CN116334127A - 花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1的克隆方法及应用 - Google Patents

花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1的克隆方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物分子遗传学和作物基因工程技术领域，涉及一种花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1的克隆方法及应用，基因AhSS1包含来自栽培花生两套亚基因的两个同源基因AhSS1a和AhSS1b；所述基因AhSS1b序列如SEQ ID NO:1所示；基因AhSS1a序列如SEQ ID NO:11所示；通过生物技术手段操作上述基因能够调控花生籽仁可溶性糖含量；该基因在大豆中的两个同源基因GmSS1/2同样具有调控籽仁可溶性糖含量的保守性功能。基因AhSS1能够作为花生籽仁可溶性糖含量基因工程改良的功能基因，对于改变花生籽仁可溶性糖含量及与此相关的产量、抗性、品质等方面的基因工程改良具有重要的意义。

Description

花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1的克隆方法及应用
技术领域：
本发明属于植物分子遗传学和作物基因工程技术领域，特别涉及花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1的克隆及应用，提供一种调控花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1的克隆，同时提供一种通过基因工程或基因编辑等分子生物学方法对该基因进行分子遗传操作，进而对花生籽仁可溶性糖含量及与其相关的品质、产量、耐逆性等相关性状进行分子遗传改良的方法。同时提供利用该基因在大豆中的同源基因，在大豆籽仁可溶性糖含量及其相关的品质、产量、耐逆性等性状进行分子遗传改良的方法。
背景技术：
花生是我国重要的油料经济作物，但其单产、总产、出口量及产值在五大油料作物中一直位居首位，花生籽仁营养丰富，主要含有蛋白质(12.48％-36.82％)和油脂(32.35％-60.21％)，两者之和超过75％(万书波,封海胜等2004)。花生既可直接食用，又是食品原料，糖分含量是其重要的食味品质性状。随着人们对花生营养的全面认识，作为全籽仁食品的比例逐年增加，口感甜度高的花生越来越受到消费者的青睐。最直接影响花生口感甜度的因素即其籽仁的可溶性糖的含量。花生籽仁中的糖主要由可溶性糖和非可溶性糖组成，而可溶性糖主要是蔗糖、果糖和葡萄糖等。葡萄糖是高等植物光合产物的主要直接产物，继而转化为蔗糖的形式进行运输，进入储藏器官后再分解为单糖转化为其他储藏物质进行储存，是农作物产量形成的物质基础。在可溶性糖中，蔗糖所占的比例最大，花生的品尝甜味主要来源于蔗糖(Basha.et al.1992；Oupadissakoon,Young et al.1980)。另外，有研究表明种子含糖量的降低会导致种子对低温的敏感(Uemura,Warren et al.2003)，反之提高种子的含糖量，在种子的抗逆性尤其是发芽阶段对低温和盐碱的耐受性中也将具有重要的积极意义(Shi,Wang et al.2016；Sui,Yang et al.2015)。尤其是当下花生种植区域向辽宁、吉林等高纬度春季低温地区以及盐碱地等区域发展，利用改良花生籽仁中的可溶性糖含量来提高花生的耐逆性也将是一个新的途径。鉴于此，发掘花生籽仁中可溶性糖含量的关键基因位点，将为分子遗传手段调控花生的籽仁可溶性糖含量，进而改良花生的品质、耐逆性和抗病性等提供理论依据。
关于籽仁可溶性糖含量的遗传位点在多种植物中已经有一定的研究。在对玉米籽粒可溶性糖含量的研究中发现了两种类型的甜玉米：一类是淀粉合成功能缺失，主要是由sh2和brittle2基因引起的，两者均编码ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucosepyrophosphorylase)，在多糖合成中发挥作用。这两个基因的突变体胚乳中累积较多的可溶性蔗糖，籽粒不透明(Laughnan,1953；Bhave,Lawrence et al.1990)。另外一类是淀粉颗粒组装的问题，以su1(sugary 1)及其隐性调节子se1(sugary enhancer 1)基因为主要调控因子。Su1基因编码一个淀粉异构酶(Isoamylase)，在多糖的分枝发育中发挥作用(James,Robertson et al.1995)，它们的功能缺失，产生可溶性的多分支的植物多糖，主要是麦芽糖，籽粒是半透明的(Ferguson,Dickinson et al.1979；Folgado et al.2014；Carey,Dickinson et al.1984)。水稻ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的功能失活同样会形成糖化和皱缩半透明的籽粒(Yano,Isono et al.2008；Tuncel,A.et al.2014)。另外水稻淀粉合成酶的磷酸化所需要的激酶SPK(Calmodulin-like domain protein kinase)的失活也会形成充满蔗糖而缺少淀粉的水稻籽粒(Asano,T.et al.2002)。除了以淀粉为储藏物质的谷物(胚乳)，对子叶类植物籽仁含糖量的研究较少。在拟南芥的研究中发现：种子中碳水化合物的代谢相关基因的功能变化会导致籽仁中(子叶中)油分和糖分的变化，例如编码一个乙烯响应的AP2/ERWEBP型的转录因子wrinkled1基因的突变会导致种子中的油分降低，可溶性糖含量增加(Focks,Benning et al.1998；Ma,W.et al.2013)。在对甜高粱的研究中，也通过正向遗传学的手段，克隆到了控制甜高粱茎秆含糖量的持汁基因Dry，该基因是一个植物特有的NAC转录因子，在高粱的栽培驯化中受到了强烈的人工选择(Zhang,L.,etal.2018)。
花生籽仁主要由两片占种子绝大部分的子叶构成，其主要的储藏物质为油脂和蛋白质(之和超过75％)，光合作用产生的碳水化合物主要以蔗糖的形式运送到发育中的种子中，之后在蔗糖转化酶的作用下水解为葡萄糖或果糖，在一系列的酶作用下经过乙酰辅酶A合成为油脂或蛋白质(Weber,Borisjuk et al.1997)。这些储藏物质的合成途径中有相当多的遗传因子发挥作用(JA,W.et al.2001)，而到底是那些基因发生变异会导致种子中可溶性糖含量的增加至今没有一个清楚的认识。Basha等对152份种质资源的研究发现：花生籽仁中可溶性总糖含量的遗传多样性较高，变幅为2.84％-19.98％，蔗糖含量的变幅为2.73％-14.65％(Basha,S.M.1992)。Harold等分离并测定了52个不同品种的20种不同的碳水化合物成分，结果发现其中有9种受到环境的影响，5种在花生类型中表现差异，11种因基因型和环境互作表现差异，其中基因型变异占38％-78％，同时发现碳水化合物的变异与烤花生的风味差异密切相关(Harold E,Pattee.et al.2000)。王秀贞等对花生的粒级间蔗糖含量和可溶性总糖进行的研究发现，三级米(秕粒)的含糖量要普遍高于一、二级米，这与前人研究发现的收获越早籽仁含糖量越高的现象相一致，也从侧面说明了花生的可溶性糖可能主要来自于光合产物的非完全转化为储藏物质。Isleib等通过杂交及其后代的研究发现：花生籽仁的可溶性糖含量主要受加性基因效应控制，同时发现蔗糖含量在正反交中差异显著(Isleib,Pattee.et al.2004)。还有一些关于花生种皮颜色、遮光覆膜、土壤肥料等对花生含糖量的影响的研究，充分表明花生籽仁可溶性糖含量是一个受多因素影响的复杂数量性状。
