CN107787181A - 通过细胞质雄性不育水稻中更高的异交率提高杂交种子生产以及相关材料和方法 - Google Patents

通过细胞质雄性不育水稻中更高的异交率提高杂交种子生产以及相关材料和方法 Download PDF

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里基·维纳拉欧
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Abstract

提供了用于提高杂交种子生产的方法。通过基因渗入长雄野生稻(Oryza longistaminata)的长柱头性状，水稻的细胞质雄性不育(CMS)系中更高的异交率实现了提高的杂交种子生产。还提供了能够产生高杂交种子结籽率的具有更高异交率的CMS系。

Description

通过细胞质雄性不育水稻中更高的异交率提高杂交种子生产 以及相关材料和方法
背景技术
大米是全世界超过半数人口的主要食品，其为超过35亿的人口提供了超过20％的每日热量摄入。据估计到2035年，将额外需要1.16亿吨大米来喂养全世界增长的人口。
从上世纪40和50年代开始，提高产量逐渐替代了种植面积的扩增而成为全世界谷物生产中的主要增长来源。在上世纪40年代至60年代后期所发生的绿色革命见证了显著改善粮食亩产量的新的耕作方法和技术的发展，并且在上世纪60年代早期，绿色革命在印度的大饥荒中拯救了数百万人。特别地，开发了水稻品种IR8，当在灌溉和肥料的作用下种植时，其每株植物生产更多谷粒。自IR8以来，已开发了众多其它高产稻系。
现在，通常认为推动水稻年产量大于3％的增长的绿色革命技术几乎不再有任何进一步的产量增长，自1990年起，其年产量增长降至约1.25％。年增长的降低导致水稻产量在许多中小型国家，包括日本和韩国，进入平台期。较大国家如印度和中国的水稻产量似乎也到了其自身发展的极限。
在上世纪70年代早期开始，大量研究工作投入到发展杂交水稻，而杂交水稻的产量已显示出比常规绿色革命高产系的产量高多达20％。上世纪70年代早期，中国研究人员在海南岛发现了野败型细胞质雄性不育(WA-CMS)水稻植物。该发现导致在中国发展出了三系杂交水稻育种法，而在中国，杂交水稻从1976年已开始商业种植。这导致中国杂交水稻产量超过6.0t ha-1。
尽管杂交水稻已大规模商业化，特别是在中国，杂交水稻覆盖了超过50％的水稻总种植面积并且占全国产量的约2/3，但是将中国杂交技术转移至其它亚洲国家已证明是有困难的。为了使杂交水稻在商业上成功，杂交水稻种子必须是农民可承受的，因为每一季都需要新的杂交种子(杂种种子，hybrid seed)。
由于其花的形态，即花药和柱头较短，并且在小花开放后不久就释放花粉，因此栽培水稻主要是自花受精的。在驯化过程中，栽培水稻品种中的异交率(outcrossing rate)随着水稻花形态的改变而降低，其异交率为约0.01％。低异交率导致了较差的杂交种子生产(5-20％的种子结籽率)，从而导致了杂交水稻种子的高成本。这两个因素已被列为杂交水稻推广的主要限制。
发展具有改善的异交率以用于提高杂交种子生产的水稻品种和系将是有益的。
其它背景技术：
Marathi等人2014Euphytica doi:10.1007/s10681-014-1213-2；
Sheeba等人2006Indian J.Agric.Res.40(4):272-276；
Liu等人2015PLOS ONE|DOI:10.1371。
发明内容
包含含有至少一个与柱头长度相关的长雄野生稻(Oryza longistaminata)数量性状基因座(QTL)的基因渗入的栽培水稻植物，所述栽培水稻植物具有至少60％的异交率。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了包含含有与柱头长度相关的至少一个长雄野生稻数量性状基因座的基因渗入的栽培水稻植物，所述栽培水稻植物的异交率为至少50％、55％、60％、65％、70％、80％、85％、90％或更高。
根据具体的实施方式，所述水稻植物的异交率为至少60％。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了包含含有与柱头长度相关的至少一个长雄野生稻数量性状基因座(QTL)的基因渗入的栽培水稻植物，所述数量性状基因座选自：qSTGL8-1和qSTGL8-2。
根据本发明的一些实施方式，所述水稻植物为细胞质雄性不育系。
根据本发明的一些实施方式，所述水稻植物为保持系。
根据本发明的一些实施方式，所述水稻植物的异交率为至少50％、55％、60％、65％、70％、80％、85％、90％或更高。
根据具体的实施方式，所述水稻植物的异交率为至少60％。
根据本发明的一些实施方式，所述水稻植物包含至少一个另外的基因渗入，所述基因渗入包含与柱头长度、柱头面积、花柱长度、柱头宽度(stigma breadth)或总雌蕊长度相关的至少一个长雄野生稻QTL。
根据本发明的一些实施方式，与柱头长度、柱头面积、花柱长度、柱头宽度和雌蕊长度相关的至少一个长雄野生稻QTL选自qSTGL2-1、qSTGL5-1、qSTGL11-1、qSTGL11-2；qSTGA8-2；qSTYL1-1、qSTYL5-2、qSTYL8-1；qSTGB1-1、qSTGB3-1；qPSTL1-1、qPSTL1-3和qPSTL11-1。
根据本发明的一些实施方式，至少一种另外的QTL的标记(marker)选自：柱头长度，RM110(qSTGL2-1)、RM421(qSTGL5-1)、RM7356(qSTGL8-1)、RM5353(qSTGL8-1)、RM256(qSTGL8-2)、RM80(qSTGL8-2)、RM590(qSTGL11-1)、RM286(qSTGL11-1)、RM120(qSTGL11-2)；RM229(qSTGL11-2)；柱头面积，RM80(qSTGA8-2)；花柱长度，RM319(qSTYL1-1)、RM7653(qSTYL5-2)、RM404(qSTYL8-1)；柱头宽度，RM403(qSTGB1-1)、RM3525(qSTGB3-1)；和雌蕊长度，RM3604(qPSTL1-1)；RM3640(qPSTL1-3)；以及RM5997(qPSTL11-1)。
根据本发明的一些实施方式，与柱头长度相关的QTL的至少一种标记选自PA08-03、RM7356、PA08-17和PA08-18。
根据本发明的一些实施方式，包含与柱头长度相关的QTL的基因渗入位于标记PA08-03至RM7356或者PA08-17至PA08-18之间。
根据本发明的一些实施方式，所述水稻植物属于选自IR68897A、IR58025A、IR127841A和IR127842A的系。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了具有所述水稻植物作为亲代(亲本，parent)或原种(ancestor)的杂交水稻植物。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了包含所述水稻植物的DNA的加工产品。
根据本发明的一些实施方式，所述加工产品选自食品、饲料、建筑材料和纸制品。
根据本发明的一些实施方式，所述加工产品为粉状物(食物，meal)。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了所述水稻植物的胚珠(ovule)。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了从所述水稻植物产生的原生质体。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了从来自所述水稻植物的原生质体或细胞产生的组织培养物(组织培养，tissue culture)，其中所述组织培养物的原生质体或细胞是从选自下列的植物部分中产生的：叶；花粉；胚；子叶；下胚轴(hypocotyl)；分生组织细胞；根；根尖；雌蕊；花药；花；茎；颖(glume)；和穗(panicle)。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了从所述组织培养物再生的水稻植物，其中所述水稻植物是具有所述水稻植物的全部形态学和生理学特征的细胞质雄性不育水稻植物。
根据本发明的一些实施方式，通过检测与柱头长度相关和/或与总柱头和花柱长度(柱头和花柱总长度，total stigma and style length)相关的至少一个长雄野生稻数量性状基因座的至少一种标记，在所述水稻植物中检测长雄野生稻的长柱头性状。
根据本发明的一些实施方式，与柱头长度相关的至少一个长雄野生稻数量性状基因座的至少一种标记选自：RM110(qSTGL2-1)、RM421(qSTGL5-1)、RM7356(qSTGL8-1)、RM5353(qSTGL8-1)、RM256(qSTGL8-2)、RM80(qSTGL8-2)、RM590(qSTGL11-1)、RM286(qSTGL11-1)、RM120(qSTGL11-2)和RM229(qSTGL11-2)。
根据本发明的一些实施方式，与总柱头和花柱长度相关的至少一个长雄野生稻数量性状基因座选自：qPSTL1-1、qPSTL1-3和qPSTL11-1。
根据本发明的一些实施方式，与总柱头和花柱长度相关的至少一个长雄野生稻数量性状基因座的至少一种标记选自：RM3604(qPSTL1-1)；RM3746(qPSTL1-1)；RM3640(qPSTL1-3)；RM8134(qPSTL1-3)；和RM5997(qPSTL11-1)；RM254(qPSTL11-1)。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了生产包含长雄野生稻的长柱头性状的细胞质雄性不育水稻植物的方法，所述方法包括将稳定细胞质雄性不育系与适合的保持系的水稻植物杂交，其中所述适合的保持系是与所述细胞质雄性不育系互补(complementary)的可育水稻系(能育水稻系，fertile rice line)，并且其中所述保持系的水稻植物包含含有与柱头长度相关的至少一个长雄野生稻数量性状基因座(QTL)的基因渗入，所述数量性状基因座选自：qSTGL8-1和qSTGL8-2。
根据本发明的一些实施方式，通过以下方法将长雄野生稻的长柱头性状基因渗入到所述保持系的水稻植物中，所述方法包括以下步骤：
将所述保持系的水稻植物与长雄野生稻的水稻植物杂交以产生一个或多个F1子代水稻植物；
将F1子代水稻植物与所述保持系的水稻植物回交以产生一个或多个BC1F1子代水稻植物，并且选择一个或多个可育BC1F1植物，相对于所述保持系的水稻植物提高柱头长度；
将步骤b)所选的子代与所述保持系的水稻植物回交；
选择从步骤c)的回交产生的具有除柱头长度提高外的所述保持系的全部生理学和形态学特征的一个或多个可育子代水稻植物；和
将步骤d)中所选的一个或多个水稻植物杂交(intercross)或自交一次或多次以生产F2或更晚世代(后代，later generation)的一个或多个子代水稻植物。
根据本发明的一些实施方式，执行步骤c)1至5次以产生BC2F1至BC6F1子代水稻植物。
根据本发明的一些实施方式，所述保持系具有种质登录号IRGC110404。
根据本发明的一些实施方式，通过胚拯救(胚挽救，embryo rescue)在步骤a)、b)和c)产生子代水稻植物。
根据本发明的一些实施方式，所述方法还包括以下步骤：
选择通过如本文所述的方法产生的相对于未基因渗入长雄野生稻的长柱头性状的所述保持系的水稻植物柱头长度提高的一个或多个可育子代水稻植物；
