CN112646924A - 与花生蔗糖含量主效qtl位点连锁的分子标记及其应用 - Google Patents

与花生蔗糖含量主效qtl位点连锁的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及与花生蔗糖含量主效QTL位点连锁的分子标记及其应用。本发明的分子标记为IndelSCA08；其与QTL位点qSCA08连锁，扩增其的引物序列如SEQ ID NO.1‑2所示。当以待鉴定花生DNA为模板，利用SEQ ID NO.1‑2所示引物进行PCR扩增后，可根据扩增片段的长度判断待鉴定花生的蔗糖含量表型，从而提高高蔗糖含量花生的育种效率。

Description

与花生蔗糖含量主效QTL位点连锁的分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及与花生蔗糖含量主效QTL位点连锁的分子标记及其应用。
背景技术
花生(Arachis hypogaea L.)是重要的油料作物和经济作物。花生籽仁富含蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素、白藜芦醇、矿物质和植物营养素等。随着生活水平的提高和营养科学的发展，其较高的营养价值将会不断的通过科学试验被确认。近年来，花生食品加工业发展迅速，食用花生的需求也呈逐年上升趋势。食用花生品质评价重要因素之一是口味，包括甜度、香味、脆度、柔嫩度、细腻度、异味6个指标，它直接影响花生的食用体验及经济价值。其中甜度与籽仁中的可溶性糖含量紧密相关，花生籽仁中可溶性糖主要是蔗糖。研究表明，甜度与花生籽仁的口味品质相关系数达0.88，花生籽仁中蔗糖含量达到50mg/g以上时，口感较好。
在对实验室405份花生资源进行蔗糖含量测定发现，蔗糖含量表型的变异一般在15-40mg/g之间，只有7份资源材料可达到40mg/g以上，具有较大的遗传改良潜力。然而蔗糖含量是复杂的数量性状，容易受到环境的影响，通过常规方法筛选优异材料的效果不好、准确性差、效率较低。随着分子遗传学的发展，通过开发全基因组高密度的分子标记，结合表型数据，利用连锁分析方法可以在基因组上定位到多个控制目标农艺性状的QTL位点。通过QTL紧密连锁的标记对表型性状进行选择，可以提高目标性状的育种效率。然而，目前花生籽仁中蔗糖含量相关QTL报道较少，限制了分子标记辅助培育甜花生的进展。
发明内容
本发明的目的是提供一个花生蔗糖含量主效稳定的QTL位点qSCA08及其连锁的标记，用于甜花生材料的分子标记辅助选择。
具体地，本发明提供如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种与花生蔗糖含量主效QTL位点连锁的分子标记，所述分子标记为IndelSCA08；
分子标记IndelSCA08与QTL位点qSCA08连锁，所述分子标记IndelSCA08能够通过如SEQ ID NO.1-2所示的引物对扩增得到。
第二方面，本发明提供一种用于扩增上述分子标记的引物。
本发明中所述的引物，包括如SEQ ID NO.1-2所示的序列。
第三方面，本发明提供一种含有上述引物的试剂或试剂盒。
第四方面，本发明提供一种上述分子标记或引物或试剂或试剂盒的以下任一应用：
(1)在鉴定花生蔗糖含量性状表型中的应用；
(2)在花生种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种中的应用；
(3)在花生蔗糖含量性状早期预测中的应用；
(4)在筛选或创制花生蔗糖含量性状不同的花生中的应用；
(5)在花生蔗糖含量基因分型中的应用。
第五方面，本发明提供一种鉴定花生蔗糖含量性状表型的方法，其包括：
(1)提取待鉴定花生的DNA；
(2)以DNA为模板，利用SEQ ID NO.1-2所示引物进行PCR扩增；
(3)根据PCR扩增产物中DNA片段的大小判断待鉴定花生蔗糖含量性状表型。
本发明中，步骤(3)中判断待鉴定花生蔗糖含量性状表型的方法如下：
当利用SEQ ID NO.1-2所示引物进行PCR扩增后，产物中DNA片段的大小为354bp时，判断待鉴定花生具有高蔗糖含量。
本发明的有益效果在于：
本发明发现了一个花生籽仁蔗糖含量主效位点qSCA08，以及连锁的分子标记IndelSCA08。获得的与花生蔗糖含量主效QTL位点qSCA08连锁的标记能够在花生育种中辅助选择高蔗糖含量的材料，有利于推动甜花生品种的选育，提高育种效率。
附图说明
图1为本发明的花生蔗糖含量主效QTL位点在染色体的定位；其中，左图为基于SSR遗传连锁图谱的本发明蔗糖主效QTL定位图，该主效QTL位于标记AGGS0988和TC20B5(由加粗字体显示)之间。中间图为本发明主效QTL区间标记在A08染色体上的物理位置图。右图为BSA-seq定位的本发明主效QTL在A08染上体上的物理位置图。相邻图之间的连线表示QTL两端标记在A08染色体上的遗传位置和物理位置。
图2为58份花生资源PCR扩增结果。
图3为58份花生资源蔗糖含量测定结果图。
图4为高蔗糖和低蔗糖扩增序列的比对图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
