CN111334606A - 花生籽仁可溶性糖含量相关位点的分子标记方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物分子遗传学和作物分子育种技术领域，提供一种花生籽仁可溶性糖含量相关位点的分子标记方法及其应用，分子标记包括InDel标记PM16‑6和PM16‑8，其分别位于花生籽仁可溶性糖含量相关主效位点的两侧，标记PM16‑6的引物如SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:4所示，标记PM16‑8的引物如SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:8所示；利用所述两个标记实现对花生籽仁可溶性糖含量相关主效位点等位变异在杂交后代中的分子标记辅助选择，进而实现对花生籽仁可溶性糖含量的分子标记辅助育种，两个标记选择正确率均在98.87％以上，具有检测方便、快速，扩增稳定，准确率高等特点。

Description

花生籽仁可溶性糖含量相关位点的分子标记方法及其应用

技术领域：

本发明属于植物分子遗传学和作物分子育种技术领域，特别涉及花生籽仁可溶性糖含量相关主效位点的分子标记方法及其应用，主要用于花生籽仁可溶性糖含量的分子标记辅助育种，以及与花生籽仁可溶性糖含量相关的品质、产量、耐逆性等相关的分子标记辅助育种。

背景技术：

花生是我国重要的油料经济作物，但其单产、总产、出口量及产值在五大油料作物中一直位居首位，花生籽仁营养丰富，主要含有蛋白质(12.48％-36.82％)和油脂(32.35％-60.21％)，两者之和超过75％(万书波,封海胜等2004)。花生既可直接食用，又是食品原料，糖分含量是其重要的品质性状。随着人们对花生营养的全面认识，作为全籽仁食品的比例逐年增加，口感甜度高的花生越来越受到消费者的青睐。最直接影响花生口感甜度的因素即其籽仁的可溶性糖的含量。花生籽仁中的糖主要由可溶性糖和非可溶性糖组成，而可溶性糖主要是蔗糖、果糖和葡萄糖等。葡萄糖是高等植物光合产物的主要直接产物，继而转化为蔗糖的形式进行运输，进入储藏器官后再分解为单糖转化为其他储藏物质进行储存，是农作物产量形成的物质基础。在可溶性糖中，蔗糖所占的比例最大，花生的品尝甜味主要来源于蔗糖(Basha.et al.1992；Oupadissakoon,Young et al.1980)。另外，有研究表明种子含糖量的降低会导致种子对低温的敏感(Uemura,Warren et al.2003)，反之提高种子的含糖量，在种子的抗逆性尤其是发芽阶段对低温和盐碱的耐受性中也将具有重要的意义(Shi,Wang et al.2016；Sui,Yang et al.2015)。尤其是当下花生种植区域向辽宁、吉林等高纬度春季低温地区以及盐碱地等区域发展，利用改良花生籽仁中的可溶性糖含量来提高花生的耐逆性也将是一个新的途径。鉴于此，发掘花生籽仁中可溶性糖含量的关键遗传位点，将为分子遗传手段改良花生的籽仁可溶性糖含量提供理论依据。

关于籽仁可溶性糖含量的遗传位点在多种植物中已经有一定的研究。在对玉米籽粒可溶性糖含量的研究中发现了两种类型的甜玉米：一类是淀粉合成功能缺失，主要是由sh2和brittle2基因引起的，两者均编码ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucosepyrophosphorylase)，在多糖合成中发挥作用。这两个基因的突变体胚乳中累积较多的可溶性蔗糖，籽粒不透明(Laughnan,1953；Bhave,Lawrence et al.1990)。另外一类是淀粉颗粒组装的问题，以su1(sugary 1)及其隐性调节子se1(sugary enhancer 1)基因为主要调控因子。Su1基因编码一个淀粉异构酶(Isoamylase)，在多糖的分枝发育中发挥作用(James,Robertson et al.1995)，它们的功能缺失，产生可溶性的多分枝的植物多糖，主要是麦芽糖，籽粒是半透明的(Ferguson,Dickinson et al.1979；Folgado et al.2014；Carey,Dickinson et al.1984)。水稻ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的功能失活同样会形成糖化和皱缩半透明的籽粒(Yano,Isono et al.2008；Tuncel,A.et al.2014)。另外水稻淀粉合成酶的磷酸化所需要的激酶SPK(Calmodulin-like domain protein kinase)的失活也会形成充满蔗糖而缺少淀粉的水稻籽粒(Asano,T.et al.2002)。除了以淀粉为储藏物质的谷物(胚乳)，对子叶类植物籽仁含糖量的研究较少。在拟南芥的研究中发现：种子中碳水化合物的代谢相关基因的功能变化会导致籽仁中(子叶中)油分和糖分的变化，例如编码一个乙烯响应的AP2/ERWEBP型的转录因子wrinkled1基因的突变会导致种子中的油分降低，可溶性糖含量增加(Focks,Benning et al.1998；Ma,W.et al.2013)。在对甜高粱的研究中，也通过正向遗传学的手段，克隆到了控制甜高粱茎秆含糖量的持汁基因Dry，该基因是一个植物特有的NAC转录因子，在高粱的栽培驯化中受到了强烈的人工选择(Zhang,L.,etal.2018)。

