CN109750047A - 茶树己糖转运体基因CsSWEET17及其在调控植物营养生长和种子大小中的应用 - Google Patents

Abstract

茶树己糖转运体基因CsSWEET17及其在调控植物营养生长和种子大小中的应用，属于生物基因工程技术领域。茶树己糖转运体基因CsSWEET17，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其蛋白序列如SEQ ID NO.2所示；茶树己糖转运体基因CsSWEET17在调控植物营养生长和种子大小中的应用。上述一种茶树己糖转运体基因CsSWEET17及其在调控植物营养生长和种子大小中的应用，CsSWEET17基因编码的蛋白在不同植物中具有保守性和重要的生物学功能。本发明提供了一个重要的并且可能具有普适性的调控植物营养生长和种子大小的基因资源，为培育叶用和种子用的品种提供了优秀的候选基因。

Description

茶树己糖转运体基因CsSWEET17及其在调控植物营养生长和 种子大小中的应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体为茶树己糖转运体基因CsSWEET17及其在调控植物营养生长和种子大小中的应用。

背景技术

叶片是植物重要的营养器官，是光合作用的场所，叶片面积在一定程度上能够影响农作物的产量。种子大小是一个十分重要的农艺性状，是影响农作物产量的主要因素之一。研究控制叶片营养生长和种子大小的重要基因，解析叶片和种子大小的调控分子机制，可为作物高产育种奠定重要的基础，在农业生产上具有重要的实际应用价值。茶树是重要的以叶用为主的经济作物，同时，部分茶树资源的茶籽可以用来榨油，茶树叶片的发育和叶片大小直接影响着茶叶生产，而茶树的种子大小则直接影响着茶籽油的生产。

糖是真核生物主要的碳和能量来源，根据植物需求，糖要从合成部位运输到利用部位、储存部位，糖在源-库细胞，细胞内的分配与平衡都需要糖转运体的参与。SWEET（sugars will eventually be exported transporter）家族糖转运体，广泛存在于原核生物、真核生物、高等植物和动物中，能够参与运输蔗糖、葡萄糖或果糖等。本发明涉及的CsSWEET17基因序列已在NCBI中公开（accession number: KP025705），但其功能未见报道。目前，茶树转基因体系尚不成熟，而拟南芥是植物生物学研究领域的模式植物，通过农杆菌介导的转基因技术可以在拟南芥中过表达候选基因，从而研究候选基因的生物学功能。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种茶树己糖转运体基因CsSWEET17及其在调控植物营养生长和种子大小中的应用的技术方案，本发明通过过表达实验首次验证了CsSWEET17的生物学功能。CsSWEET17基因编码的蛋白在不同植物中具有保守性和重要的生物学功能。通过转基因技术使CsSWEET17基因在拟南芥中过量表达，获得的转CsSWEET17基因植株具有叶片变大，地上部分鲜重增加，种子变大的表型。所以，茶树CsSWEET17基因的克隆和功能验证可以为茶树育种提供基因资源。本发明提供了一个重要的并且可能具有普适性的调控植物营养生长和种子大小的基因资源，为培育叶用和种子用的品种提供了优秀的候选基因。

所述的茶树己糖转运体基因CsSWEET17，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的茶树己糖转运体基因CsSWEET17，其特征在于：其蛋白序列如SEQ ID NO. 2所示。

所述的茶树己糖转运体基因CsSWEET17在调控植物营养生长和种子大小中的应用。

所述的茶树己糖转运体基因CsSWEET17在调控植物营养生长和种子大小中的应用，其特征在于：含有CsSWEET17基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、表达载体和工程菌。

所述的茶树己糖转运体基因CsSWEET17在调控植物营养生长和种子大小中的应用，其特征在于：使植物包含基因CsSWEET17或使植物过表达基因CsSWEET17。

所述的茶树己糖转运体基因CsSWEET17在调控植物营养生长和种子大小中的应用，其特征在于：所述植物包括木本植物和草本植物。

所述的茶树己糖转运体基因CsSWEET17在调控植物营养生长和种子大小中的应用，其特征在于：采用农杆菌介导法将基因CsSWEET17转入到植物中，获得CsSWEET17基因过表达的转基因植物。

