传转化中广泛应用。

目前植物遗传转化中广泛使用的标记基因是抗生素基因和抗除草剂基因，但这两类基因对生态环境和食品安全均具有潜在威胁，已经引起了人们对转基因植物生物安全性的普遍担忧。本发明以甘露糖为筛选剂，在筛选培养基中添加甘露糖作为主要碳源，只有表达PMI基因的植物细胞，才能以6-磷酸甘露糖为底物催化产生6-磷酸果糖并产生ATP，为细胞正常生长提供能量，所以转化的细胞可以在含甘露糖的培养基上生长正常。相反，不含PMI基因的非转化细胞，因不能利用6-磷酸甘露糖，从而积累大量6-磷酸甘露糖并消耗ATP，长期处于饥饿状态，导致生长停滞。因此这种转基因植物选择系统，是根据细胞糖代谢能力的不同区分转化细胞和非转化细胞，即转化的细胞由于获得了糖代谢能力，可以在筛选培养基上正常生长；而非转化细胞因为缺乏糖代谢能力而处于饥饿状态，生长受到抑制。

在转基因植物氯酚红显色法鉴定中，直接利用植物叶片，不需要利用任何溶液提取植物细胞蛋白，也不需要其它前处理，就可以直观地根据反应液的颜色来鉴定转基因植物的PMI酶活性；而且，氯酚红显色检测法不需昂贵试剂，显色反应稳定，干扰因素少，因而鉴定结果准确可靠，重复性高，经氯酚红显色法检测的没有发现逃逸现象，所有经氯酚红显色法检测的转基因植物，均是PCR分析为阳性的转基因植株。而经典的转基因植物鉴定分析中采用的PCR及Southern杂交分析结果，通常仅表明植物基因组中整合了目的基因，不能鉴定整合的基因是否表达。氯酚红显色法鉴定结果则证实整合到植物基因组中的基因不仅表达，而且表达的蛋白质能形成具有功能的生物酶。因此氯酚红显色法是一种转基因功能鉴定法。同时，氯酚红显色法检测可利用ELISA板，操作简单，结果直观，一次可检测大量样本。而常规方法中以除草剂筛选转基因小麦植株时，需要喷雾或涂抹除草剂，不仅周期长、费用高，而且很容易出现逃逸现象。

另外，以这种植株营养而不是抗生素作为筛选剂的正向筛选法，转基因植物具有PMI基因才可以有效利用培养基中的营养成份，从而生长健壮，因此这种正向筛选法筛选获得转基因植株的效率，显著高于利用抗生素或除草剂作为筛选剂的筛选效率(表1)。

该选择系统所用筛选剂甘露糖，不仅对生物细胞无害，而且易于被微生物分解，可以避免抗生素长期存留带来的副作用。本发明应用的manA基因表达产物6-磷酸甘露糖异构酶(PMI)对人类及动物健康、生态环境均无任何副作用，是一种典型的安全环保型筛选剂。因此，PMI/甘露糖阳性选择系统，在转基因植物及食品安全上显示出巨大的应用价值和潜力，这一系统的推广应用具有巨大的经济效益和社会效益。

附图说明

图1，本发明技术路线图

图2，是本发明的植物表达载体pMBL5物理图谱

图3，是本发明实施例中小麦转基因植株分子鉴定结果

图3中的1为分子量标记，2为以质粒DNA为模板的PCR产物。3-6为是以幼胚为外植体获得的转基因小麦植株，8-9是以幼穗为外植体获得的转基因小麦植株。

图4，是本发明其中实施例中小麦转基因植株PMI酶活性鉴定结果

在图4中，以幼穗为外植体获得的转基因小麦植株(A3和A4)、以幼胚为外植体获得的转基因小麦植株(编号分别为B2、B3、D3和D4)为红色，未转化的野生型对照植株(A1、B1、C1和D1)、不含植物材料(编号分别为C2、C3和C4)的对照以及没有PMI活性的植株(编号为A2、B4和D2)均为紫色。

