CN110760539A

CN110760539A - 茶树己糖转运体基因CsSWEET1a的应用

Info

Publication number: CN110760539A
Application number: CN201911129116.4A
Authority: CN
Inventors: 王璐; 姚利娜; 王新超; 杨亚军
Original assignee: Tea Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Tea Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-11-18
Filing date: 2019-11-18
Publication date: 2020-02-07
Anticipated expiration: 2039-11-18
Also published as: CN110760539B

Abstract

本发明公开了一种茶树己糖转运体基因CsSWEET1a在提高植物耐低温能力中的应用，通过在拟南芥中过表达该基因进行生物学功能验证，证明所述CsSWEET1a基因通过提高植物体内的蔗糖和葡萄糖含量，提高拟南芥的低温抗性，为培育耐低温植物新品种提供了基因资源，具有较好的潜在应用价值。

Description

茶树己糖转运体基因CsSWEET1a的应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及茶树己糖转运体基因CsSWEET1a的应用。

背景技术

植物在生长发育过程中，不可避免地会遭受外界的各种不良环境。在全球气候变化的背景下，极端温度出现得越来越频繁，低温胁迫已严重影响了经济作物的品质和产量。植物的耐低温能力决定其地域分布，关系着其能否安全越冬，能否抵御早春的倒春寒。茶树是重要的以叶用为主的经济作物，其起源于热带或亚热带地区，对低温较为敏感，茶树的低温适应能力与茶叶质量和生产经济效益息息相关。因此，研究与植物抗低温性相关的重要基因，解析抗低温胁迫的分子机制，选育并获得抗低温品种，在农业生产上具有重要的实际应用价值。

植物遭受低温胁迫后，细胞内的可溶性糖（如蔗糖、葡萄糖等）含量会显著增加，可溶性糖可作为抗冻剂使细胞液冰点下降，也可作为渗透保护剂维持细胞的渗透势。SWEET家族糖转运体，广泛存在于原核生物、真核生物、高等植物和动物中，能够参与运输蔗糖、葡萄糖或果糖等。本发明涉及的CsSWEET1a基因序列已在NCBI中公开（accession number:KP025702），已有研究表明，CsSWEET1a的表达受低温胁迫显著诱导，但其功能未见报道。

目前，茶树转基因体系尚不成熟，而拟南芥是植物生物学研究领域的模式植物，通过农杆菌介导的转基因技术可以在拟南芥中过表达候选基因，从而研究候选基因的生物学功能。通过转基因技术使CsSWEET1a基因在拟南芥中过量表达，获得的转CsSWEET1a基因植株叶片的蔗糖和葡萄糖含量以及对低温的耐受性显著增加，茶树CsSWEET1a基因的克隆和功能验证可以为茶树育种提供基因资源。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种茶树己糖转运体基因CsSWEET1a的应用的技术方案。

所述的茶树己糖转运体基因CsSWEET1a在提高植物耐低温能力中的应用。

所述的应用，其特征在于所述植物包括木本植物和草本植物。

所述的茶树己糖转运体基因CsSWEET1a在提高植物耐低温能力中的应用方法，其特征在于包括：

1）使植物包含基因CsSWEET1a；或

2）使植物过表达基因CsSWEET1a。

所述的采用农杆菌介导法将茶树己糖转运体基因CsSWEET1a转入到植物中，获得CsSWEET1a基因过表达的转基因植物。

所述的一种提高植物耐低温能力转基因拟南芥的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）提取茶树叶片总RNA，反转录获得cDNA，设计引物F和R，以茶树cDNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物CsSWEET1a基因，将扩增产物构建到具有super promoter启动子的pCambia 1300植物表达载体上，得到重组表达载体；

2）用上述重组表达载体转化农杆菌，利用转化的农杆菌侵染拟南芥花序，获得转基因拟南芥株系。

所述的一种提高植物耐低温能力转基因拟南芥的方法，其特征在于所述引物F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述引物R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明通过过表达实验首次验证了CsSWEET1a基因的生物学功能，证明了所述CsSWEET1a基因通过提高植物体内的蔗糖和葡萄糖的含量，增强调控植物的耐低温能力，为培育耐低温植物新品种提供了基因资源，具有较好的潜在应用价值。

附图说明

图1为过表达株系OE-1，OE-2和OE-3的CsSWEET1a基因表达检测图。

图2为过表达株系OE-1，OE-2和OE-3在含糖培养基中的生长状态。

图3为过表达株系OE-1，OE-2和OE-3在正常培养和低温胁迫下的蔗糖和葡萄糖含量。

图4为过表达株系OE-1，OE-2和OE-3在正常培养和低温胁迫下的电导率。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件（可参考Sambrook J. & Russell D. W., Molecular cloning: alaboratory manual, 2001）或按照制造厂商说明书建议条件。