所述的茶树己糖转运体基因CsSWEET17在调控植物营养生长和种子大小中的应用，其特征在于所述的植物为拟南芥，其具体应用方法包括以下步骤：

1）提取茶树叶片总RNA，反转录获得cDNA，设计引物F和R，以茶树cDNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物CsSWEET17基因，将扩增产物构建到具有35S启动子的植物表达载体pH7FWG2上，得到重组表达载体；

2）用上述重组表达载体转化农杆菌，利用转化的农杆菌侵染拟南芥花序，获得转基因拟南芥株系。

上述一种茶树己糖转运体基因CsSWEET17及其在调控植物营养生长和种子大小中的应用，本发明通过过表达实验首次验证了CsSWEET17的生物学功能。CsSWEET17基因编码的蛋白在不同植物中具有保守性和重要的生物学功能。通过转基因技术使CsSWEET17基因在拟南芥中过量表达，获得的转CsSWEET17基因植株具有叶片变大，地上部分鲜重增加，种子变大的表型。所以，茶树CsSWEET17基因的克隆和功能验证可以为茶树育种提供基因资源。本发明提供了一个重要的并且可能具有普适性的调控植物营养生长和种子大小的基因资源，为培育叶用和种子用的品种提供了优秀的候选基因。

附图说明

图1为本发明实施例2中过表达株系OE-1和OE-9的CsSWEET17基因表达检测图；

图2为本发明实施例3中过表达株系OE-1和OE-9正常生长13天的照片；

图3为本发明实施例3中过表达株系OE-1和OE-9正常生长18天的照片；

图4为本发明实施例3中过表达株系OE-1和OE-9正常生长18天，每棵植株地上部分的鲜重统计（n=15）；

图5为本发明实施例4中过表达株系OE-1和OE-9的种子照片。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步说明。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件（可参考Sambrook J. & Russell D. W., Molecular cloning: a laboratory manual, 2001）或按照制造厂商说明书建议条件。

以下实施例中pENTRTM/D-TOPO载体为常用的克隆载体，可市购；pH7FWG2载体为常用的表达载体，可市购；拟南芥品种为哥伦比亚生态型；农杆菌GV3101菌株是常用菌株，多数分子生物学实验室均有保存。

以下实施例中的主要试剂为：pENTRTM/D-TOPO克隆载体试剂盒、LR反应试剂盒等购自于Invitrogen公司；Taq酶，dNTP，反转录试剂盒等购自于TAKARA公司；质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自于Axygen公司；植物RNA提取试剂盒购自于天根公司；潮霉素，SYBR green等购自于Roche公司；琼脂糖，卡那霉素，壮观霉素，利福平等购自Sigma；实施例中使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂。

实施例中所使用的引物由上海华津生物科技有限公司合成，并进行相关测序。

实施例1

茶树CsSWEET17基因的克隆和过表达载体构建

根据NCBI数据库中公开的CsSWEET17序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，其编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，设计引物F和R，以茶树叶片cDNA为模板，PCR扩增得到基因CsSWEET17。将扩增出的序列连接到pENTRTM/D-TOPO载体上，通过LR反应最终连接到pH7FWG2植物表达载体上。

所用引物为 F：5’-CACCATGGCTAGCTTGAGCTTCATC-3’；R：5’-AGGGTGATCCTTGGTGCTTCC-3’。

实施例2

CsSWEET17基因过表达植株的构建与筛选

将实施例1中构建的测序正确的载体转化到农杆菌GV3101菌株中，再转入拟南芥野生型植株中，得到拟南芥转基因当代苗的种子。pH7FWG2载体所带筛选抗性基因为潮霉素，用潮霉素对拟南芥转基因幼苗进行筛选，获得的T1代具有潮霉素抗性的阳性苗进行单株收种，再对T2代种子进行潮霉素抗性筛选，选择抗性苗与无抗性苗的分离比约为3:1的株系，说明在该株系中，连有目的基因的载体序列是以单拷贝形式插入。将这些株系中具有潮霉素抗性的植株移出，再进行单株收种，再进行潮霉素抗性筛选，如果没有分离，说明该转基因株系为纯合体，该纯合体可以用于繁种和生理实验。