将步骤a)中选择的所述一个或多个子代水稻植物与来自稳定细胞质雄性不育系的水稻植物回交；
选择从步骤b)的回交产生的具有除柱头长度提高外的所述细胞质雄性不育系的全部生理学和形态学特征的一个或多个可育子代水稻植物；
将步骤c)中选择的所述一个或多个子代水稻植物与来自如本文所述的稳定细胞质雄性不育系的水稻植物回交；和
选择通过步骤d)的回交产生的具有完全雄性不育性(complete male sterility)和除柱头长度提高外的所述细胞质雄性不育系的全部生理学和形态学特征的一个或多个子代水稻植物。
根据本发明的一些实施方式，当柱头长度比未基因渗入长雄野生稻的长柱头性状的保持系的水稻植物的柱头长度大至少30％、大至少40％、大至少50％或大至少60％时，选择提高的柱头长度。
根据本发明的一些实施方式，所述方法还包括在子代水稻植物中检测与柱头长度相关的和/或与总柱头和花柱长度相关的至少一个长雄野生稻数量性状基因座的至少一种标记。
根据本发明的一些实施方式，与柱头长度相关的至少一个长雄野生稻数量性状基因座选自：qSTGL8-1和qSTGL8-2。
根据本发明的一些实施方式，与柱头长度相关的QTL的至少一种标记选自PA08-03、RM7356、PX08-17和PA08-18。
根据本发明的一些实施方式；与总柱头和花柱长度相关的至少一个长雄野生稻数量性状基因座选自：qPSTL1-1；qPSTL1-3和qPSTL11-1。
根据本发明的一些实施方式，与总柱头和花柱长度相关的至少一个长雄野生稻数量性状基因座的至少一种标记选自：RM3604(qPSTL1-1)；RM3746(qPSTL1-1)；RM3640(qPSTL1-3)；RM8134(qPSTL1-3)；和RM5997(qPSTL11-1)；RM254(qPSTL11-1)。
根据本发明的一些实施方式，所述稳定的细胞质雄性不育系是系IR58025A，并且适合的保持系是IR58025B。
根据本发明的一些实施方式，所述稳定的细胞质雄性不育系是系IR68897A，并且适合的保持系是IR68897B。
根据本发明的一些实施方式，所述稳定的细胞质雄性不育系是系IR127841A，并且适合的保持系是IR127841B。
根据本发明的一些实施方式，所述稳定的细胞质雄性不育系是系IR127842A，并且适合的保持系是IR127842B。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了如本文所述产生的植物或植物部分。
根据本发明的一些实施方式，所述植物部分为种子。
根据本发明的一些实施方式，相对于不包含长雄野生稻的长柱头性状的细胞质雄性不育水稻植物，包含长雄野生稻的长柱头性状的细胞质雄性不育水稻植物的异交率提高。
根据本发明的一些实施方式，提高的异交率表示为种子结籽率(seed set)的最大百分比的提高。
根据本发明的一些实施方式，种子结籽率的最大百分比的提高选自：2.5倍提高；5倍提高；10倍提高；15倍提高；20倍提高；25倍提高；30倍提高；35倍提高；40倍提高；45倍提高；50倍提高；55倍提高；60倍提高；65倍提高；70倍提高；75倍提高；80倍提高和85倍提高。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了提高水稻植物中杂交种子结籽率的方法，包括：
提供包含长雄野生稻的长柱头性状的细胞质雄性不育水稻植物；
用适合的水稻恢复系的花粉对包含长雄野生稻的长柱头性状的细胞质雄性不育水稻植物授粉；和
相对于不具有长雄野生稻的长柱头性状的细胞质雄性不育水稻植物，提高包含长雄野生稻的长柱头性状的细胞质雄性不育水稻植物上的杂交水稻种子结籽率。
根据本发明的一些实施方式，所述适合的水稻恢复系是能够对包含长雄野生稻的长柱头性状的细胞质雄性不育水稻植物授粉以产生可育杂交种子的任何水稻系。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了产生杂交水稻种子的方法，其包括：
实施如本文所述的方法；和
收集包含长雄野生稻的长柱头性状的细胞质雄性不育水稻植物上的杂交水稻种子结籽。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了从如本文所述收集的种子生长的杂交水稻植物。
根据本发明的一些实施方式，所述杂交水稻植物相对于其亲代植物，在至少一种有经济价值的农艺学性状中优于其亲代。
根据本发明的一些实施方式，在至少一种有经济价值的农艺学性状中的更优性能(outperformance)：更高的产量；更高的均一性；更高的抗病水平；更高的抗虫水平；和提高的抗旱性。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了产生稻米粉状物(rice meal)的方法，所述方法包括：
(a)种植和采集所述杂交水稻植物的种子；和
(b)将所述种子加工成粉状物(食物，meal)。
在本文所述的其它实施方式中，当柱头长度比未基因渗入长雄野生稻的长柱头性状的保持系的水稻植物的柱头长度大至少30％、大至少40％、大至少50％或大至少60％时，选择提高的柱头长度。
在本文所述的另一个实施方式中，所述稳定的细胞质雄性不育系是系IR58025A，并且适合的保持系是IR58025B。在另一个实施方式中，所述稳定的细胞质雄性不育系是系IR68897A，并且适合的保持系是IR68897B。
在另一个具体的实施方式中，本文描述了通过本文所述方法中的任一种所产生的植物或植物部分。在一个实施方式中，所述植物部分是种子。
在另一个实施方式中，相对于不包含长雄野生稻的长柱头性状的细胞质雄性不育水稻植物，包含长雄野生稻的长柱头性状的细胞质雄性不育水稻植物的异交率提高。提高的异交率可以表示为种子结籽率的最大百分比的提高。在某些实施方式中，种子结籽率的最大百分比的提高选自：2.5倍提高；5倍提高；10倍提高；15倍提高；20倍提高；25倍提高；30倍提高；35倍提高；40倍提高；45倍提高；50倍提高；55倍提高；60倍提高；65倍提高；70倍提高；75倍提高；80倍提高和85倍提高。
在具体的实施方式中，本文描述了提高水稻植物中杂交种子结籽率的方法，其包括：a)提供包含长雄野生稻的长柱头性状的细胞质雄性不育水稻植物；b)用适合的水稻恢复系的花粉对包含长雄野生稻的长柱头性状的细胞质雄性不育水稻植物授粉；和c)相对于不具有长雄野生稻的长柱头性状的细胞质雄性不育水稻植物，提高包含长雄野生稻的长柱头性状的细胞质雄性不育水稻植物上的杂交水稻种子结籽率。在某些实施方式中，所述适合的水稻恢复系是能够对包含长雄野生稻的长柱头性状的细胞质雄性不育水稻植物授粉以产生可育杂交种子的任何水稻系。
在另一个具体实施方式中，本文描述了产生杂交水稻种子的方法，其包括：a)实施用于提高水稻植物中杂交种子结籽率的方法；和b)收集包含长雄野生稻的长柱头性状的细胞质雄性不育水稻植物上的杂交水稻种子结籽。在另一个具体的实施方式中，是从所收集的种子种植的杂交水稻植物。
在某些实施方式中，所述杂交水稻植物相对于其亲代植物，在至少一种有经济价值的农艺学性状中优于其亲代。所述至少一种有经济价值的农艺学性状可以选自：更高的产量；更高的均一性；更高的抗病水平；更高的抗虫水平；和提高的抗旱性。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员一般所理解的相同的含义。尽管可以在本发明的实施方式的实践或测试中使用与本文所述那些相似或等同的方法和材料，但是以下描述了示例性方法和/或材料。在矛盾的情况下，将以专利说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的并且不意欲进行必要的限制。
附图说明
仅通过举例的方式，参考附图在本文中说明了本发明的一些实施方式。现在具体参考附图，强调指出通过举例说明并且出于对本发明实施方式说明性讨论的目的，示出特别之处。在此方面，对于本领域技术人员来说，与附图一起的说明使得可以如何实践本发明的实施方式变得显而易见。
在附图中：
图1：显示发展基因渗入长雄野生稻的长柱头性状的细胞质雄性不育(CMS)水稻系的育种策略的示意图。顶部部分A)发展具有长柱头的保持系。底部部分B)发展具有长柱头的cMS系。*：实施胚拯救。
图2：从对照CMS系IR68897A和IR58025A(未基因渗入长柱头性状)和基因渗入长柱头性状的测试CMS系产生杂交种子的实验设计。用于所有所测试的CMS系的恢复系(授粉者)为IR71604-4-1-4-4-4-2-2-2R。
图3：显示IR68897A，转化的A系(基因渗入来自长雄野生稻的长柱头性状)和长雄野生稻中柱头长度和伸出(exsertion)的差异度的照片。
图4：显示对照CMS系IR68897和基因渗入(转化)有来自长雄野生稻的长柱头性状的A系(OCF15-107-9)中柱头长度提高的照片。IR68897A：柱头长度＝2.43±0.14mm；柱头绒毛(stigma brush)＝1.58±0.12mm。OCF15-107-9：柱头长度＝3.33±0.14*；柱头绒毛＝2.54±0.12*。*：平均值显著高于IR68897A，P<0.05。比例尺＝2.0mm
图5：显示来源于长雄野生稻和对照CMS系(IR68897A)的转化的A系中柱头长度和宽度的表。*：平均值(mm)显著高于IR68897A，P<0.05。
图6A：显示来源于长雄野生稻和对照CMS系(IR68897A)的转化的A系的活力的表。
图6B：显示来源于长雄野生稻和对照CMS系(IR68897A)的转化的A系的活力的柱状图。
图7：显示对照CMS系IR68897A中的不育性以及转化系OCF15-107-3的两种植物以及转化系OCF15-107-9的一种植物中种子结籽率的照片和表格。
图8：显示来源于长雄野生稻和对照CMS系(IR68897A)的多个转化的A系中柱头绒毛长度(mm)、柱头非绒毛长度(stigma non-brush length)(mm)、柱头总绒毛长度(stigmatotal brush length)(mm)、柱头宽度(mm)和最大种子结籽率(％)的表。突出显示的最大种子结籽率值表示在转化的A系中观察到的最小(63.5％)和最大(80.5％)种子结籽率值。
图9A：显示通过复合区间作图法(composite interval mapping)对柱头长度鉴别的主效QTL(major QTL)(QSTGL2-1、QSTGL5-1、QSTGL8-1、QSTGL8-2、QSTGL11-1和QSTGL11-2)的连锁图的图。
图9B：显示为改善异交对除柱头长度外的其它花性状鉴别的主效QTL的连锁图的图。
图9C qSTGL8.0的精细作图(精细定位，fine mapping)。精细作图的假定qSTGL8.0显示出两个亚QTL，第一个位于长雄野生稻来源的标记PA08-03和RM 7356(qSTGL8.1)之间，而另一个位点在PA08-17和PA08-18标记之间(qSTGL8.2)。
图9D qSTGL8.0的物理作图(定位，mapping)。基于通过使用最新设计的InDel标记分析出的来自IR-64×长雄野生稻的357个BC2F2分离子，在SSR标记RM1109和RM256之间观察的qSTGL8.0。括号内的数字表示各个标记的重组体个数。
图9E位于PA08-03和RM356以及PA08-18和PA08-19标记之间的两个假定位点区域。
图9F显示靠近qSTGL8.0的SSR和最新设计的InDel标记的共分离(co-segregation)型式百分比的柱状图。X轴表示靠近qSTGL8.0的InDel和SSR标记，Y轴表示共分离百分比。每个数据点的值表示各个标记的共分离百分比。深绿色条棒的柱状图表示最高的共分离标记PA08-18，百分比为75％。
