CN109762828A

CN109762828A - 苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2及其应用

Info

Publication number: CN109762828A
Application number: CN201910151778.5A
Authority: CN
Inventors: 李明军; 王正阳; 祝令成; 杨静静; 魏晓钰; 马锋旺
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2019-02-28
Filing date: 2019-02-28
Publication date: 2019-05-17
Anticipated expiration: 2039-02-28
Also published as: CN109762828B

Abstract

本发明公开了一种苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2，核苷酸序列如序列表1。本发明还公开了含有苹果果实糖转运蛋白基因MdHT2.2的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物组织或者重组菌，本发明还公开了苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2编码的蛋白，氨基酸序列如序列2所示，以及苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2的应用。本发明的苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2，能够合成苹果果实己糖转运蛋白；苹果果实己糖转运蛋白，能够促进葡萄糖、果糖等进入细胞质的运输，在提高果实品质；苹果果实糖转运蛋白应用到提早开花的转基因植物中、提高植物果实糖含量、提高植物果实大小和矮化植株等领域均有显著的效果。

Description

苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2，本发明还涉及该苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2的蛋白，同时本发明还涉及苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2的应用。

背景技术

在植物细胞中，糖不仅是为植物生长发育提供能量的基础分子，也是渗透调节、营养组分、信号分子等的物质。在水果作物中，可溶性糖含量决定了果实品质，尤其是甜味，而糖含量与组分则由糖的运输、合成、代谢来调控，糖的积累是果实品质形成的主要原因，其主要受糖转运蛋白(Sugar transporter)的介导。

在大部分水果作物中，蔗糖作为主要的光合产物从成熟叶片等源器官中运输到非光合库器官，例如发育中的种子、果实以及茎。在源叶中，蔗糖在光和器官中的装载一种是通过胞间连丝沿着化学浓度梯度进行的共质体途径，另一种利用转运蛋白的质外体途径。装载后，蔗糖经过长距离的韧皮部运输，从筛管-伴胞细胞(SE-CC)卸载到利用/储藏器官。而卸载也是有两种方式，其一是蔗糖从筛管-伴胞细胞通过胞间连丝沿着化学梯度直接运输到周围的薄壁细胞(PCs)中，例如在茎尖和根中。另一种是蔗糖先通过SWEET转运蛋白从韧皮部筛管或筛管-伴胞细胞运输到质外体空间，然后蔗糖再通过蔗糖转运蛋白(SUT/SUC)运输进薄壁细胞。此外，蔗糖也能先被细胞壁酸性转化酶(CWINV)裂解为果糖和葡萄糖，然后被己糖转运蛋白(HT)运输进细胞。现在人们普遍认为韧皮部卸载能力在光合产物分配中很重要，并且决定了作物产量与质量以及果实糖含量。尽管韧皮部卸载的机制已经有很多人研究，但是其对糖代谢以及含量调控仍是未知。

在苹果、猕猴桃等果实的成熟阶段，蔗糖卸载是通过质外体途径进行的，而在苹果和番茄中，随着果实成熟存在着从共质体变为质外体途径的一个阶段转化。在卸载过程中，细胞壁酸性转化酶裂解蔗糖后通过己糖转运蛋白运输己糖到库细胞中在决定库强，调节源库平衡过程中也起着很大作用。在番茄果实中利用糖积累相关性状的数量位点定位得到了3个番茄己糖转运蛋白基因，说明己糖转运蛋白与番茄果实糖积累有着密不可分的关系。而利用RNAi技术突变掉番茄的三个己糖转运蛋白后，己糖含量比野生型下降了55％同样证实了这一点。还有其他的报道发现己糖转运蛋白能通过提高库强来增强抗病性。在苹果果实发育后期，山苹果醇转运蛋白会被高浓度的己糖抑制，因此己糖转运蛋白对果实的生长发育与糖积累非常重要。而苹果中与果实糖积累相关的己糖转运蛋白研究很少，本研究对促进果实糖积累方面有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2，能够合成苹果果实糖转运蛋白；