花生籽仁主要由两片占种子绝大部分的子叶构成，其主要的储藏物质为油脂和蛋白质(之和超过75％)，光合作用产生的碳水化合物主要以蔗糖的形式运送到发育中的种子中，之后在蔗糖转化酶的作用下水解为葡萄糖或果糖，在一系列的酶作用下经过乙酰辅酶A合成为油脂或蛋白质(Weber,Borisjuk et al.1997)。这些储藏物质的合成途径中有相当多的遗传因子发挥作用(JA,W.et al.2001)，而到底是那些基因发生变异会导致种子中可溶性糖含量的增加至今没有一个清楚的认识。Basha等对152份种质资源的研究发现：花生籽仁中可溶性总糖含量的遗传多样性较高，变幅为2.84％-19.98％，蔗糖含量的变幅为2.73％-14.65％(Basha,S.M.1992)。Harold等分离并测定了52个不同品种的20种不同的碳水化合物成分，结果发现其中有9种受到环境的影响，5种在花生类型中表现差异，11种因基因型和环境互作表现差异，其中基因型变异占38％-78％，同时发现碳水化合物的变异与烤花生的风味差异密切相关(Harold E,Pattee.et al.2000)。王秀贞等对花生的粒级间蔗糖含量和可溶性总糖进行的研究发现，三级米(秕粒)的含糖量要普遍高于一、二级米，这与前人研究发现的收获越早籽仁含糖量越高的现象相一致，也从侧面说明了花生的可溶性糖可能主要来自于光合产物的非完全转化为储藏物质。Isleib等通过杂交及其后代的研究发现：花生籽仁的可溶性糖含量主要受加性基因效应控制，同时发现蔗糖含量在正反交中差异显著(Isleib,Pattee.et al.2004)。还有一些关于花生种皮颜色、遮光覆膜、土壤肥料等对花生含糖量的影响的研究，充分表明花生籽仁可溶性糖含量是一个受多因素影响的复杂数量性状。

已有的研究仅限于此，还未见对花生籽仁可溶性糖含量这一品质性状较为系统及分子遗传方面的研究。未见对花生籽仁可溶性糖含量相关基因位点或连锁的分子标记的报道，本发明提供两个与花生籽仁可溶性糖含量相关的主效位点连锁的分子标记及其在花生籽仁可溶性糖含量的遗传改良中的分子标记辅助选择的应用方法。

发明内容：

本发明的目的是提供两个与花生籽仁可溶性糖含量相关位点紧密连锁的分子标记，利用该分子标记，可以快速准确地对花生籽仁可溶性糖含量性状进行分子标记辅助的种质鉴定，同时可以在杂交育种中对后代的籽仁可溶性糖含量进行分子标记辅助选择，以提高花生籽仁可溶性糖含量相关的育种效率。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明提供一种花生籽仁可溶性糖含量相关位点的分子标记，所述分子标记包括InDel标记PM16-6和InDel标记PM16-8，InDel标记PM16-6位于花生第16染色体末端，其对应的2kb范围的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，与其有多态性差异的目标区序列如SEQ IDNO:2所示；InDel标记PM16-8位于花生第16染色体末端，其对应的2kb范围的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，与其有多态性差异的花生品种的目标区序列如SEQ ID NO:6所示；

所述SEQ ID NO:1的具体核苷酸序列如下：

TTATTTAACTTTAGAGTCTTTGGTTTTTTTTTCTATTCCCATTTGGATGTTAGTAATAATGTATCTTTCTTTTCTTTCATTTGGATTTTATTATAAGTCCTTATTCCCTGCGAATGAATGATTAACATCAAGAATTCCAAGCTAAACCGTGTAAAGTTGGAAAGTGGAAACTTATTATGGAAGAACCAGTCAACCATAATTAATGTGTTGACAAATCAACAAGAATCACTACTATATAATTGACTTTTACTAATATTTAAAAAATATTATTAAATCATATTAAAATATTATCTATATATATTAGTAATATTTTAACAAATATTAAATATATCATATTTTATTAAAAAGTTTTACTAACATTTTTTAAAAAATTTAATAATACTTGGTAAAAATATTACAATAGATTTTCTATAGTAATATTATGAAAAATGTTATAATAGACTTTTTTTAGTAACATTTAAAGAAATGTTACAATAAATATATTTTGTAACATTTAAAAAATATTACAATAGATATTTTATGTAACACTTAAAAAAATGTTACCATAAATATTTTTTGTAACACTTAGAAAAATATTACTATAGATAGTTTTTATAACACTTAAAAAATGTTACAAAAGATTTAAAGTAATATTTTTTTAGTTATATTATATTATTTTTTATTTTATATTATACATAATATAAATATACTAAAATTAATTACTACAACATAAAATATTTCTACAACTAGAAAATGGATTAATACAGACAGATTTACAGACGGATTTAGTCTTTATTACAGACGGATTTTTGGTTAGCGACGAAATTACCGACGGATTTTGTCCCTCTATAAAAGTCCCGTCGGAAATTATTTACCGACGGATTTTTTTTCCGTCGAAAAATTACAGACAAATTTTTACCAGTTACCGACGGATTTTTTCTCTGTAAATTTTCTATCTATTTCCCAAAGACGACGCACTTTCAAACGGATTTTCCGTCTATAATTACAGACGGATTTTCATACGGATTTTCCGACGGATTTTTCGTCTGTAATTACAGACGGATTTTCCGACAGATTTTCCGTCTGTAATTTGAACTTTGGAAAATCATCTCACATTCTGATTACAGACAGAAAATTCGTCTGTAAATCCGTCAGTAAGGTAAAATAGAATTTTTTTTATTTTTCTAATTACGAAATAAACTTGTTTTCATACAAAATAAATATAAATTTAATATAAATTTTATCTAATTTTATTCGAATATTTATAATATTTCAAAAAATAAACAAATTCATCGTATTATCAAACTAAAAGAAAAGTACTATAAATAAACAAGTCAATATAATTCAAAACATAAACAAAGTATAATCCCCAAGCAACACTGGTTTACAAGGAAATACATGAGCACAGACTGAACATTAGTTGTTCAATTCTTCTAAGATCCATTCAACGTTTTCTCTTTCTCTTGGCGACTTGTTCTGCTAAGACCTCTGGGTTTCTTCTGCGTGCCACAATAATTTTTTGAGGAGTGGAGGAGTGATAACCACTGCAGAAAGCATAGAAAAACAATTGAATAAAGAAAATAAAGCAAGGATCAAACGATTATATTCTACTTCATTCATTTAAACATGTTAAGAATTAATGAAAGCATATCGTGGCACTGGATTTGAAAGGTATAGTATCATAAGGATGCGACATTGGTTGATCACGGGGCCTATGAAACAGTAAGTGTGCTATAGATCGATCAATGGGGTTTGTGTCAGTTTCCATATCCATGAATCTCATACACCTGAATGAAGTTGCAGGTTATACTTATCAAGAAGATTAAATAGCATTATATTTTTGCAATAAATTAAAAAAGTTTGTTTAACAGTACTTTCTATGCACTGACATTAAGTACTTATAACTCTGAGCAATAAAACTGAAGTGAAGACAGCAACCAATACCTGCTACCATTATGTGGCACCATTGATTTGCATGCTTGATCATCTCCGGTGCAACCATTTGCAATTGAGTCATTATG；

