CN117535340A - 蛋白质pce1在调控高粱株高和粒重中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了蛋白质PCE1在调控高粱株高和粒重中的应用。所述蛋白质PCE1为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。获得的PCE1蛋白单碱基缺失突变突变体材料pce1与WT相比，突变体pce1的株高和粒重显著减少。将PCE1蛋白的编码基因的特异片段进行转基因沉默，得到T2代沉默PCE1基因高粱，与转基因受体材料P898012相比，T2代沉默PCE1基因高粱的株高和和粒重均显著减少。因此，降低蛋白质PCE1在高粱中的表达量，可以调控高粱的株高和粒重。本发明在调控高粱株高和粒重方面具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及蛋白质PCE1在调控高粱株高和粒重中的应用。
背景技术
高粱(Sorghum bicolor L.Moench)属禾本科高粱属一年生C4草本植物，起源于非洲，是人类最早栽培的重要谷类作物之一，也是仅次于水稻、玉米、小麦和大麦的第五大粮食作物。高粱光能利用率高，适应性强，具有耐旱、耐涝、耐寒、耐盐碱等多重抗性，广泛分布于干旱、半干旱和低洼易涝及盐碱地区，同时高粱用途广泛，有食用、饲用、酿造用、生物能源用和化工材料用等多种类型，是具有开发潜力的饲料作物和绿色能源作物。
随着人们对淡水资源需求的增加，耕地面积的减少和全球气候变暖的严峻环境条件，耐旱抗逆作物高粱在供给全球不断增加的粮食需求上越来越重要。高产高粱品种的培育和种植将对世界粮食安全问题产生深远影响。株高和籽粒产量是影响高粱生物量和产量的重要农艺性状，因此，克隆高粱中的相关基因并将其应用于高粱育种生产中具有重要的理论意义和实践价值，也是高粱株型和粒重调控的有效途径，近年来，高粱粒重基因的克隆进展较慢，亟需提供影响高粱粒重的分子。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何调控高粱的株高和粒重。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质PCE1在调控高粱株高和粒重中的应用；
所述蛋白质PCE1可为a1)或a2)或a3)：
a1)氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的蛋白质；
a2)在SEQ ID NO.1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加得到的与高粱株高和/或粒重相关的蛋白质。
其中，SEQ ID NO.1由139个氨基酸组成。
优选的，a2)所述的标签如表1所示，连接所述标签为了使a1)中的蛋白质便于纯化。
表1标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
优选的，上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
优选的，上述a3)中的蛋白质由人工合成得到。
优选的，上述a3)中的蛋白质先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述a3)中蛋白质的编码基因可以通过将SEQ ID NO.2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5’端和/或3’端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码所述蛋白质PCE1的核酸分子在调控高粱株高和粒重中的应用也属于本发明的保护范围。
编码所述蛋白质PCE1的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：
b1)编码区如SEQ ID NO.1所示的DNA分子；
b2)核苷酸序列是SEQ ID NO.2所示的DNA分子；
b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质PCE1的DNA分子；
b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质PCE1的DNA分子。
其中，所述核酸分子是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；
优选的，所述核酸分子是RNA，如mRNA或hnRNA。