本发明还提供了一种苹果果实己糖转运蛋白，能够促进葡萄糖、果糖等进入细胞质的运输，提高果实品质；

本发明还提供了一种苹果果实己糖转运蛋白的应用。

本发明所采用的第一种技术方案是，苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2，核苷酸序列如序列表1所示。

本发明采用的第二种技术方案是,含有苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2的重组表达载体。

本发明采用的第二种技术方案的特点还在于：

重组表达载体是将苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2利用Gateway方法插入质粒中所得。

本发明采用的三种技术方案是，含有苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2的表达量、转基因细胞系、转基因植物组织或者重组菌；

本发明采用的第四种技术方案是，苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2编码的蛋白，氨基酸序列如序列2所示。

本发明采用的第五种技术方案是，苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2在提早开花的转基因植物中的应用。

本发明采用的第六种技术方案是，苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2在提高植物果实糖含量中的应用。

本发明采用的第七种技术方案是，苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2在增大植物果实中的应用。

本发明采用的第八种技术方案是，苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2在增加植物果实种子数量中的应用。

本发明采用的第九种技术方案是，苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2在矮化植株中的应用。

本发明的有益效果是

本发明一种苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2，能够合成苹果果实糖转运蛋白；

本发明一种苹果果实己糖转运蛋白基因，能够促进葡萄糖、果糖等进入细胞质的运输，提高果实品质；

本发明苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2应用到提早开花的转基因植物中、提高植物果实糖含量、提高植物果实大小和矮化植株等领域均有显著的效果。

附图说明

图1为本发明苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2在苹果不同组织中的qRT-PCR分析得到的相对表达量图，小写字母表示差异显著性。

图2为苹果发育过程中苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2表达量图；

图3为苹果果实发育过程中果实的果糖含量变化图；

图4为苹果果实发育过程中果实的葡萄糖含量变化图；

图5为苹果果实发育过程中果实的蔗糖含量变化图；

图6为本发明克隆的苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2的琼脂糖凝胶电泳图；

图7为本发明克隆的苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2基因编码蛋白拓扑结构示意图；

图8为本发明克隆的苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2酵母互补功能验证；

图9为本发明实施例5中番茄遗传转化琼脂糖凝胶电泳检测图；

图10为本发明实施例5中苹苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2在番茄植株中过量表达对植株矮化的影响；其中，野生型番茄WT作为阴性对照，重组质粒为阳性对照，L5、L11、L12为阳性转基因株系；

图11为本发明实施例5中苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2在番茄植株中过量表达对果实大小与种子数量的影响示意图；其中，野生型番茄WT作为阴性对照，L5、L11、L12为阳性转基因株系；

图12为本发明克隆的苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2在番茄植株中过量表达对番茄果实果糖含量的影响；

图13为本发明克隆的苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2在番茄植株中过量表达对番茄果实葡萄糖含量的影响；

图14为本发明克隆的苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2在番茄植株中过量表达对番茄果实蔗糖含量的影响；

图15为本发明克隆的苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2在番茄植株中过量表达对番茄果实可溶性固形物含量的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2，其核苷酸序列如序列表1所示。

实施例1，对本发明的苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2的基因表达模式进行分析：

材料选自西北农林科技大学北校园艺场“嘎啦”苹果，砧木为新疆野苹果(M.sieversii)。种植密度为3×4m，南北行。在整个生长过程中，定期喷施杀菌剂和杀虫剂来防治病虫害。采集花、幼果、成熟果、果皮、果肉、幼叶、成熟叶、老叶、根、果柄、叶柄、韧皮部、木质部为样品，将所有样品采后立即放到液氮中速冻，提取总RNA并反转录，所得的第一链cDNA用于扩增苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2。

其中，提取总RNA时利用CTAB法，(CTAB提取缓冲液包括2％CTAB，2％PVP K-30，0.05％亚精胺，10mMTris·HCl(pH＝8.0)，25mM EDTA，2M NaCl)提取总RNA，取1μg总RNA样品，经1U DNaseI(Fermentas公司)37℃孵育30min，结束后立即置于冰上5min，加入1μlEDTA(25mM)65℃孵育30min。