已有的研究仅限于此，还未见对花生籽仁可溶性糖含量这一品质性状较为深入的分子遗传方面的研究，亦未见对花生籽仁可溶性糖含量相关基因的报道。
本发明提供一种调控花生籽仁可溶性糖含量的基因AhSS1(Sweet Seed 1ofArachis hypogaea L.)的定位与克隆，并提供一系列通过基因工程等分子生物学手段对该基因及其启动子包括其花生内同源基因及其它作物中同源基因进行分子遗传操作，进而对花生、大豆等豆科作物籽仁可溶性糖含量进行调控，进而为改良与此相关的花生食味品质、油脂含量、蛋白含量、饱满程度、休眠性和对霉菌的抗性等性状提供分子遗传改良的方法。
发明内容：
本发明的目对是为了填补花生籽仁可溶性糖含量调控相关基因的空白，提供一种花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1的克隆方法及应用。
为了实现上述目的，本发明提供花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1在调控花生籽仁可溶性糖含量中的应用，基因AhSS1包含来自栽培花生两套亚基因的两个同源基因分别为AhSS1a和AhSS1b；所述基因AhSS1b核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，；基因AhSS1a核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。利用可溶性糖含量差异显著的两份花生品种构建的分离群体结合图位克隆技术在花生中定位并克隆了一个调控花生籽仁可溶性糖含量的基因AhSS1。该基因包含来自于异源四倍体栽培花生的两套亚基因组的AhSS1a和AhSS1b两个同源基因及其启动子。
通过对该两个基因及其同源基因的生物技术操作可以调控花生籽仁的可溶性糖含量，进而调控花生籽仁的食味品质、油脂含量、蛋白含量、饱满程度、休眠性和对霉菌的抗性等。具体为：通过分子生物学手段破坏该基因的功能或降低该基因的表达量或翻译量可以显著提高花生籽仁可溶性糖含量、提高其淀粉类多糖的含量，进而调控花生籽仁的食味品质，以及与其相关的籽粒饱满度、粒重、含油量、蛋白含量等。通过分子生物学手段提高该基因的表达量或翻译量可以显著降低花生籽仁可溶性糖及淀粉类多糖的含量，进而提高花生籽仁的蛋白含量、油脂含量及对霉菌等的抗性等性状。
本发明所述的花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1及其等位变异直接来源于花生，也可以来源于大豆、绿豆、鹰嘴豆等农作物的相似度足够高(大于60％)的同源基因。
本发明还提供调控花生籽仁可溶性糖含量的方法，该方法包括制备含有上述中AhSS1或同源基因的相关核苷酸序列的构建体及花生植株。
同时该基因在多种子叶类豆科植物中的同源基因具有相对保守的功能，例如大豆、芸豆、菜豆等，对它们进行类似的去功能化或降低表达翻译量或提高表达翻译量均可以调控籽仁的可溶性糖含量，进而改变上述作物的与此相关的其他性状。
本发明提供对上述基因AhSS1及其同源基因及其启动子的克隆及其在作物分子遗传改良中的应用。优选在调控花生、大豆等豆类作物的籽仁可溶性糖和淀粉类含量及与其相关的籽粒饱满度、营养物质含量及籽仁对霉菌的抗性等性状的分子遗传改良中的应用。该基因及其同源基因为豆科植物的籽仁品质改良提供了重要的基因资源。
本发明所述完整功能的等位变异AhSS1b的基因组水平的核苷酸序列为SEQ IDNO:1，其转录的mRNA对应的CDs序列为SEQ ID NO:2，其编码的蛋白序列为SEQ ID NO:3；其启动子序列为SEQ ID NO:4，其可以来源于花生代表品种为基因组测序品种Tifrunner或狮头企等。该基因存在一个来源于冀花甜1号去功能性的等位变异ahss1b，其基因组水平的核苷酸序列为SEQ ID NO:5，其转录的mRNA对应的CDs序列为SEQ ID NO:6，其启动子序列与完整功能的等位变异AhSS1b的启动子序列相同(SEQ ID NO:4)。
本发明所述花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1b为没有内含子的基因，在基因组水平和cDNA水平的克隆引物均可采用引物对AhSS1b-F/R，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7-8，利用该引物对以相应品种的DNA或cDNA为模板均可以克隆功能性AhSS1b或其去功能性等位变异ahss1b的完整编码框，扩增产物为1621bp。利用该引物对在代表品种Tifrunner的基因组DNA或cDNA中的克隆产物电泳图如图2。
本发明所述花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1b启动子的克隆引物对为AhSS1b-pro-F/R，其核苷酸序列如SEQ ID NO:9-10，利用该引物对在代表品种的基因组DNA中克隆其启动子的电泳图如图2，扩增产物为2334bp。另外可以利用AhSS1b-pro-F/SS1b-R组合，以代表性花生品种基因组DNA为模板，直接克隆带有启动子和编码区的完整AhSS1b基因，扩增产物为3816bp，电泳图如图2。上述扩增通过产物的测序确认。
本发明所述花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1b位于栽培花生B亚基因组上，同时在栽培花生A亚基因组上存在一个同源基因AhSS1a，其序列如SEQ ID NO:11，其转录的mRNA对应的CDs序列为SEQ ID NO:12，其编码的蛋白序列为SEQ ID NO:13；其启动子序列为SEQ ID NO:14。其完整功能性等位变异AhSS1a来源于栽培花生MJX或野生花生A.duranensis，在基因组水平和cDNA水平的克隆引物对为AhSS1a-F/R，其核苷酸序列如SEQID NO:15-16，利用该引物对以野生花生A.duranensis的基因组DNA或cDNA为模板均可以克隆完整功能性等位变异AhSS1a的完整编码框，其克隆产物电泳图如图3，扩展产物为1558bp。
同时在栽培花生的A亚基因上，存在一种AhSS1a常见的功能失活性的等位变异
ahss1a，其基因组水平的核苷酸序列为SEQ ID NO:17，该功能失活性的等位变异ahss1a发生了编码区末端57bp和整个3`UTR及下游一个基因启动区在内的4051bp的缺失，该缺失导致形成一个新的融合基因(Tifrunner参考基因组注释为Arahy.3URM83)，其来源的代表品种为花生基因组测序品种Tifrunner或狮头企等。本发明还提供一对能够直接鉴定缺失型ahss1a的引物对AhSS1t2-F/R，其核苷酸序列为SEQ ID NO:18-19，在花生代表品种中扩展产物如图4，如果有大片段缺失将扩增出554bp的产物，如果没有缺失将不能扩增或扩增出4605bp的产物(因为产物太大，通常普通Taq酶无法扩增，长片段酶可以扩增)。
本发明还提供花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1a和AhSS1b编码的蛋白质在作物遗传改良中的应用。
本发明还提供花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1的等位变异在作物遗传改良中的应用。
本发明还提供花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1的启动子在作物遗传改良中的应用，所述启动子包括来自栽培花生两套亚基因的两个同源基因AhSS1a和AhSS1b的启动子，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:4所示；该启动子核心区能够特异性地启动下游基因在花生籽仁中特异性表达，而在其他组织中不表达或微量表达。