图9G显示预测连锁至qSTGL8.2的PA08-18新InDel长雄野生稻来源的标记的BC2F3共分离型式的琼脂糖(3％)凝胶图像。对于基因型得分评价，标记等位基因对IR-64等位基因评分为“A”；对长雄野生稻(O.L)等位基因为“B”并且对IR-64和长雄野生稻的杂合性等位基因为“H”。低于基因型得分的表型代表各个BC2F3个体的柱头长度表型。
图9H显示IR68897B来源的改善的CMS系IR127841A(OCF15-107-1-9)的图形基因型的表型图。每个染色体下方的数字表示各自染色体的数目，蓝色线表示回交亲本的等位基因，红色线表示供方亲本的等位基因，并且空白空间表示在各个位置不存在SNP。
图10：稻属物种以及相关禾本物种的雌蕊照片。A)亚洲稻(O.sativa)，B)尼瓦拉野生稻(O.nivara)，C)普通野生稻(O.rufipogon)，D)非洲栽培水稻(O.glaberrima)，E)短舌野生稻(O.barthii)，F)长雄野生稻，G)南方野生稻(O.meridionalis)，H)展颖野生稻(O.glumaepatula)，I)斑点野生稻(O.punctata)，J)小粒野生稻(O.minuta)，K)药用稻(O.officinalis)，L)根茎野生稻(O.rhizomatis)，M)紧穗野生稻(O.eichingeri)，N)阔叶野生稻(O.latifolia)，O)高秆野生稻(O.alta)，P)大颖野生稻(O.grandiglumis)，Q)澳洲稻(O.australiensis)，R)短花药野生稻(O.brachyantha)，S)颗粒野生稻(O.granulata)，T)疣粒野生稻(O.meyeriana)，U)马来野生稻(O.ridleyi)，V)长护颖野生稻(O.longiglumis)，W)O.coarctata，X)锥粒野生稻(Rhychoryza subulata)，Y)Leersiaperrieri。
图11：显示IR68897B、IR68897B_改善(转化)和IR68897A测交子代的柱头伸出的照片。
图12：显示典型的长雄野生稻雌性繁殖器官雌蕊的不同部分的示意图。
具体实施方式
在其一些实施方式中，本发明涉及具有改善的异交率的水稻植物，具体地，本发明的实施方式涉及具有改善的异交率的细胞质雄性不育水稻植物及其在杂交水稻生产中的应用。
在详细解释本发明的至少一种实施方式之前，应理解本发明不必需将其应用限于以下说明中所述或通过实施例举例说明的细节。本发明能够有其它实施方式或者能够以多种方式实践或实施。
定义
为了使本发明可以更容易理解，首先定义了某些术语。
如本文所使用的，术语“植物”是指完整植物、其器官(即叶、茎、根、花等)、种子、植物细胞和它们的子代。术语“植物细胞”包括但不限于种子、混悬培养、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子内的细胞。根据具体的实施方式，所述植物是植物系。
根据具体的实施方式，所述植物系是优良系(elite line)。短语“植物部分”是指植物的一部分，其包括单个细胞和细胞组织，如在植物中完整的植物细胞、细胞块(cellclump)和从中可以再生出植物的组织培养物。植物部分的实例包括(但不限于)来自花粉、胚珠、叶、胚、根、根尖、花药、花、果实、茎、芽和种子的单个细胞和组织；以及幼枝、根茎(rootstock)、原生质体、愈伤组织等。根据具体的实施方式，所述植物部分包含赋予来自长雄野生稻的长柱头的核酸序列。根据具体的实施方式，所述植物部分是种子。根据具体的实施方式，所述植物部分是杂交种子。
如本文所使用的，短语“子代植物”是指作为子代从一个或多个亲本植物的无性或有性生殖产生的任何植物或其后代。例如，可以通过亲本植物的克隆或自交或者通过两个亲本植物的杂交获得子代植物，并且所述子代植物包括自交(selfings)以及F1或F2或者更进一步的代。F1是从其中至少一个首次作为性状供体的亲本产生的第一代子代，而第二代子代(F2)或者后代(F3、F4等)是从F1、F2等的自交、杂交(intercross)、回交或其它杂交产生的样本。因此，F1可以是(并且在一些实施方式中是)从两个不分离系(真实遗传，truebreeding)亲本(即不分离系亲本对所关心的性状或其等位基因分别是纯合的，例如，在这种情况下，如本文所述具有长柱头的雄性不育系和恢复系)之间的杂交产生的杂种，而F2可以是(并且在一些实施方式中是)通过F1代杂种的自花受粉产生的子代。
如本文所使用的，术语“栽培水稻植物”是指具有二倍体基因组，2n＝24(AA基因组)的栽培禾本物种。驯化的稻属物种的实例包括(但不限于)亚洲稻(Oryza sativa)(亚洲稻(Asian rice))或光稃稻(Oryza glaberrima)(非洲稻)。该术语可以与术语水稻互换。
根据示例性实施方式，在本文中所考虑的驯化的水稻品种是指长粒、短粒、白色、棕色、红色和黑色。
主要有三种亚洲稻(Oryza sativa)品种：
籼稻：籼稻品种是长粒的，例如印度香米，其主要种植在印度次大陆。
粳稻：粳稻是短粒的并且支链淀粉含量高(因此，烹饪时会变“粘”)，并且主要种植在更温和或更冷的区域，如日本。
爪哇稻(Javanica)：爪哇稻是宽粒的并且种植在热带气候。
其它主要品种包括香稻(Aromatic)和糯米(Glutinos)。
根据具体的实施方式，本文考虑的水稻品种是籼稻。
根据具体的实施方式，本文考虑的水稻品种是粳稻。
根据具体的实施方式，本文考虑的水稻品种是印度香稻。
在每个品种内，还有多个栽培种，每个有利于特定目的或区域。可以使用驯化水稻，例如，亚洲稻(Oryza sativa)的任何遗传背景。根据本发明的教导内容可以使用的其它品种和种质选自：IR64；日本晴(Nipponbare)；PM-36、PS 36、Lemont、γS 27、ArkansasFortuna、Sri Kuning、IR36、IR72、Gaisen Ibaraki 2、Ashoka 228、IR74、NERICA 4、PS 12、Bala、Moroberekan、IR42、Akihikari、日本晴、IR20、IR56、IR66、NSIC Rc158、NSIC Rc222和NSIC Rc238。
在本发明的上下文中，术语“杂交的”或“杂交”表示通过授粉的配子融合以产生子代(即，细胞、种子或植物)。该术语涵盖了有性杂交(通过另一个植物对一个植物授粉)和自交(自花受粉，即当花粉和胚珠来自相同植物或者来自基因上相同的植物)两者。
“回交”是其中育种者将杂交子代反复与亲代之一杂交的过程，例如，将第一代杂种F1与F1杂种的亲代基因型之一杂交。所述杂种回交的亲代是“回交亲代(轮回亲本，recurrent parent)”。
标记辅助选择可以用于扩大或替换表型选择(如通过使用染色体8的分子标记)。
不考虑选择方法，在性状选择和回交后，回交亲本的驯化水稻植物的基因组恢复到至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％或至少98％。也就是说，本发明所述的植物的基因组是回交亲本，例如，亚洲稻(Oryza sativa)的基因组的至少85％，例如，85-99.9％。
还提供了这些方法，其中回交(轮回，recurrent)水稻植物的基因组(例如，亚洲稻(Oryza sativa))的恢复在92％至97％之间。
与自花受粉(即自交)相反，如本文所使用的，“异交”和“异交的”是指与具有不同基因组成的植物的异花授粉。优选地，两种植物是相同种类的，例如，水稻，例如，栽培水稻，例如，相同亚种的亚洲稻(O.sativa)，例如，粳稻、籼稻等。
“异交率”是指特定植物授粉或被另一个植物授粉的比率。这与自花授粉相对。
“改善的异交率”或“提高的异交率”是指与相同遗传背景的未转化的植物相比，异交率提高至少50％、60％、70％、80％、90％、100％，或甚至120％、130％、150％、200％、250％、300％或甚至更大。表3中提供了示例性实施方式，其中至少2.3倍的提高是明显的。
因此，根据本发明的一些实施方式，本发明所述的水稻植物具有与未转化的植物相比大于100％的异交率。
如本文所使用的，术语“杂种优势”是指杂种优势或远交(outbreeding)增强，它是杂种后代中任何生物学特性的改善或提高的功能。如果由于混合其亲代的遗传贡献而提高了其性状，则后代显示出杂种优势。
根据具体的实施方式，提高的异交率表现为最大种子结籽率百分比(最大结籽率百分比，maximum percent of seed set)的提高，其可以选自：1.5倍提高；2倍提高；2.5倍提高；5倍提高；10倍提高；15倍提高；20倍提高；25倍提高；30倍提高；35倍提高；40倍提高；45倍提高；50倍提高；55倍提高；60倍提高；65倍提高；70倍提高；75倍提高；80倍提高和85倍提高。
“产量”描述了植物、植物组群或植物作物生产的谷粒(粮食，grain)量。可以通过多种方式测量产量，例如，t ha-1，和每株植物的平均谷粒产量(grain yield)(以克为单位)。
术语“数量性状基因座”或“QTL”是指具有至少两个反映连续分布的表型性状的差异表达的等位基因的多态性遗传基因座。
如本文所使用的，“基因渗入”表示由于育种方法(例如，异交)，来自一个植物品种的一个或多个基因或者一组基因向另一个的基因复合体的移动。基因渗入还指来自一个植物品种的一个或多个基因或者一组基因所编码的性状向另一个的移动。
“转化的”是指已基因渗入了另一个植物的性状的植物。根据一些实施方式，该术语是指基因渗入了长雄野生稻的长柱头性状的植物。所述性状的基因渗入可以通过与所述性状有关的一个或多个QTL的基因渗入造成。例如，“转化的保持系”是基因渗入了长雄野生稻的长柱头性状的保持系。
具有指定植物的“基本上全部生理学和形态学特征”的植物是指除来源于特定转化的基因或基因组的那些特征(例如，长柱头)外，具有相同的一般生理学和形态学特征的植物。在图12中进一步解释了以下定义。
如本文所使用的，“柱头长度”是指由作为雌蕊的雌性繁殖器官的绒毛和非绒毛部分组成的总长度。与柱头长度相关的QTL缩写为“qSTGL”。
如本文所使用的，“柱头面积”是指“柱头的长度和宽度”。与柱头面积有关的QTL缩写为“qSTGA”。
如本文所使用的，“花柱长度”是指二裂柱头的茎(细丝)的长度。与花柱长度相关的QTL缩写为“qSTYL”。
如本文所使用的，“柱头宽度”是指从柱头(绒毛)部分的一侧至另一侧的距离或量度。与柱头宽度有关的QTL缩写为“qSTGB”。
如本文所使用的，可互换使用的“雌蕊长度”或“总雌蕊长度”是指总柱头长度和花柱长度。尽管词语雌蕊包括子房、花柱和柱头，但是子房长度在正常系和转化系之间无显著不同。因此，将总柱头和花柱长度作为雌蕊长度。与雌蕊长度相关的QTL缩写为“qPSTL”。
在本发明的上下文中，术语“与……有关的”或者“有关的”是指(例如)处于连锁不平衡的QTL和表型性状(例如，长柱头)，即，与核酸和表型如果独立分离的情况相比，更经常在子代植物中一起发现QTL和该性状。
术语“标记”或者“分子标记”或者“遗传标记”是指鉴别遗传学上连锁的位点，如QTL时，用作参考点的基因位点(“标记位点”)。
“探针”是其上连接了常规可检测标记物或报告分子，例如，放射性同位素、配体、化学发光试剂或酶的分离的核酸。无论来自水稻植物还是来自包含来自所述水稻植物的DNA的样品(例如，粉状物(meal))，这种探针与靶标核酸链互补，就本发明来说，与来自长雄野生稻的长柱头基因渗入的基因组DNA链互补。根据本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，而且还包括特异性结合至靶标DNA序列并且可以用于检测该靶标DNA序列的存在的聚酰胺及其它探针材料。