第一链cDNA的合成用Transcript@One-Step RT-PCR SuperMix反转录试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)，按照试剂盒说明书操作。选取MdActin(CN938023)为内参基因，进行qPCR时采用的引物如表1所示。

qPCR采用LightCycler 480SYBR GreenIMaste试剂盒(Roche公司)，按照试剂盒操作说明书操作。20μL qPCR反应体系包括:10μl SYBR Green I Master，0.4μl正向引物，0.4μl反向引物，1μl cDNA，8.2μl ddH₂O，其中引物如表1所示。使用96孔qPCR板(Roche公司)，运用qPCR仪(型号:LightCycler 480II，Roche公司)进行PCR。qPCR反应程序为:95℃预变性5min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸20s，共40个循环；72℃10min。每个cDNA样品重复3次，计算出每个cDNA样品的Ct值，通过采用2^-△△ct法得出这些基因的相对表达量。

qPCR分析苹果MdHT2.2基因在不同组织中的相对表达量见图1，从图1能够得到，本发明的苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2在成熟果实中有较高的表达丰度。

实施例2，本发明苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2的基因表达及与果实糖积累的关系

1，苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2在苹果果实发育过程中的qPCR分析

材料取自西北农林科技大学北校园艺场“嘎啦”苹果开花后16，34，55，75，98，122天，与下午3：00到4：00之间取果实样品。采样时，在全部15株树中，以3株树上的6颗果实作为一个重复，共5个重复。采样后迅速称重，去核后切成碎块立即冻存。为了比较源、库组织中相关基因的表达模式，同时在花后34天采取了茎尖和成熟叶片。所有的样品都贮藏在超低温冰箱中。

表1本发明所使用引物

2，苹果果实发育过程中可溶性糖含量变化

将所取的样品根据Wei et al.(2014)所描述的方法获取并衍生化可溶性糖和磷酸己糖。具体按照爱书方法操作：将样品研磨后取0.09–0.11g于2ml离心管中，加入预存-20℃冰箱中的甲醇1.4ml，同时加入Ribitol作为内标。在无极性的代谢物在氯仿中溶解后，取2ul极性相(上层)溶液到2.0ml Eppendorf管中用来测量每个样品的代谢产物(果糖，葡萄糖，蔗糖)。将其进行真空干燥，随后加入甲氧基胺盐酸盐和N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(N-methy l-N-tr imethylsilyl-trifluoroacetamide)进行衍生化(Lisec etal.2006)。用Shimadzu GCMS-2010SE(Shimadzu Corporation，Tyoto，Japan)进行代谢产物分析。通过比较这些代谢产物与来自GC/MS系统质谱库中的物质的裂解方式，来鉴定这些代谢产物并通过代谢产物和内标产生的标准曲线为标准进行量化。苹果果实发育过程中果实的果糖含量变化如图3所示，葡萄糖的含量变化如图4所示，蔗糖的含量变化如图5所示。

通过Pearson相关性分析方法计算得到基因表达量和果实糖含量之间的相关性，统计分析使用SPSS 16.0软件和Excel来完成。相关性分析结果如表2所示，表2表明MdHT2.2基因的相对表达量与果糖、葡萄糖、蔗糖含量均呈显著正相关，其中与果糖相关系数最大，表明本发明克隆的苹果MdHT2.2基因与糖分积累高度相关。

