CN116024258A

CN116024258A - 花生AhP5CS2基因在提高植物抗逆性中的应用

Info

Publication number: CN116024258A
Application number: CN202211493016.1A
Authority: CN
Inventors: 徐扬; 张智猛; 戴良香; 丁红; 张冠初; 郭庆; 秦斐斐
Original assignee: Shandong Peanut Research Institute
Current assignee: Shandong Peanut Research Institute
Priority date: 2022-11-25
Filing date: 2022-11-25
Publication date: 2023-04-28

Abstract

本发明公开了花生AhP5CS2基因在提高植物抗逆性中的应用，属于提高植物抗逆性技术领域。本发明中花生AhP5CS2基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。将该基因构建植物表达载体，转化烟草，能够显著提高烟草萌发期、幼苗期和成苗期的抗逆性。因而，花生AhP5CS2基因在提高植物抗逆性中具有潜在的应用价值。

Description

花生AhP5CS2基因在提高植物抗逆性中的应用

技术领域

本发明属于提高植物抗逆性技术领域，具体涉及一种花生AhP5CS2基因在提高植物抗逆性中的应用。

背景技术

随着人口增多、环境恶化，耕地面积日益减少，常规耕地生产力水平进一步提升面临瓶颈，通过提高干旱、半干旱地区的整体改良技术能力、大幅度提高干旱、半干旱地区的生产力水平和农业生产效率，对增加后备耕地资源储备和保障国家粮食安全具有重要意义。花生主要种植在干旱、半干旱亚热带地区，每年因干旱导致花生减产20％以上，全球直接经济损失高达30亿美元。花生虽然具有耐贫瘠、抗干旱、适应性强的特点，但要保证干旱、半干旱地区花生稳产增产需从改良品种特性、筛选高抗品种等方面入手。

种子萌发是一个复杂变化的过程，会受各种环境条件的影响，其中干旱对花生种子的萌发影响最大，萌发优劣态势极大影响作物后期群体的构建。通过抗逆育种和遗传转化技术来改良作物品种的抗逆性，是提高干旱、半干旱地区花生发芽率和抗旱性的两大有效途径。但是，抗逆育种中传统常规杂交育种周期长，效率低，发展缓慢；而诱变育种虽然突变频率大幅提高，但是其有益突变频率低，突变方向难以掌握，化学诱变剂毒性较大，具有残留效应。遗传转化改良作物品质具有定向高效性，但目前花生抗旱基因挖掘较少，转基因花生成果严重不足；因此，筛选花生种子萌发期抗旱基因、解析其抗逆分子机制、培育耐旱抗逆新品种，是合理利用干旱、半干旱地区温光资源的有效途径。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种花生AhP5CS2基因在提高植物抗逆性中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

花生AhP5CS2基因在提高植物抗逆性中的应用，所述花生AhP5CS2基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在上述方案的基础上，所述的抗逆性为抗干旱胁迫、抗氧化胁迫、抗高盐胁迫中的至少一种。

在一个具体的实施例中，所述的抗逆性为抗干旱胁迫；具体表现为：可以使植物在干旱胁迫下，萌发期的萌发速率变快、发芽率提高，幼苗期的根长更长，成苗期萎蔫程度更低、生长更好、抗旱性更强。

含有花生AhP5CS2基因的重组载体、重组菌、表达盒、转基因细胞系，所述花生AhP5CS2基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

一种提高植物抗逆性的方法是将花生AhP5CS2基因的编码区序列构建到植物表达载体中，转化植物细胞，使其在植物中表达，以提高植物抗逆性；所述花生AhP5CS2基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在上述方案的基础上，所述提高植物抗逆性的方法可以提高植物萌发期、幼苗期和成苗期的抗逆性。

在一个具体的实施例中，所述提高植物抗逆性是通过提高植物中脯氨酸和可溶性糖含量实现的。

花生AhP5CS2基因在提高植物中脯氨酸和/或可溶性糖含量中的应用，所述花生AhP5CS2基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