所述SEQ ID NO:2的具体核苷酸序列如下：

TTCTATCTATTTCCCAAAGACGACGCACTTTCAAACGGATTTTCCGTCTATAATTACAGACGGATTTTCAACGGATTTTCCGTCTGTAATTACAGTACGGATTTTCCGACGGATTTTTCGTCTGTAATTACAGACGGATTTTCCGACAGATTTTCCGTCTGTAATTTGAACTTTGGAAAATCATCTCACATTCTGATTACAGACAGAAAATTCGTCTGTAAATCCGTCAGTAAGGTAAAATAGAATT；

所述SEQ ID NO:5的具体核苷酸序列如下：

TGAGGGTGCAGAGTCTGAAGCTTTTGAATTTTGTCACTGATGGAGAGGGTTAACTCAATCTCATATATCTTATATAGAGGTGTGCATGGGCCGGGTGAAACCGGGTTTGATGTGATCCAGATCCGGCTCGAAATATATATCGGGCCTATTTATTAGACTCGAACCCGATCCTAGGTCCGATGAAATCTATACACTTTCGGGCGACGATTATACCGGGTAAAAATCGGGTGAAAATCGGGCCATTAACACTACATTACCTTGATACCTTCTTATAAGCTAGCATGTGAAAATATCCAAATTTCCAATACTTCAACCATTATTTAACATGGTAAAATTCACTTAGAAAAATATAACAAGAACCAACTCTTCTCTAAAATTAAAGCATAACCATAATCAATACTAATATTGTCTAATAATACCAAATATTTAAATCAATATAAATAACACAATAGTATGCATTAGTCTAAAATCTTATGCATTTTAAACATAAAACATTAACTTATAGTCTTATAATAACTAATAACACAAAATATTAAGGTTTACAATACTTAAATTCCACATAAGAATAGTCATCATCCATCACTAATAACACAAAATATTAATTGTATCTGATGACTGGACCACCGGGCTGACTTCGGGTAACCCGAGTCATGGCTCGGACCCGACCCGAAATAATGACCGGGTCTATTTTTGAGACCCTTATCCGACCCTAGACCCAGTGAAATCACACCAAAATAGCCTCTAAAATGTTCGGGACCGGGTCGGATCTTCGGGTCGGGTCGGGCCATGCACACCCCTAATCTTATATATACTAGTGCAGCTGACACGCAAATAATAAAAGATACGAAGCTTATTTCATATTGGATCCTCTCCAATAAAAAAAATAAATTAAATAGTGTATAATATTTAATTTAATTATTTATTATTTTTTTATTTATTTTTGTCCAACTTATAAAATTAAAAATAAAAAATTATATTATATTCTATCAAATATTAAAAAAATTAAAAAAAATTCATTTCCTTCCATCGTACGAATGTGAAACTTTTTCGTTCTAATTTATTTAATCATTCAGATTTAATATAAAAAATATTAACGGTCAAAATTGAAGTGGAAAGTATATTGTAGATGTGCAGTTTGAGTGGTTTACAGGTAGGGATGGCAAAATTTCCCGAGACGCGGGGATCCCTGCAGGGACTGCCCCGAATGGGGATCCGATTGTGGGGAATTTTCTCCGCGGGGATGGGAATGGGGGACAAAATTCCCCCGAAGCAGGCGTGGGGACCCGAGCGGGGATCCCCGCCCCGTCCCCGCTATACCCCGAAATTTATGAATTCCTTAAATTATCCTTAATAGTTTATTTCTCATATATGTTTTTTAGTCATTTCTCACACACACATATATAGAAACTCAAAACTCCTAATCTTTATTTGCATAACCCTTCTTTAATTCAGAGATCCCTAAGGCTGTCCATACTCCATCTAACCTCTCTGCAGCCACCCCCTCGTCACCCTTCTCACCGAATCGTCACACCTCACCGTGCCATCACCCTTATCGCGTCGTAATTTCTATTTGCGGCGTTCTTTTTCATAACTCTGCCGTCGTATCCATTCTCCTCTCTGTTGCCACGTCTCTTACCTCGTCCACTACTTTGTCCTTTGACTCGTCGTTGCGTCCCCCTATTACGTTATTTCGGAGAAGTCACCATCGTATCATTTAGACTTTTTGTATAAAATCTTGCAGTTTTTGTATAAGATAGATACTTGCAGCTCTATTCATATGGAAATTAATAATTAGTTAGAACTATTATGTAGATGAAGAATGGGGTCCCCGCGGAGAATGGGGCCCCGTGGAGAATGGGGATGGGGAGCAATATTCCCCCACGGCGGGAAATGGGACGGGGATGGGGAGCAAATCTGAGGGCGGGAATGGGGAGCAGGGAGGCATCCCCCGCCCCCGCCCTGCCCCATTGACATCCCTATTTACAGGTGGTTTTCAATTG；

所述SEQ ID NO:6的具体核苷酸序列如下：

TCGGGCCATGCACACCCCTAATCTTATATATACTAGTGCAGCTGACACGCAAATAATAAAAGATACGAAGCTTATTTCATATTGGATCCTCTCCAATAAAAAAAATAAATTAAATAGTGTATAATATTTAATTTAATTATTTATTATTTTTTTATTTATTTTTGTCCAACTTATAAAATTAAAAATAAAAAATTATATTATATTCTATCAAATATTAAAAAAATTCATTTCCTTCCATCGTACGAATGTGAAACTTTTTCGTTCTAATTTATTTAATCATTCAGATTTAATATAAAAAATATTAACGGTCAAAATTGAAGTGGAAAGTATATTGTAGATGTGCAGTTTGAGTGGTTTACAGGTAGGGATGG。