表2苹果果实发育过程中MdHT2.2基因表达与可溶性糖含量的相关性分析

基因	果糖	葡萄糖	蔗糖
				MdHT2.2	0.954<sup>**</sup>	0.257	0.929<sup>*</sup>

其中，**表示差异达极显著水平(P<0.01)，*表示差异达显著水平(P<0.05)。

实施例3，苹果果实MdHT2.2基因的克隆

以“嘎啦”果实为试材，提取果肉总RNA并反转录，所得的第一链cDNA用于扩增MdHT2.2基因。果肉总RNA提取、cDNA合成及引物设计方法同

实施例1。

扩增引物同表1.50μl反应体系包括：10μl 5×Phusion HF for GC Buffer(NEB公司)，1μl 10mM dNTPs，2.5μl正向引物，2.5μl反向引物，0.5μl Phusion高保真DNA聚合酶(NEB公司)，1μl cDNA。PCR反应程序为：98℃预变性30s；98℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；循环完成后72℃延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，将产生如图6所示的目的条带，用凝胶试剂盒进行回收。胶回收试剂盒购买于北京康为世纪生物科技有限公司，具体操作步骤根据说明书进行。回收纯化的PCR产物与pMD19T载体(TaKaRa公司)进行连接反应，连接反应体系包括：3μl回收纯化的PCR产物，1μl pMD19T载体，1μl ddH₂O和5μl Solution I(TaKaRa公司)。采用热击法(参照《分子克隆实验手册》第三版，科学出版社，2002)转化大肠杆菌DH5α，在含有100mg/ml卡那霉素的液体LB培养基中于37℃摇床振荡培养6-8h，取1μl菌液，用MdHT2.2克隆引物进行PCR检测，并将阳性克隆菌液送公司测序(由苏州金唯智公司完成)。

测序结果表明，本发明扩增的目的片段长度为1569bp，通过序列比对分析，确定该序列是本发明需要的目的基因，申请人将这个基因命名为MdHT2.2。

MdHT2.2基因包括1569bp的开放阅读框，编码522个氨基酸，氨基酸序列如序列2所示。通过TMHMM2.0分析表明：该MdHT2.2编码的氨基酸多肽如图7所示，其中跨膜结构利用在线工具TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)进行分析，跨膜模型利用软件TMRPRES2d构建(Tusnady and Simon,2001)。如图7所示，本发明的MdHT2.2编码的氨基酸多肽存在典型的11个α-helices跨膜区和一个中央胞质环，属于主要易化子超家族(Majorfacilitator superfamily，MFS)中的一员，这是植物糖转运蛋白生物学功能所必需的。

实施例4酵母互补实验

大量的研究结果表明，植物HT载体对葡萄糖和果糖等单糖有强的转运功能。为了鉴定本发明克隆的苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2对不同糖的吸收转运能力，本实施例利用酵母功能缺失互补实验进行了验证，所用的表达载体为pYST2。空载pYES2.0和MdHT2.2反义基因(antisense)转入酵母突变体EBY.VW4000中作为阴性对照，Line1/2为阳性转基因酵母。分别在外源果糖Fru、葡萄糖Glc、半乳糖Gal和木糖Xyl上的生长状况。

糖转运蛋白敲除的酿酒酵母突变体为EBY.VW4000(Wieczorke et al.,1999)。将本发明克隆的苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2通过酶切方法连接到pYST2载体上，获得重组质粒，将重组质粒转入EBY.VW4000酵母突变体菌株。在液体的SD-Ura培养基中培养鉴定为阳性的酵母菌，转入MdHT2.2反义基因的酵母菌以及转入空载体pYST2的酵母突变株直到OD600＝0.8(摇床，30℃，1d左右)；吸取1ml菌液于1.5ml离心管中，快速离心，去上清；加入1ml无菌水，混匀后，滴到加入了不同碳源(果糖、葡萄糖、半乳糖、木糖)的SD-Ura固体培养基中；30℃暗培养3-5天后检测对酵母生长的影响。

酵母功能互补结果如图8所示，图8表明将本发明克隆的苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2转入糖转运蛋白缺失的酿酒酵母突变体EBY.VW4000(仅对麦芽糖有吸收能力)后，酵母突变株EBY.VW4000对糖的转运功能恢复，可以在培养基上生长，对不同糖的吸收能力是：果糖>葡萄糖>半乳糖>木糖，证明苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2对果糖、葡萄糖的转运功能较强。