本发明还提供花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1在基因工程改良中的应用，利用基因编辑技术对花生品种中的基因AhSS1a或/和AhSS1b的基因启动子区、编码区、内含子区或3’非翻译区进行改造、或利用RNAi干涉技术降低花生品种中的基因AhSS1a或/和AhSS1b的表达量、或利用转基因技术过表达AhSS1a或/和AhSS1b或其同源基因以改变花生籽仁可溶性糖含量。
本发明还提供一种含有所述的AhSS1b或/和等位基因AhSS1a的部分核苷酸序列或互补序列的基因编辑载体构建方法及应用，通过基因编辑技术，对本发明所述的花生籽仁可溶性糖调控基因AhSS1进行基因敲除，以提高花生籽仁含糖量的技术方案。所述载体是基因编辑载体KO-AhSS1。用于构建基因AhSS1基因编辑的目标靶点的序列优选有两种，分别为：AhSS1-sgRNA1(正义链可以同时靶向AhSS1a和AhSS1b)和AhSS1-sgRNA2(反义链，仅靶向AhSS1b)，其序列如SEQ ID NO：20-21所示。将该两个片段分别连接进入CRISPR/Cas9载体BGK041(图5)的sgRNA区，分别构建成针对目标基因AhSS1的基因编辑敲除载体KO-AhSS1。将该基因编辑载体转化入普通花生品种可以对其AhSS1a/b基因实现基因编辑而改变，进而挑选出去功能性基因编辑后代(截断基因或改变氨基酸)，而实现低甜度的花生(例如青花1号可溶性糖含量1％)转变为高甜度的甜花生(可溶性糖含量>4％)，同时调控与其相关的其它性状。当所针对的品种为AhSS1a提前失活的品种，AhSS1b被编辑敲除会使可溶性糖含糖提高到10％左右，当所针对的品种为AhSS1a/b均为完整功能，编辑一个基因会使可溶性糖含糖提高3-4％左右，同时编辑两个基因会使可溶性糖含糖提高6-8％。
所述AhSS1-sgRNA1和AhSS1-sgRNA2为优选靶标序列，根据不同的CRISPR/Cas9载体系统或编辑效率，靶标序列sgRNA可以不同。
本发明还提供了一种含有所述花生籽仁可溶性糖调控基因AhSS1的过表达载体构建方法及应用：利用烟草花叶病毒的35S启动子构建过表达载体p35S::AhSS1b，其载体骨架为植物过表达载体WMV003(如图6)，其含有所述花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1b相关核苷酸序列，该过表达载体构建所需的引物对为OE-AhSS1b-F和OE-AhSS1b-R，其序列如SEQ ID NO：22-23所示；利用该引物对在普通栽培花生的DNA或cDNA或含有该基因完整编码框的质粒中扩增获得基因AhSS1b，将扩增产物通过酶切连接或重组连接入过表达载体WMV003或其它植物过表达载体，构建成为一种过表达转基因载体p35S::AhSS1b。将该过表达载体转化入花生可以降低花生的可溶性糖和淀粉的含量，尤其是AhSS1a失活或AhSS1a和AhSS1b同时失活的甜花生品种，进而调控与其相关的其它性状，例如显著降低黄曲霉的侵染速度和几率(如图7)。
本发明还提供一种含有所述花生籽仁可溶性糖调控基因AhSS1的互补表达转基因载体构建方法及应用：利用基因AhSS1b的自身启动子构建互补表达转基因载体：pAhSS1b::AhSS1b，其含有所述花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1b及其启动子的相关核苷酸序列。利用适当的引物对花生品种Tifrunner的DNA进行克隆扩增，同时扩展出带有启动子的完整序列，将产物通过酶切链接或者同源重组连入遗传转化载体。将该互补表达载体pAhSS1b::AhSS1b转化入甜花生型花生可以将其转变为低甜度花生，直接降低其籽仁可溶性糖和淀粉的含量，进而调控与其相关的其它性状。
鉴于AhSS1a和AhSS1b具有极高的同源性，上述互补表达载体和过表达载体中均可以用AhSS1a代替AhSS1b。
本发明还提供大豆中含有花生AhSS1基因的两个同源基因在作物遗传改良中的应用，花生AhSS1基因在大豆中的两个同源基因分别为Glyma.14G089033(SEQ ID NO:24)和Glyma.17G234300(SEQ ID NO:25)，将其分别命名为GmSS1和GmSS2。
本发明还提供一种含有同源基因GmSS1/2部分核苷酸序列的基因编辑载体的构建方法及其应用，所述载体是基因编辑载体KO-GmSS。用于构建基因GmSS1和GmSS2基因编辑的目标靶点的序列优选有两种，分别为：Gm-sgRNA3和Gm-sgRNA4，其序列如SEQ ID NO:26-27所示；将该两个片段同时连接进入CRISPR/Cas9载体BGK041(图5)的sgRNA区构建成针对目标基因GmSS两个同源基因的基因编辑敲除载体KO-GmSS。形成一个双基因双靶点的基因编辑载体。其中靶点Gm-sgRNA3只针对GmSS1，而靶点Gm-sgRNA4同时靶向GmSS1和GmSS2。将该基因编辑载体KO-GmSS转化入大豆可以对其GmSS基因实现基因编辑而改变，进而挑选出去功能性编辑后代，而实现提高大豆籽仁可溶性糖含量的作用。所述Gm-sgRNA3和Gm-sgRNA4为优选靶标序列，根据不同的CRISPR/Cas9载体系统或编辑效率，靶标序列可以不同。
本发明还提供了一种含有同源基因GmSS1/2的过表达载体构建方法：利用烟草花叶病毒的35S启动子构建过表达载体p35S::GmSS1/2，其载体骨架为植物过表达载体WMV003(如图6)，其含有所述大豆GmSS1/2相关核苷酸序列，该过表达载体构建所需的引物对为OE-GmSS1-F和OE-GmSS1-R，其序列如SEQ ID NO：28-29所示；利用该引物对在普通大豆的cDNA或含有该基因完整编码框的质粒中扩增获得基因GmSS1，将扩增产物通过同源重组无缝连接入过表达载体WMV003或其它植物过表达载体，构建成为一种过表达转基因载体p35S::GmSS1。将该过表达载体转化入大豆可以降低大豆的可溶性糖和淀粉的含量，进而调控与其相关的其它性状。
表1本发明所用的人工合成序列
Figure BDA0004151170690000071
Figure BDA0004151170690000081
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明提供的花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1及其等位变异，为探索花生籽仁可溶性糖含量的分子机制和初步构建其花生营养物质储存的分子网络，以及研究该基因功能在作物间的演化规律等提供重要的参考；
(2)本发明提供的花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1及其等位变异基因间的差异，可以开发为功能性分子标记，用于作物分子标记辅助选择育种，优选在改良花生籽仁可溶性糖含量其相关的淀粉含量、油脂含量和耐黄曲霉菌等方面的作用；
(3)本发明提供了花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1的基因序列和氨基酸或多肽或蛋白质在作物遗传改良中的应用，优选在改良花生籽仁可溶性糖含量及其相关的淀粉含量、油脂含量和耐黄曲霉菌等方面的作用；
(4)本发明提供了花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1的过表达载体、互补表达载体和基因编辑载体及含有所述载体的植株在改良籽仁可溶性糖含量及其相关的淀粉含量、油脂含量和耐黄曲霉菌等方面的作用；