一种提高植物中脯氨酸和/或可溶性糖含量的方法，是将花生AhP5CS2基因的编码区序列构建到植物表达载体中，转化植物细胞，使其在植物中表达，以提高植物中脯氨酸和/或可溶性糖含量；所述花生AhP5CS2基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明技术方案的优点

本发明将花生AhP5CS2基因全长cDNA连接到过表达载体启动的表达载体上，农杆菌介导的叶盘法转化烟草，发现该基因过表达可以使模式植物烟草萌发期和苗期出现抗旱表型，具体表现为萌发出苗更快，发芽率更高；幼苗根长更长，成苗更抗旱。AhP5CS2转基因烟草的脯氨酸和可溶性糖含量在干旱胁迫下迅速升高，可有效缓解干旱胁迫对植物造成的伤害。因而，花生AhP5CS2基因在提高植物抗逆性中具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为克隆到的目的基因AhP5CS2电泳图；

图2为AhP5CS2-pMD19-T simple载体的酶切结果图；

图3为目的基因连到pBI121表达载体质粒酶切结果图；

图4为RT-PCR鉴定转基因株系阳性苗中AhP5CS2表达量(其中1号泳道为野生型WT，其余泳道为转基因株系)；

图5为不同烟草株系萌发期抗旱性结果；

图6为不同烟草株系幼苗期抗旱性结果；

图7为不同烟草株系成苗期抗旱性结果；

图8为不同烟草株系中脯氨酸和可溶性糖含量图。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

pMD19-T simple克隆载体购买自Takara T-Vector pMD^TM19(Simple)；CodeNo.3271；

大肠杆菌DH5α菌株购买自Solarbio；Code No.C1100；

带有35S的pBI121空载体购买自懋康MKbio；Code No.MF3721-5UG；

农杆菌LBA4404购买自Tolo Bio；Code No.CC96302。

以下实施例中采用农杆菌介导的叶盘法将表达载体导入到模式植物烟草中；在实际应用中，导入方法还可以采用其他方法例如发芽种子真空侵染法等。

以下实施例中花生RNA的提取和纯化可采用天根RNA prep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(DP441)，也可直接用Trizol法提取；cDNA第一链的合成采用天根FastKing一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂(KR118)，也可以采用现有的工艺或者其他试剂盒。但是上述两者均优选采用本发明所记载的具体方法。之后利用cDNA第一链作为模板，用AhP5CS2对应的特异性引物以获得的cDNA为模板进行Phusion高保真酶扩增。

实施例1花生AhP5CS2基因的克隆

花生AhP5CS2基因(Arachis hypogaea delta1-pyrroline-5-carboxylatesynthase)编码Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶，是谷氨酸途径合成脯氨酸的关键酶，其CDS序列(5’→3’)为2103bp(序列如SEQ ID NO:1所示)，编码700个氨基酸的合成酶(序列如SEQ IDNO:2所示)。