实施例5苹果果实MdHT2.2基因超表达分析

1、构建苹果MdHT2.2基因的植物超表达载体

对pGWB402载体的多克隆位点和苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2的核苷酸序列进行了分析，设计的正反引物的5’分别加上attb位点，即得到相应的引物，用于构建表达载体pGWB402-MdHT2.2，用含有100mg·L^-1氨苄霉素的液体LB培养基悬浮培养pMD19T-MdHT2.2重组质粒的大肠杆菌DH5α，37℃，220rpm振荡培养12h。提取pMD19T-MdHT2.2重组质粒作为模板进行PCR扩增，25μl反应体系包括：1×LAPCR BufferII(Mg²⁺free)(TaKaRa公司)，2.5mM MgCl₂，0.4mM dNTPs，0.4μl正向引物，0.4μl反向引物，100ng重组质粒，1.25UTaKaRa LATaq聚合酶(TaKaRa公司)。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；循环完成后72℃延伸10min。目的片段的回收纯化、目的片段与pMD19T载体的连接、阳性克隆的获得与测序，均同实施例3。经过测序的目的基因片段，通过添加attb酶切位点的引物PCR，产生带有attb位点的基因片段。BP反应：用pDonor222载体与attB-PCR产物反应，25℃反应过夜，反应产物转化TOP10感受态大肠杆菌，涂板，挑取阳性克隆。用M13通用引物检测阳性克隆。提取质粒，进行LR反应。用pGWB402植物表达载体与BP产物反应。25℃温育过夜。反应产物转化TOP10(大肠杆菌感受态细胞)，涂板，挑取阳性克隆。用attB通用引物PCR检测阳性克隆。获得含有插入MdHT2.2基因的重组载体，将其命名为pGWB402-MdHT2.2重组载体，应用冻融法将重组载体pGWB402-MdHT2.2导入到农杆菌EHA105中。

2、番茄的遗传转化和转化植株分子鉴定

根癌农杆菌介导的番茄遗传转化野生型番茄选择‘小汤姆’，具体遗传转化方法如下：

无菌苗培养及外植体制备：无菌操作台紫外灯灭菌20min待用；400mlddH2O、量筒、烧杯(废液缸)、大口三角瓶高压蒸汽灭菌处理后烘干备用；番茄种子无菌水浸泡5min；75％酒精浸泡1min；无菌水冲洗2次；40％NaClO浸泡15min；无菌水冲洗4次；滤纸吸干多余水分；每瓶MS培养基接种7粒种子，暗培养4d；见光至子叶伸展(真叶长出前)。

转化番茄：将子叶切下后划伤，叶背向上放置于预培养培养基暗培养中2d(预培养培养基：MS+6-ZT 2.0mg·L^-1+IAA 0.2mg·L^-1)；农杆菌制备同转化拟南芥，侵染20min，共培养3d，暗培养(共培养培养基：MS+ZT 2.0mg·L^-1+IAA 0.2mg·L^-1+1mM甜菜碱+0.1mMAS)；用400mg·L^-1的头孢水洗掉叶片上面的农杆菌，转移到筛选培养基上暗培养10d(筛选培养基：MS+ZT 2.0mg·L^-1+Kana 50mg·L^-1+头孢Cef 400mg·L^-1)；见光培养，每15d换一次筛选培养基，至叶片长出愈伤及小芽；将小芽附带部分子叶组织切下转入继代培养基，没20继代一次，至小芽约10cm左右(MS+ZT 2.0mg·L^-1+Kana 25mg·L^-1+头孢Cef 400mg·L^-1)；将小芽转入生根培养基中进行生根培养，先暗培养3d，后见光；出现根后一周后移栽于营养土中。