其中，序列表中SEQ ID NO.2由832个核苷酸组成，序列表中SEQ ID NO.2的核苷酸编码序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质PCE1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质PCE1的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质PCE1，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的属于“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表的SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质PCE1的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
本发明还保护一种培育转基因高粱的方法，步骤如下：抑制出发高粱中上述任意所述蛋白质PCE1的表达量/或活性，得到转基因高粱；与出发高粱相比，转基因高粱的株高和粒重降低。
上述方法中，抑制出发高粱中上述任一所述蛋白质PCE1的表达量和/或活性通过向出发高粱中导入抑制编码蛋白质PCE1的核酸分子表达的物质实现。
所述抑制编码蛋白质PCE1的核酸分子表达的物质为特异DNA分子、含有所述特异DNA分子的表达盒或含有所述特异DNA分子重组质粒；
所述特异DNA分子包括正义片段、反义片段以及位于它们之间的间隔片段；
所述正义片段为SEQ ID NO.2自335至518所示DNA分子；
所述反义片段为SEQ ID NO.2自385至552所示DNA分子的反向互补序列。
上述方法中，抑制出发高粱中上述任一所述蛋白质PCE1的表达量和/或活性通过向出发高粱中导入干扰载体RNAi-PCE1实现。
所述干扰载体RNAi-PCE1为将干扰载体pFGC5941的限制性内切酶BamHI和XbaI之间的DNA小片段替换为SEQ ID NO.2自385至552所示DNA分子的反向互补序列，限制性内切酶AscI和SmiI之间的DNA小片段替换为SEQ ID NO.2自335至518所示DNA分子，得到的重组质粒。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
实验证明，向出发高粱P898012中导入所述干扰载体RNAi-PCE1，得到T2代沉默PCE1基因高粱株系RNAi-1和RNAi-2。与出发高粱P898012相比，RNAi-1和RNAi-2高粱的株高降低、穗子变短、籽粒变短变窄、粒重减小。由此可见，降低P898012中蛋白质PCE1的表达量可以调控高粱株型和粒重。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为突变体pce1与野生型表型对比图，其中，A为株高表型对比，B为穗长表型对比，C为穗粒表型对比，D为百粒对比，E为粒长表型对比，F为粒宽表型对比，G为株高对比，H为穗长对比，I为百粒重对比，J为粒长对比，K为粒宽对比；
图2为PCE1基因的克隆，其中，A为Δ(SNP-index)在染色体上的分布，B为PCE1定位；
图3为实时荧光定量PCR检测T2代沉默PCE1基因高粱系中PCE1基因的相对表达水平；
图4为沉默PCE1基因高粱的表型鉴定，其中，A为株高表型对比，B为穗长表型对比，C为粒长表型对比，D为粒宽表型对比，E为株高对比，F为穗长，G为百粒重对比，H为粒长对比，I为粒宽对比。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1、突变体pce1的创制、筛选与表型鉴定
为获得高粱突变体pce1，以高粱品种Shangzhuang为底盘材料，利用浓度为0.25％的EMS诱变12h，连续种植2代，获得M2代诱变群体，从M2代诱变群体中筛选突变体构建高粱突变体库。M3代按系种植并筛选出表型稳定且不分离的pce1突变体。与Shangzhuang相比，pce1突变体的株高降低、穗长变短、籽粒变短变窄、粒重降低，如图1所示。
实施例2、PCE1基因的克隆
将pce1突变体材料连续套袋自交2代后与Shangzhuang回交并自交，得到由271个单株构成的遗传分离群体，挑选分离群体中Shangzhuang表型与pce1突变型典型植株各20株，以等量基因组DNA混池，构建野生子代池(QUN-WT-pool)与突变子代池(QUN-pce1-pool)。同时，对Shangzhuang与突变体pce1分别构建野生亲本池(WT-pool)与突变亲本池(pce1-pool)。完成上述步骤后，利用高通量测序技术对四个混池进行高通量重测序，将两个极端性状子代池SNP-index作差，得到两个子代间的Δ(SNP-index)分布情况，参照Mut-map定位分析方法，选取置信水平为0.01的置信区间，分析发现变异位点SV1-1位于基因Sobic.001G034700的编码区，使Sobic.001G034700基因在第3个外显子处发生一个腺嘌呤(A)缺失突变，导致蛋白翻译提前终止。利用一代测序技术对混池单株进行PCR扩增和测序，验证突变位点的准确性，如图2所示。