以栽培花生中花10号为母本，遗传资源材料ICG12625为父本进行杂交并通过单粒传法构建重组自交系(RIL)群体F11(2018年)代和F12(2019年)代。基于SSR标记构建包含1219个位点、总长度为2038.52cM的高密度遗传连锁图谱，该图谱标记间平均距离为1.67cM。
将亲本和RIL群体(140份)分别在2018-2019年种植于襄阳市农业科学院试验基地(2018XY、2019XY)、2018-2019年种植于中国农业科学院油料作物研究所武汉市试验基地(2018WH、2019WH)以及2019年种植于武汉阳逻试验基地(2019YL)。采用完全随机区组实验设计两次重复。每次重复每个株系种植1行12个单株，行距30厘米，株距20厘米。采取标准的田间管理方式，收获生长正常的8个单株成熟的荚果。每个株系挑选10克左右饱满成熟无病斑的种子，采用HPLC-RID的方法检测籽仁中的蔗糖含量。获得表型数据后，利用独立样本T检验对亲本蔗糖含量进行差异性分析，发现亲本之间的蔗糖含量存在显著差异。ICG 12625的蔗糖含量始终高于中花10。对RIL群体的表型进行分析发现蔗糖含量在群体中呈正太分布，表明蔗糖含量是由多基因控制的数量性状。
采用Windows QTL Cartographer 2.5软件的复合区间作图法进行蔗糖含量的连锁分析，在A08染色体上鉴定到一个花生籽仁蔗糖含量QTL qSCA08，该QTL在2018XY、2018WH、2019WH、2019XY和2019YL五个环境下都能重复检测到(参见图1中的左图)，其LOD值分别为4.77、3.84、2.60、5.13和4.08，贡献率分别为12.37％、9.47％、6.87％、12.01％和11.11％。其中2018XY，2019XY和2019YL环境下检测到的QTL贡献率大于10％，该QTLqSCA08被认为是控制籽仁蔗糖含量的主效QTL位点。该主效QTL区间两端分子标记分别为AGGS0988和TC20B5，遗传距离为17.14cM，该区间一共有8个SSR标记，其对应的物理区间为34.2-41.6Mb，物理距离为7.4Mb(参见图1中的中间图)。从RIL群体中分别筛选极端高蔗糖和低蔗糖株系17个进行BSA测序，结果显示在A08的35Mb左右存在一个很高的峰值，与SSR定位的结果一致(参见图1中的右图)。
实施例2
结合实施例1中SSR和BSA定位的结果，本发明在A08的35Mb的位置设计了一对Indel引物：IndelSCA08F 5`-TTGGAGATGACTTTAAGAGTGTGTG-3`(如SEQ ID NO.1所示)；IndelSCA08R 5`-CGGATCTCTATAATCTGTATTTGAC-3`(如SEQ ID NO.2所示)，该对引物扩增的片段与目标QTL紧密连锁，为本发明的分子标记IndelSCA08。以该对引物对2019年武汉阳逻基地(2019YL)和襄阳(2019XY)基地种植的58份花生资源进行PCR扩增。扩增结果参见图2，其中，1-58号泳道对应的花生品种如表1所示，59号泳道为ICG12625，60号泳道为中花10号。标记IndelSCA08扩增出的DNA片段的大小为338bp时，其与母本中花10为相同带型，记为aa；扩增出的DNA片段的大小为354bp时，其与与父本ICG12625为相同带型，记为AA。结果显示aa基因型的有31份，AA基因型的有27份。对2019年武汉阳逻基地和襄阳基地种植的上述58份材料利用HPLC-RID方法(参见：李威涛,郭建斌,喻博伦,徐思亮,陈海文,吴贝,龚廷锋,黄莉,罗怀勇,陈玉宁,周小静,刘念,陈伟刚,姜慧芳.基于HPLC-RID的花生籽仁可溶性糖含量检测方法的建立[J].作物学报,2021,47(02):368-375.)进行蔗糖含量的测定，具体结果参见表1。经统计后结果表明aa基因型(低蔗糖)的均值为19.96±5.27mg/g，AA基因型(高蔗糖)的均值为39.72±10.59mg/g，独立样本T检验结果表明，两个基因型之间的蔗糖含量显著差异(P<0.001，参见图3)。说明以本发明的分子标记IndelSCA08可以有效筛选蔗糖含量高的花生。高蔗糖和低蔗糖扩增序列的比对图参见图4。其中，high：高蔗糖，low：低蔗糖；灰色区域为低蔗糖扩增片段缺失序列。
表1花生材料蔗糖含量表型和基因型
Figure BDA0002893633630000051
Figure BDA0002893633630000061
注：品种名中开头为Zhh的花生资源来源于国家种质库(中国农业科学院)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院油料作物研究所
<120> 与花生蔗糖含量主效QTL位点连锁的分子标记及其应用
<130> KHP201119306.3
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttggagatga ctttaagagt gtgtg 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cggatctcta taatctgtat ttgac 25