本发明涉及的InDel标记PM16-6的优选引物对为：

PM16-6-F:5`-TTCTATCTATTTCCCAAAGACGAC-3`(SEQ ID NO:3)，

PM16-6-R:5`-AATTCTATTTTACCTTACTGACGG-3`(SEQ ID NO:4)；

InDel标记PM16-8的优选引物对为：

PM16-8-F:5`-TCGGGCCATGCACACCCCTAAT-3`(SEQ ID NO:7)，

PM16-8-R:5`-CCATCCCTACCTGTAAACCACT-3`(SEQ ID NO:8)。

本发明涉及的InDel标记PM16-6和InDel标记PM16-8分别位于花生籽仁可溶性糖含量相关主效位点的两侧，与该位点紧密连锁，两个标记间连锁率超过98.87％，重组率约为1.13％；标记PM16-6和PM16-8间的遗传距离为1.13cM。

上述两个标记的引物对为优选引物，但不仅限于此，但凡围绕该两个片段中心差异区域能够进行PCR扩增和凝胶检测的引物对均可采用。

基于上述的分子标记，本发明提供一种花生籽仁可溶性糖含量相关主效位点的分子标记方法，具体包括以下步骤：

(1)针对由高可溶性糖含量和低可溶性糖含量的双亲杂交或回交育种，提取亲本及其杂交后代待测花生植株的基因组DNA，获得基因组DNA溶液；

(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，利用分子标记PM16-6的引物对和分子标记PM16-8的引物对中的一对引物或两对引物，对基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(3)将步骤(2)制得的PCR扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，凝胶通过硝酸银染色显影后，进行带型判读，根据扩增产物的条带大小及与双亲带型的关系确定杂交后代的标记基因型，将杂交后代的扩增条带与亲本的扩增条带进行比对，如果后代个体的扩增条带与高可溶性糖含量亲本一致，则该个体标记基因型为高可溶性糖含量亲本型，如果后代个体的扩增条带与低可溶性糖含量亲本一致，则该个体标记基因型为低可溶性糖含量亲本型，如果后代个体的扩增产物为两条带，则该个体标记基因型为为双亲杂合型。

本发明涉及的步骤(2)中，PCR扩增的反应体系优选为：PCR总体系为10μl，其中2×Taq Master Mix for PAGE 5μl，DNA模板1μl，10pmol/μl上下游引物各0.5μl，补充加超纯水至10μl；PCR扩增的反应程序优选为：对于分子标记PM16-6：PCR反应程序为DNA 95℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，循环9次；94℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环30～35次；最后72℃延伸7min；对于分子标记PM16-8：PCR反应程序为DNA94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；最后72℃延伸7min(该程序可以根据不同PCR扩增酶或PCR仪的扩增效果适当调整退火温度及循环数等)。

本发明还提供所述花生籽仁可溶性糖含量相关位点的分子标记在花生籽仁可溶性糖含量的遗传改良中的分子标记辅助选择的应用，具体为：以高可溶性糖含量亲本、低可溶性糖含量亲本及其杂交后代的基因组DNA为模板，用标记PM16-6的引物对和PM16-8的引物对中的一对引物或两对引物对上述模板进行PCR扩增和凝胶检测，根据杂交后代个体的扩增产物大小与亲本的扩增产物大小比较判定个体标记的基因型，进而判定籽仁可溶性糖含量相关基因位点的基因型及该个体的籽仁可溶性糖含量；若后代个体的标记扩增大小与高可溶性糖含量亲本大小一样，则该个体籽仁可溶性糖含量相关基因位点的基因型是高可溶性糖含量亲本型，其表型即为籽仁高可溶性糖含量；若后代个体的标记扩增大小与低可溶性糖含量亲本大小一样，则该个体籽仁可溶性糖含量相关基因的基因型是低可溶性糖含量亲本型，其表型即为籽仁低可溶性糖含量；鉴于高可溶性糖含量对低可溶性糖含量具有半显性，因而当后代个体的标记扩增产物为父母本条带都有，则该个体籽仁可溶性糖含量相关基因位点的基因型是杂合型，该个体的表型为略高于双亲可溶性糖含量平均值；单独使用标记PM16-6或标记PM16-8对花生籽仁可溶性糖含量相关主效位点的选择正确率均在98.87％以上，同时使用InDel标记PM16-6和PM16-8对花生籽仁可溶性糖含量相关主效位点的选择准确率超过99.9％。

本发明具有以下有益效果：

本发明所提供的花生籽仁可溶性糖含量相关主效位点的分子标记方法，能够应用在花生籽仁可溶性糖含量性状的分子标记辅助育种中，利用本发明所提供的分子标记对杂交后代进行选择时，只需检测这些标记的扩增条带带型，即可判断花生籽仁可溶性糖含量相关主效位点的亲本来源，由此预测杂交后代个体的可溶性糖含量高低的表型，可以快速有目的的筛选出花生籽仁可溶性糖含量高或低的品种或品系，用于花生改良品质的育种工作；同时该发明所提供的分子标记具有检测方便、快速，扩增稳定，准确率高等特点。

附图说明：

图1为本发明涉及的InDel标记PM16-6在荣丰7号和冀花甜一号及其杂交后代中的胶图。

图2为本发明涉及的InDel标记PM16-8在荣丰7号和冀花甜一号及其杂交后代中的胶图。

图3为本发明涉及的荣丰7号×冀花甜一号的F₂代和F₆代的可溶性糖含量的次数分布图。

图4为本发明涉及的控制花生籽仁可溶性糖含量相关主效位点的BSA定位图。

图5为本发明涉及的花生第16染色体的目标区局部连锁图和可溶性糖含量定位图。

具体实施方式：

下面结合附图和实施例对本发明进行进一步说明。

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂和试验材料如无特别说明，均为市售常规试剂和试验材料；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规分子生物学方法。