(5)本发明提供的花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1在大豆中的同源基因GmSS或其他豆科作物中的同源基因，都有可能的同源保守性的作用，对它们的基因工程改造与利用都可以在调节其它子叶类作物籽仁可溶性糖含量方面发挥作用。
附图说明：
图1为本发明涉及的花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1b的图位克隆过程图。
图2为本发明涉及的花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1b的基因克隆，启动子加基因克隆和启动子克隆结果示意图。
图3为本发明涉及的花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1a的基因克隆结果示意图。
图4为本发明涉及的鉴别ahss1a的大片段缺失的InDel标记克隆结果示意图。
图5为本发明涉及的基因编辑构建体KO-AhSS1和KO-GmSS的骨架载体BGK041结构图。
图6为本发明涉及的过表达构建体p35S::AhSS1b和互补表达构建体pAhSS1b::AhSS1b的骨架载体WMV003结构图。
图7为本发明涉及的过表达AhSS1b花生降低可溶性糖含量提高对黄曲霉菌的抗性图。
图8为本发明涉及的基因编辑大豆含糖量测定结果示意图。
具体实施方式：
下面结合实施例和附图对本发明进行进一步说明。
在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂和试验材料如无特别说明，均为市售常规试剂和试验材料；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规分子生物学技术。
实施例1：花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1的图位克隆
(1)花生籽仁可溶性糖含量相关基因位点的初定位
通过籽仁含糖量5％左右的荣丰7号和籽仁含糖量10％左右的冀花甜1号杂交，后进行单株自交继代繁殖至F5代。获得重组自交系群体RFT-F5，其包含204个家系。其所结种子即为RFT-F6，采用蒽酮比色法对F5所结的种子(F6)进行可溶性糖含量的测定，统计分析发现：F6群体中，可溶性糖含量平均值为5.05％，方差为8.92，变幅从1.17％～14.72％，呈现连续性变化。将荣丰7号×冀花甜1号的F5群体的种子(F6代)切为两半，一半用于测定可溶性糖含量，一半留下用于DNA提取。根据测得的荣丰7号×冀花甜1号F6群体的表型数据，选取30个可溶性糖含量低的极端表型个体和30个可溶性糖含量高的极端表型个体，分别等量混合其DNA构成两个极端性状个体混池进行基因组测序(可溶性糖含量低池N-Pool；可溶性糖含量高池T-Pool)，测序深度为30×。亲本荣丰7号和冀花甜1号进行20×测序深度的测序。通过BSA的方法，将花生籽仁可溶性糖含量相关位点定位在第16染色体末端(图1)。
根据BSA-seq的定位结果，利用两个亲本材料荣丰7号和冀花甜1号基因组重测序的数据开发并分析了涵盖第16号染色体目标区间的10对InDel标记，获得两亲本间具有良好的共显性差异且凝胶电泳分析效果良好的7对InDel标记，用于RFT-RIL群体的全群体连锁定位分析。
对荣丰7号×冀花甜1号RIL群体中的202个个体，在物理距离最远的两个InDel标记PM16-10和PM16-8之间发生重组的27个个体，利用上述的7对InDel标记对其进行详细的基因分型，而对于不发生重组的175个个体，认为InDel标记PM16-10和PM16-8间的染色体片段纯合，该片段的基因型同PM16-10和PM16-8。由此得到RFT-RIL群体202个个体的基因型。根据InDel标记的基因型，利用软件QTL IciMapping v4.0提供的遗传连锁图谱构建模块，采用LOD＝3.0为阈值的标准分群，进一步排序调整之后，构建RFT-RIL群体的第16号染色体的局部遗传连锁图谱(物理距离3.5Mb，遗传距离7.87cM)。
结合RFT-RIL群体的202个个体的标记型和表型，及其上述的遗传图谱，使用软件IciMapping v4.0提供的双亲群体的QTL作图模块，以LOD＝3为阈值，采用加性完备区间作图法进行QTL作图。经过全群体连锁定位分析，在第16号染色体末端定位到与花生籽仁可溶性糖含量相关的位点，这一结果与BSA-seq的定位结果一致。其中，可溶性糖含量相关的位点定位在标记PM16-6和PM16-8之间，其间距为1.13cM，对表型的贡献率为39.82％，增效位点来自于冀花甜1号，理论上可使可溶性糖含量增加2.16％。
(2)花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1的精细定位
为了缩小目标区间，针对上述在RFT-RIL群体中筛选到的27个重组个体，继续分析内部新开发标记，结合重组个体表型初步将区间缩小在PM16-5和SNP16-5两个标记之间的479Kb区间。为进一步缩小区间，利用定位的两个InDel标记PM16-5和PM16-8对较大的F2分离群体RFT-F2的225个家系和TRF-F2的108个家系进行重组个体筛选，RFT-F2获得区间内的14个重组个体，TRF-F2获得区间内的3个重组个体，针对这17个重组个体，利用标记PM16-5和PM16-8之间的1个InDel标记和10个SNP标记继续筛选重组位点，并且结合其F3表型为不甜且没有发生性状分离的个体，最终将可溶性糖含量的位点定位在SNP-15和SNP-12之间，区间的物理距离约为71Kb。
(3)花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1的克隆
根据花生基因组数据库的花生基因注释信息，在标记SNP-15和SNP-12之间的71Kb的距离内，共有7个预测的ORFs，结合基因组重测序发现的亲本间基因组差异和花生组织表达谱数据，其中Arahy.42CAD1仅在种子中高表达，并且测序结果显示，冀花甜1号的Arahy.42CAD1的ATG起始的第110位的碱基存在一个碱基替换(+110C→A)，导致密码子TCA变成了一个新的终止密码子TAA，进而导致蛋白翻译提前终止，形成截断性无功能的蛋白。参考前期课题组完成的全长转录组，设计克隆引物，将该Arahy.42CAD1在双亲间基因组水平克隆测序也验证了这一差异。因此将Arahy.42CAD1选定为候选基因，并将其命名为AhSS1(Sweet Seed 1of Arachis hypogaea L.)。鉴于其来自栽培花生的B06染色体，将其命名为AhSS1b。
所述花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1b位于栽培花生B亚基因组的B06染色体上，该基因在花生中有来自A亚基因组的一个同源基因将其命名为AhSS1a。根据来自野生花生Arachis duranensis的参考基因组，设计该基因的克隆引物对AhSS1a-F/R。栽培花生为异源四倍体，因而在B06染色体对应的同源染色体A06上也有一个同源性极高的同源基因，参考基因组Tifrunner的注释其为Arahy.3URM83，但该基因在Tifrunner和狮头企中均发生了功能失活性的等位变异ahss1a，具体为发生了编码区末端57bp和整个3`UTR及下游一个基因启动区在内的4051bp的缺失，该缺失导致形成一个新的融合基因，我们将其命名为ahss1a，将该突变设计为一个InDel标记，具体引物对为：AhSS1to2-F/R，在品种Tifrunner和野生AA，品种MJX和狮头企中的克隆结果如附图4所示。能够扩增出152bp则说明该品种的AhSS1a基因为缺失型ahss1a。