“引物”是通过核酸杂交退火至互补靶标DNA链，从而在所述引物和该靶标DNA链之间形成杂交，然后通过聚合酶，例如，DNA聚合酶沿该靶标DNA链延伸的分离的核酸。本发明的引物对是指它们(例如)通过聚合酶链反应(PCR)或其它常规核酸扩增方法用于靶标核酸序列扩增的应用。
探针和引物的长度通常为11个核苷酸或更多，优选地18个核苷酸或更多，更优选地24个核苷酸或更多，并且最优选地30个核苷酸或更多。这些探针和引物在高严格性杂交条件下特异性杂交至靶标序列。根据一些实施方式，根据本发明的探针和引物与该靶标序列具有完全序列相似性，尽管通过常规方法可以设计不同于该靶标序列并且保留了杂交至靶标序列的能力的探针。
在以下文献中描述了制备和使用探针和引物的方法，例如，在MolecularCloning:A Laboratory Manual，第2版，1-3卷，Sambrook等人主编,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989(在下文中称为“Sambrook等人,1989”)；Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等人主编,GreenePublishing and Wiley-Interscience,New York,1992(定期更新)(在下文中称为“Ausubel等人,1992”)；和Innis等人,PCR Protocols:A Guide to Methods andApplications,Academic Press:San Diego,1990。PCR-引物对可以来源于已知序列，例如，通过使用设计用于该目的的计算机程序，如Primer(0.5版,.COPYRGT.1991,WhiteheadInstitute for Biomedical Research,Cambridge,Mass.)。
术语“对(靶标序列)特异的”表示在严格杂交条件下，探针或引物仅杂交至包含该靶标序列的样品中的该靶标序列。
如本文所使用的，“扩增的DNA”或“扩增子”是指作为核酸模板的一部分的靶标核酸序列的核酸扩增产物。
一般说明
杂种优势是其中来源于不同亲本的F1杂种通过显示出更高的产量、更高的均一性、更高的抗病水平、更高的抗虫水平、提高的活力、每穗更高的小穗(颖花，spikelet)数、更高的有效分蘖数(生产分蘖数，productive tillers)等所显示出的优于它们亲代的优势的现象。杂种优势仅表现在第一代中。并且由于它们相对于非杂种更好的种子质量，农民往往对杂种使用低于常规品种的播种量，因此每一季都必需购买新的种子。杂交种子的额外费用，特别是产生水稻杂交种子的难度常常使农民无法获得种子。
通过利用杂种优势的现象发展了杂交水稻。作为严格自花受粉的作物，水稻需要使用雄性不育体系来发展商品化的水稻杂种。雄性不育(遗传或非遗传)使植物的花粉无活力，从而水稻的小穗不能通过自交结出种子。将雄性不育系用作母本，并在隔离区中紧邻花粉亲本种植，从而产生大量由花粉亲本的异花授粉所产生的杂交种子。所述雄性不育植物上的种子结籽是用于种植商品化杂交作物的杂交种子。
杂交水稻育种的三系法是基于细胞质雄性不育(CMS)和可育恢复系统并且包括三个系：CMS系(A系)；保持系(B系)和恢复系(授粉者；R系)。
通过细胞质和核基因中存在的遗传因子S的相互作用控制雄性不育。雄性不育因子S位于线粒体DNA。当细胞质中的雄性不育-控制因子S和可育恢复基因的隐性等位基因(rf)存在于核中时，A系是雄性不育的。保持系(B系)对CMS系是异细胞质的，这是因为对于核基因，它与之类似，但是在细胞质遗传因子(N)方面不同，这使其是自体能育的，但是当与之杂交时，它具有维持A系可育的能力。恢复系或R系具有显性可育恢复基因(Rf)，并且它与A系不相似或不同。将作为花粉亲本的恢复系与作为母本的CMS(A)系杂交恢复了所得的F1杂种的可育性，从而允许从杂交种子种植的植物自花授粉和结籽。
使用基于CMS的三系法的杂交种子生产包括两个基本步骤：CMS系的增殖和杂交种子的生产。通过人工异交少量种子或者在大田中通过空间或时间隔离异交产生大量种子，利用其保持系使CMS系增殖。对于CMS系的生产，将其(例如)以6或8行间隔2行保持系的交替方式种植。
由于在A和B系的种植持续期之间通常存在小差异，因此可以调整它们的播种期以实现它们开花的良好同步。使用了一些其它技术(包括(但不限于)旗叶修剪、赤霉酸应用和通过绳牵引或摇晃的辅助授粉)来改善CMS系的异交率和种子产量。
杂交种子的生产包括使用CMS系与所选恢复系(授粉者；R系)，通过将它们以特定的雌性：雄性比在大田中在通过空间或时间隔离的条件下种植(图2)。优选地，使A和R系的播种期交错以实现它们开花的同步。如在维持步骤中，可以通过以下方法提高异交率和杂种结籽，所述方法包括(但不限于)旗叶修剪、赤霉酸应用和通过绳牵引或摇晃的辅助授粉。
雌性种子亲代(CMS系)中异交的程度受花性状，如柱头尺寸(长度和宽度)、花柱长度、柱头伸出和颖开放的角度和持续时间的影响。在稻属(Oryza)的24个种的47个登录号中鉴定了柱头和花柱的长度以及总长(柱头+花柱)(实施例1的表XX)。与其它种相比，长雄野生稻，具有AA基因组的野生种，具有显著长且更宽的柱头、更长的花柱以及更大的总长。因此，将长雄野生稻鉴别为潜在的长柱头性状的供体。
首先，将长雄野生稻(登录号no.110404)与保持系杂交，借此将长且宽的柱头性状基因渗入到所述保持系的一个或多个植物中。可以将任何保持系与长雄野生稻杂交。在具体的实施方式中，将两个常见的籼稻保持系IR58025B和IR68897B与长雄野生稻杂交，借此将长且宽的柱头性状基因渗入到所述保持系的至少一个植物中。在F1、BC1F1、BC2F1和它们的分离世代中选择长且宽柱头的子代。图1(顶部部分)显示了将长雄野生稻的长且宽的柱头性状基因渗入到保持系的一般策略。
在一个实施方式中，将F1子代与所述保持系的水稻植物回交以产生BC1F1代。选择相对于所述保持系的水稻植物具有提高的柱头长度的可育BC1F1用于回交。可以将与回交亲本的回交进行1至5次，从而产生BC2F1至BC6F1子代水稻植物。再次选择可育子代，其中除所期望的提高的柱头长度的性状外，所选植物具有所述保持系的全部生理学和形态学特征。将所选植物杂交或自交以产生F2或之后的世代，其对于长柱头性状是稳定的。本领域那些技术人员将认识到可以对该一般策略进行修改，但仍导致产生转化的保持系。认为这些修改在本发明的范围内。
在某些实施方式中，长雄野生稻和所述保持系之间杂交的子代植物或之后的回交子代是通过胚拯救产生的。
然后，通过将CMS系与相应保持系杂交将长且宽的柱头性状基因渗入到细胞质雄性不育(CMS)系中，其中所述相应的保持系表现出来源于长雄野生稻的长且宽的柱头性状(即转化的)。例如，将CMS系IR58025A与来自与长雄野生稻的杂交的所选IR58025B子代杂交，其中所述所选子代表现出长且宽的柱头性状。将CMS系IR68897A与长且宽柱头-基因渗入的保持系IR68897A杂交。可以类似地将其它CMS系与所选的适当保持系的植物杂交，其中所述所选植物表现出长雄野生稻的长且宽的柱头性状。选择长且宽柱头的CMS×转化的保持系的子代。在某些实施方式中，将具有长柱头的可育F1子代与CMS回交亲本系回交，然后将具有长柱头的可育BC1F1子代与CMS回交亲本回交。选择具有完全雄性不育和长柱头的回交子代。在一些实施方式中，选择具有完全雄性不育和长柱头的回交子代用于产生具有长柱头的稳定CMS系。优选地，通过回交产生稳定的CMS系。图1(底部部分)显示了基因渗入长雄野生稻的长且宽的柱头性状的一般策略，其首先引入到保持系，然后到CMS系。本领域那些技术人员将承认可以对该一般策略进行修改(例如，额外的回交)，但仍导致产生转化的CMS系。认为这些修改在本发明的范围内。
在如上所述的育种方法的某些实施方式中，当柱头长度比未基因渗入长雄野生稻的长柱头性状的保持系的水稻植物的柱头长度大至少30％、大至少40％、大至少50％或大至少60％时，选择提高的柱头长度。在优选的实施方式中，当柱头长度比未基因渗入所述长雄野生稻的长柱头性状的所述保持系的水稻植物的柱头长度大至少50％时，选择提高的柱头长度。
然后，通过包含显性可育恢复基因的恢复系(Rf；图2)对转化的CMS系授粉。可以使用在转化的CMS中能够恢复可育性的任何恢复系。在一个实施方式中，所述恢复系是IR71604-4-4-4-2-2-2R。从所述转化的CMS×恢复系杂交产生的杂交种子在所述转化的CMS系的植物上结籽。然后，收集杂交种子用于未来种植。如实施例和附图所示，与其回交CMS亲本相比，基因渗入长雄野生稻的长且宽的柱头性状的CMS系具有显著更长的柱头绒毛和更大的总柱头长度(图3-5，11)。这种提高的柱头长度导致了改善的柱头活力(图6)和异交率，如通过种子结籽率的显著提高所观察的(图7-8)。例如，对CMS系IR68897A观察到了5-20％的最大种子结籽率百分比。具有比对照更长的柱头的转化的CMS系具有63.5％至80.5％的最大种子结籽率百分比，或种子结籽率百分比提高约3-倍至约16-倍。在具体的实施方式中，最大种子结籽率百分比提高在约2.5-倍至约85-倍的范围内。
在具体的实施方式中，所述转化的CMS系、恢复系或两者包含一种或多种所期望的农艺特征。所期望的农艺特征包括(但不限于)半矮生植物高度、高产量、均一性、细菌性叶枯病(bacterial leaf blight disease)抗性、褐飞虱(brown planthopper pest)抗性和/或耐旱性。在优选的实施方式中，从在本文所述的转化的CMS系上结籽的杂交种子生长而来的水稻在至少一种所期望的农艺特征中优于其亲代。例如，本文所述的杂交种子可以导致更高的产量、更高的均一性、更高的抗病水平、更高的抗虫水平和/或改善的耐旱性。
因此，在本发明的一个方面，提供了包含含有与柱头长度相关的至少一个长雄野生稻数量性状基因座(QTL)的基因渗入的栽培水稻植物，所述栽培水稻植物的异交率为至少60％。
在本发明的一个方面，提供了包含含有与柱头长度相关的至少一个长雄野生稻数量性状基因座(QTL)的基因渗入的栽培水稻植物，所述数量性状基因座选自：qSTGL8-1和qSTGL8-2。
在一个具体的实施方式中，所述水稻植物为细胞质雄性不育系。
在一个具体的实施方式中，所述水稻植物为保持系。
在一个具体的实施方式中，所述水稻植物的异交率为至少60％(或者如本文所述)。
在一个具体的实施方式中，所述水稻植物包含至少一个另外的基因渗入，所述基因渗入包括与柱头长度、柱头面积、花柱长度、柱头宽度或总雌蕊长度相关的至少一个长雄野生稻QTL。
在一个具体的实施方式中，与柱头长度、柱头面积、花柱长度、柱头宽度和雌蕊长度相关的至少一个长雄野生稻QTL选自qSTGL2-1、qSTGL5-1、qSTGL8-1、qSTGL8-2、qSTGL11-1、qSTGL11-2；qSTGA8-2；qSTYL1-1、qSTYL5-2、qSTYL8-1；qSTGB1-1、qSTGB3-1；qPSTL1-1、qPSTL1-3和qPSTL11-1。
在一个具体的实施方式中，所述至少一种另外的QTL的标记选自：柱头长度，RM110(qSTGL2-1)、RM421(qSTGL5-1)、RM7356(qSTGL8-1)、RM5353(qSTGL8-1)、RM256(qSTGL8-2)、RM80(qSTGL8-2)、RM590(qSTGL11-1)、RM286(qSTGL11-1)、RM120(qSTGL11-2)；RM229(qSTGL11-2)；柱头面积，RM80(qSTGA8-2)；花柱长度，RM319(qSTYL1-1)、RM7653(qSTYL5-2)、RM404(qSTYL8-1)；柱头宽度，RM403(qSTGB1-1)、RM3525(qSTGB3-1)；和雌蕊长度，RM3604(qPSTL1-1)；RM3640(qPSTL1-3)；和RM5997(qPSTL11-1)。