实施例1：

(1)花生籽仁可溶性糖含量材料筛选及遗传特性分析

从青岛农业大学花生中心保存的300多份花生种质资源中选出164份代表性花生种资，利用近红外光谱分析仪对其进行光谱采集，利用近红外模型对采集到的光谱进行数据分析，得到164份花生籽仁的可溶性糖含量及其它品质含量。根据测得的可溶性糖含量数据，从164份花生种质资源中筛选到一个高可溶性糖含量的品种冀花甜一号。采用高效液相色谱-质谱联用对冀花甜一号和普通品种荣丰7号两个品种进行可溶性糖组分的测定，结果显示：冀花甜一号和荣丰7号的可溶性糖主要为蔗糖、葡萄糖和果糖，且冀花甜一号的蔗糖含量约为荣丰7号的蔗糖含量的2倍。同时利用蒽酮比色法对这两个品种进行可溶性总糖的较为准确的测定，结果证明冀花甜一号的可溶性总糖含量通常在9.49±1.89％，荣丰7号的可溶性总糖含量通常在3.48±0.25％，冀花甜一号的可溶性总糖含量显著高于普通花生品种荣丰7号的可溶性总糖含量。

利用可溶性糖含量低的荣丰7号和可溶性糖含量高的冀花甜一号进行正反杂交，种植杂交种F₁，自交获得F₂分离群体，连续多代株系自交繁育，最终得到重组自交系RIL-RFT。

其中，以荣丰7号作为母本的杂交种(RFT-F₁可溶性糖含量为7.12±0.62％)与冀花甜一号作为母本的杂交种(TRF-F₁可溶性糖含量为6.65±0.34％)之间可溶性糖含量没有显著性差异，且均高于荣丰7号，而接近荣丰7号和冀花甜一号的平均值(6.48％)。这初步说明，花生籽仁的可溶性糖含量这一性状主要受胚基因型调控，同时冀花甜一号中的高可溶性糖含量基因位点具有半显性遗传特性。

通过对杂交分离群体可溶性糖含量进行次数分布分析发现(见图3)：F₂群体中，可溶性糖含量平均值为6.65％，方差为8.85，变幅从1.44％～17.10％，呈现出连续性变化，且可溶性糖含量的最低值低于母本荣丰7号，最高值高于父本冀花甜一号，存在双向超亲分离现象。而且测得的可溶性糖含量表现出偏态分布，据此可以推断在F₂群体中减效基因起主导作用；F₆群体中，可溶性糖含量平均值为5.05％，方差为8.92，变幅从1.17％～14.72％，呈现连续性变化；F₆群体与F₂群体的可溶性糖含量呈现出来的遗传规律保持一致，即F₆群体同样存在双向超亲分离现象，表现出偏态分布的规律。结合F₂群体和F₆群体表现出的规律，推断F₂群体和F₆群体中减效基因起主导作用且存在控制可溶性糖含量的主效基因位点，可以利用极端个体分群法定位主效位点。

(2)花生籽仁可溶性糖含量相关基因位点的初定位

将荣丰7号×冀花甜一号的F₅群体的种子(F₆代)切为两半，一半用于测定可溶性糖含量，一半留下用于DNA提取。根据测得的表型数据，选取30个可溶性糖含量低的极端表型个体和30个可溶性糖含量高的极端表型个体，每个个体分别进行DNA提取，对DNA进行定量测定，将30个可溶性糖含量低的极端表型个体和30个可溶性糖含量高的极端表型个体的DNA分别等量混合，构成两个极端个体池(可溶性糖含量低池N-Pool；可溶性糖含量高池T-Pool)。由广州基迪奥生物科技有限公司对亲本荣丰7号和冀花甜一号进行20×测序深度的基因组重测序，对两个极端个体池分别进行30×测序深度的基因组重测序。

测序获得的原始数据经质量控制及数据过滤后，与栽培花生Tifrunner的基因组(参考基因组https://www.peanutbase.org/peanut_genome)进行比对并对亲本及混池进行变异分析，得到样本的基因组变异信息；然后以亲本荣丰7号的SNP作为参考基因组，亲本冀花甜一号为突变型，筛选荣丰7号和冀花甜一号间纯合且不一致，测序深度均大于2的位点作为差异位点，并将子代SNP index都小于0.3，SNP深度小于7的位点过滤掉，计算每个子代混池所有SNP位点的突变基因型的频率，即为子代SNP-index(具体方法见分子生物学报道的BSA法)；通过计算两个极端个体池的SNP_index值的差(ΔSNP-index)，将控制花生籽仁可溶性糖含量的相关位点定位在了花生第16染色体的末端149473050bp-152282499bp之间约2.8Mb的物理区间内(见图4)。

(3)花生籽仁可溶性糖含量的局部连锁验证

根据亲本基因组的重测序数据与参考基因组(Tifrunner基因组数据)的比较，对双亲间不同且纯合的插入缺失变异位点开发为基于PCR的分子标记。具体为提取插入缺失位点所在位置上下各300bp的序列，利用Primer 5软件设计引物。利用这种方法在涵盖花生第16染色体目标区间的范围内开发了物理距离间隔尽量保持均匀，能够相对完整覆盖候选区间的可能有多态的若干个InDel标记的引物对，以荣丰7号与冀花甜一号花生的DNA为模板，进行PCR扩增，最终通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染分析，筛选得到条带清晰，亲本间条带大小有差异的7个有多态的InDel标记(表1)。

表1 RFT群体中第16染色体所用标记的引物

先利用物理距离最远的两个InDel标记PM16-10和PM16-8对RFT-F₆群体进行重组个体的筛选，将在RFT-F₆群体筛选到的重组个体，在RFT-F₇群体中重新提取DNA，用7个有多态的InDel标记对其进行详细的基因分型，对于在RFT-F₆群体不重组的个体，认为此家系在目标区间内已达到纯合，在RFT-F₇群体中也不再重组，其内部基因型与PM16-10和PM16-8的基因型一致。根据InDel标记的基因分型，利用软件QTL IciMapping v4.0提供的遗传连锁图谱构建模块，采用LOD＝3.0为阈值的标准分群，进一步排序调整之后，得到第16号染色体的局部遗传连锁图谱，其物理距离3.5Mb，总遗传距离7.87cM(图5)。结合RFT-RIL群体的202个个体的基因型和表型，及其上述的遗传图谱，使用软件IciMapping v4.0提供的双亲群体的QTL作图模块，以LOD＝3为阈值，采用加性完备区间作图法进行QTL作图。经过全群体连锁定位分析，在第16号染色体末端定位到与花生籽仁可溶性糖含量相关的位点(见图5)，这一结果与BSA-seq的定位结果一致。