以本发明的甘露糖为选择标记，筛选以小麦幼穗和幼胚为外植体的转基因小麦植株的效率分别为1.35％、1.82％，不仅显著高于利用抗生素为选择剂的筛选幼胚为外植体的转化效率(表1)，而且获得高频率的以幼穗为外植体的转基因小麦植株。

具体实施方式

实施例1

小麦品种愈伤组织诱导

将小麦品种郑9023(该品种来自于河南省农业科学院)的小花原基形成期的幼穗，在如下条件下诱导愈伤组织：在小花原基形成期，取小麦幼穗经酒精消毒处理后剥出幼穗，选取长度1cm的幼穗切成1mm左右，置于L7培养基上诱导愈伤(L7培养基成分：250mg/L NH₄NO₃，1500mg/L KNO₃，200mg/L KH₂PO₄，350mg/L MgSO₄·7H₂O，450mg/L CaCl₂·2H₂O，11.61mg/L MnSO₄·4H₂O，5mg/L H₃BO₃，7.5mg/LZnSO₄·7H₂O，0.75mg/L KI，0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O，0.025mg/L CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L CoCl₂·6H₂O，27.8mg/L FeSO₄·7H₂O，37.3mg/L Na₂·EDTA·2H₂O，750mg/L谷氨酰胺，150mg/L脯氨酸，100mg/L天门冬酰胺，200mg/L肌醇，2mg/L2，4-D，30g/L麦芽糖，pH5.7，8g/L琼脂)。置于25℃暗培养21天。

小麦幼胚愈伤诱导是在小麦开花期，对开花单株挂牌记录，取开花后12-15天未成熟种子，经酒精表面处理后，置于无菌培养皿中，用解剖针挑出幼胚；选择直径0.8-1.5mm左右的幼胚，盾片朝上放置于MS诱导培养基上(成分：MS基本培养基附加10mg/L thiamine-HCl，1mg/L pyridoxine-HCl，1mg/L烟酸，1mg/L Ca-pantothenate，200mg/L肌醇，200mg/L脯氨酸，300mg/L水解酪蛋白，2mg/L 2，4-D，30g/L麦芽糖，8g/L琼脂，pH5.8)置于25℃暗培养14天。

实施例2

小麦品种的遗传转化与筛选

小麦幼穗及幼胚的转化及培养筛选条件相同。即将含有表达载体pMBL5(图2)的根癌农杆菌细胞C58，按1∶100(v/v)的比例接种在YEB液体培养基上，28℃震荡(250r/min)培养过夜(至OD₆₀₀值0.8左右)，离心(5000xg)10min收集细菌，重悬于MS液体培养基中，25℃下培养2h。将待转化的愈伤组织置于50ml三角瓶中，倒入20ml菌液后浸染30min，浸染培养基为1/10的L7培养基附加100mg/L抗坏血酸，0.02％Fluronic F68，1.95g/L乙磺酸，200μM/L乙酰丁香酮，10g/L葡萄糖，pH5.2。取出愈伤组织置于滤纸上以吸干愈伤组织表面菌液，再将浸染后的愈伤组织放置到共培养基上，共培养基为不含Fluronic F68的浸染培养基，于25℃下共培养3天。

将上述共培养的小麦幼穗或幼胚愈伤组织转移到恢复再生培养基(L7)上培养(L7+500mg/L头孢霉素)培养7-10天，再在分化培养基(L7+25g/L麦芽糖，5g/L甘露糖，500mg/L头孢霉素，pH5.8)上培养20-25天；在再生培养基(MS培养基+10mg/L thiamine-HCl，1mg/L pyridoxine-HCl，1mg/L nicotinic acid，1mg/L Ca-pantothenate，200mg/L肌醇，200mg/L脯氨酸，300mg/L水解酪蛋白，20g/L麦芽糖，10g/L甘露糖，0.5mg/L吲哚丁酸，300mg/L头孢霉素，8g/L琼脂，pH5.8)上培养30-35天；最后在壮苗培养基(1/2MS培养基+10mg/L thiamine-HCl，1mg/L pyridoxine-HCl，1mg/L nicotinic acid，1mg/L Ca-pantothenate，200mg/L肌醇，200mg/L脯氨酸，300mg/L水解酪蛋白，20g/L麦芽糖，0.5mg/L吲哚丁酸，1mg/L多效唑，2mg/L萘乙酸，15g/L甘露糖，300mg/L头孢霉素，8g/L琼脂，pH5.8)上培养14-20天，得到转基因侯选植株。