SEQ ID NO:1：

ATGCAGCCTCCCGTCAAAAATGGTTTCAACGTGTTTTTGGGCAACTCGACGGAGTGGCGCCTTTCGAATGGGCCGGCTTACTTGAACTCGCCGACGGCATACATAGAACCTGAATCAGTCACCTTGGATCCTTCTCGAGCTTTCTTGAAGGATGTCAAGCGCCTCATCGTTAAGGTTGGAACTGCGGTGGTTACTCGCAGCGATGGAAGATTAGCATTGGGGAGACTTGGAGCTCTTTGTGAGCAGCTTAAAGAATTAAATTCTAGGGGATATGAGGTTATATTAGTGACTTCAGGTGCTGTCGGCCTTGGACGTCAAAGACTAAGATATCGCAGATTGGCCAATAGCAGTTTTTCGGATCTTCAAAAGCCACAAGGTGAATTCGATGGAAAAGCATGTGCAGCCGTTGGGCAGAGTAGTCTTATGGCTCTCTATGATACCATGTTCAGCCAGCTTGATGTGACTTCATCCCAACTTCTTGTGAATGATGGCTTCTTTAGGGATGCAGGTTTCAGAAAACAACTTTCAGACACTGTGCACTCACTATTGAATTTAAGAGTTATCCCCATTTTCAATGAAAATGATGCTGTTAGTACTAGGAAGGCACCATATGAGGACTCATCTGGTATATTCTGGGACAATGACAGTTTGGCTGGTTTATTAGCATTGGAACTAAAGGCTGATCTTCTTGTTCTGTTGAGTGATGTTGAAGGCCTTTATAGTGGCCCTCCATCTGACCCAAACTCAAAGCTAATTGATACATATGTGAAAGAAAAGCATCAAAAGGAAATCACTTTTGGAGACAAATCAAGATTGGGGAGAGGGGGTATGACTGCCAAAGTTAATGCTGCTGTTTGTGCTGCTTATGCTGGCACCCCGGTCATCATTACTAGTGGCTATGCAACAGACAACATCATAAGAGTACTCCAAGGAGATAGAATTGGCACTGTTTTCCACAAAGATGCACATCTGTGGGCCCACATAAAGCAAGTGAGTGCACGTGAGATGGCAATTTCAGCACGTGATTGTTCAAGACGACTTCAATCTTTAAACTCTGAAGAAAGGAGGAAGATATTGCTAGCAGTGGCAGATGCACTAGAGAACAATCTAAGCTTGATAATGGAAGAGAATGGAGTTGATATTGCTGATGCAGAGCTTGCTGGATTGGAAAAATCACTCATCTCTCATTGCTGGGCTTGTGAAATCTGTTCGAATCTAGCAGATAAACTCACACTGGAGCGAATATCGTGTCCTTTGGGTGTTGTCCTAGTTATTTTTGAGTCACGACCAGATGCCCTTGTCCAGATTGCTGCTTTGGCAGTTCGAAGTGGAAATGGTTTATTGCTTAAAGGTGGAAAGGAAGCCAAAAGATCAAATGCTGCCTTACACAAGGTTATTACTTCAGCTATTCCAGAAAAAGTTGGTGACAAACTTATAGGACTTGTGACTTCAAGGGAAGAGATCCCAGATTTGCTTAAGCTTGATGATGTGATAGATCTTGTTGTCCCCAGAGGCAGTAACAAGCTTGTTTCTCAAATCAAGGAATCAACAAAGATTCCTGTCCTCGGTCATTCTGATGGAATTTGTCATGTGTATGTTGACAAAGCTGCTAATATTGATATGGCGAAGCAGATTGTTAAGGATGCAAAGATTGATTATCCTGCAGCTTGCAATGCAATGGAAACCCTTCTTGTACACAAGGATCTGTCAGAAACTGGTGGACTTAATCAACTTGTTGCTGAACTCACAAAAGAAGGTGTTGAACTATATGGTGGACCAAGAGCAAGTGGCTTATTGAACATTACTAAAACAAGTTCTTTCCATAAGGATTCTCATACTGAATGCATTGTTACAGAAGACCCTGAAGTTGCTGAAACTTTCTTACGTCGAGTTGATAGTGCTGCTGTATTCCACAATGCAAGTACAAGGTTCTGTGATGGAGCACGCTTTGGTCTTGGAGCAGAGGTGGTTGGAATAAGCACCAGCAGAATTCATGCTCGAGGCCCTGTAGGAGTTGAGGGGATATTGAGAGGGAGTGGGCAAGTGGTAGACGGTGATCGAGGGGTCACTTACACTCACAAGGAACTTCCAATCATAGCATGA