在一个具体的实施方式中，与柱头长度相关的QTL的至少一种标记选自PA08-03、RM7356、PA08-17和PA08-18。
在一个具体的实施方式中，包含与柱头长度相关的QTL的基因渗入位于标记PA08-03至RM7356或者PA08-17至PA08-18之间。
在一个具体的实施方式中，所述水稻植物是选自IR68897A、IR58025A、IR127841A和IR127842A的系。
在本发明的一个方面，提供了用如本文所述的具有长柱头的水稻植物作为亲代(亲本)或原种的杂交水稻植物。
在本发明的一个方面，提供了如本文所述从来自具有长柱头的水稻植物的原生质体或细胞产生的组织培养物，其中所述组织培养物的原生质体或细胞是从选自下列的植物部分中产生的：叶；花粉；胚；子叶；下胚轴(hypocotyl)；分生组织细胞；根；根尖；雌蕊；花药；花；茎；颖和穗。
在本发明的一个方面，提供了从所述组织培养物再生的水稻植物，其中所述水稻植物是具有全部形态学和生理学特征的细胞质雄性不育水稻植物。
在一个具体的实施方式中，通过本文所述的方法育种系IR58025A CMS植物以包含长雄野生稻的长柱头性状。转化的CMS系IR58025A的适合的保持系是系IR58025B。在另一个具体的实施方式中，通过本文所述的方法育种系IR68897A CMS植物以包含长雄野生稻的长柱头性状。转化的CMS系IR68897A的适合的保持系是系IR68897B。
在另一个方面，本发明提供了用于在包含长雄野生稻的长柱头性状的CMS植物的组织培养(tissue culture)中使用的可再生细胞。所述组织培养优选地能够再生具有上述水稻植物的生理学和形态学特征的植物并且能够再生具有基本相同的基因型的植物。优选地，这些组织培养中的可再生细胞将从胚、原生质体、分生组织细胞、愈伤组织、花粉、叶、茎、叶柄(petiole)、根、根尖、果实、种子、花、花药、雌蕊等产生。更进一步，本发明提供了从本发明的组织培养物再生的转化的CMS水稻植物。
转化的保持系和CMS系的标记辅助选择
在本文所述的另一个实施方式中，通过标记辅助选择提高了转化的保持系和CMS系的发展。标记辅助选择的基本规程对本领域的普通技术人员来说是熟知的。考虑到本发明公开的益处，包括本文所述的数量性状基因座(QTL)和标记，本领域技术人员将能够如所述的实施本发明。
通过将长雄野生稻与栽培水稻品种(例如，IR64)杂交产生了遗传作图群体(genetic mapping population)。然后，可以通过分子定位(分子作图，molecularmapping)鉴别与控制柱头长度的基因组区域(例如，QTL)有关的标记。然后，将这些标记用于帮助选择成功基因渗入有长雄野生稻的长柱头性状的保持系或CMS系的水稻植物。
将长雄野生稻的单一植物与高产品种IR64杂交，如实施例6所述。图9A和9B中显示了所检测的QTL的连锁图。通过对5种花性状，包括柱头长度(6个QTL)、花柱长度(3个QTL)、柱头宽度(2个QTL)、柱头面积(1个QTL)和总雌蕊长度(3个QTL)复合区间作图，鉴别了总计15个QTL(实施例6的表5)。
标记-辅助选择(MAS)包括用于鉴别和选择含有编码所期望的性状的基因中的一个或多个的那些子代植物的分子标记的一个或多个的应用。在这种情况下，这种鉴别和选择是基于长雄野生稻的长且宽的柱头性状和本发明的QTL或与之相关的标记。通过鉴别具有所关心的QTL的植物，在转化的保持系和/或CMS系的开发期间，可以将MAS用于选择具有所期望的性状的子代植物，从而允许及时且准确的选择。根据该实施方式开发的水稻植物可以有利地从受体植物(即保持系或CMS系植物)获得它们性状的大多数并且从供体植物(长雄野生稻)获得长柱头性状。
在某些实施方式中，在转化的保持系、转化的CMS系或两者的发展期间，(检测)子代植物中的一个或多个标记。转化系中一个或多个标记的检测指示目标性状的基因渗入，其中所述标记连锁至与柱头长度和/或柱头和花柱总长有关的长雄野生稻的QTL。所述QTL可以是与柱头长度和/或柱头和花柱总长有关的表5的那些QTL中的任一个。使用与如表5所提供的给定QTL有关的任何标记检测本发明的QTL。在具体的实施方式中，所检测的QTL为与柱头长度相关的至少一个长雄野生稻数量性状基因座，其选自：qSTGL2-1；qSTGL5-1；qSTGL8-1；qSTGL8-2和qSTGL11-1。与柱头长度相关的至少一个长雄野生稻数量性状基因座的至少一种标记选自：RM110(qSTGL2-1)；RM421(qSTGL5-1)；RM7356(qSTGL8-1)；RM5353(qSTGL8-1)；RM256(qSTGL8-2)；RM80(qSTGL8-2)；RM590(qSTGL11-1)；RM286(qSTGL11-1)；RM120(qSTGL11-2)和RM229(qSTGL11-2)。对其它花性状所检测的QTL是qPSTL1-1；qPSTL1-3；和qPSTL11-1。与总柱头和花柱长度相关的至少一个长雄野生稻数量性状基因座的至少一种标记可以选自：RM3604(qPSTL1-1)；RM3640(qPSTL1-3)；和RM5997(qPSTL11-1)。
根据示例性实施方式，可以使用SEQ ID NO：13、14和9、10(InDel标记，PA08-18或PA08-03)检测qSTGL8-1；qSTGL8-2的基因渗入。
表8中列出了可以用于检测根据本发明的一些实施方式所述的基因渗入的引物，其被认为是总的说明书的一部分。
还考虑了可以诊断本发明所述的基因渗入(来自长雄野生稻(Oryzalogistaminata)的长柱头)的引物、探针、扩增子和/或包含它们的试剂盒。
本发明所述的核酸探针和引物在严格条件下与靶标DNA序列杂交。任何常规核酸杂交或扩增方法可以用于鉴别样品中来自长雄野生稻的长柱头基因渗入的存在。核酸分子或其片段能够在特定情况下特异性杂交至其它核酸分子。如本文所使用的，如果两个分子能够形成反向平行的双链核酸结构，则所述两个核酸分子能够特异地彼此杂交。如果它们显示出完全互补性，则将核酸分子称为是另一个核酸分子的“互补体(互补物，complement)”。如本文所使用的，当分子之一的每个核苷酸与另一个的核苷酸互补，则称分子显示出“完全互补性”。如果在至少常规“低-严格性”条件下，它们可以以足够稳定性彼此杂交以允许它们彼此保持退火，则称这两个分子是“最低限度互补(minimallycomplementary)”。类似地，如果在常规“高-严格性”条件下，它们可以以足够稳定性彼此杂交以允许它们彼此保持退火，则称这些分子是“互补的”。Sambrook等人，1989和Haymes等人在Nucleic Acid Hybridization,A Practical Approach,IRL Press,Washington,D.C.(1985)中描述了常规严格性条件。因此，允许偏离完全互补性，只要这些偏离不会完全妨碍所述分子形成双链结构的能力。为了使核酸分子用作引物或探针，它仅需要在所使用的特定溶剂和盐浓度下在序列中是充分互补的从而能够形成稳定的双链结构即可。
对于使用特定扩增引物对的靶标核酸序列的扩增(例如，通过PCR)，“严格条件”是允许引物对仅杂交至靶标核酸序列(具有相应的野生型序列(或其互补体)的引物将结合到其上)并优选地在DNA热扩增反应中产生独特的扩增产物扩增子的条件。
例如，为了确定从有性杂交产生的水稻植物是否含有来自本发明所述的水稻植物的长雄野生稻的长柱头基因渗入，可以使用包含来源于邻近于插入的异源DNA的插入位点的植物基因组中的侧接序列的引物和来源于插入的异源DNA的第二引物的引物对，对从水稻植物组织样品(例如，具有(例如)杂交植物的如本文所述的长柱头的水稻植物的种子/粉状物(大米粉，meal)/谷粒的胚乳)提取的DNA进行核酸扩增方法，以产生诊断来自长雄野生稻的长柱头基因渗入的存在的扩增子。所述扩增子具有一定长度，并且具有也用于诊断来自长雄野生稻的长柱头基因渗入的序列。所述扩增子的长度可以在所述引物对加一个核苷酸碱基对，优选地加约50个核苷酸碱基对，更优选地加约250个核苷酸碱基对，并且甚至更优选地加约450个核苷酸碱基对的组合长度的范围。作为另外一种选择，引物对可以来源于位于所述插入的DNA两侧的侧接序列，从而产生包含整个插入核苷酸序列的扩增子。来源于植物基因组序列的引物对的成员可以位于距插入的DNA分子一定的距离，该距离可以在1个核苷酸碱基对至约20000个核苷酸碱基对的范围。术语“扩增子”的使用具体地排除了可以在DNA热扩增反应中形成的引物二聚体。
可以通过本领域中已知的多种核酸扩增方法中的任一种来完成核酸扩增，其包括聚合酶链反应(PCR)。在本领域中已知并描述了多种扩增方法，特别是在美国专利No.4,683,195和4,683,202以及在PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Innis等人(主编),Academic Press,San Diego,1990中。已发展了扩增多达22kb的基因组DNA和多达42kb的噬菌体DNA的PCR扩增方法(Cheng等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:5695-5699,1994)。可以在本发明的实践中使用这些方法以及DNA扩增领域中已知的其它方法。可以通过使用来源于本文所提供的序列的引物扩增来自长雄野生稻的长柱头基因渗入的这些序列，然后对PCR扩增子或克隆的DNA进行标准DNA测序，从而验证(并且如有必要进行修正)基因渗入或侧接序列的序列。
可以通过多种技术检测通过这些方法产生的扩增子。一种这样的方法是遗传比特分析(Nikiforov等人，Nucleic Acid Res.22:4167-4175,1994)，其中设计与相邻侧接基因组DNA序列和插入的DNA序列两者重叠的DNA寡核苷酸。将所述寡核苷酸固定在微孔板的孔中。在所关心区域的PCR后(使用插入序列中的一个引物和相邻侧接基因组序列中的一个引物)，可以将单链PCR产物杂交至所述固定的寡核苷酸并用作使用DNA聚合酶和对所期望的下一个碱基特异的标记ddNTP的单一碱基延伸反应的模板。读数可以基于荧光或者ELISA。信号表示由于成功扩增、杂交和单碱基延伸的插入/侧接序列的存在。
另一种方法是焦磷酸测序技术，如Winge(Innov.Pharma.Tech.00:18-24,2000)所述。在该方法中，设计与相邻基因组DNA和插入DNA接点重叠的寡核苷酸。将寡核苷酸杂交至来自所关心区域的单链PCR产物(插入序列中的一个引物和侧接基因组序列中的一个引物)并在存在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、荧光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶、腺苷5'磷酰硫酸和萤光素的情况下培育。单个加入dNTP，并且所述掺入导致产生了所测量的光信号。光信号指示由于成功扩增、杂交和单碱基或多碱基延伸的来自长雄野生稻的长柱头基因渗入的存在。
如Chen等人(Genome Res.9:492-498,1999)所述的荧光偏振是可以用于检测本发明的扩增子的方法。使用该方法，设计了与基因组侧接和插入的DNA接点重叠的寡核苷酸。将所述寡核苷酸杂交至来自所关心区域的单链PCR产物(插入的DNA中的一个引物和侧接基因组DNA序列中的一个引物)并在存在DNA聚合酶和荧光-标记的ddNTP的情况下培育。单碱基延伸导致ddNTP的掺入。掺入可以使用荧光计测量为偏振的变化。偏振的变化表示由于成功扩增、杂交和单碱基延伸的来自长雄野生稻的长柱头基因渗入的存在。