实施例3、PCE1基因全长序列的获得
一、全基因组RNA的提取
以高粱品种Shangzhuang幼穗为材料，利用RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN)提取Shangzhuang幼穗的总RNA，再利用SuperScriptII反转录酶(Invitrogen，Cat no.18064-014)进行反转录，获得Shangzhuang的总cDNA。
二、PCE1基因的RACE实验
采用Clontech公司的RACE5’/3’Kit试剂盒，该试剂盒采用技术，可以polyA+或总RNA为起始，合成的第一链cDNA可直接进行5’和3’RACE-PCR反应，无需Adaptor连接，灵敏高效特异地获得全长cDNA序列。具体步骤如下：
1、合成用于RACE实验的cDNA(5’or3’-RACE-ReadycDNA)。
2、按照试剂盒配制5’和3’RACE反应体系，GSP引物Tm值>70℃，故采用Touchdown程序进行扩增。
3、取5μL反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，观测条带有无与条带位置，确认PCR扩增产物。
4、将5’和3’RACE的PCR反应产物分别纯化，连接至pMD18-T载体上，挑选阳性克隆进行测序。
三、PCE1基因的全长序列扩增
以步骤二获得的cDNA为模板，利用引物一进行PCE1基因的全长序列扩增，回收纯化PCR产物获得约832bp的DNA片段。测序结果表明回收的片段核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为ACTCGGCACGCAGGCAGCACAGCAGCAGCAGCCAGGACCCCCCTCCCTGCTCTTTCCCCTCCTCGCTTCGCTTCCTCGGCGGATTCCTCCTCCTCCTCTCGTCCGTGCCCTTCCGACGCGCGAGCTCGCCCGAGATGGCAAATGCAAGATCGGGTGTCGCTGTGAATGACGAGTGCATGCTGAAGTTTGGCGAGCTGCAGTCGAAGAGGCTGCACCGCTTCATAACTTACAAGATGGATGACAAGTTCAAGGAGATAGTTGTGGACCAGGTTGGGGATCGTGCTACCAGCTACGAGGACTTCACAAACAGCCTCCCTGAGAATGACTGCCGATACGCAATCTATGATTTTGACTTTGTGACTGCAGAGGATGTCCAGAAGAGCAGGATATTCTATATCCTATGGTCCCCAGACTCTGCCAAGGTGAAGAGCAAGATGCTTTACGCAAGCTCTAACCAAAAGTTCAAGAGTGGGCTCAATGGCATTCAGGTGGAGCTCCAGGCTACAGATGCAAGTGAAATCAGCATTGATCAGATCAAGGATCGGGCACGCTAGGCGCAGTGCACCGCCATCACGTGTTTCATGATCATGCATCATGGACTCGCCTACTACTGTGGATTTGTACGCCATTATAGACTTGGTGCTGTGAAAGACTGCTTGATGATTTGCAGGTTTGTTGCTGTGTAAAAAAGGTCCTCGGCTTCCAGAAGACCATGAAGGTTTGGATCTATCATGTAATTCCTTGTTATCTGCCAATTATGTATGGACTATGGACATGTGTTGCGCTGTTCAACTTACTACAAATAAGTAATCGATATGTTCCCTATTCATGA。SEQ ID NO.2自5’末端起第135至554位所示的DNA片段即为PCE1基因(具体为PCE1基因的编码区)。其中，引物一为：
引物F：5’-ACTCGGCACGCAGGCAGCACAG-3’，记为SEQ ID NO.3；
引物R：5’-TCATGAATAGGGAACATATCGA-3’，记为SEQ ID NO.4。
PCE1基因编码蛋白质PCE1，蛋白质PCE1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为MANARSGVAVNDECMLKFGELQSKRLHRFITYKMDDKFKEIVVDQVGDRATSYEDFTNSLPENDCRYAIYDFDFVTAEDVQKSRIFYILWSPDSAKVKSKMLYASSNQKFKSGLNGIQVELQATDASEISIDQIKDRAR。