Claims (7)

1.与花生蔗糖含量主效QTL位点连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记为IndelSCA08；
分子标记IndelSCA08与QTL位点qSCA08连锁，所述分子标记IndelSCA08能够通过如SEQID NO.1-2所示的引物对扩增得到。
2.用于扩增权利要求1所述的分子标记的引物。
3.根据权利要求2所述的引物，其特征在于，包括如SEQ ID NO.1-2所示的序列。
4.含有权利要求2或3所述的引物的试剂或试剂盒。
5.权利要求1所述的分子标记或权利要求2或3所述的引物或权利要求4所述的试剂或试剂盒的以下任一应用：
(1)在鉴定花生蔗糖含量性状表型中的应用；
(2)在花生种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种中的应用；
(3)在花生蔗糖含量性状早期预测中的应用；
(4)在筛选或创制花生蔗糖含量性状不同的花生中的应用；
(5)在花生蔗糖含量基因分型中的应用。
6.鉴定花生蔗糖含量性状表型的方法，其特征在于，包括：
(1)提取待鉴定花生的DNA；
(2)以DNA为模板，利用SEQ ID NO.1-2所示引物进行PCR扩增；
(3)根据PCR扩增产物中DNA片段的大小判断待鉴定花生蔗糖含量性状表型。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中判断待鉴定花生蔗糖含量性状表型的方法如下：
当利用SEQ ID NO.1-2所示引物进行PCR扩增后，产物中DNA片段的大小为354bp时，判断待鉴定花生具有高蔗糖含量。
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