SEQ ID NO:2

MQPPVKNGFNVFLGNSTEWRLSNGPAYLNSPTAYIEPESVTLDPSRAFLKDVKRLIVKVGTAVVTRSDGRLALGRLGALCEQLKELNSRGYEVILVTSGAVGLGRQRLRYRRLANSSFSDLQKPQGEFDGKACAAVGQSSLMALYDTMFSQLDVTSSQLLVNDGFFRDAGFRKQLSDTVHSLLNLRVIPIFNENDAVSTRKAPYEDSSGIFWDNDSLAGLLALELKADLLVLLSDVEGLYSGPPSDPNSKLIDTYVKEKHQKEITFGDKSRLGRGGMTAKVNAAVCAAYAGTPVIITSGYATDNIIRVLQGDRIGTVFHKDAHLWAHIKQVSAREMAISARDCSRRLQSLNSEERRKILLAVADALENNLSLIMEENGVDIADAELAGLEKSLISHCWACEICSNLADKLTLERISCPLGVVLVIFESRPDALVQIAALAVRSGNGLLLKGGKEAKRSNAALHKVITSAIPEKVGDKLIGLVTSREEIPDLLKLDDVIDLVVPRGSNKLVSQIKESTKIPVLGHSDGICHVYVDKAANIDMAKQIVKDAKIDYPAACNAMETLLVHKDLSETGGLNQLVAELTKEGVELYGGPRASGLLNITKTSSFHKDSHTECIVTEDPEVAETFLRRVDSAAVFHNASTRFCDGARFGLGAEVVGISTSRIHARGPVGVEGILRGSGQVVDGDRGVTYTHKELPIIA

上述花生AhP5CS2基因的克隆方法如下：

(一)提取花生总RNA

使用天根RNA prep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(DP441)提取花生的总RNA，具体步骤如下：

1.花生种子Tifrunner萌发5d，取材后液氮中充分研磨成粉末，取0.1g于RNase-Free离心管中，加入500μL RL(需提前加入β-巯基乙醇)，漩涡振荡混匀，室温放置1-3min；

2.12,000rpm离心2min；

3.将上清转移溶液至过滤柱CS上(过滤柱CS放在收集管中)，12,000rpm离心2min，小心吸取收集管中的上清至RNase-Free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀；

4.缓慢加入0.4倍上清体积的无水乙醇，混匀，将溶液全部转入吸附柱CR3中，12,000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

5.向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

6.向吸附柱CR3中央加入80μL的DNase I工作液，室温放置15min；

7.向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

8.向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW(需提前加入乙醇)，12,000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中，重复上述步骤一次；

9.12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置5-10min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

10.将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μL RNase-Free ddH₂O，37℃放置2min，12,000rpm离心2min，得到RNA提取液。

(二)将提取的花生总RNA反转录成cDNA

使用天根FastKing一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂(KR118)进行反转录：

取1μg总RNA，加入5×FastKing-RT SuperMix 4μL，补水到20μL，42℃反应15min，95℃失活3min。

(三)AhP5CS2基因的克隆

以上述制备的花生cDNA作为模板，采用如下引物对用于PCR扩增花生AhP5CS2基因。

克隆AhP5CS2基因的引物对序列：

上游引物5’-TCTAGAATGCAGCCTCCCGTCAAAAATGG-3’(SEQ ID NO:3)；

下游引物5’-GTCGACTGCTATGATTGGAAGTTCCTTGTG-3’(SEQ ID NO:4)；

其中下划线处为酶切位点，上游引物的酶切位点为XbaI，下游引物的酶切位点为SalI。

使用诺唯赞

Max Super-Fidelity DNA Polymerase高保真酶进行扩增，反应体系为：2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTP Mix(10mM)1μL，上游引物2μL，下游引物2μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL，cDNA模板1μL，水补齐到50μL。

反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15sec，55℃退火15sec，72℃延伸90sec，共35个循环；72℃后延伸5min。

反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，检测到目的条带后，如图1所示，切胶并进行胶回收，胶回收方法根据天根公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209)进行。

高保真酶扩增的产物末端为平末端，需要进行加尾反应，反应体系如下：10×反应缓冲液2μL，dNTP 1.5μL，Taq酶0.2μL，胶回收产物补齐到20μL。72℃反应30min。

取上述4μL加尾产物与pMD19-T simple克隆载体进行TA连接，16℃过夜连接，热激法转化大肠杆菌DH5α菌株，在含有氨苄霉素的LB平板上生长过夜。挑取白色单个菌落到LB培养液，37℃培养4-6h后进行菌液PCR，选取阳性菌落在含有氨苄霉素的LB液体培养基中过夜。