实施例3

小麦转基因植物的鉴定

取经上述培养基(进行过甘露糖由低到高的梯度试验)培养的得到的转基因小麦叶片，以SDS法提取转基因植物叶片总DNA，以引物PMIP2(5’-AAGGATCCTTACAGCTTGTTGAAACACG-3’)和引物PMIP4(5’-CGCTGGAAGTGATGGCAAAC-3’)进行PCR扩增，反应体系为：10×PCR Buffer 2.5μl，50mmol/LMgCl₂ 0.75μl，2mmol/L dNTP 2μl，10μmol/L primer各0.5μl，Taq酶(1 U/μl)0.5μl，模板DNA 20-50ng，补超纯水至总体积25μl。PCR反应程序为：95℃5min；94℃1min，55℃50s，72℃1min，35 cycles；72℃5min。PCR产物电泳结果表明，筛选出来的2株以幼穗为外植体的转基因小麦及4株以幼胚为外植体的转基因小麦植株中，均扩增出片段大小为400bp的特异DNA条带，与预期大小完全一致，证实转基因小麦植物中确实含有manA基因(图3)。

取少量经PCR鉴定的转基因小麦幼苗叶片，用于氯酚红显色法检测PMI酶活性。氯酚红显色法检测条件如下：配制氯酚红溶液，即用蒸馏水溶解氯酚红钠盐，配制成12.5mg/ml贮存液。氯酚红显色反应液为，MS基本培养基+5g/L甘露糖+50mg/氯酚红，pH6.0，121℃灭菌20min。灭菌后分装至96孔细胞培养板，每孔0.2ml，以非转基因植株叶片为对照，于黑暗条件下25℃培养3天，如果转基因植株含有manA基因，即能以编码形成PMI酶而具有异构酶功能，则转基因植株叶片在含甘露糖的溶液中能使培养基颜色变成红色或褐色；而没有PMI酶活性的植株叶片在相同溶液中则为紫色。这种基因产物的直接鉴定法，不仅能够证实植物细胞是否具有manA基因，而且能够证实manA基因能正确表达出具有功能的6-磷酸苷露糖异构酶(图4)。这些结果说明氯酚红显色法可以准确检测转基因植株中PMI活性，用于筛选、鉴定转基因植株。以本发明的甘露糖为选择剂，本发明筛选转基因小麦的筛选率达到1.35-1.82％，高于利用抗生素的选择效率(表1)。

表1  本发明的甘露糖梯度培养与现有抗生素为选择剂的转化率比较

^a本发明以甘露糖为选择剂，小麦品种为郑9023，转化了615个幼穗、723个幼胚，按以下公式计算转化率：

^b以小麦幼穗为外植体，根癌农杆菌介导的转化，只得到了瞬间表达结果，没有获得转基因植株(见文献Amoah et al.Factors influencing Agrobacterium-mediated transient expression of uidAin wheat inflorescence tissue.Journal of Experimental Botany，2001，52(358)：1135-1142)。

Claims (7)

1、一种非抗生素筛选农杆菌介导的转基因小麦的方法，其步骤包括引物设计、PCR扩增、载体构建、遗传转化、筛选鉴定转基因植物，其特征在于，通过农杆菌将manA基因导入受体小麦，利用甘露糖替代抗生素作为选择剂，按照由低到高的量分别添加到基本培养基中，对转化后的受体细胞进行筛选，通过PCR检测和酶活性鉴定，筛选获得转基因植株。

2、权利要求1所述的方法，其步骤如下：

1)设计一对特异引物：PMIP1：5’-ATGGATCCATGCAAAAACTCATTAACTCA-3’和PMIP2：5’-AAGGATCCTTACAGCTTGTTGTAAACACG-3’，扩增大肠杆菌manA基因，以该基因为选择标记基因构建植物表达载体，转化根癌农杆菌；