全群体连锁定位分析的具体实验方法如下：

①用CTAB法或者DNA提取试剂盒提取亲本及其杂交后代待测花生叶片或籽仁的基因组DNA，获得基因组DNA溶液；

②以步骤①制得的基因组DNA为模板，利用上述的筛选到的目标区间内的InDel标记的引物对(表1)，对基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

③将步骤②制得的PCR扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，凝胶通过硝酸银染色显影后，进行带型判读，根据扩增产物的条带大小及与双亲带型的关系确定杂交后代的标记基因型；

④亲本及其杂交后代进行可溶性糖含量的测定利用蒽酮比色法。

⑤利用软件QTL IciMapping v4.0提供的遗传连锁图谱构建模块和双亲群体的QTL作图模块，对RIL群体构建局部遗传连锁图谱和QTL定位。

在上述步骤②中，PCR扩增的反应体系优选为：PCR总体系为10μl，其中2×TaqMaster Mix for PAGE 5μl，DNA模板1μl，10pmol/μl上下游引物各0.5μl，补充加超纯水至10μl；PCR扩增的反应程序优选为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；最后72℃延伸7min；当上述PCR反应程序不能很好扩增情况下，根据引物扩增难易特点选用梯度PCR，具体反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，循环9次；94℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环30～35次；最后72℃延伸7min。

在上述步骤③中，标记基因型判读时，对于目标区间内在亲本间有多态的7个InDel标记，对荣丰7号和冀花甜一号构建的杂交后代，将其扩增条带与亲本的扩增条带进行比对，如果扩增条带与亲本荣丰7号一致，则记录为荣丰型，如果扩增条带与亲本冀花甜一号一致，则记录为冀花甜一号型，如果扩增出两条带，则标志着该标记位点为双亲杂合型；

在上述步骤⑤中，本实施例采用的标记为共显性标记，其赋值规则符合共显性标记赋值规则，即与母本一样记为2，与父本一样记为0，杂合带型记为1，缺失带型记为-1。对统计的RIL群体的标记型分析结果及采用蒽酮比色法得到的202个家系可溶性糖含量的表型值，利用软件QTL IciMapping v4.0提供的遗传连锁图谱构建模块，采用LOD＝3为阈值的标准分群，利用nnTwoOpt算法排序，利用SARF做标准，窗口大小为5对标记顺序进行调整，得到局部遗传连锁图谱。利用双亲群体的QTL作图模块，采用LOD＝3为阈值，扫描步长1cM，逐步回归标记进入的概率(PIN)是0.001及ICIM-ADD的定位方法，进行QTL定位。

通过对第16号染色体的局部连锁图谱构建及QTL作图，发现可溶性糖含量相关的主效位点定位在标记PM16-6和PM16-8之间，其遗传距离间距为1.13cM，对表型的贡献率为39.82％，增效位点来自于冀花甜一号，可使可溶性糖含量增加2.16％。

所述InDel标记PM16-6位于花生第16染色体末端，其对应的2kb范围的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示(具体位置为Tifrunner.gnm1.Arahy.16:151576560..151578559)；与其有多态性差异的目标区序列如SEQ ID NO:2所示；InDel标记PM16-6的引物对优选为PM16-6-F/R，该引物对所对应的核苷酸序列分别如下：

PM16-6-F:5`-TTCTATCTATTTCCCAAAGACGAC-3`(SEQ ID NO:3)，

PM16-6-R:5`-AATTCTATTTTACCTTACTGACGG-3`(SEQ ID NO:4)；

所述InDel标记PM16-8位于花生第16染色体末端，，其对应的2kb范围的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示(具体位置为：Tifrunner.gnm1.Arahy.16:152275872..152277871)；与其有多态性差异的花生品种的目标区序列如SEQ ID NO:6所示；InDel标记PM16-8的引物对优选为PM16-8-F/R，该引物对所对应的核苷酸序列分别如下：

PM16-8-F:5`-TCGGGCCATGCACACCCCTAAT-3`(SEQ ID NO:7)，

PM16-8-R:5`-CCATCCCTACCTGTAAACCACT-3`(SEQ ID NO:8)。

上述两个标记的引物对为优选引物，但不仅限于此，但凡围绕该两个片段中心差异区域能够进行PCR扩增和凝胶检测的引物对均可采用。

通过将基因型结果与表型测量结果进行对应发现：标记PM16-6和PM16-8间的遗传距离为1.13cM，与表型间的重组率低于1.13％，同时采用两个标记进行后代选择，理论上错误率仅为万分之一，准确率超过99.9％。

综合以上结果，通过检测与花生籽仁可溶性糖含量相关基因位点连锁的分子标记，能够确定控制花生籽仁可溶性糖含量的等位变异在育种后代中的分布，实现对花生品质改良中后代的分子标记辅助选择，提高花生籽仁可溶性糖含量选择育种的效率、加快育种进度，提高花生品质改良的目的性和准确性。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 花生籽仁可溶性糖含量相关位点的分子标记及其应用

<130> 20200402

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2000

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttatttaact ttagagtctt tggttttttt ttctattccc atttggatgt tagtaataat 60