使用天根质粒小提试剂盒(DP103)提取上述阳性菌的质粒DNA，由生工生物工程(上海)股份有限公司限公司完成测序，保留测序正确的质粒命名为AhP5CS2-pMD19-Tsimple，待用。

实施例2含有花生AhP5CS2基因的过表达载体

含有花生AhP5CS2基因的过表达载体由以下方法构建而成：

用XbaI和SalI酶切AhP5CS2-pMD19-T simple和带有35S的pBI121空载体，37℃酶切一个小时，进行琼脂糖凝胶电泳，切除正确的条带进行胶回收，其中AhP5CS2-pMD19-Tsimple的酶切结果如图2所示。利用Thermo公司的T₄ DNA连接酶将酶切后获得的目的片段与酶切后的pBI121载体连接过夜，连接产物转化DH5α菌株，在含有卡那霉素的LB平板上生长过夜。挑取白色单个菌落到LB培养液，37℃培养4-6h后进行菌液PCR，选取阳性菌落在含有卡那霉素的LB液体培养基中过夜。质粒DNA的提取：使用天根质粒小提试剂盒(DP103)提取质粒DNA，XbaI和SalI酶切鉴定，如图3所示。构建得到35S::AhP5CS2的过表达载体。

以上是以pBI121空载体为例进行说明，也可以根据转化目标的类型选择其他合适的表达载体。

实施例3过表达AhP5CS2的转基因烟草的获得

将实施例2构建的35S:AhP5CS2过表达载体转化烟草的方法，步骤如下：

(一)含有35S::AhP5CS2的农杆菌的获得：

1.农杆菌(LBA4404)感受态细胞置于冰上融化，加入3μL 35S::AhP5CS2质粒，然后冰浴30min，液氮冷冻1min，37℃水浴5min；

2.加入1mL YEP培养基，28℃下200rpm振荡培养至对数生长期；

3.8000rpm离心2min，离心弃上清，取沉淀涂布于含卡那霉素和利福平的YEP平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天；

4.挑取单个菌落到YEP培养液，28℃培养4-6h后进行菌液PCR，选取阳性菌落3-4个，加20mL左右YEP(卡那霉素加利福平)培养基中，过夜培养。获得含有35S::AhP5CS2农杆菌菌液。

(二)农杆菌介导的叶盘法转化烟草

1.将长至2-3片真叶期普通烟移至小盆中培养，至叶片较健壮时备用；

2.取健壮普通烟叶片，清水冲洗2-3次，用70％乙醇消毒30sec，0.1％升汞(HgCl₂)消毒10min，然后用无菌水来冲洗5-6次，用无菌滤纸吸去叶片表面液体；

3.将叶片剪成0.5×0.5cm的小块，然后置于MS的分化培养基(MS培养基+0.1mg/LNAA+1.5mg/L 6-BA)中，25℃长日照(16h光照/8h黑暗)培养箱中预培养约2d；

4.吸取含有35S::AhP5CS2农杆菌菌液50μL接种于YEP培养基(含卡那霉素和利福平)中，28℃200rpm振荡培养24h至对数生长期，8000rpm离心5min，弃上清后用MS液体培养基(MS基础培养基，青岛海博生物，HB8469)悬浮沉淀，调OD600至0.4-0.6；

5.用重悬的农杆菌菌液浸泡预培养烟草叶片5-10min，用无菌滤纸吸去多余的菌液，将叶片转至MS固体培养基中，黑暗下，25℃共培养2d；

6.先用含羧苄青霉素(250mg/L)的无菌水将共培养过的外殖体冲洗2-3次，再用含羧苄青霉素(250mg/L)的MS液体培养基冲洗1次，用无菌滤纸吸干液体，转到MS选择培养基上(MS培养基+0.1mg/L NAA+1.5mg/L 6-BA+50mg/L卡那霉素+250mg/L羧苄青霉素)，置于25℃长日照培养箱中培养，每隔15d左右更换一次培养基；