(PE Applied Biosystems,Foster City,Calif.)被描述为检测和定量DNA序列存在的方法并且在生产商所提供的说明书中充分理解。简要地，设计与基因组侧接和插入DNA接点重叠的FRET寡核苷酸探针。在存在热稳定聚合酶和dNTP的情况下，将FRET探针和PCR引物(插入DNA序列中的一个引物和侧接基因组序列中的一个引物)循环。FRET探针的杂交导致从FRET探针上的淬灭部分切割并释放荧光部分。荧光信号表示由于成功扩增和杂交的来自长雄野生稻的长柱头基因渗入的存在。
已描述了分子信标在序列检测中的使用，如Tyangi等人所述(NatureBiotech.14:303-308,1996)。简要地，设计与侧接基因组和插入DNA接点重叠的FRET寡核苷酸探针。FRET探针的独特结构导致它含有使荧光和淬灭部分非常接近的二级结构。在存在热稳定聚合酶和dNTP的情况下，将FRET探针和PCR引物(插入DNA序列中的一个引物和侧接基因组序列中的一个引物)循环。在成功PCR扩增后，FRET探针与靶标序列的杂交导致所述探针二级结构的移除，以及导致产生荧光信号的荧光和淬灭部分的空间分离。荧光信号表示由于成功扩增和杂交的来自长雄野生稻的长柱头基因渗入的存在。
其它所述方法，如微流体(美国专利公开2006068398、美国专利No.6,544,734)提供了分离和扩增DNA样品的方法与装置。使用光学染料检测和定量特异性DNA分子(WO/05017181)。纳米管装置(WO/06024023)包含用于DNA分子检测的电子传感器或者纳米珠结合特异性DNA分子并且可以随后被检测。
使用本文所公开的组合物，提供了DNA检测试剂盒。所述试剂盒用于样品中来自长雄野生稻的长柱头基因渗入的鉴别，并且可以将所述试剂盒至少应用于含有适当的基因渗入DNA的水稻植物的育种方法。所述试剂盒含有与选自如序列表中所示的SEQ ID NO：1-56所示的序列的片段同源或互补的DNA引物和/或探针。这些DNA序列可以在DNA扩增反应中使用或者在DNA杂交方法中作为探针用于检测多核苷酸(其用于样品中靶标DNA存在的诊断)的存在。热扩增反应中预定扩增子的产生诊断(表明，diagnostic)对应于样品中来自长雄野生稻的长柱头基因渗入的DNA的存在。如果选择杂交，则检测到所述探针与所述生物样品的杂交是对样品中来自长雄野生稻的长柱头基因渗入的存在的诊断(指征，diagnostic)。通常，所述样品是水稻或水稻产品或者水稻应用的副产品。
还提供了从本文所述的植物产生的并且优选地含有赋予本文所述的改善的异交率的核酸序列的加工的水稻产品。还提供了加工水稻(例如，例如，从而产生粉状物)或者其它加工产品的方法。
食品特征：
大米淀粉是人类饮食，特别是亚洲人类饮食中主要的碳水化合物来源，并且本发明的谷粒(谷物，grain)以及来源于它的产品可以用于制备食品。人或者动物可以消耗所述食品，例如，在畜牧生产或者在宠物食品中。来源于水稻植物的谷粒可以容易地用于食品加工程序，并因此本发明包括碾磨、磨碎、粗磨、粗碎、辊压、煮熟或煮半熟的谷粒，或者从水稻植物的加工或全粒所获得的产品，包括米粉、礼品(brokers)、米糠和米糠油。所述产品可以是预煮的或速煮的米、速食米、粒状米、糊化米、罐装米或米饭布丁。谷粒或淀粉可以用于生产加工水稻产品，包括面条、米饼、米纸(rice paper)或蛋卷包装纸(egg roll wrapper)，或者发酵产品，如发酵面条或者饮料，如清酒。由此获得的谷粒或淀粉还可以用于(例如)面包、蛋糕、脆饼(cracker)、饼干等，包括将米粉与小麦粉或其它粉、或食品添加剂如增稠剂或粘结剂混合，或者用于制造饮料、面条、意大利面或速食汤。所述水稻产品可以适用于无麦食物。所述谷粒或来源于本发明所述的谷粒的产品可以在早餐谷类食品中使用，如膨化米、米薄片或作为挤出产品使用。
膳食纤维：
在本说明书中，食用纤维是碳水化合物和在健康人小肠中不吸收而是进入大肠的碳水化合物消化产物。这包括抗性淀粉及其它可溶性和不溶性碳水化合物聚合物。它旨在包括通过常驻微生物群落在大肠中至少部分可发酵的碳水化合物部分。
非食品应用：
大米广泛用于非食用行业，包括薄膜、纸张、纺织品、瓦楞纸和粘合剂产业，例如用作胶粘剂(上浆剂，sizing agent)。大米淀粉可以用作葡萄糖浆生产或乙醇产生的底物。
可以使用在本领域中熟知的并且在上文中详细描述的方法进行所述加工产品中DNA的检测。
因此，所述标记可以是与高异交率有关的本文所述的任何位点(例如，表5)。
根据一些示例性实施方式，所述DNA位点是与柱头长度相关的数量性状基因座，其可以选自：qSTGL2-1；qSTGL5-1；qSTGL8-1；qSTGL8-2和qSTGL11-1。与柱头长度相关的至少一个长雄野生稻数量性状基因座的至少一种标记选自：RM110(qSTGL2-1)；RM421(qSTGL5-1)；RM7356(qSTGL8-1)；RM5353(qSTGL8-1)；RM256(qSTGL8-2)；RM80(qSTGL8-2)；RM590(qSTGL11-1)；RM286(qSTGL11-1)；RM120(qSTGL11-2)和RM229(qSTGL11-2)。
在本文所述的另一个实施方式中，与总柱头和花柱长度相关的至少一个长雄野生稻数量性状基因座可以选自：qPSTL1-1；qPSTL1-3；和qPSTL11-1。与总柱头和花柱长度相关的至少一个长雄野生稻数量性状基因座的至少一种标记可以选自：RM3604(qPSTL1-1)；RM3640(qPSTL1-3)；和RM5997(qPSTL11-1)。
如下所示，提供了用于验证长柱头性状的示例性标记：PA08-03(GCTCTCTACATGCCCTCGT；CCGTGTGTTGGTAGGTCAGA)和PA08-18(GATCAATGTTTGGTCACCATCC；GTAGTCTCCTGCAATATCCC，SEQ ID NO：9、10、13和14)。这些是我们通过长雄野生稻和日本晴(O.sativa)之间的基因组序列比较所设计的Indel标记。
预期在根据本发明申请的专利成熟期间，将发展多个相关标记并且术语标记的范围旨在包括所有这些新的先验技术。
如本文所使用的，术语“约”是指±10％。
术语“包含”(“comprises”，“comprising”)、“包括”(“includes”，“including”)、“具有”以及它们的同根词表示“包括但不限于”。
术语“由……组成”表示“包括并且限于”。
术语“基本由……组成”表示所述组合物、方法或结构可能包括其它成分、步骤和/或部分，但是只有在所述其它成分、步骤和/或部分不会实质性改变所主张的组合物、方法或结构的基本和新颖性特征时才包括。
除非在上下文中明确说明，否则如本文所使用的，单数形式的“一个”、“一种”和“所述”包括复数引用。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括它们的混合物。
在本申请通篇中，可以通过范围形式提供本发明的多种实施方式。应理解以范围形式进行说明仅是为了方便和简洁，并不应将其视作对本发明范围刻板的限制。因此，范围的说明应认为具有具体公开的所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，范围的说明(如1至6)应认为具有具体公开的子范围，如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及该范围内的单个数值，例如，1、2、3、4、5和6。不考虑范围的宽度，这都是适用的。
每当在本文中指明数值范围时，它表示在所指明的范围内包括任何引用的数值(分数或整数)。短语第一指明的数值和第二指明的数值“之间的范围”和“从”第一指明的数值“至”第二指明的数值“的范围”在本文中可互换使用，并且表示包括第一和第二指明的数值以及它们之间所有的分数和整数。
如本文所使用的术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、方法、技术和程序，其包括(但不限于)化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的实践人员已知的或者易于根据已知的方式、方法、技术和程序发展出的那些方式、方法、技术和程序。
如本文所使用的，术语“治疗”包括终止、基本抑制、减缓或逆转病况的发展，基本改善病况的临床或美学症状，或者基本防止病况的临床或美学症状的出现。
当参考特定序列表时，这种参考将理解为还涵盖了作为包含微小序列变化的基本对应于其互补序列的序列，所述微小序列变化是由(例如)序列错误、克隆错误或其它变化所造成的，其导致碱基替换、碱基缺失或碱基添加，只要这种变化的频率小于1/50个核苷酸，作为另外一种选择，小于1/100个核苷酸，作为另外一种选择，小于1/200个核苷酸，作为另外一种选择，小于1/500个核苷酸，作为另外一种选择，小于1/1000个核苷酸，作为另外一种选择，小于1/5000个核苷酸，作为另外一种选择，小于1/10000个核苷酸。
应理解，为了清楚起见，在单独的实施方式的背景中描述的本发明的某些特征也可在单一实施方式中组合提供。相反地，为了简便起见，在单一实施方式的背景中描述的本发明的多种特征也可单独提供或者以任何适合的子组合形式提供，或者如果适合可在本发明任何其它所述的实施方式中提供。在多种实施方式的背景中描述的某些特征不应认为是那些实施方式的必要特征，除非在没有那些要素时该实施方式不能实施。
如上文所描述的和如在以下权利要求部分中所主张的本发明的多个实施方式和方面在下列实施例中获得实验支持。
实施例
现在参考以下实施例，并连同上述说明，以非限制的方式描述了本发明的一些实施方式。
在以下实施例中进一步定义了本文所述的材料、方法和实施方式。在本文的实施例中定义了本发明的某些实施方式。应理解，这些实施例尽管显示了本发明的某些实施方式，但仅是通过举例说明的方式提供的。根据本文的讨论和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不背离其精神和范围的情况下，可以对本发明做出多种改变和修改以使其适合于多种应用和情况。
实施例1.稻属物种雌蕊性状的鉴定以鉴别作为转移影响异交的花性状的供体的野生种
为了理解雌蕊性状的差异度，在包括栽培水稻和两个不相关的植物品种的覆盖11个基因组的稻属24个物种的47个登录号中鉴定了柱头长度、柱头宽度、花柱长度和总柱头和花柱长度(表1；图10)。由于从来不在热带条件下开花，因此未收集O.schelcteri的数据。亚洲稻(O.sativa)亚种粳稻的栽培种具有比籼稻栽培种显著更短的柱头、花柱和总长。在具有AA基因组的野生种中，长雄野生稻具有比其它物种显著更长且更宽的柱头、花柱和总长。在基因组复合物(genome complex)水平上，马来野生稻(O.ridleyi)复合物具有比亚洲稻(O.sativa)复合物和药用稻(O.officinalis)复合物显著更长的柱头。疣粒野生稻(O.meyeriana)复合物和马来野生稻(O.ridleyi)复合物的柱头和花柱的总长比亚洲稻(O.sativa)和药用稻(O.officinalis)复合物的柱头和花柱的总长显著更长。总长显示与柱头长度高度正相关。
在栽培种和野生种中，未观察到花柱长度的尺寸变化。在我们的研究中，我们观察到栽培水稻往往具有比一年生野生种(尼瓦拉野生稻(O.nivara)和短舌野生稻(O.barthii))更短的柱头，而一年生野生种的柱头又比多年生的祖代短。在AA基因组野生种中，可以将具有比其余种更长的柱头和花柱长度的长雄野生稻用于将更长且更宽的柱头转移至保持系和CMS系以提高杂交水稻的种子生产。
表1.稻属物种中柱头、花柱以及它们总长的长度特征
实施例2.具有长柱头的IR58025B保持系的发展