转基因植株鉴定：取移栽后一个月后的植株叶片，采用实施例1中RNA提取，cDNA的合成方法；RT-PCR反应体系和反应程序同上文。

番茄遗传转化琼脂糖凝胶电泳检测如图9所示，有目的条带的株系为MdHT2.2转基因阳性番茄植株，表明目的基因己经整合到了番茄植株中。

3、苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2在番茄植株中过量表达及对植株生长的影响

根据图9所示，目的基因己经整合到了番茄植株中。通过移栽观察，如图10所示，转苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2能促进番茄植株矮化并提前开花10-15天，如图11所示，转苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2能够明显提高果实大小与种子数量，苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2在番茄植株中过量表达对植株生长统计如表3所示；以上表明本发明克隆的苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2参与调控植株生长发育，具有促进植株矮化、提早开花结果、提高果实大小与种子数量的应用价值。

表3本发明克隆的苹果MdHT2.2基因在过量表达番茄植株表型统计

*表示差异达显著水平(P<0.05)。

4、苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2在番茄植株中过量表达对可溶性糖含量的影响

为了进一步研究本发明克隆的苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2对果实糖积累的影响，申请人以野生型番茄植株为对照，测定了苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2转基因番茄植株果实不同成熟阶段的含糖量，测定方法见实施例2，测试结果如图12、图13、图14和图15所示。从图12、图13、图14和图15所示分析结果表明，转苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2能明显提高番茄果实的己糖含量与可溶性固形物，与野生型番茄植株比较差异显著。