实施例4、沉默PCE1基因高粱的获得及其表型鉴定
一、干扰载体RNAi-PCE1的构建
以表达载体pFGC5941为空载，利用限制性内切酶对空载进行双酶切，获得线性化载体；根据PEC1基因CDS特异区段设计特异引物，对特异引物序列进行修饰加工，以shangzhuang幼穗cDNA为模板分别扩增出正向片段与反向互补片段，采用同源重组的方法，先将正向片段连接到载体上，挑选包含正向片段的阳性质粒，将反向互补片段连接到阳性质粒的酶切位点AscI与SmiI之间。具体操作步骤如下：
1、利用RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN)与SuperScriptII反转录酶(Invitrogen，Cat no.18064-014)获得Shangzhuang的cDNA。
2、以步骤1获得的cDNA为模版，利用特异引物一对进行目标片段的PCR扩增，获得PCR产物一。
其中，对所述特异引物一进行修饰加工后的序列如下：
pRNAi-PCE1-1F：5’-TGGTCAATTTGCAGGTATTTGGATCCCGCAATCTATGATTTTGACT-3’(下划线为引物序列)，记为SEQ ID NO.5；
pRNAi-PCE1-1R：5’-TCCCGGGTCTTAATTAACTCTCTAGAATTTCACTTGCATCTGTAGC-3’(下划线为引物序列)，记为SEQ ID NO.6。
3、用限制性内切酶AscI和SmiI双酶切步骤2扩增获得的PCR产物一，纯化回收约183bp的DNA片段1。
4、利用AscI和SmiI双酶切pFGC5941载体，纯化回收载体骨架1。
5、将步骤3纯化回收的DNA片段1和步骤4酶切回收的载体骨架1进行连接，获得中间载体。
6、以步骤1获得的cDNA为模版，利用特异引物二对进行目标片段的PCR扩增，获得PCR产物二。
其中，对所述特异引物二进行修饰加工后的序列如下：
pRNAi-PCE1-2F：5’-ACATTTACAATTACCATGGGGCGCGCCAGCGTGCCCGATCCTTGATC-3’(下划线为引物序列)，记为SEQ ID NO.7；
pRNAi-PCE1-2R：5’-AACATAAGAAATTCTTACACATTTAAATGGATATTCTATATCCTATGG-3’(下划线为引物序列)，记为SEQ ID NO.8。
7、利用BamHI和XbaI双酶切步骤6扩增获得的PCR产物二，纯化回收约167bp的DNA片段2。
8、利用BamHI和XbaI双酶切步骤5纯化获得的中间载体，回收获得载体骨架2。
9、将步骤7纯化回收的DNA片段2和步骤8酶切回收的载体骨架2进行连接，获得沉默/或干扰载体RNAi-PCE1。
将构建好的RNAi-PCE1载体进行测序分析。结果表明，RNAi-PCE1载体中将pFGC5941载体中的限制性内切酶BamHI和XbaI之间的DNA小片段替换为SEQ ID NO.2自385至552所示DNA分子的反向互补序列，限制性内切酶AscI和SmiI之间的DNA小片段替换为SEQID NO.2自335至518所示的DNA分子，获得重组质粒。
二、沉默PCE1基因高粱的获得及其表型鉴定
利用农杆菌浸染的方法，转入出发高粱品种P898012中，利用特异性引物进行检测T2代转基因植株中PCE1基因的表达量，并对其表型阳性植株表型进行统计分析(图3；图4)。具体步骤如下：
1、将干扰载体RNAi-PCE1导入AGL1中，获得重组农杆菌AGL1/RNAi-PCE1。
2、利用农杆菌浸染法，将AGL1/RNAi-PCE1转化至P898012中，获得T0代转基因高粱植株，连续自交获得T2代阳性植株。其中，利用特异性引物对每代转基因苗进行阳性检测，检测方法为：提取待检测幼苗叶片基因组DNA，利用特异引物对DNA进行PCR扩增检测。
其中，所述特异性引物为：
T-RNAi-PCE1-1F:5’-TCCTTAAGTAGCATCACACGTG-3’，记为SEQ ID NO.9；
T-RNAi-PCE1-1R:5’-ATTTCACTTGCATCTGTAGC-3’，记为SEQ ID NO.10；
T-RNAi-PCE1-2F:5’-ACAGTAGAAAAGGAAGGTGGC-3’，记为SEQ ID NO.11；
T-RNAi-PCE1-2R:5’-GGATATTCTATATCCTATGG-3’，记为SEQ ID NO.12。
3、利用qRT-PCR方法对T2代阳性植株RNAi-1、RNAi-2中的PCE1基因的相对表达量水平进行检测。检测PCE1基因表达量的引物为：
PCE1-RT-PCR-1F:CGAGTGCATGCTGAAGTTTG，记为SEQ ID NO.13；
PCE1-RT-PCR-1R:ATTGCGTATCGGCAGTCATT，记为SEQ ID NO.14。