7.待芽长至约l cm时，用无菌镊子将其移入MS生根培养基(MS培养基+0.1mg/LIAA+50mg/L卡那霉素+250mg/L羧苄青霉素)中，促进生根；

8.再生苗转移至土中，25℃长日照温室中常规管理。

(三)过表达AhP5CS2转基因烟草阳性苗的筛选

1.转化植株生长至8周时，取叶片提取基因组，进行PCR鉴定，将阳性转基因单株收获获得T₁代。

2.T₁代繁殖获得T₂，取叶片提取RNA，用RT-PCR检测转基因株系，选取表达量高的株系繁殖并用于进一步实验。

如图4，经RT-PCR检测，共获得5个AhP5CS2过表达转基因株系，选取AhP5CS2表达量不同的转基因株系OE1、OE2和OE3用于后续研究。

实施例4 AhP5CS2基因在提高烟草抗旱性中的应用

(一)AhP5CS2基因在提高烟草萌发期抗旱性中的应用

以实施例3获得的转基因烟草阳性株系OE1、OE2和OE3作为试验材料，并以未转基因的野生型烟草作为对照(WT)。烟草种子用70％乙醇消毒5min，离心弃上清，然后用2.6％的次氯酸钠消毒10min，离心弃干净上清，最后用无菌ddH₂O冲洗5-6次，将消毒的无菌种子整齐的点铺在含有不同浓度PEG的MS固体培养基上。4℃避光处理3天，放置于25℃长日照培养箱生长10d，每隔12h数一次萌发。种子突破种皮视为萌发，统计每天的烟草种子发芽率。所有试验进行3次生物学重复。

试验结果如图5所示，图5中A指的是不同烟草株系的种子在含不同浓度PEG的MS固体培养基上的萌发情况；图5中B-E分别指的是不同烟草株系的种子在含不同浓度PEG的MS固体培养基上随时间变化的萌发情况。图5中A、B均可说明转基因阳性植株在萌发期具有抗旱的表型。在MS培养基中转基因烟草种子与对照萌发率并没有表现出差异，而在较高浓度PEG的培养基上生长时，差异显著：其中10％ PEG条件下，WT萌发率为89.70％左右，OE1和OE2萌发率分别能达到100％和98.37％，OE3能达到93.43％；15％ PEG条件下，WT萌发率为79.33％左右，OE1、OE2和OE3萌发率分别能达到92.27％、90.57％和83.83％，OE1、OE2两个转基因阳性株系的种子萌发率要明显高于对照，分别提高萌发率16.30％和14.16％，OE3的抗旱能力低于OE1和OE2，与WT差异较小，这是由于其中AhP5CS2表达量低于OE1、OE2。综上表明，AhP5CS2可以提高干旱胁迫下烟草种子的发芽率，并且提高程度与AhP5CS2的表达量有关。

(二)AhP5CS2基因在提高烟草幼苗期抗旱性中的应用

以实施例3获得的转基因烟草阳性株系OE1、OE2和OE3作为试验材料，并以未转基因的野生型烟草作为对照(WT)。烟草种子用70％乙醇和2.6％次氯酸钠消毒后，整齐的点铺在含有不同浓度PEG的MS固体培养基上。4℃避光处理3天，放置于25℃的长日照培养箱竖立培养10d，统计不同培养皿上烟草株系的根长。所有试验进行3次生物学重复。

试验结果如图6和表1所示，图6中A指的是不同烟草株系的幼苗在含不同浓度PEG的MS固体培养基上的表型图；B指的是不同烟草株系的幼苗在含不同浓度PEG的MS固体培养基上的根长长度。由图6中A、B和表1可以看出：在MS培养基中转基因烟草种子与对照长势基本一致，而在10％ PEG条件下，OE1和OE2的根长高于对照22.32％和17.81％；15％ PEG条件下，OE1和OE2的根长高于对照33.90％和32.61％；转基因株系OE3仅提高8.88％(10％ PEG)和7.73％(15％ PEG)，抗旱能力低于OE1和OE2。以上结果说明转AhP5CS2基因可以提高烟草幼苗期抗旱性。

