CN114395022B

CN114395022B - 苹果锌指蛋白转录因子MdZF-HD11及应用

Info

Publication number: CN114395022B
Application number: CN202210105876.7A
Authority: CN
Inventors: 王苗苗; 郑先波; 冯建灿; 吴尧; 王豪; 陈明; 黄松; 白团辉; 焦健; 宋春晖; 宋尚伟; 庞宏光
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2022-01-27
Filing date: 2022-01-27
Publication date: 2023-06-13
Anticipated expiration: 2042-01-27
Also published as: CN114395022A

Abstract

本发明公开了一种苹果锌指蛋白转录因子MdZF‑HD11及在调控果实成熟软化中的应用，分析了该基因在不同处理苹果果实采后贮藏过程中的表达模式，利用瞬时过表达和VIGS技术验证MdZF‑HD11基因在苹果果实后熟软化中的作用，发现过表达MdZF‑HD11基因的苹果果实与对照果实相比，乙烯释放显著升高，硬度显著降低，果实颜色明显变黄；而沉默MdZF‑HD11基因的苹果果实乙烯释放显著降低，果实颜色偏青。说明该基因可以调控苹果果实后熟软化，对培育耐贮运的苹果新品种具有积极的指导作用。

Description

苹果锌指蛋白转录因子MdZF-HD11及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及苹果锌指蛋白转录因子MdZF-HD11及在调控果实成熟软化中的应用。

背景技术

苹果(Malus Domestica)是典型的呼吸跃变型果实，其成熟过程与植物激素乙烯密切相关(Yue et al.，2020)。采后苹果果实的后熟软化极大地影响果实口感，严重影响其货架期，降低苹果果实的商品价值。因此，挖掘调控苹果果实成熟软化的关键因子对选育耐贮运的苹果新品种具有重要意义。

Zinc finger Homeodomain(ZF-HD)转录因子是植物特有的一类转录因子。ZF-HD转录因子由N端的C2H2类型的zinc finger(ZF)结构域和C端的homeodomain(HD)结构域组成。其中，ZF代表半胱氨酸和/或组氨酸结合锌原子形成的具有特定功能的局部多肽结构(Tan&Irish，2006)，HD是由长度为60的氨基酸组成的DNA结合域(Mukherjee et al.，2009)。近年来，ZF-HD转录因子在调控植物生长发育和响应生物或非生物胁迫方面发挥着重要作用(Agarwal&Jha，2010；Zhang et al.，2015；Khatun et al.，2017)。然而，关于ZF-HD转录因子调控果实成熟软化的研究鲜见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种苹果锌指蛋白转录因子MdZF-HD11及在调控果实成熟软化中的应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种苹果锌指蛋白转录因子MdZF-HD11，所述转录因子MdZF-HD11的DNA序列如SEQID NO：1所示，共969bp；所述转录因子MdZF-HD11编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，共编码322个氨基酸。

包含上述苹果锌指蛋白转录因子MdZF-HD11的重组载体或重组质粒，也落入本发明的保护范围，本发明所选用的重组载体为农杆菌过表达载体。

本发明还公开了上述基因超表达载体构建方法，具体为：

设计带有限制性酶切位点的特异引物扩增转录因子MdZF-HD11基因CDS序列，利用同源重组方法将MdZF-HD11基因整合到超表达载体pRI-101上，构建35S：：MdZF-HD11重组质粒，并通过电击法转化至GV3101农杆菌。引物序列如下：

上述基因VIGS载体的构建方法，具体为：

设计带有限制性酶切位点的特异引物，扩增转录因子MdZF-HD11基因cDNA非保守区200-400bp片段，利用同源重组方法将所扩增片段插入到TRV2载体中，构建完成pTRV2-MdZF-HD11重组质粒，并通过电击法转化至GV3101农杆菌。引物序列如下：

本发明还通过瞬时过表达转录因子MdZF-HD11基因来验证了该基因的功能，经过研究发现，该基因能够促进苹果果实成熟软化，具体表现为：能够加速苹果果实硬度的下降、增加乙烯释放量、提高果实可溶性固形物含量以及促进果实色泽由绿变黄。

还可以通过抑制所述转录因子MdZF-HD11基因或蛋白的功能表达能够抑制苹果果实成熟软化，对于一些早/中熟苹果品种在采后贮藏过程中易发生软化的果实储藏，可以采用这种方法。具体表现为将转录因子MdZF-HD11基因沉默能够延缓苹果果实硬度的下降、减少乙烯释放量、减少果实可溶性固形物含量以及抑制果实色泽由绿变黄。