gtatctttct tttctttcat ttggatttta ttataagtcc ttattccctg cgaatgaatg 120

attaacatca agaattccaa gctaaaccgt gtaaagttgg aaagtggaaa cttattatgg 180

aagaaccagt caaccataat taatgtgttg acaaatcaac aagaatcact actatataat 240

tgacttttac taatatttaa aaaatattat taaatcatat taaaatatta tctatatata 300

ttagtaatat tttaacaaat attaaatata tcatatttta ttaaaaagtt ttactaacat 360

tttttaaaaa atttaataat acttggtaaa aatattacaa tagattttct atagtaatat 420

tatgaaaaat gttataatag acttttttta gtaacattta aagaaatgtt acaataaata 480

tattttgtaa catttaaaaa atattacaat agatatttta tgtaacactt aaaaaaatgt 540

taccataaat attttttgta acacttagaa aaatattact atagatagtt tttataacac 600

ttaaaaaatg ttacaaaaga tttaaagtaa tattttttta gttatattat attatttttt 660

attttatatt atacataata taaatatact aaaattaatt actacaacat aaaatatttc 720

tacaactaga aaatggatta atacagacag atttacagac ggatttagtc tttattacag 780

acggattttt ggttagcgac gaaattaccg acggattttg tccctctata aaagtcccgt 840

cggaaattat ttaccgacgg attttttttc cgtcgaaaaa ttacagacaa atttttacca 900

gttaccgacg gattttttct ctgtaaattt tctatctatt tcccaaagac gacgcacttt 960

caaacggatt ttccgtctat aattacagac ggattttcat acggattttc cgacggattt 1020

ttcgtctgta attacagacg gattttccga cagattttcc gtctgtaatt tgaactttgg 1080

aaaatcatct cacattctga ttacagacag aaaattcgtc tgtaaatccg tcagtaaggt 1140

aaaatagaat tttttttatt tttctaatta cgaaataaac ttgttttcat acaaaataaa 1200

tataaattta atataaattt tatctaattt tattcgaata tttataatat ttcaaaaaat 1260

aaacaaattc atcgtattat caaactaaaa gaaaagtact ataaataaac aagtcaatat 1320

aattcaaaac ataaacaaag tataatcccc aagcaacact ggtttacaag gaaatacatg 1380

agcacagact gaacattagt tgttcaattc ttctaagatc cattcaacgt tttctctttc 1440

tcttggcgac ttgttctgct aagacctctg ggtttcttct gcgtgccaca ataatttttt 1500

gaggagtgga ggagtgataa ccactgcaga aagcatagaa aaacaattga ataaagaaaa 1560

taaagcaagg atcaaacgat tatattctac ttcattcatt taaacatgtt aagaattaat 1620

gaaagcatat cgtggcactg gatttgaaag gtatagtatc ataaggatgc gacattggtt 1680

gatcacgggg cctatgaaac agtaagtgtg ctatagatcg atcaatgggg tttgtgtcag 1740

tttccatatc catgaatctc atacacctga atgaagttgc aggttatact tatcaagaag 1800

attaaatagc attatatttt tgcaataaat taaaaaagtt tgtttaacag tactttctat 1860

gcactgacat taagtactta taactctgag caataaaact gaagtgaaga cagcaaccaa 1920

tacctgctac cattatgtgg caccattgat ttgcatgctt gatcatctcc ggtgcaacca 1980

tttgcaattg agtcattatg 2000

<210> 2

<211> 247

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttctatctat ttcccaaaga cgacgcactt tcaaacggat tttccgtcta taattacaga 60

cggattttca acggattttc cgtctgtaat tacagtacgg attttccgac ggatttttcg 120

tctgtaatta cagacggatt ttccgacaga ttttccgtct gtaatttgaa ctttggaaaa 180

tcatctcaca ttctgattac agacagaaaa ttcgtctgta aatccgtcag taaggtaaaa 240

tagaatt 247

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttctatctat ttcccaaaga cgac 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aattctattt taccttactg acgg 24

<210> 5

<211> 2000

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgagggtgca gagtctgaag cttttgaatt ttgtcactga tggagagggt taactcaatc 60

tcatatatct tatatagagg tgtgcatggg ccgggtgaaa ccgggtttga tgtgatccag 120

atccggctcg aaatatatat cgggcctatt tattagactc gaacccgatc ctaggtccga 180

tgaaatctat acactttcgg gcgacgatta taccgggtaa aaatcgggtg aaaatcgggc 240

cattaacact acattacctt gataccttct tataagctag catgtgaaaa tatccaaatt 300

tccaatactt caaccattat ttaacatggt aaaattcact tagaaaaata taacaagaac 360

caactcttct ctaaaattaa agcataacca taatcaatac taatattgtc taataatacc 420

aaatatttaa atcaatataa ataacacaat agtatgcatt agtctaaaat cttatgcatt 480

ttaaacataa aacattaact tatagtctta taataactaa taacacaaaa tattaaggtt 540

tacaatactt aaattccaca taagaatagt catcatccat cactaataac acaaaatatt 600

aattgtatct gatgactgga ccaccgggct gacttcgggt aacccgagtc atggctcgga 660

cccgacccga aataatgacc gggtctattt ttgagaccct tatccgaccc tagacccagt 720

gaaatcacac caaaatagcc tctaaaatgt tcgggaccgg gtcggatctt cgggtcgggt 780

cgggccatgc acacccctaa tcttatatat actagtgcag ctgacacgca aataataaaa 840

gatacgaagc ttatttcata ttggatcctc tccaataaaa aaaataaatt aaatagtgta 900

taatatttaa tttaattatt tattattttt ttatttattt ttgtccaact tataaaatta 960

aaaataaaaa attatattat attctatcaa atattaaaaa aattaaaaaa aattcatttc 1020

cttccatcgt acgaatgtga aactttttcg ttctaattta tttaatcatt cagatttaat 1080

ataaaaaata ttaacggtca aaattgaagt ggaaagtata ttgtagatgt gcagtttgag 1140

tggtttacag gtagggatgg caaaatttcc cgagacgcgg ggatccctgc agggactgcc 1200

ccgaatgggg atccgattgt ggggaatttt ctccgcgggg atgggaatgg gggacaaaat 1260

tcccccgaag caggcgtggg gacccgagcg gggatccccg ccccgtcccc gctatacccc 1320

gaaatttatg aattccttaa attatcctta atagtttatt tctcatatat gttttttagt 1380

catttctcac acacacatat atagaaactc aaaactccta atctttattt gcataaccct 1440

tctttaattc agagatccct aaggctgtcc atactccatc taacctctct gcagccaccc 1500

cctcgtcacc cttctcaccg aatcgtcaca cctcaccgtg ccatcaccct tatcgcgtcg 1560

taatttctat ttgcggcgtt ctttttcata actctgccgt cgtatccatt ctcctctctg 1620

ttgccacgtc tcttacctcg tccactactt tgtcctttga ctcgtcgttg cgtcccccta 1680

ttacgttatt tcggagaagt caccatcgta tcatttagac tttttgtata aaatcttgca 1740

gtttttgtat aagatagata cttgcagctc tattcatatg gaaattaata attagttaga 1800

actattatgt agatgaagaa tggggtcccc gcggagaatg gggccccgtg gagaatgggg 1860

atggggagca atattccccc acggcgggaa atgggacggg gatggggagc aaatctgagg 1920

gcgggaatgg ggagcaggga ggcatccccc gcccccgccc tgccccattg acatccctat 1980

ttacaggtgg ttttcaattg 2000

<210> 6

<211> 371

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcgggccatg cacaccccta atcttatata tactagtgca gctgacacgc aaataataaa 60