表1

(三)AhP5CS2基因在提高烟草成苗期抗旱性中的应用

以实施例3获得的转基因烟草阳性株系OE1、OE2和OE3作为试验材料，并以未转基因的野生型烟草作为对照(WT)。将转基因烟草和野生型烟草种子撒在培养钵里，25℃的长日照培养10d。长势较好的烟草幼苗转移至培养钵中，每钵一株，生长40d，挑选生长健康，长势一致的转基因和野生型烟草进行干旱处理10d。

观察各个烟草株系的长势结果如图7所示，转基因阳性植株在成苗期具有抗旱的表型。正常条件下转基因与非转基因烟草长势一致，但干旱处理10d后，非转基因烟草萎蔫严重，但转基因烟草萎蔫程度较轻，萎蔫程度WT>OE3>OE2>OE1。

干旱胁迫对转基因烟草株系中脯氨酸和可溶性糖的影响

以实施例3获得的转基因烟草阳性株系OE1、OE2和OE3作为试验材料，并以未转基因的野生型烟草作为对照(WT)。将烟草种子用70％乙醇和次氯酸钠消毒后，均匀撒在含有不同浓度PEG的MS固体培养基上。4℃避光处理3天，放置于25℃的长日照培养箱竖立培养10d，取材用于脯氨酸和可溶性糖含量测定。

脯氨酸含量测定方法为：

1.先配置不同浓度的脯氨酸标准液，沸水浴30min，取出冷却至室温，加入甲苯混匀后萃取红色物质，测其在520nm的OD值，绘制标准曲线；

2.取不同处理培养皿上烟草幼苗各0.1g于研钵中，加入3％的磺基水杨酸充分研磨成匀浆，转入带塞试管中；

3.将试管放入沸水浴中反应15min，过滤；

4.分别取出过滤液2mL转入带塞试管中，依次加入2mL蒸馏水，4mL酸性茚三酮以及2mL冰醋酸，混合摇匀，然后沸水浴2h；

5.2h后取出滤液，冷却至室温，分别加入4mL甲苯，摇匀萃取；

6.静置10min后，吸取上清液，在520nm处测定吸光度值。

可溶性糖含量测定方法为：使用苏州科铭生物技术有限公司的可溶性糖测定试剂盒(KT-1-Y)测定烟草可溶性糖。

试验结果如图8和表2所示，图8中A、B和表2均可说明干旱胁迫下转基因阳性烟草植株中脯氨酸和可溶性糖迅速积累，显著高于对照，转基因株系OE1、OE2较OE3差异更显著，这说明转基因烟草是通过提高脯氨酸和可溶性糖的含量来缓解干旱胁迫、渗透胁迫对植物造成的伤害，增强植物抗旱性。

表2

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims

1.花生AhP5CS2基因在提高植物抗逆性中的应用，其特征在于，所述花生AhP5CS2基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗逆性为抗干旱胁迫、抗氧化胁迫、抗高盐胁迫中的至少一种。

3.含有花生AhP5CS2基因的重组载体、重组菌、表达盒、转基因细胞系，其特征在于，所述花生AhP5CS2基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.一种提高植物抗逆性的方法，其特征在于，将花生AhP5CS2基因的编码区序列构建到植物表达载体中，转化植物细胞，使其在植物中表达，以提高植物抗逆性；所述花生AhP5CS2基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

5.根据权利要4所述提高植物抗逆性的方法，其特征在于，所述的抗逆性为抗干旱胁迫、抗氧化胁迫、抗高盐胁迫中的至少一种。

6.花生AhP5CS2基因在提高植物中脯氨酸和/或可溶性糖含量中的应用，其特征在于，所述花生AhP5CS2基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

7.一种提高植物中脯氨酸和/或可溶性糖含量的方法，其特征在于，将花生AhP5CS2基因的编码区序列构建到植物表达载体中，转化植物细胞，使其在植物中表达，以提高植物中脯氨酸和/或可溶性糖含量；所述花生AhP5CS2基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。