筛选获得过表达株系OE-1和OE-9。提取野生型，OE-1和OE-9的总RNA，逆转录合成cDNA，通过qRT-PCR方法检测所得过表达株系OE-1和OE-9中CsSWEET17的表达量，检测结果见图1，可以看出OE-1和OE-9中均能检测出CsSWEET17的基因表达。

实施例3

过表达CsSWEET17植物的营养生长表型

将拟南芥种子灭菌后，播种在二分之一MS培养基上，生长7天后，移入到育苗块中生长。培养至苗龄为13天和18天时，分别拍照记录，见图2和图3。18天大小的苗还进行了地上部分鲜重称量（野生型和OE-1，OE-9各15棵苗进行统计），见图4。结果表明，OE-1和OE-9过表达植株较野生型均表现出叶面积增大和地上部分鲜重增加的表型。

实施例4

过表达CsSWEET17植物的种子大小表型

将同一批培养的野生型，OE-1和OE-9株系的种子进行收集并干燥，放于体视显微镜镜下进行拍照观察，见图5。结果表明，OE-1和OE-9过表达植株较野生型均表现出种子增大的表型。

上述结果证明了CsSWEET17基因正调控植物的营养生长和种子大小。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

<110> 中国农业科学院茶叶研究所

<120> 茶树己糖转运体基因CsSWEET17及其在调控植物营养生长和种子大小中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 915

<212> DNA

<213> 茶树(tea tree)

<400> 1

atggctagct tgagcttcat cattggcatt atagggaata taatctctat actagttttt 60

gcttctccca taggaacatt caagggagtg gtaaagaaga aatcaacaga gaattacaaa 120

gcacttccat acataaccac tctgctcagc acatctctgt ggactttcta tggaattctc 180

aagccagggg gtcttcttat tctaacagta aatggtgctg gtgctgtctt acaattcatt 240

tatgtcactc tctttctcat ctatgctcca agggatatca aggttaaatc tatgaagttg 300

gtggcaatat tggatgttgg gtttcttggg gcagtaatag ctgtgactat gctaacaatc 360

catggaagtc taaagcttac ctttgtaggc attttatgtg cagcattgac tattggcatg 420

tatgcagcac ctctagctgt catgagaaca gtgataaaga caacaagtgt agagtacatg 480

ccttttttcc tatctttttt cctcttcctc aatgctggag tttggtcggt ctatgctctc 540

cttgtcaagg atattttcat cggagtacca aatgcaattg gatttatatt gggctcggcc 600

caactaatcc tctatttggt gtacaagaac aaatcatcct cagcaaaatc aaaagatgaa 660

atggaagaag aagaagaagg atctgcccac cttgtcaaaa cgtccattga aatgcaagac 720

cttgacgacc accacgactt gaaaagtaca aatcgaaacc tcaacaaagg aaggagcctc 780

ccgaagccat cggtttctcg gcaatacagc atcaacaaaa tcatgaaaac attttctctt 840

cacccatatg agttgaattc tggctcactc catgaaaatg atgttgaaaa tggaagcacc 900

aaggatcacc cttga 915

<210> 2

<211> 304

<212> PRT

<213> 茶树(tea tree)