agatacgaag cttatttcat attggatcct ctccaataaa aaaaataaat taaatagtgt 120

ataatattta atttaattat ttattatttt tttatttatt tttgtccaac ttataaaatt 180

aaaaataaaa aattatatta tattctatca aatattaaaa aaattcattt ccttccatcg 240

tacgaatgtg aaactttttc gttctaattt atttaatcat tcagatttaa tataaaaaat 300

attaacggtc aaaattgaag tggaaagtat attgtagatg tgcagtttga gtggtttaca 360

ggtagggatg g 371

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcgggccatg cacaccccta at 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccatccctac ctgtaaacca ct 22

Claims (6)

1.一种花生籽仁可溶性糖含量相关位点的分子标记，其特征在于：所述分子标记包括InDel标记PM16-6和InDel标记PM16-8，InDel标记PM16-6位于花生第16染色体末端，其对应的2kb范围的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，与其有多态性差异的目标区序列如SEQ IDNO:2所示；InDel标记PM16-8位于花生第16染色体末端，其对应的2kb范围的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，与其有多态性差异的花生品种的目标区序列如SEQ ID NO:6所示。

2.根据权利要求1所述花生籽仁可溶性糖含量相关位点的分子标记，其特征在于：

InDel标记PM16-6的优选引物对为：

PM16-6-F:5`-TTCTATCTATTTCCCAAAGACGAC-3`，

PM16-6-R:5`-AATTCTATTTTACCTTACTGACGG-3`；

InDel标记PM16-8的优选引物对为：

PM16-8-F:5`-TCGGGCCATGCACACCCCTAAT-3`，

PM16-8-R:5`-CCATCCCTACCTGTAAACCACT-3`。

3.根据权利要求1所述花生籽仁可溶性糖含量相关位点的分子标记，其特征在于：所述的InDel标记PM16-6和InDel标记PM16-8分别位于花生籽仁可溶性糖含量相关主效位点的两侧，与该位点紧密连锁，两个标记间连锁率超过98.87％，重组率约为1.13％；标记PM16-6和PM16-8间的遗传距离为1.13cM。

4.一种花生籽仁可溶性糖含量相关主效位点的分子标记方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)针对由高可溶性糖含量和低可溶性糖含量的双亲杂交或回交育种，提取亲本及其杂交后代待测花生植株的基因组DNA，获得基因组DNA溶液；

(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述分子标记PM16-6的引物对和分子标记PM16-8的引物对中的一对引物或两对引物，对基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(3)将步骤(2)制得的PCR扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，凝胶通过硝酸银染色显影后，进行带型判读，根据扩增产物的条带大小及与双亲带型的关系确定杂交后代的标记基因型，将杂交后代的扩增条带与亲本的扩增条带进行比对，如果后代个体的扩增条带与高可溶性糖含量亲本一致，则该个体标记基因型为高可溶性糖含量亲本型，如果后代个体的扩增条带与低可溶性糖含量亲本一致，则该个体标记基因型为低可溶性糖含量亲本型，如果后代个体的扩增产物为两条带，则该个体标记基因型为双亲杂合型。

5.根据权利要求4所述的花生籽仁可溶性糖含量相关主效位点的分子标记方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系为：PCR总体系为10μl，其中2×3G Taq Master Mix forPAGE(Red Dye)5μl，模板1μl，10pmol/μl上下游引物各0.5μl，补充加超纯水至10μl；PCR扩增的反应程序为：对于分子标记PM16-6：PCR反应程序为DNA 95℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，循环9次；94℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环30～35次；最后72℃延伸7min；对于分子标记PM16-8：PCR反应程序为DNA 94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；最后72℃延伸7min。

6.权利要求1-3任一所述的花生籽仁可溶性糖含量相关位点的的分子标记在花生籽仁可溶性糖含量的遗传改良中分子标记辅助选择中的应用，其特征在于：以高可溶性糖含量亲本、低可溶性糖含量亲本及其杂交后代的基因组DNA为模板，用标记PM16-6的引物对和PM16-8的引物对中的一对引物或两对引物对上述模板进行PCR扩增和凝胶检测，根据杂交后代个体的扩增产物大小与亲本的扩增产物大小比较判定个体标记的基因型，进而判定籽仁可溶性糖含量相关基因位点的基因型及该个体的籽仁可溶性糖含量；若后代个体的标记扩增大小与高可溶性糖含量亲本大小一样，则该个体籽仁可溶性糖含量相关基因位点的基因型是高可溶性糖含量亲本型，其表型即为籽仁高可溶性糖含量；若后代个体的标记扩增大小与低可溶性糖含量亲本大小一样，则该个体籽仁可溶性糖含量相关基因的基因型是低可溶性糖含量亲本型，其表型即为籽仁低可溶性糖含量；鉴于高可溶性糖含量对低可溶性糖含量具有半显性，因而当后代个体的标记扩增产物为父母本条带都有，则该个体籽仁可溶性糖含量相关基因位点的基因型是杂合型，该个体的籽仁可溶性糖含量表型为略高于双亲平均值；单独使用标记PM16-6或标记PM16-8对花生籽仁可溶性糖含量相关主效位点的选择正确率均在98.87％以上，同时使用InDel标记PM16-6和PM16-8对花生籽仁可溶性糖含量相关主效位点的选择准确率超过99.9％。

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