SEQUENCE LISTING

<110> 西北农林科技大学

<120> 苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2943

<212> MRNA

<213> 苹果

<400> 1

atggcaggag gatttggagg tgatggagta gtatctgaaa gagctcagca gtatgagtat 60

aggattactg ggtatttcgt ctttgcttgc attgttgctg ctctaggagg ctctctcttt 120

ggctatgatc ttggtgtttc aggtcagatt tcttcctggt ttattattca aaatttgaaa 180

taaattagat ttattttatc aggtaataat ttcttttgca tgcactcctc gctgtgaatc 240

gagtgattga ataaaataga agacaacggg agtgtaaaaa gcattaccct tgatctggtc 300

atatatgtaa tttacagatt cattatatcc tgtgaaccgg atttgtttga ctgatgcttc 360

ccttccgtac taatgttttt tcagacctaa tttkagagat ttagaggagg tgtctgagat 420

atgaaatttg agtttttagg gacatatgaa gataaacatg aagacctttt ttttttatgt 480

tkgctcagaa aaaaaaaata caggaamtga taataaaagg ctttgtttgg tgttctgaat 540

aacaaaattg atggttttat ggaatttaat ttcaatcctg attcagcttt tcttcaaagt 600

aattatacac cactcatgtt tccatcaatt tattactcag gctaaaaaaa aaatgattag 660

tgcaacaaaa caaaagagga gtgcaatcat tttcccttac taaatttcca aattrttgya 720

maaaaaaaaa aaaaaaaatt aaaacttcaa tgatatatac cttagttgca acttaccatc 780

agtgatgtgc tcctcaccta acattgaagc ttatcctttc tgtgattccc cctttgacaa 840

aaatagatag aagtcyttac aaataaaagt tactattatt ttagataaga cattcattga 900

caatccaaaa ttaacatatt atttgggatt atatactgct gtgattaaag gcctctttta 960

gttttggtat atacaacaac caccaagcct tatctcacta agtggggtcg gctatatgaa 1020

tcttagaacg ctattgygcc aagtcttccg ttggctccaa atactccata tattttctta 1080

tactctctat aagagtcttt ctgagccttc ctcgattctt tttgttctga gcctgcatct 1140

catagtcgag ttttggtata tcattccaaa atcaccataa taatttttac ctctgtggta 1200

aatttcaggt ggagtgactt ccatggatga tttcttaaag gaattcttcc caaaaattta 1260

cagaaggaag caactgcacc tcaatgagac agattactgt aaatatgata accaaattct 1320

gacactcttt acatcctctt tgtactttgc gggcctcgtt tctacgttcg gagcttcgta 1380

cgttacccga aacaaaggaa ggaaggccag cattcttgtt ggagctgtca gcttctttct 1440

aggagcagtc ctgaatgctt ctgcaaaaaa cattgcaatg ctgatcatcg gtcgaatact 1500

tcttggtgtt ggcattggat ttggaaatca agtaagccta atgctatgct atccatccac 1560

caaagaaaaa taacaacatt ttgatttctg atttatgaca actttcttgt tctgtaatcc 1620

aggcagttcc cttgtatctc tcggaaatgg ctcctgcgaa aattcgagga gcagttaacc 1680

aacttttcca gctgacgact tgcttaggca tcctggttgc taacttgata aactatggaa 1740

ccgataaaat ccatccgtgg ggttggcgat tgtctcttgg tttagctacr gtcccagcag 1800

ttcttatgtt tgttgggggt ctttttcttc ctgagacccc aaatagtctt gtagagcaag 1860

gcaggttaga agaggcaaga attatactgg agaaagtgag aggtaccaaa aaagttgatg 1920

ctgagtttgc tgacctggtt gatgctagca atgtagctcg agccataaag aacccgttta 1980

ggaatctact cacacgaaaa aatcgccctc aattggtgat aggggccttg ggaatccctg 2040

cattccaaca gctcaccggc atgaactcga tcctcttcta tgcacctgtc atatttcaga 2100

gcttgggatt tggctctggg gcagctctgt actcatctgt cttcacaagt ggagcacttg 2160

ttgttgctac attcatttca atgggttttg ttgataagtt tggtagaaga gctttcttct 2220

tagaagctgg aactgaaatg atatgctgct tggtaaatcc acttataatt acctgtatgc 2280

ctgtaaccag gatgccgcta tggcagtatc ccaattcaat caagtattgt cgcatgggaa 2340

agttaaaata cacggcagtg tttgattagc ttgggatact gccatagtga catttcagta 2400

gtacggaggt tcttctccgg atttctactg tgtatacagt tactcactag aatgtctgat 2460

tttatgcagg ttgctctggc cattacccta gccctgaagt ttggacaagg agaaatcctc 2520

ccaaaaggga taggaatctt ccttgttatc gtcatttgca tatttgtttt ggcttatgga 2580

aggtcatggg gtcctttggg gtggctagtt ccaagtgagc tgtttccctt ggagacaaga 2640

tcagctgggc agagtgttgt tgtctgtgtc aatctcctct tcacagcttt gatagcgcag 2700

tgtttccttg cggggctttg ccatcttcaa tatgggattt tcctgctgtt cgcgggtcta 2760

ataatcatta tgagtacctt tatcttcttc ctcttgccag aaacaaagca ggtccccata 2820

gaagaaatat atcttctgtt tcagaaacat tggttttgga aaagaatagt aggagatggg 2880