实施例2：花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1的过表达降低籽仁甜度。
本实施例利用烟草花叶病毒的35S作为启动子构建过表达转基因载体p35S::AhSS1，通过花粉管导入法将花生基因AhSS1的功能性mRNA在普通花生品种中进行过表达，具体步骤包括：以带有通过AhSS1克隆引物对(SEQ ID NO:7-8)扩增的产物链接的T质粒为模板，利用同源重组的引物OE-AhSS1-F和OE-AhSS1-R，其序列如SEQ ID NO：22-23所示，扩增目的片段，胶回收T质粒扩增的目的片段和过表达载体WMV003骨架片段，纯化后用同源重组的方法进行连接，将连接产物热激转化大肠感菌DH5a感受态细胞，涂布卡那霉素抗性的LB平板，挑取单克隆通过PCR检测，将阳性克隆送去生物技术公司测序，选择测序正确的菌株摇菌，提取带有目的片段的质粒，即为AhSS1过表达转基因载体：p35S::AhSS1。将AhSS1过表达载体转化农杆菌GV3101感受态细胞，涂布卡那霉素和利福平双抗的YEB平板，挑取单克隆后通过PCR检测阳性后作转基因菌株备用。将该过表达转基因载体转化入甜度较高的花生可以显著降低其可溶性糖和淀粉的含量，进而影响与其相关的其它性状。
过表达转基因载体的构建也可以利用适当的引物直接扩增普通花生品种中功能性AhSS1包含启动子和编码区在内的基因组全长连入适当的植物转基因载体，此处不再赘述。
实施例3：基因编辑敲除花生AhSS1提高花生籽仁可溶性糖含量
本实施例利用CRISPR/Cas9体系进行基因编辑敲除，具体操作步骤包括：在线设计并生成sgRNA靶点序列(http://www.biogle.cn/index/excrispr)，选择两个得分最高的靶位点AhSS1-sgRNA1和AhSS1-sgRNA2(SEQ ID NO：20-21)，将生成的sgRNA序列交由生物公司合成互补的两条单链Oligo，将合成的Oligo加水溶解至10μM，在200ul PCR管中加入18μlBuffer Anneal、1μl Up Oligo和1μl Low Oligo混合后，95℃加热3分钟，然后以约0.2℃/秒缓慢降至20℃，制备Oligo二聚体(具体参照百格载体BGK041说明书)；将Oligo二聚体通过连接酶连接至线性化的CRISPR/Cas9载体即为KO-AhSS1载体；在200ul PCR管中加入2ulKO-AhSS1载体、1ul Oligo二聚体、1μl Enzyme Mix和16ul ddH2O，混匀后室温(20℃)反应1小时，将连接产物热激法分别转化大肠感菌DH5a感受态细胞，涂布卡那霉素抗性的LB平板，挑取单克隆，通过PCR检测，将阳性克隆送去生物技术公司测序，选择测序正确的菌株摇菌，提取质粒，即为基因AhSS1的基因编辑载体：KO-AhSS1。将AhSS1基因敲除载体KO-AhSS1转化农杆菌感受态细胞，涂布卡那霉素和利福平双抗的YEB平板，挑取单克隆后通过PCR检测阳性，选择阳性克隆转化花生(如鲁花11或狮头企)；所述CRISPR/Cas9载体选用BGK041(如图5)，该载体采用大豆U6启动子驱动sgRNA序列，能够高效的用于双子叶植物，采用加强型CaMV 35S启动子高效表达Cas9蛋白。将该基因编辑载体转化入普通花生品种可以将其AhSS1基因实现基因编辑而改变，进而挑选出去功能性编辑后代，而实现对花生籽仁可溶性糖和淀粉含量的提高，以及与其相关的其他性状的改变。
基因编辑所用的CRISPR/Cas9载体BGK041骨架购买自百格基因公司(http://www.biogle.cn/index/excrispr)，仅用于范例说明，也可以采用其它植物CRISPR/Cas9基因编辑载体或其他单碱基编辑载体。
实施例4：基因编辑敲除大豆中GmSS1/2同源基因提高大豆含糖量
本实施例利用CRISPR/Cas9体系进行基因编辑敲除，具体操作步骤包括：在线设计并生成sgRNA靶点序列(http://www.biogle.cn/index/excrispr)，选择两个得分最高的靶位点sgRNA3和sgRNA4(SEQ ID NO：21-22)，其中sgRNA3只针对GmSS1，而sgRNA4同时针对GmSS1和GmSS2。将生成的sgRNA序列交由生物公司合成互补的两条单链Oligo，将合成的Oligo加水溶解至10μM，在200ul PCR管中加入18μl Buffer Anneal、1μl Up Oligo和1μlLow Oligo混合后，95℃加热3分钟，然后以约0.2℃/秒缓慢降至20℃，制备Oligo二聚体(具体参照百格载体说明书)；将Oligo二聚体通过连接酶连接至线性化的CRISPR/Cas9载体即为KO-GmSS1/2载体；在200ul PCR管中加入2ul KO-GmSS1/2载体、1ul Oligo二聚体、1μlEnzyme Mix和16ul ddH2O，混匀后室温(20℃)反应1小时，将连接产物热激法分别转化大肠感菌DH5a感受态细胞，涂布卡那霉素抗性的LB平板，挑取单克隆，通过PCR检测，将阳性克隆送去生物技术公司测序，选择测序正确的菌株摇菌，提取质粒，即为GmSS1/2敲除质粒：KO-GmSS1/2。将GmSS1/2基因敲除质粒KO-GmSS1/2转化农杆菌感受态细胞，涂布卡那霉素和利福平双抗的YEB平板，挑取单克隆后通过PCR检测阳性，选择阳性克隆转化大豆()；所述CRISPR/Cas9载体选用BGK041(如图5)，该载体采用大豆U6启动子驱动sgRNA序列，能够高效的用于双子叶植物，采用加强型CaMV 35S启动子高效表达Cas9蛋白。将该基因编辑载体转化入普通花生品种可以将其GmSS1/2基因实现基因编辑而改变，进而挑选出去功能性编辑后代，而实现对大豆籽仁可溶性糖含量的提高，以及与其相关的其他性状的改变。具体结果如图8
基因编辑所用的CRISPR/Cas9载体BGK041骨架购买自百格基因公司(http://www.biogle.cn/index/excrispr)，仅用于范例说明，也可以采用其它植物CRISPR/Cas9基因编辑载体或其他单碱基编辑载体。
实施例5：过表达大豆中GmSS1同源基因降低大豆含糖量。
本实施例利用烟草花叶病毒的35S作为启动子构建过表达转基因载体p35S::GmSS1，通过子叶节法将大豆基因GmSS1的功能性mRNA在普通花生品种中进行过表达，具体步骤包括：以带有通过GmSS1克隆引物对扩增的产物链接的T质粒为模板，利用同源重组的引物OE-GmSS1-F/R，其序列如SEQ ID NO：28-29所示，扩增目的片段，胶回收T质粒扩增的目的片段和过表达载体WMV003骨架片段，纯化后用同源重组的方法进行连接，将连接产物热激转化大肠感菌DH5a感受态细胞，涂布卡那霉素抗性的LB平板，挑取单克隆通过PCR检测，将阳性克隆送去生物技术公司测序，选择测序正确的菌株摇菌，提取带有目的片段的质粒，即为GmSS1过表达转基因载体：p35S::GmSS1。将GmSS1过表达载体转化农杆菌GV3101感受态细胞，涂布卡那霉素和利福平双抗的YEB平板，挑取单克隆后通过PCR检测阳性后作转基因菌株备用。将该过表达转基因载体转化入甜度较高的大豆可以显著降低其可溶性糖和淀粉的含量，进而影响与其相关的其它性状。
过表达转基因载体的构建也可以利用适当的引物直接扩增普通大豆品种中功能性GmSS1包含启动子和编码区在内的基因组全长连入适当的植物转基因载体，此处不再赘述。
鉴于大豆两个同源基GmSS1和GmSS2同源性极高，对于上述过表达也可以采用GmSS2作为功能基因，本实施例不在赘述。
序列表
SEQ ID NO:1(AhSS1b，来自栽培花生Tifrunner)
Figure BDA0004151170690000131
/>
Figure BDA0004151170690000141