以下实施例中pEASY bluntzero载体为常用的克隆载体，可市购；Superpromoter-pCambia1300载体为本课题组保存的载体；拟南芥品种为哥伦比亚生态型；农杆菌GV3101菌株是常用菌株，多数分子生物学实验室均有保存。

以下实施例中的主要试剂为：pEASY bluntzero克隆载体试剂盒购自于北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶，Taq酶，dNTP，反转录试剂盒等购自于TAKARA公司；蔗糖和葡萄糖含量测定试剂盒购自苏州科铭生物技术有限公司；质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自于Axygen公司；植物RNA提取试剂盒购自于天根公司；潮霉素，SYBRgreen等购自于Roche公司；琼脂糖，卡那霉素，壮观霉素，利福平等购自Sigma；实施例中使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂，实施例中所使用的引物由上海华津生物科技有限公司合成，并进行相关测序。

实施例1：茶树CsSWEET1a基因的过表达载体构建

根据NCBI数据库中公开的CsSWEET1a序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，其编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，设计引物F和R，以茶树叶片cDNA为模板，PCR扩增得到基因CsSWEET1a。将扩增出的序列连接到pEASY bluntzero载体上，通过双酶切连接反应最终连接到Super promoter-pCambia1300植物表达载体上。

所用引物为 F：5’-CCCAAGCTTATGGGTAATACTGCGCATTTCG-3’，SEQ ID NO: 3所示；

R：5’-GCGTCGACCTACTTGCTCGATCGCTTCTCT-3’，SEQ ID NO: 4所示。

实施例2 ：CsSWEET1a基因过表达植株的构建与筛选

将实施例1中构建的测序正确的载体转化到农杆菌GV3101菌株中，再转入拟南芥野生型植株中，得到拟南芥转基因当代苗的种子。Super promoter-pCambia1300载体所带筛选抗性基因为潮霉素，用潮霉素对拟南芥转基因幼苗进行筛选，获得的T1代具有潮霉素抗性的阳性苗进行单株收种，再对T2代种子进行潮霉素抗性筛选，选择抗性苗与无抗性苗的分离比约为3:1的株系，说明在该株系中，连有目的基因的载体序列是以单拷贝形式插入。将这些株系中具有潮霉素抗性的植株移出，进行单株收种，再进行潮霉素抗性筛选，如果没有分离，说明该转基因株系为纯合体，该纯合体可以用于繁种和生理实验。

筛选获得过表达株系OE-1，OE-2和OE-3。提取野生型，OE-1，OE-2和OE-3的总RNA，逆转录合成cDNA，通过qRT-PCR方法检测所得过表达株系OE-1，OE-2和OE-3中CsSWEET1a的表达量，检测结果见图1，可以看出OE-1，OE-2和OE-3中均能检测出CsSWEET1a基因的超表达。

实施例3：过表达CsSWEET1a植物的糖转运能力

将拟南芥种子灭菌后，播种在1/2MS，1/2MS+1.5%蔗糖和1/2MS+1.5%葡萄糖培养基上，生长18天后，拍照记录表型，地上部分见图2A-D，地下部分见图2 E-H。将拟南芥种子灭菌后，播种在1/2MS，1/2MS+3%蔗糖和1/2MS+3%葡萄糖培养基上，生长24天后，拍照记录表型，见图2I-L。结果表明，与野生型相比，过表达植株能够吸收更多的蔗糖或葡萄糖，也因此表现出叶片变紫、根变褐色等糖中毒的表型。

将拟南芥种子灭菌后，播种在1/2MS+1.5%蔗糖培养基中，生长18天后，分别进行常温和低温处理。低温处理操作如下，4℃处理2天，降温至0℃处理8小时，取地上部分测定糖含量，测定结果见图3。结果表明，与野生型相比，无论是正常还是低温条件下，OE-1，OE-2和OE-3过表达植株的蔗糖和葡萄糖含量都显著高于野生型，证明了CsSWEET1a能够将蔗糖和葡萄糖转运到植物体内。

实施例4：过表达CsSWEET1a植物的耐低温能力

将拟南芥种子灭菌后，播种在1/2MS+1.5%蔗糖培养基上，生长7天后，移入到育苗块中生长。培养至苗龄为18天时，进行4℃低温处理3天，降温至0℃，以2℃/h的降温速率降至-6℃并维持6小时。处理后取整个地上部分测定相对电导率，测定结果见图4。结果表明，与野生型相比，低温胁迫下，OE-1，OE-2和OE-3过表达植株的相对电导率显著降低，耐寒能力增加。