部分检测结果如图3所示。与P898012相比，T2代沉默PCE1基因高粱中PCE1基因的相对表达量均显著性下调，其中两个T2代沉默系的表达量下调较大，将其命名为RNAi-1和RNAi-2，如图3所示。
4、常规种植P898012和RNAi-1和RNAi-2转基因材料各3行，每行20株。待植株成熟后对其株高、穗长、粒长、粒宽、百粒重进行统计分析。
统计结果如图4所示，与P898012相比，T2代沉默PCE1基因高粱(RNAi-1、RNAi-2)的株高降低，粒长变短，粒宽变窄，百粒重降低。
上述结果表明，降低高粱中PCE1蛋白的表达量可以调控高粱的株高和粒重，调控粒重表现为调控粒长、粒宽和百粒重。
需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.蛋白质PCE1的应用，其特征在于：为S1)或S2)：
S1)调控高粱株高和粒重；
S2)培育目标株高和粒重的转基因高粱；
所述蛋白质PCE1为a1)或a2)或a3)：
a1)氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的蛋白质；
a2)SEQ ID NO.1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加得到的与高粱株高和/或粒重相关的蛋白质。
2.编码权利要求1中所述蛋白质PCE1的核酸分子的应用，其特征在于：为S1)或S2)：
S1)调控高粱株高和粒重；
S2)培育目标株高和粒重的转基因高粱。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为如下b1)或b2)或b3)或b4)或b5)所示的DNA分子：
b1)编码区是SEQ ID NO.2自135至554位所示的DNA分子；
b2)核苷酸序列是SEQ ID NO.2自135至554位所示的DNA分子；
b3)核苷酸序列是SEQ ID NO.2所示的DNA分子；
b4)与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质PCE1的DNA分子；
b5)在严格条件下与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质PCE1的DNA分子。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：调控所述株高和粒重表现为高粱株高、粒长、粒宽、百粒重、粒型的调控。
5.一种培育转基因高粱的方法，其特征在于：包括如下步骤：抑制出发高粱中权利要求1中所述蛋白质PCE1的表达量和/或活性，得到转基因高粱；与出发高粱相比，转基因高粱的株高和粒重得到调控。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：抑制出发高粱中所述蛋白质PCE1的表达量和/或活性，通过向出发高粱中导入抑制编码蛋白质PCE1的核酸分子表达的物质实现；
所述抑制编码蛋白质PCE1的核酸分子表达的物质为特异DNA分子、含有所述特异DNA分子的表达盒或含有所述特异DNA分子重组质粒；
所述特异DNA分子包括正义片段、反义片段以及位于它们之间的间隔片段；
所述正义片段为SEQ ID NO.2自335至518位所示DNA分子；
所述反义片段为SEQ ID NO.2自385至552位所示DNA分子的反向互补序列。
7.一种调控高粱的育种方法，其特征在于：包括如下步骤：降低高粱中权利要求1中所述蛋白质PCE1的含量和/或活性，从而调控高粱株高和粒重。
8.特异DNA分子、含有所述特异DNA分子的表达盒或含有所述特异DNA分子重组质粒，其特征在于，所述特异DNA分子为权利要求6所述的包括正义片段、反义片段以及位于它们之间的间隔片段。
9.权利要求8所述特异DNA分子、含有所述特异DNA分子的表达盒或含有所述特异DNA分子重组质粒的应用，其特征在于：为S1)或S2)：
S1)调控高粱株高和粒重；
S2)培育目标株高和粒重的转基因高粱。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：调控所述株高和粒重表现为高粱的株高、粒长、粒宽、百粒重、粒型调控。
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| CN101001955A (zh) * | 2004-07-28 | 2007-07-18 | 巴斯福植物科学有限公司 | 通过改变肌动蛋白解聚因子的含量和/或活性产生具有增加的病原体抗性的转基因植物的方法 |
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