SEQ ID NO:2(AhSS1b编码的CDS，来自栽培花生Tifrunner)ATGATCAAAACTCTGAACCCTAATTACCCAAATAATACAGCAAAAACGGCTGAGATCATGTCAAGGTATAGGCCAATAGCTCCAAAGCCAGATACCAATAATTCCTCATCAAGCTCCCTCACTGATAACAATGGCTCCAACAGCAGCAACAGCAACAATTCACTCTCTCAAAAGATCAAGAATTCTCCTTATCTTAGGAGTCTTTGGCCACAGCTTCAAGCAAGACCAACAAGGACTAGAAAGAGAGGTAGAGCCCCAATTTTAACACTTCCACCTTCTTCACTCTTTAAAAGGCAAAAACTCAACAACACAAATAATCTTCTACTAGGATTTTATCCCTCTACAACAAAGAACCTACTTTCATTACAAAGTTTGAATTTTGTTCCTCCTCATCAACAACTCGGTAATCCTCTCTCTAATCATGCAATTGGGGTTCTTAATTGTCAATTAGAAAACACTAATGATGTTAGCACTATCAGTAATTCCACTACAAGCCCAAGTTTGGTTACACTTCCACTTCTTCCATGTTCACCTTCTTCTTCTTCTACTTCTTCCATCCATCAACCACCAAAGTTTGACTTAACCAACAACAACAATGCTTGCAAAGAAGTAACATTTGATCTGAATTTGACTGCGAAGTTGCACATCCCGGAAGAGAAGGATCTCTTGCAGCAACTTCAGAGGCCGGTGGCGATGACGGCGACAGCAGCAACAAATAACAATGTGGTAGTAGTAGCTCCTCAACCGGTTCGACCGGTTGGTTCCTCCATAAGCGTTGGTTGCATCAATGAAGATGCAACAATGGCAATTCAAGATCAGAATCTCAAGAGAAAACAAGAGGTTGAGGATGAGGTTGAAACCGAGACATTACCAGCAATTATAACAGACTCAAAAAACCGGGTTAGGATGGTAAATTCCTCATACAAGGAACTAGTTGGTCAACCAGAATGTCCATGGCTTGAATCCATGGTAACAAGCATTCAATGCGGGTCATCAGCATCATCATCAACACCATCATCATCACCAAGATCATCATCTCCAAGAAGTAACAAGAGGATAAGTGGTGAAGTAGCACTTCAAGTCTGTGATGATTCAATTAAGATACCAGATTCATCATCATCAAATGGATTCTCTTGCTGGGTTAGGATTGAATGGCAAAGCAGTGAAGATCAGAGGAAGAAGTTTTGTGTGAATGCTTTCTGTGATGTTACCAAGTTGTGTTGTGAATCGAGGGATTATGTGTTCTCGTGGAGGTTCCACACGCGCACCAGAGAAGCTTCTCAATCTAGTTGCAATCTTTAA
SEQ ID NO:3(AhSS1b编码的蛋白质，来自栽培花生Tifrunner)
MIKTLNPNYPNNTAKTAEIMSRYRPIAPKPDTNNSSSSSLTDNNGSNSSNSNNSLSQKIKNSPYLRSLWP
QLQARPTRTRKRGRAPILTLPPSSLFKRQKLNNTNNLLLGFYPSTTKNLLSLQSLNFVPPHQQLGNPLSN
HAIGVLNCQLENTNDVSTISNSTTSPSLVTLPLLPCSPSSSSTSSIHQPPKFDLTNNNNACKEVTFDLNLT
AKLHIPEEKDLLQQLQRPVAMTATAATNNNVVVVAPQPVRPVGSSISVGCINEDATMAIQDQNLKRKQEV
EDEVETETLPAIITDSKNRVRMVNSSYKELVGQPECPWLESMVTSIQCGSSASSSTPSSSPRSSSPRSN
KRISGEVALQVCDDSIKIPDSSSSNGFSCWVRIEWQSSEDQRKKFCVNAFCDVTKLCCESRDYVFSWRF
HTRTREASQSSCNL
SEQ ID NO:4(AhSS1b的启动子，来自栽培花生Tifrunner)
Figure BDA0004151170690000151
Figure BDA0004151170690000161
SEQ ID NO:5(去功能性等位变异Ahss1b来自于栽培花生冀花甜1号)
Figure BDA0004151170690000162
SEQ ID NO:6(去功能性等位变异ahss1b编码的cDNA)
Figure BDA0004151170690000163
Figure BDA0004151170690000171
SEQ ID NO:7(SS1b-F基因克隆人工序列)
Figure BDA0004151170690000172
SEQ ID NO:8(SS1b-R基因克隆人工序列)
Figure BDA0004151170690000173
SEQ ID NO:9(SS1b-pro-F启动子克隆引物人工序列)
Figure BDA0004151170690000174
SEQ ID NO:10(SS1b-pro-R启动子克隆引物人工序列)
Figure BDA0004151170690000175
SEQ ID NO:11(完整功能基因AhSS1a，来自野生花生A.duranensis)
Figure BDA0004151170690000176
Figure BDA0004151170690000181
SEQ ID NO:12(完整功能基因AhSS1a编码的CDS，来自野生花生A.duranensis)
Figure BDA0004151170690000182
SEQ ID NO:13(AhSS1a编码的蛋白质，来自野生花生A.duranensis)
MIKTLNPNYPNNTAKTAEIMSRYRPIAPKPDTNNSSSSSLTDNNGSNSSNSNNSLSQKIKNSPYLRSLWPQLQARPTRTRKRGRAPILTLPPSSLFKRQKPNNTNNLLLGFYPSTTKNLISLQSLNFVPPHQQLGNPLSNHAIGVLNCQLETTNNDVGTICNSTTSPSLVTLPLLPCSPSSSTSSIHQPPKFDLTNNNNACQEVTFDLNLTAKLHIPEEKDLLQQLQRPVATTATAATNNNVVVVAPQPVRPVGSSISVGCINEDATIMAIQDQNLKRKQEVEDEVETETLPAIITDSKNRVRMVNSSYKELVGQPECPWLESMVTSIQCGSSAPSSTPSSSPRSSSPRSNKRISGEVALQVCDDSIKIPDSSSSNGFSCWVRIEWQSSEDQRKKFCVNAFCDVTKLCCESRDYVFSWRFHTRTREASQSSCNL
SEQ ID NO:14(AhSS1a的启动子，来自野生花生A.duranensis)
Figure BDA0004151170690000183
Figure BDA0004151170690000191
SEQ ID NO:15(AhSS1a-F人工序列)
TACTCCAATAGATAAATTAGGCCA
SEQ ID NO:16(AhSS1a-R人工序列)
TTATAAGGCAAAAGCATAACAAAAC
SEQ ID NO:17(去功能性等位变异ahss1a来自于Tifrunner)
Figure BDA0004151170690000192
/>
Figure BDA0004151170690000201