在保持系IR58025B和长雄野生稻(登录号110404)之间进行杂交以将长柱头性状转移至IR58025B背景。在BC1F1中，对来自12个杂交的475株BC1F1植物评价了柱头长度，并且选择柱头长度比回交亲本大50％的系并将其回交以产生46个BC2F1杂交种子。在BC2F1中，评价了来自46个杂交的1653株BC2F1植物并与各自回交亲本进行回交以产生34个BC3F1种子。在BC1F2中，评价了944株植物并选择45株具有较长柱头的植物。在BC2F2中，评价了1109株植物并选择98株具有较长柱头的植物。不同回交代中的柱头长度在0.85至2.88mm的范围内，而柱头+花柱长度在2.22-4.57mm的范围内(表2)。
实施例3.具有长柱头的IR68897B保持系的发展
在保持系IR68897B和长雄野生稻(登录号110404)之间进行杂交以将长柱头性状转移至IR68897B背景。将15个F1植物用于产生364株BC1F1植物并评价柱头长度。从这些中，选择29株柱头长度比回交亲本大50％的植物并进一步回交以产生BC2F1种子。此外，评价了825株BC2F1植物并将43株具有长柱头的植物回交以产生BC3F1植物。在BC2F2中，评价了1609株植物并选择109株具有较长柱头的植物。不同回交代中的柱头长度在1.06至3.00mm的范围内，而柱头+花柱长度在2.02-4.51mm的范围内(表2)。已产生了77株IR58025B和IR68897B的BC3F1杂种。在图11中显示了IR68897B、IR68897B改善系和IR68897A测交子代中的柱头伸出。
表2.IR58025B和IR68897B背景中亲代与不同回交子代的柱头特征。
实施例4.IR58025A和IR68897A的雄性不育系的开发
将BC1F2中IR58025B和长雄野生稻之间的杂交的45个回交子代以及具有长柱头的BC2F2代中的36个回交子代与IR58025A测交。在IR68897B回交子代中，将BC1F2中的38株植物和来源于IR68897B和长雄野生稻之间杂交的具有长柱头的BC2F2代中的33株植物与IR68897A测交。开发了具有长柱头的稳定保持系。同时，将更长且更宽的柱头性状基因渗入到各个CMS系。
实施例5：具有长柱头的IR127841B保持系的开发
参照实施例4和图1。
实施例6：具有长柱头的IR127841A雄性不育系的开发
参照实施例4和图1。
实施例7：异交率和杂交种子质量。
我们获得了具有长柱头(如以上实施例5和6所述产生)的新的细胞质雄性不育系(CMS)IR127841A和IR127842A系(两个系均来自于相同的B系)的农艺形态(agro-morphological)性状，并与正常CMS系IR68897A进行比较。据观察所述转化的CMS系的主要农艺形态性状类似于正常CMS系，特别是在株高、分蘖数、穗伸出度和穗长方面，从而表明有效恢复了正常CMS系的表型。所述新的CMS系中的异交率显示比正常CMS系显著提高。与正常CMS系相比，异交率提高了230％-250％(表3)。
表3.转化的CMS系中的农艺形态性状、异交率和杂交种子生产
*p<0.05时显著
我们对来自IR127841A(OCF15-107-1-9A)和IR71604-4-1-4-4-4-2-2-2R之间杂交的新杂种(IR127844H)以及Mestizo 7杂种进行谷粒品质分析。有趣地，该新杂种显示出与Mestizo 7杂种相比类似的直链淀粉含量(24％)和胶稠度的谷粒品质，从而显示了较软且成片的(flaky)煮饭特征。然而，该新杂种显示出与Mestizo 7的低GT相比中等的胶凝温度(GT)，表明水稻品质更好(表4)。
表4.新杂种的比较谷粒品质特征
*IR127844H：IR127841A(转化的CMS系)×IR71604-4-1-4-4-4-2-2-2R
实施例8.使用转化的CMS系对异交率和种子生产的实验。
以两个重复，每个重复18株植物，将用来自于长雄野生稻遗传的长且宽柱头转化的并根据实施例4生产的两个CMS系IR58025A和IR68897A与正常CMS系一起种植。用IR71604-4-1-4-4-4-2-2-2R作为恢复授粉者包围所述转化的CMS系植物和正常的CMS系植物(图2)。所述CMS系植物与所述授粉者同步开花。研究了有关开花持续时间、开颖持续时间、穗伸出度、花粉不育性、柱头长度、柱头宽度和柱头活力的数据。授粉后25天，收获单个CMS系植物的穗，并记录种子结籽率百分比。结果显示出63.5-80.5％范围内的更高的种子结籽率。对照CMS系显示出5-20％范围内的低种子结籽率(图5-8)。
实施例9.IR64/长雄野生稻BC2F2作图群体中影响花性状的QTL的分子定位。
将单一长雄野生稻(登录号110404)植物与高产优良栽培种IR64杂交以产生F1种子。将通过形态学和分子标记确认其杂种性质的F1植物用作母本并回交至IR64以生产267个BC1F1种子。基于它们与IR64的表型相似性，选择BC1F1植物并将其用作母本祖代，并回交至IR64以生产220个BC2F1植物。收集来自于37株BC2F1植物中最优植物的一组357个BC2F2种子以用于花性状的作图。在2012年旱季，在菲律宾洛斯巴诺斯的国际水稻研究所，通过设置两个重复，在完全随机化区组设计中进行实验，并从4200株植物上切下～25,000个小花以收集有关柱头长度、花柱长度、柱头宽度、柱头面积和总长(柱头+花柱)的数据。亲代的平均表现以及群体的最小和最大性状值显示了对所有性状在栽培亲代方向上的越亲分离。大部分性状是正态分布的并且偏向栽培水稻。通过822个SSR和STS标记进行亲代多态性调查，并且发现147个标记在IR64和长雄野生稻之间是多态性的。用147个多态性标记建立连锁图。通过复合区间作图法对包括柱头长度(6)、花柱长度(3)、柱头宽度(2)、柱头面积(1)和总雌蕊长度(3)在内的五个花性状鉴别了总计15个QTL(表5)。
对柱头长度，在标记区间RM7356和RM5353鉴别了主效QTL(主QTL)，即染色体8上的qSTGL8.0，其LOD值为33.0，占总表型变化的25％。在染色体1上的相同标记区间，即RM319和RM3640鉴别了花柱长度的QTL(qSTYL1-1)，其LOD值为9.97，占表型变化的16％。对柱头宽度，在染色体1上鉴别了主效QTL，即qSTGB1-1，其LOD值为14.71，占表型变化的21％。对雌蕊长度，鉴别了染色体11上的基因组区域qPSTL11-1，其LOD值为5.63，占表型变化的27％。
表5.通过初级作图在IR64×长雄野生稻BC2F2作图群体中检测的花性状QTL的列表
实施例11.QTL精细作图
通过赋予长伸出柱头性状的基因组区域的复合区间作图法检测了6个假定的QTL(表6)。
表6.通过复合区间作图法，通过IR64×长雄野生稻BC2F2作图群体的初级作图检测的QTL的列表
Sl.编号 *性状名称 染色体 左侧标记 右侧标记 LOD PVE(％) **Add **Dom
1 STGL 2 RM110 SO2026 4.6 9.0 0.0 0.2
2 STGL 5 RM421 RM7653 5.6 3.0 0.0 0.0
3 STGL 8 RM7356 RM5353 33.0 25.0 -0.1 0.1
4 STGL 8 RM256 RM80 9.4 10.5 -0.1 0.1
5 STGL 11 RM590 RM286 7.4 4.0 0.0 0.1
6 STGL 11 RM120 RM229 5.7 7.0 -0.1 -0.1
在它们当中，发现QTL位点qSTGL8.0是主效QTL，其LOD高达33.0，并且在标记RM7356和RM 5353之间检测到25％的R2，然后是微效QTL RM256和RM80，其LOD为9.4，并且10.5％的R2来自这些标记的381.82cM至396.18cM内的染色体8长臂上的357BC2F2作图群体(图9A和9B)。
将QTL位点qSTGL8.0精细作图以缩小标记和QTL之间的基因距离，从而达到所述标记的高共分离。因此，我们使用了长雄野生稻的高质量全基因组序列信息，其具有从通过SOAPdenovo ver.2.2获得的52.5×覆盖度Illumina HiSeq片段(reads)组装的60,198个架构(scaffolds)，总序列长度为326,442,508bp，并设计了对长雄野生稻特异的新的InDel标记。尽管在RM7356和RM 5353之间的区域检测的主效QTL分别具有381.82cM和396.18cM之间的标记位置，但是我们还是考虑将从RM1109至RM256表达的标记位置分别为362.34cM和400.04cM的微效QTL用于精细作图。将长雄野生稻的高质量全基因组序列与日本晴的参考基因组序列进行比对以鉴别插入缺失序列，从而建立InDel标记。我们从RM1109至RM256建立了21个新的InDel标记，其也覆盖了主效QTL和微效QTL。这21个InDel标记设计具有37kb的最小间隔至655kb的最大间隔。在21个InDel标记中，14个标记在IR64和长雄野生稻之间显示出多态性，通过使用这些新近发展的多态性InDel标记对先前对初级作图使用的357株BC2F2植物再次基因分型并进行用于精细作图的QTL分析。进一步的QTL分析显示存在两个亚QTL：qSTGL8.1和qSTGL8.2，其物理上位于PA08-03和RM7356以及PA08-17和PA08-18之间，大小分别为294kb和171kb。发现这些标记与从长雄野生稻转移的长柱头伸出性状有关。我们对qSTGL8.1的两个侧接标记PA08-03和RM7356鉴别了78个重组体，对qSTGL8.2的侧接标记PA08-17和PA08-18分别鉴别了64和76个重组体。QTL位点qSTGL8.0从约3.89Mb缩小至294kb(qSTGL8.1)和171kb(qSTGL8.2)，从而实现了显著高的标记-性状相关性(图9C和9D、9E)。在两个精细作图的QTL中，与qSTGL8.1相比，qSTGL8.2位点具有高LOD(24.0)和R2(14％)(表7)，表明对长伸出柱头表达的更大贡献机会。
表7.通过复合区间作图法，通过IR64×长雄野生稻BC2F2作图群体的精细作图检测的QTL的列表
Sl.编号 *性状名称 染色体 位置 左侧标记 右侧标记 LOD PVE(％) **Add **Dom
1 STGL 8 283 PA08-03 RM7356 19.0 12.0 0.0 0.2
2 STGL 8 337 PA08-17 PA08-18 24.0 14.0 -0.1 0.0
*STGL：柱头长度
**Add：加性效应；**Dom：显性效应
实施例12.对长伸出柱头的标记验证
将135个BC2F3植物用于标记验证研究。将初级作图的侧接标记(SSR)和精细作图的标记(InDel)的基因型数据以及表型数据(柱头长度)进行比较以计算标记-性状共分离百分比(图9F和表8)。
表8.新设计的长雄野生稻-来源基因特异性InDel标记以及它们的序列和产物大小的列表
McCouch-S-R,Teytelman-L,Xu-Y,Lobos-K-B,Clare-K,Walton-M,Fu-B,Maghirang-R,Li-Z,Xing-Y,Zhang-Q,Kono-I,Yano-M,Fjellstrom-R,DeClerck-G,Schneider-D,Cartinhour-S,Ware-D,Stein-L,"Development and mapping of 2240newSSR markers for rice(Oryza sativa L.)",DNA research:an international journalfor rapid publication of reports on genes and genomes,2002,vol.9,pp.199-207.