2)在诱导培养基上分别诱导小麦幼穗或幼胚，得到愈伤组织；

3)将步骤2)的愈伤组织与农杆菌共培养，将共培后的愈伤组织依次转移至恢复、分化、再生以及壮苗培养基上培养，筛选获得侯选转基因植株；

4)采用PCR检测转基因植物；

5)以氯酚红显色法鉴定转基因植株，获得转基因植物。

3、权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的植物表达载体是pMBL5。

4、权利要求1或2所述的方法，其中步骤2)所述的愈伤组织诱导培养基按以下配方制备：

小麦幼穗愈伤培养基L7：250mg/L NH₄NO₃，1500mg/L KNO₃，200mg/L KH₂PO₄，350mg/L MgSO₄·7H₂O，450mg/L CaCl₂·2H₂O，11.61mg/L MnSO₄·4H₂O，5mg/L H₃BO₃，7.5mg/L ZnSO₄·7H₂O，0.75mg/L KI，0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O，0.025mg/L CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L CoCl₂·6H₂O，由27.8mg/L FeSO₄·7H₂O，37.3mg/L Na₂·EDTA·2H₂O配制成的铁盐；750mg/L谷氨酰胺，150mg/L脯氨酸，100mg/L天门冬酰胺；200mg/L肌醇，2mg/L2，4-D，30g/L麦芽糖，8g/L琼脂，pH5.7；

小麦幼胚愈伤组织诱导培养基L8：MS基本培养基附加10mg/L thiamine-HCl，1mg/Lpyridoxine-HCl，1mg/L烟酸，1mg/L Ca-pantothenate，200mg/L肌醇，200mg/L脯氨酸，300mg/L水解酪蛋白，2mg/L 2，4-D，30g/L麦芽糖，8g/L琼脂，pH5.8；

5、权利要求1或2所述的方法，其中步骤3)所述的培养基按以下配方制备：

浸染培养基L9：1/10的L7培养基附加100mg/L抗坏血酸，0.02％Fluronic F68，1.95g/L乙磺酸，200μM/L乙酰丁香酮，10g/L葡萄糖，pH5.2；

恢复培养基L10：L7培养基附加500mg/L头孢霉素，pH5.2；

分化培养基L11：L7培养基附加25g/L麦芽糖，5g/L甘露糖，500mg/L头孢霉素，8g/L琼脂，pH5.8；

再生培养基L12：MS培养基附加10mg/L thiamine-HCl，1mg/L pyridoxine-HCl，1mg/Lnicotinic acid，1mg/L Ca-pantothenate，200mg/L肌醇，200mg/L脯氨酸，300mg/L水解酪蛋白，20g/L麦芽糖，10g/L甘露糖，0.5mg/L吲哚丁酸，300mg/L头孢霉素，8g/L琼脂，pH5.8，和

壮苗培养基L13：1/2MS培养基附加10mg/L thiamine-HCl，1mg/L pyridoxine-HCl，1mg/Lnicotinic acid，1mg/L Ca-pantothenate，200mg/L肌醇，200mg/L脯氨酸，300mg/L水解酪蛋白，20g/L麦芽糖，0.5mg/L吲哚丁酸，1mg/L多效唑，2mg/L萘乙酸，15g/L甘露糖，300mg/L头孢霉素，8g/L琼脂，pH5.8。

6、权利要求1或2所述的方法，其中步骤4)方法如下：

用权利要求2所述的引物PMIP2和序列为5’-CGCTGGAAGTGATGGCAAAC-3’的引物PMIP4，PCR扩增manA基因特异DNA片段，片段长度为400bp。

7、权利要求1或2所述的方法，其中步骤5)所述的方法如下：

1)制备氯酚红显色反应液；

2)将步骤1)显色反应液分装至细胞培养板中；

3)将PCR鉴定的转基因植株叶片浸入显色反应液中，25℃暗培养3天；

4)鉴定转基因植物特异颜色反应。

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