SEQ ID NO:18(AhSS1t2-F)ATCAACACCATCATCATCACCASEQ ID NO:19(AhSS1t2-R)AAATCTCATCTCATCCACCTCASEQ ID NO:20(AhSS1-sgRNA1)GTTGGTTCCTCCATAAGCGTTGGSEQ IDNO:21(AhSS1-sgRNA2)GCTGTATTATTTGGGTAATTAGGSEQ ID NO:22(OE-AhSS1b-F)
Figure BDA0004151170690000202
SEQ ID NO:23(OE-AhSS1b-R)
Figure BDA0004151170690000211
SEQ ID NO:24(GmSS1，Glyma.14G089033)
Figure BDA0004151170690000212
Figure BDA0004151170690000221
SEQ ID NO:25(GmSS2，Glyma.17G234300)
TACTACCAACGCAGTCCTTTGTTCAGCCAAAGAGAAAAAAAAAGTATTGTCATTTGCATGGTTATGAAA
TTATCGAGTTGACTCGCTAATTCTTACGAATTTATAAATTCATTTGTTTTTTTGAGTCGACTTTTGAGTAA
ATTTTTTTTTTAGTAAACTCTAAACAAACTCTATAAACTCTGAGTAAATTCGGTAAACTCTTGAGTTTAC
CACCAAGTCAATGAGTTAGTAAGTTAAAAAAATTAAACCAAAATATAAGTCATTTTTTATTGTTTTCTTT
TTGTATAGTATTCAACATACCTTCATTTAGTGTATTATTCTCAAATACAAAATTCTCACCTTTAATAATATC
AAACATTTATTCTCTAATAACAACAAACTCTCGATGAGAATGATCTACCACTACTATAACCTTTGCAAAT
TATTATCTAGTAGTGATGTATTATTACTAGGTTTGATTAATTAAATATTTTGAACTTTATAATTTACTATTTTA
CTTTATTATATTGTTGAAATATTTAATTAATATATTATTTATAGATATTATCTTTATACGAAATAGACTCTTAT
GAATTTACGAGTTGAGTCACGAGTCGAGTCTATCCAACTCTCATGAGTTTACATAAACTCTCGAGTTTG
ATAACCTTGATCATTTGTAATGGGATACTAATAACAAAAATTATTAATAAAAAGTTTAAGGATGAAGTATA
TACTAATACAGTAGTAATATACTACTACAAGACATATTAATAACACTTTTTAATTCTTGAATTATAGTAGTA
CTTCAAAGTTGAAAACAGTGAATAACATTTACTGCTTTTTCTTAAGATTGATTGTCATACGTATGGTTGA
TGAGTAATATTGAGTTGGCGGGCAATATATACTGACTCTCCAATGAGATTGAATCTCATTGATTGCATGC
AATGGGAGAGGGTGTTGATGCGACATGTGGAAACACAACAAATGTTAACCGACTGGGAAGTGTTTGAT
GAAACTAGGGAAGAAAAAGACAGGGCGACCAAACCAATCCTCATAGGTGTTTTCATGCATGGCACTCT
ACACCACACGCGTTATGATGACAGCCCCCTTTTGGTATAATAAGCCAGCCAGACTACACCTCATTGGCG
TTACACATTCATCATTCATGAGCTAGCCTCCCTCTTCTTAAATATGGGTGCATCAATTCAATTGTTACCAC
CTTAATTTGACATAATAACATTTTCACTCTATTTCCCATTCTACCACTCCCCTAGCTAGAAAAAACGTCCT
TATCCAATGGAGGTAGTGTTAAAAAGAATAAATAGTTAAATTTCTCTATGGTGCAATACATTGGTTTATG
AAAAATGAAAATATCATTTCATAAAGACAAAATATGAATATAATTTTTAAATATATAAAAAGTGCGATAAA
TTAATTTTATTATGGTTGAATTTATGAGATTAATTATTTTATCATTTAGTTATAATATTTAAAAATCAATTTTA
TAATAAGTTTATATTTTTTAAAAATTAATTTAACATCAAGTTATGAAATTTATGAATCAATTTATCATTTTAT
AGGATTGATTTATTGTATTTTTTATATATTTAAAAATTAAAATTAAATTTTTCTTATTTTAAAAATTGATTTA
TCAATGTTGCATATTTTGATGGATGAATTTGATTATTTAACCAAAATTAAAAATTAAAATTACCAATAATAT
CCCTATGTGGTGTAACCATGCATGGACCCACTTTCAATGCCCAATCCCCACATGTCCTTCTTCATTAGCC
TAGCCAACACGTACCCACCGTACAATATACAAGTGTCATTTTCTCCTCTCTTCTTTCTTCATGTTGCCTAT
CTCTCATTGGTTCACTTCTCTATACTTCAATTTCCACCAAACAAAACTCTTCTCGGATCCTTACTATGCTC
ACTCATTAGTCACACACCCTTATAACCCCCTCTCTTCCAACGCCCTCCTTCCTTTATAACTCTCCCCCCCC
CCTTTACCCTCTTTGTCAACAACAGTGTTCCCATAGGAGATAATAAAAATCCTCTCATCATTCTGCCTCA
GCCTCATTGCATCCCACAAACTATAGGATCCTCACATTGCTAGCACCATGATCAAGACCTTGAATCCTTA
CCCAAATCCAGCAAAAACTGCTGAGATCATGTCAAGGTACCGGCCAATAGCACCAAAGCCTGAAACCT
CTCCAAACTCCATGAGTGAGGGCCCTTCTTCCTCTTCTCTCTCCCAGAAGATCAAGCAATCTCCTTACC
TTAGGAATTTATGGCCACAGCTTCAAGCCAGACCCACCAGGACCAGAAAGAGAGGTAGAGCTCCTTTG
ACACTACCCTCTTCCTCCCTCAAGAGACACAAGACAACACATCATCATGTCCTAGGATTTTGTCCCCCT
TGTCATCATGTTGTTACATCATCATCATCATCCCCATCCAAAAACCTTTCCTTGCAGGGATTTGCTCCTCC
ACACCCTCTTCCTCATCATCTTGGAGTGCTCAATTGCACCATGGAGAAAAACAACACCAATCCAAGCTT
AGTGACACTTCCACTCCTTCCATGCTCTCCAACATTAACAACCAAGCCTTGTGCGGGTGAAGTCATAAA
CTTGAACACCAAAGCGAGTGTTCCTGAAGAGAAAGATCTCTTGCAACAACTTCAAAAACCAGTTTCCA
ACAACATTATTAATGTCATAACACCTCAACCAATTCGCCCCATTGGTTCTTCCATAAGCGTTGTGTGCAT
TAGTGAAGACTCAACTCTGTCACCTCTTGCTCAAACACCAAAAAAACCAAACGAGGTTGAACAAGAG
GTTGAGAATGAAGCCTTGCCAACTGTCATATCAGACTCAAACCACAGAATCAGGATGGCGAATTCTGC
ATACAAGGAAATGGTGGGCCAGCCAGTGTGTCCTTGGCTTGAATCCATGGGAAACCTACTTCAATGCA