InDel标记PA08-18显示出75.0％的最高共分离，并且该标记可以在向杂种亲本系的长柱头性状基因渗入的MAS中有效使用以提高异交率(图9G)。
实施例13.改善的细胞质雄性不育系的背景分析
我们使用Illumina平台的Infinium 6K SNP芯片来分析新改善的CMS系IR127841A(OCF15-107-1-9)中回交亲本IR68897B基因组的恢复。所述改善的CMS系显示出最高的基因组恢复(80.0％)并且具有qSTGL8.0(参与长柱头伸出的主效QTL)(图9H)。
尽管已参考多个且优选的实施方式描述了本发明，但是本领域技术人员应理解在不背离本发明基本范围的情况下，可以进行多种改变，并且等价物可以替代本发明的元素。另外，在不背离其基本范围的情况下，可以做出多种修改，从而使具体情况或材料适合于本发明的教导内容。
因此，本发明旨在不局限于对于实施本发明所考虑的本文公开的具体实施方式，而是本发明将包括落在所附权利要求范围内的所有实施方式。
序列表
<110> 国际水稻研究所（International Rice Research Institute）
克施洛德·杰纳（JENA, Kshirod）
巴拉姆·马拉迪（MARATHI, Balram）
乔伊·拉莫斯（RAMOS, Joie）
雷纳尔多·迪奥克顿四世（DIOCTON IV, Reynaldo）
里基·维纳拉欧（VINARAO, Ricky）
G·D·帕拉哈拉达（PRAHALADA, G.D.）
金中原（KIM, Sung-Ryul）
<120> 通过细胞质雄性不育水稻中更高的异交率提高杂交种子生产以及相关材料和方法
<130> 66431
<150> US 62/171,524
<151> 2015-06-05
<160> 56
<170> PatentIn version 3.5
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Claims (49)

1.一种栽培水稻植物，包含基因渗入，所述基因渗入包括至少一个与柱头长度相关的长雄野生稻(Oryza longistaminata)数量性状基因座(QTL)，所述栽培水稻植物具有至少60％的异交率。
2.一种栽培水稻植物，包含基因渗入，所述基因渗入包括至少一个选自下组的与柱头长度相关的长雄野生稻数量性状基因座(QTL)：qSTGL8-1和qSTGL8-2。
3.根据权利要求1或2所述的水稻植物，是细胞质雄性不育系。
4.根据权利要求1或2所述的水稻植物，是保持系。
5.根据权利要求2或3所述的水稻植物，具有至少60％的异交率。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的水稻植物，包含至少一个另外的基因渗入，所述至少一个另外的基因渗入包括至少一个与柱头长度、柱头面积、花柱长度、柱头宽度或总雌蕊长度相关的长雄野生稻QTL。
7.根据权利要求6所述的水稻植物，其中，所述至少一个与柱头长度、柱头面积、花柱长度、柱头宽度和雌蕊长度相关的长雄野生稻QTL选自下组：qSTGL2-1、qSTGL5-1、qSTGL11-1、qSTGL11-2；qSTGA8-2；qSTYL1-1、qSTYL5-2、qSTYL8-1；qSTGB1-1、qSTGB3-1；qPSTL1-1、qPSTL1-3和qPSTL11-1。
8.根据权利要求7所述的水稻植物，其中，所述至少一个另外的QTL的标记选自下组：柱头长度，RM110(qSTGL2-1)、RM421(qSTGL5-1)、RM7356(qSTGL8-1)、RM5353(qSTGL8-1)、RM256(qSTGL8-2)、RM80(qSTGL8-2)、RM590(qSTGL11-1)、RM286(qSTGL11-1)、RM120(qSTGL11-2)；RM229(qSTGL11-2)；柱头面积，RM80(qSTGA8-2)；花柱长度，RM319(qSTYL1-1)、RM7653(qSTYL5-2)、RM404(qSTYL8-1)；柱头宽度，RM403(qSTGB1-1)、RM3525(qSTGB3-1)；和雌蕊长度，RM3604(qPSTL1-1)；RM3640(qPSTL1-3)；和RM5997(qPSTL11-1)。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的水稻植物，其中，所述与柱头长度相关的QTL的至少一种标记选自下组：PA08-03、RM7356、PA08-17和PA08-18。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的水稻植物，包含与柱头长度相关的QTL的所述基因渗入位于标记PA08-03至RM7356或者PA08-17至PA08-18之间。
11.根据权利要求3所述的水稻植物，属于选自下组的系：IR68897A、IR58025A、IR127841A和IR127842A。
12.一种杂交水稻植物，以权利要求1-11中任一项所述的水稻植物作为亲代或原种。
13.一种加工产品，包含权利要求1-12中任一项所述的水稻植物的DNA。
14.根据权利要求13所述的加工产品，选自下组：食品、饲料、建筑材料和纸制品。
15.根据权利要求13所述的加工产品，是粉状物。
16.权利要求1-12中任一项所述的水稻植物的胚珠。
17.从权利要求1-12中任一项所述的水稻植物产生的原生质体。
18.从来自权利要求1-12中任一项所述的水稻植物的原生质体或细胞产生的组织培养物，其中，所述组织培养物的原生质体或细胞是从选自下组的植物部分产生的：叶；花粉；胚；子叶；下胚轴；分生组织细胞；根；根尖；雌蕊；花药；花；茎；颖；以及穗。
19.从权利要求18所述的组织培养物再生的水稻植物，其中，所述水稻植物是具有权利要求1-12中任一项所述的水稻植物的全部形态学和生理学特征的细胞质雄性不育水稻植物。
20.根据权利要求1-11中任一项所述的水稻植物，其中，通过检测至少一个与柱头长度相关和/或与总柱头和花柱长度相关的长雄野生稻数量性状基因座的至少一种标记，在所述水稻植物中检测长雄野生稻的长柱头性状。
21.根据权利要求20所述的水稻植物，其中，所述至少一个与柱头长度相关的长雄野生稻数量性状基因座的至少一种标记选自下组：RM110(qSTGL2-1)、RM421(qSTGL5-1)、RM7356(qSTGL8-1)、RM5353(qSTGL8-1)、RM256(qSTGL8-2)、RM80(qSTGL8-2)、RM590(qSTGL11-1)、RM286(qSTGL11-1)、RM120(qSTGL11-2)和RM229(qSTGL11-2)。
22.根据权利要求20所述的水稻植物，其中，所述至少一个与总柱头和花柱长度相关的长雄野生稻数量性状基因座选自下组：qPSTL1-1、qPSTL1-3和qPSTL11-1。
23.根据权利要求20所述的水稻植物，其中，所述至少一个与总柱头和花柱长度相关的长雄野生稻数量性状基因座的至少一种标记选自下组：RM3604(qPSTL1-1)；RM3746(qPSTL1-1)；RM3640(qPSTL1-3)；RM8134(qPSTL1-3)；和RM5997(qPSTL11-1)；RM254(qPSTL11-1)。
24.一种产生包含长雄野生稻的长柱头性状的细胞质雄性不育水稻植物的方法，所述方法包括使稳定的细胞质雄性不育系的水稻植物与适合的保持系的水稻植物杂交，其中，所述适合的保持系是与所述细胞质雄性不育系互补的可育水稻系，并且其中，所述保持系的水稻植物包含基因渗入，所述基因渗入包括至少一个选自下组的与柱头长度相关的长雄野生稻数量性状基因座(QTL)：qSTGL8-1和qSTGL8-2。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，通过以下方法将长雄野生稻的长柱头性状基因渗入到所述保持系的水稻植物中，所述方法包括以下步骤：
使所述保持系的水稻植物与长雄野生稻的水稻植物杂交以产生一个或多个F1子代水稻植物；
使F1子代水稻植物与所述保持系的水稻植物回交以产生一个或多个BC1F1子代水稻植物，并且选择一个或多个可育BC1F1植物，相对于所述保持系的水稻植物提高柱头长度；
使步骤b)所选的子代与所述保持系的水稻植物回交；
选择从步骤c)回交产生的除柱头长度提高外具有所述保持系的全部生理学和形态学特征的一个或多个可育子代水稻植物；以及
使步骤d)中所选的一个或多个水稻植物杂交或自交一次或多次，从而产生F2或更晚世代的一个或多个子代水稻植物。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，实施步骤c)1至5次以产生BC2F1至BC6F1子代水稻植物。
27.根据权利要求25所述的方法，其中，所述保持系具有种质登录号IRGC 110404。
28.根据权利要求25或权利要求26所述的方法，其中，通过胚拯救在步骤a)、b)和c)中产生子代水稻植物。
29.根据权利要求24所述的方法，还包括以下步骤：
选择通过权利要求24所述的方法产生的一个或多个可育子代水稻植物，所述一个或多个可育子代水稻植物相对于未基因渗入长雄野生稻的长柱头性状的保持系的水稻植物具有提高的柱头长度；
使步骤a)中选择的所述一个或多个子代水稻植物与权利要求24所述的稳定的细胞质雄性不育系的水稻植物回交；
选择从步骤b)回交产生的除柱头长度提高外具有所述细胞质雄性不育系的全部生理学和形态学特征的一个或多个可育子代水稻植物；
使步骤c)中选择的所述一个或多个子代水稻植物与权利要求24所述的稳定的细胞质雄性不育系的水稻植物回交；以及
选择通过步骤d)回交产生的具有完全雄性不育性和除柱头长度提高外所述细胞质雄性不育系的全部生理学和形态学特征的一个或多个子代水稻植物。
30.根据权利要求25或权利要求29所述的方法，其中，当柱头长度比未基因渗入所述长雄野生稻的长柱头性状的所述保持系的水稻植物的柱头长度大至少30％、大至少40％、大至少50％或大至少60％时，选择提高的柱头长度。
31.根据权利要求25、26或29中一项所述的方法，还包括在子代水稻植物中检测至少一个与柱头长度相关和/或与总柱头和花柱长度相关的长雄野生稻数量性状基因座的至少一种标记。
32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述至少一个与柱头长度相关的长雄野生稻数量性状基因座选自下组：qSTGL8-1和qSTGL8-2。
33.根据权利要求29所述的方法，其中，所述与柱头长度相关的QTL的至少一种标记选自下组：PA08-03、RM7356、PX08-17和PA08-18。
34.根据权利要求28所述的方法，其中，至少一个与总柱头和花柱长度相关的长雄野生稻数量性状基因座选自下组：qPSTL1-1；qPSTL1-3；和qPSTL11-1。
35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述至少一个与总柱头和花柱长度相关的长雄野生稻数量性状基因座的至少一种标记选自下组：RM3604(qPSTL1-1)；RM3746(qPSTL1-1)；RM3640(qPSTL1-3)；RM8134(qPSTL1-3)；和RM5997(qPSTL11-1)；RM254(qPSTL11-1)。
36.根据权利要求24所述的方法，其中，所述稳定的细胞质雄性不育系是系IR58025A，并且所述适合的保持系是IR58025B。
37.根据权利要求24所述的方法，其中，所述稳定的细胞质雄性不育系是系IR68897A，并且所述适合的保持系是IR68897B。
38.根据权利要求24所述的方法，其中，所述稳定的细胞质雄性不育系是系IR127841A，并且所述适合的保持系是IR127841B。
39.根据权利要求24所述的方法，其中，所述稳定的细胞质雄性不育系是系IR127842A，并且所述适合的保持系是IR127842B。
40.通过权利要求24-39中任一项产生的植物或植物部分。
41.根据权利要求40所述的植物部分，其中，所述植物部分是种子。
42.包含1、2-15所述的长雄野生稻的长柱头性状的细胞质雄性不育水稻植物，其中，包含长雄野生稻的长柱头性状的所述细胞质雄性不育水稻植物相对于不包含长雄野生稻的长柱头性状的细胞质雄性不育水稻植物具有提高的异交率。
43.根据权利要求42所述的细胞质雄性不育水稻植物，其中，所述提高的异交率表示为种子结籽率的最大百分比的提高。
44.根据权利要求43所述的细胞质雄性不育水稻植物，其中，所述种子结籽率的最大百分比的提高选自下组：2.5倍提高；5倍提高；10倍提高；15倍提高；20倍提高；25倍提高；30倍提高；35倍提高；40倍提高；45倍提高；50倍提高；55倍提高；60倍提高；65倍提高；70倍提高；75倍提高；80倍提高；以及85倍提高。
45.一种用于提高水稻植物中杂交种子结籽率的方法，包括：
提供包含长雄野生稻的长柱头性状的细胞质雄性不育水稻植物；
用适合的水稻恢复系的花粉对包含长雄野生稻的长柱头性状的所述细胞质雄性不育水稻植物授粉；以及
相对于不具有长雄野生稻的长柱头性状的细胞质雄性不育水稻植物，提高包含长雄野生稻的长柱头性状的细胞质雄性不育水稻植物上的杂交水稻种子结籽率。
46.根据权利要求45所述的方法，其中，所述适合的水稻恢复系是能够对包含长雄野生稻的长柱头性状的细胞质雄性不育水稻植物授粉以产生可育杂交种子的任何水稻系。
47.一种产生杂交水稻种子的方法，包括：
实施权利要求45所述的方法；和
收集包含长雄野生稻的长柱头性状的细胞质雄性不育水稻植物上的杂交水稻种子结籽。
48.从权利要求43中收集的种子生长的杂交水稻植物。
49.一种产生稻米粉状物的方法，所述方法包括：
(a)种植和收集权利要求12或48中任一项所述的杂交水稻植物的种子；和
(b)将所述种子加工成粉状物。
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