gagcaaattg gacccaatgg gaggccaagc caaccagatg ggaagtcagg agcacaagtt 2940

taa 2943

<210> 2

<211> 522

<212> PRT

<213> 苹果

<400> 2

Met Ala Gly Gly Phe Gly Gly Asp Gly Val Val Ser Glu Arg Ala Gln

1 5 10 15

Gln Tyr Glu Tyr Arg Ile Thr Gly Tyr Phe Val Phe Ala Cys Ile Val

20 25 30

Ala Ala Leu Gly Gly Ser Leu Phe Gly Tyr Asp Leu Gly Val Ser Gly

35 40 45

Gly Val Thr Ser Met Asp Asp Phe Leu Lys Glu Phe Phe Pro Lys Ile

50 55 60

Tyr Arg Arg Lys Gln Leu His Leu Asn Glu Thr Asp Tyr Cys Lys Tyr

65 70 75 80

Asp Asn Gln Ile Leu Thr Leu Phe Thr Ser Ser Leu Tyr Phe Ala Gly

85 90 95

Leu Val Ser Thr Phe Gly Ala Ser Tyr Val Thr Arg Asn Lys Gly Arg

100 105 110

Lys Ala Ser Ile Leu Val Gly Ala Val Ser Phe Phe Leu Gly Ala Val

115 120 125

Leu Asn Ala Ser Ala Lys Asn Ile Ala Met Leu Ile Ile Gly Arg Ile

130 135 140

Leu Leu Gly Val Gly Ile Gly Phe Gly Asn Gln Ala Val Pro Leu Tyr

145 150 155 160

Leu Ser Glu Met Ala Pro Ala Lys Ile Arg Gly Ala Val Asn Gln Leu

165 170 175

Phe Gln Leu Thr Thr Cys Leu Gly Ile Leu Val Ala Asn Leu Ile Asn

180 185 190

Tyr Gly Thr Asp Lys Ile His Pro Trp Gly Trp Arg Leu Ser Leu Gly

195 200 205

Leu Ala Thr Val Pro Ala Val Leu Met Phe Val Gly Gly Leu Phe Leu

210 215 220

Pro Glu Thr Pro Asn Ser Leu Val Glu Gln Gly Arg Leu Glu Glu Ala

225 230 235 240

Arg Ile Ile Leu Glu Lys Val Arg Gly Thr Lys Lys Val Asp Ala Glu

245 250 255

Phe Ala Asp Leu Val Asp Ala Ser Asn Val Ala Arg Ala Ile Lys Asn

260 265 270

Pro Phe Arg Asn Leu Leu Thr Arg Lys Asn Arg Pro Gln Leu Val Ile

275 280 285

Gly Ala Leu Gly Ile Pro Ala Phe Gln Gln Leu Thr Gly Met Asn Ser

290 295 300

Ile Leu Phe Tyr Ala Pro Val Ile Phe Gln Ser Leu Gly Phe Gly Ser

305 310 315 320

Gly Ala Ala Leu Tyr Ser Ser Val Phe Thr Ser Gly Ala Leu Val Val

325 330 335

Ala Thr Phe Ile Ser Met Gly Phe Val Asp Lys Phe Gly Arg Arg Ala

340 345 350

Phe Phe Leu Glu Ala Gly Thr Glu Met Ile Cys Cys Leu Val Ala Leu

355 360 365

Ala Ile Thr Leu Ala Leu Lys Phe Gly Gln Gly Glu Ile Leu Pro Lys

370 375 380

Gly Ile Gly Ile Phe Leu Val Ile Val Ile Cys Ile Phe Val Leu Ala

385 390 395 400

Tyr Gly Arg Ser Trp Gly Pro Leu Gly Trp Leu Val Pro Ser Glu Leu

405 410 415

Phe Pro Leu Glu Thr Arg Ser Ala Gly Gln Ser Val Val Val Cys Val

420 425 430

Asn Leu Leu Phe Thr Ala Leu Ile Ala Gln Cys Phe Leu Ala Gly Leu

435 440 445

Cys His Leu Gln Tyr Gly Ile Phe Leu Leu Phe Ala Gly Leu Ile Ile

450 455 460

Ile Met Ser Thr Phe Ile Phe Phe Leu Leu Pro Glu Thr Lys Gln Val

465 470 475 480

Pro Ile Glu Glu Ile Tyr Leu Leu Phe Gln Lys His Trp Phe Trp Lys

485 490 495

Arg Ile Val Gly Asp Gly Glu Gln Ile Gly Pro Asn Gly Arg Pro Ser

500 505 510

Gln Pro Asp Gly Lys Ser Gly Ala Gln Val

515 520

Claims

1.苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2，其特征在于，核苷酸序列如序列表1所示。

2.含有权利要求1所述苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2的重组表达载体。

3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体是将苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2利用Gateway方法插入质粒中所得。

4.含有权利要求1所述苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2的表达盒、转基因细胞系、转基因植物组织或者重组菌。

5.权利要求1所述的苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2编码的蛋白，其特征在于，氨基酸序列如序列2所示。

6.权利要求1所述的苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2在提早开花的转基因植物中的应用。

7.权利要求1所述的苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2在提高植物果实糖含量中的应用。

8.权利要求1所述的苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2在增大植物果实中的应用。

9.权利要求1所述的苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2在增加植物果实种子数量中的应用。

10.权利要求1所述的苹果果实己糖转运蛋白基因MdHT2.2在矮化植株中的应用。