这些结果证明了CsSWEET1a基因通过提高植物体内的蔗糖和葡萄糖的含量正调控植物的耐低温能力。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院茶叶研究所

<120> 茶树己糖转运体基因CsSWEET1a的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 756

<212> DNA

<213> 茶树(tea tree)

<400> 1

atgggtaata ctgcgcattt cgtgtttgga gtgtttggaa atgttaatgg gttgttgctg 60

tttttggcac cgacgattac gtttaagagg atcatcatga gcaaatccac cgaacaattt 120

tcaggcattc catacgtcat gaccttgctc aactgcttgc tttctgcttg gtatggcatg 180

ccttttgttt caccacacaa catgctagtc tcaaccatta atggcactgg tgcagccatt 240

gaggccatct atgtgttcat cttcatcata tttgcaccaa agaaagagaa gggcaagatc 300

ctaggacttc tcatctttgt gctcagcgtg ttcactgcag tcgccctcat ttctatgttc 360

gctcttcatg gcaaaaacag aaagatcttc tgcggtctag ctgcctccat cttctccatc 420

atcatgtacg cttcccctct atcaatcatg aggatggtga tcaaaaccaa aagtgtggag 480

ttcatgccat ttttcttgtc gctgtttgtg ttcttatgcg gcacttcctg gttcgtcttt 540

ggactgctcg gaaaggaccc ttttgttgct gtgcctaatg gttttggcag cggtttagga 600

gtgattcagt tgatcttata tgtcatatac cgcaacaaca agggtgaagc caagaaacct 660

cctaataccg atggatcgct ggagatagga ctggaaaagt cccagcccca tgaagagaag 720

cgatcgagct atgaagagaa gcgatcgagc aagtag 756

<210> 2

<211> 187

<212> PRT

<213> 茶树(tea tree)

<400> 2

Met Gly Asn Thr Ala His Phe Val Phe Gly Val Phe Gly Asn Val Asn

1 5 10 15

Gly Leu Leu Leu Phe Leu Ala Pro Thr Ile Thr Phe Lys Arg Ile Ile

20 25 30

Met Ser Lys Ser Thr Glu Gln Phe Ser Gly Ile Pro Tyr Val Met Thr

35 40 45

Leu Leu Asn Cys Leu Leu Ser Ala Trp Tyr Gly Met Pro Phe Val Ser

50 55 60

Pro His Asn Met Leu Val Ser Thr Ile Asn Gly Thr Gly Ala Ala Ile

65 70 75 80

Glu Ala Ile Tyr Val Phe Ile Phe Ile Ile Phe Ala Pro Lys Lys Glu

85 90 95

Lys Gly Lys Ile Leu Gly Leu Leu Ile Phe Val Leu Ser Val Phe Thr

100 105 110

Ala Val Ala Leu Ile Ser Met Phe Ala Leu His Gly Lys Asn Arg Lys

115 120 125

Ile Phe Cys Gly Leu Ala Ala Ser Ile Phe Ser Ile Ile Met Tyr Ala

130 135 140

Ser Pro Leu Ser Ile Met Arg Met Val Ile Lys Thr Lys Ser Val Glu

145 150 155 160

Phe Met Pro Phe Phe Leu Ser Leu Phe Val Phe Leu Cys Gly Thr Ser

165 170 175

Trp Phe Val Phe Gly Leu Leu Gly Lys Asp Pro

180 185

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 3

cccaagctta tgggtaatac tgcgcatttc g 31

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 4

gcgtcgacct acttgctcga tcgcttctct 30

Claims

1.茶树己糖转运体基因CsSWEET1a在提高植物耐低温能力中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述植物包括木本植物和草本植物。

3.如权利要求1或2所述茶树己糖转运体基因CsSWEET1a在提高植物耐低温能力中的应用方法，其特征在于包括：

1）使植物包含基因CsSWEET1a；或

2）使植物过表达基因CsSWEET1a。

4.采用农杆菌介导法将茶树己糖转运体基因CsSWEET1a转入到植物中，获得CsSWEET1a基因过表达的转基因植物。

5.一种提高植物耐低温能力转基因拟南芥的方法，其特征在于包括以下步骤：

6.如权利要求5所述的一种提高植物耐低温能力转基因拟南芥的方法，其特征在于所述引物F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述引物R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。