<400> 2

Met Ala Ser Leu Ser Phe Ile Ile Gly Ile Ile Gly Asn Ile Ile Ser

1 5 10 15

Ile Leu Val Phe Ala Ser Pro Ile Gly Thr Phe Lys Gly Val Val Lys

20 25 30

Lys Lys Ser Thr Glu Asn Tyr Lys Ala Leu Pro Tyr Ile Thr Thr Leu

35 40 45

Leu Ser Thr Ser Leu Trp Thr Phe Tyr Gly Ile Leu Lys Pro Gly Gly

50 55 60

Leu Leu Ile Leu Thr Val Asn Gly Ala Gly Ala Val Leu Gln Phe Ile

65 70 75 80

Tyr Val Thr Leu Phe Leu Ile Tyr Ala Pro Arg Asp Ile Lys Val Lys

85 90 95

Ser Met Lys Leu Val Ala Ile Leu Asp Val Gly Phe Leu Gly Ala Val

100 105 110

Ile Ala Val Thr Met Leu Thr Ile His Gly Ser Leu Lys Leu Thr Phe

115 120 125

Val Gly Ile Leu Cys Ala Ala Leu Thr Ile Gly Met Tyr Ala Ala Pro

130 135 140

Leu Ala Val Met Arg Thr Val Ile Lys Thr Thr Ser Val Glu Tyr Met

145 150 155 160

Pro Phe Phe Leu Ser Phe Phe Leu Phe Leu Asn Ala Gly Val Trp Ser

165 170 175

Val Tyr Ala Leu Leu Val Lys Asp Ile Phe Ile Gly Val Pro Asn Ala

180 185 190

Ile Gly Phe Ile Leu Gly Ser Ala Gln Leu Ile Leu Tyr Leu Val Tyr

195 200 205

Lys Asn Lys Ser Ser Ser Ala Lys Ser Lys Asp Glu Met Glu Glu Glu

210 215 220

Glu Glu Gly Ser Ala His Leu Val Lys Thr Ser Ile Glu Met Gln Asp

225 230 235 240

Leu Asp Asp His His Asp Leu Lys Ser Thr Asn Arg Asn Leu Asn Lys

245 250 255

Gly Arg Ser Leu Pro Lys Pro Ser Val Ser Arg Gln Tyr Ser Ile Asn

260 265 270

Lys Ile Met Lys Thr Phe Ser Leu His Pro Tyr Glu Leu Asn Ser Gly

275 280 285

Ser Leu His Glu Asn Asp Val Glu Asn Gly Ser Thr Lys Asp His Pro

290 295 300

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 3

caccatggct agcttgagct tcatc 25

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 4

agggtgatcc ttggtgcttc c 21

Claims (9)

1.茶树己糖转运体基因CsSWEET17，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

2.茶树己糖转运体基因CsSWEET17编码蛋白，其特征在于：其蛋白序列如SEQ ID NO. 2所示。

3.茶树己糖转运体基因CsSWEET17在调控植物营养生长和种子大小中的应用。

4.如权利要求3所述的茶树己糖转运体基因CsSWEET17在调控植物营养生长和种子大小中的应用，其特征在于：含有CsSWEET17基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、表达载体和工程菌。

5.如权利要求3所述的茶树己糖转运体基因CsSWEET17在调控植物营养生长和种子大小中的应用，其特征在于：使植物包含基因CsSWEET17或使植物过表达基因CsSWEET17。

6.如权利要求3所述的茶树己糖转运体基因CsSWEET17在调控植物营养生长和种子大小中的应用，其特征在于：所述植物包括木本植物和草本植物。

7.如权利要求3所述的茶树己糖转运体基因CsSWEET17在调控植物营养生长和种子大小中的应用，其特征在于：采用农杆菌介导法将基因CsSWEET17转入到植物中，获得CsSWEET17基因过表达的转基因植物。

8.如权利要求3所述的茶树己糖转运体基因CsSWEET17在调控植物营养生长和种子大小中的应用，其特征在于所述的植物为拟南芥，其具体应用方法包括以下步骤：

1）提取茶树叶片总RNA，反转录获得cDNA，设计引物F和R，以茶树cDNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物CsSWEET17基因，将扩增产物构建到具有35S启动子的植物表达载体pH7FWG2上，得到重组表达载体；

2）用上述重组表达载体转化农杆菌，利用转化的农杆菌侵染拟南芥花序，获得转基因拟南芥株系。

9.如权利要求3所述的茶树己糖转运体基因CsSWEET17在调控植物营养生长和种子大小中的应用，其特征在于引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。