GGAGGATCAGTGGTGAGGTGACACTGAATCTCAGTGACTCATCAACTGTTATTCCAACTTCATCAAACG
GTTTCTCTTGCTGGGTGAGGATAGAGTGGCTGAGTGAACACAACAATAAGAAGAAGAACTGTATCAAC
GCATTCTGTGATGTGATGAAGTTGGCTTGTGAATCCAGGGATTATCTTTTCACATGGAGGTTCCACACTC
GTACTACCAGGGAAGCTTCTCAATCAAGTTGCAACGCTTGAAATTAATTAATATATCTTAATCAATGCAC
ATATAGTTTTCTAGCTAGCTAGACTCTAGTACCATGATCGATGATGACTAGCTTTCTTGTCTGCTATCGAT
ATACATATATGTACATGGTTATATAGTATTGCTATTAGGGATGATCAAATATAGTTTTGCCTATGTTTCTTTT
TACTAAAATGTCTTGATCAGGACCTTGTTCTTCTGCTGATAGATCAAAAATATGTATCAAGAACCAAGCT
ATTTAGTATTTAATTACTATATAAACTCTTTTCCAAGTACAAATTCGGGAAACGGGTTTACCCGACTATTA
TTTTAACTTAGCATACAGTTTTACATAAACAAAAAGATCACAAAAAGGGGGAAATTGCACTATTGTTTT
CCGGCTTTTTTGCCGAATGAAATATTGTCTTTATTCATAGTATATTTATTAGGACGTAATAAAGAAGTTGA
AGATGATAAAAACAAGGTGGTGAGATGGAGACGTTACTGCCTCGGTTTTTATAAGGTGGTCTTCATGTA
GACTATACTGAGGGAGGTAATTTGGGGGAAAAGAGAGGAATTTATTGCAAGGGATATGATGGAAAAAG
TAATAAAAGAGGACATCACGAAAAGGGTGAGGCAAGAAAGGTCTTAGTAAAACATTGAGGCAGAGAC
ACCTTTTAAACAAGGT
SEQ ID NO:26(Gm-sgRNA3)
GTTGGTTCCTCCATAAGCGTTGG
SEQ ID NO:27(Gm-sgRNA4)
GCTGTATTATTTGGGTAATTAGG
SEQ ID NO:28(OE-GmSS1-F人工序列)
Figure BDA0004151170690000231
SEQ ID NO:29(OE-GmSS1-R人工序列)
Figure BDA0004151170690000232
/>

Claims (10)

1.花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1的应用，其特征在于：所述应用为在调控花生籽仁可溶性糖含量中的应用，基因AhSS1包含来自栽培花生两套亚基因的两个同源基因分别为AhSS1a和AhSS1b；所述基因AhSS1b核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；基因AhSS1a核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
2.花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1a和AhSS1b编码的蛋白质在作物遗传改良中的应用，其特征在于：基因AhSS1b编码的蛋白序列如SEQ ID NO:3所示；基因AhSS1a编码的蛋白序列如SEQ ID NO:13所示。
3.花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1的等位变异在作物遗传改良中的应用，其特征在于，所述花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1的等位变异包括去功能化等位变异ahss1b和ahss1a，去功能化等位变异ahss1b的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；去功能化等位变异ahss1a的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示。
4.权利要求1所述的花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1在基因工程改良中的应用，其特征在于：利用基因编辑技术对花生品种中的基因AhSS1a或/和AhSS1b的基因启动子区、编码区、内含子区或3’非翻译区进行改造、或利用RNAi干涉技术降低花生品种中的基因AhSS1a或/和AhSS1b的表达量、或利用转基因技术过表达AhSS1a或/和AhSS1b或其同源基因以改变花生籽仁可溶性糖含量。
5.含权利要求1所述的花生籽仁可溶性糖含量基因AhSS1的过表达载体在基因工程改良中的应用，其特征在于，利用在花生籽仁中高表达外源基因的载体将所述基因AhSS1a或AhSS1b导入常规品种使其在花生籽仁中超量表达，能够显著降低花生籽仁可溶性糖含量，进而培育出低可溶性糖含量的花生品种。
6.含权利要求1所述的花生籽仁可溶性糖含量基因AhSS1的基因编辑载体在基因工程改良中的应用，其特征在于，通过基因编辑技术，对基因AhSS1进行基因敲除，以提高花生籽仁含糖量。
7.花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1的启动子在作物遗传改良中的应用，其特征在于：所述启动子包括来自栽培花生两套亚基因的两个同源基因AhSS1a和AhSS1b的启动子，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:4所示；该启动子核心区能够特异性地启动下游基因在花生籽仁中特异性表达，而在其他组织中不表达或微量表达。
8.花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1的同源基因在大豆基因工程改良中的应用，其特征在于：所述花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1在大豆中的同源基因有两个，分别为GmSS1和GmSS2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25；在大豆中将上述两个基因分别敲除或同时敲除均能够提高大豆籽仁的含糖量。
9.根据权利要求8所述的花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1的同源基因在大豆基因工程改良中的应用，其特征在于：利用基因编辑技术对GmSS1和GmSS2的基因启动子区、编码区、内含子区或3’非翻译区进行改造、或利用RNAi干涉技术降低大豆中的同源基因GmSS1和GmSS2的表达量、或利用转基因技术过表达大豆中的同源基因GmSS1和GmSS2或其同源基因以改变大豆籽仁可溶性糖含量。
10.一种克隆权利要求1所述花生基因AhSS1的引物，其特征在于：基因AhSS1b在基因组水平和cDNA水平的克隆引物均可采用引物对AhSS1b-F/R，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7-8；基因AhSS1b启动子的克隆引物对为AhSS1b-pro-F/R，其核苷酸序列如SEQ ID NO:9-10；基因AhSS1a在基因组水平和cDNA水平的克隆引物对为AhSS1a-F/R，其核苷酸序列如SEQ IDNO:15-16。
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