本发明的优点：

本发明公开了一种苹果苹果锌指蛋白转录因子MdZF-HD11及在调控果实成熟软化中的应用，分析了该基因在不同处理苹果果实采后贮藏过程中的表达模式，利用瞬时过表达和VIGS技术验证MdZF-HD11基因在苹果果实后熟软化中的作用，发现过表达MdZF-HD11基因的苹果果实与对照果实相比，乙烯释放显著升高，硬度显著降低，果实颜色明显变黄；而沉默MdZF-HD11基因的苹果果实乙烯释放显著降低，果实颜色偏青。说明该基因可以调控苹果果实后熟软化，对培育耐贮运的苹果新品种具有积极的指导作用。

有利于从分子机制上阐明苹果锌指蛋白转录因子MdZF-HD11在调控苹果果实后熟软化中的作用，为苹果分子育种提供理论基础和基因资源。

对于一些早/中熟苹果品种在采后贮藏过程中易发生软化的果实储藏，可以通过敲除转录因子MdZF-HD11基因或者同源基因的方式培育一些新品种。

附图说明

图1是乙烯和1-MCP处理对金冠果实采后软化的影响；

图2是MdZF-HD11基因全长PCR扩增电泳图；

图3是MdZF-HD11基因在金冠果实中的表达量分析；

图4是过表达MdZF-HD11基因对‘金冠’果实成熟软化的影响；

图中，A，过表达MdZF-HD11基因的‘金冠’果实外观。比例尺＝2cm；B，MdZF-HD11基因在转基因果实中的表达量分析；C，果实在采后贮藏过程中乙烯释放速率的测定；D，硬度的测定；E，可溶性固形物含量的测定；F，色差的测定，L*代表明亮程度，a*代表绿色(-)至红色(+)的色度变化，b*代表蓝色(-)至黄色(+)的色度变化。

图5沉默MdZF-HD11基因对‘金冠’果实成熟软化的影响；

图中，A，沉默MdZF-HD11基因的‘金冠’果实外观，比例尺＝2cm；B，MdZF-HD11基因在转基因果实中的表达量分析；C，果实在采后贮藏过程中乙烯释放速率的测定；D，硬度的测定；E，可溶性固形物含量的测定；F，色差的测定，L*代表明亮程度，a*代表绿色(-)至红色(+)的色度变化，b*代表蓝色(-)至黄色(+)的色度变化。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但下述实施例中所涉及的具体实验方法如无特殊说明，均为常规方法或按照制造厂商说明书建议的条件实施。

若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以从市场中购买获得。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

除非另有说明，本发明的实施将使用本领域技术人员显而易见的植物学常规技术、微生物、组织培养、分子生物学、化学、生物化学、DNA重组及生物信息学技术。这些技术均在已经公开的文献中进行了充分解释，另外，本发明所采用的DNA提取、系统发育树的构建、基因编辑方法、基因编辑载体的构建、基因编辑植物获得等方法，除了下述实施例采用的方法外，采用现有文献中已经公开的方法均能实现。

此处使用的“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多聚核苷酸”术语意思是指包括分离的DNA分子(例如，cDNA或者基因组DNA)，RNA分子(例如，信使RNA)，自然类型，突变类型，合成的DNA或RNA分子，核苷酸类似物组成的DNA或RNA分子，单链或是双链结构。这些核酸或多聚核苷酸包括基因编码序列、反义序列及非编码区的调控序列，但不仅限于此。这些术语包括一个基因。“基因”或“基因序列”广泛用来指一有功能的DNA核酸序列。因此，基因可能包括基因组序列中的内含子和外显子，和/或包括cDNA中的编码序列，和/或包括cDNA及其调控序列。在特殊实施方案中，例如有关分离的核酸序列，优先默认其为cDNA。

“表达载体”，Expression vectors，是指在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。

“农杆菌介导转化法”，Agrobacterium-mediated transformation，指将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株的技术。

本发明利用乙烯作用抑制剂1-MCP处理的金冠苹果果实和未处理的金冠苹果果实的转录组测序，分析筛选苹果果实软化相关差异基因，克隆候选基因并构建过表达和沉默表达载体、进而在未成熟金冠果实中进行基因功能验证，发现过表达MdZF-HD11可以加速苹果果实硬度的下降、增加乙烯释放量，促进金冠果实的成熟软化；而利用VIGS沉默MdZF-HD11基因可显著降低乙烯释放量，并抑制苹果果实着色，延缓果实成熟。具体实验如下：

1.苹果锌指蛋白转录因子MdZF-HD11的序列分析

本发明利用乙烯作用抑制剂1-MCP处理金冠苹果果实，将处理金冠苹果果实和未处理的金冠苹果果实相比，与对照果实相比，乙烯(100μL·L^-1，20℃，24h)处理可以使金冠果实采后贮藏过程中乙烯释放高峰提前，促进果实硬度的下降，加速其采后软化进程；而1-MCP(1μL·L^-1，20℃，24h)处理可有效抑制金冠果实贮藏过程中乙烯的释放，延缓果实硬度的下降，有效延缓果实采后软化的发生(图1)。

利用CTAB法提取金冠苹果果实RNA，通过反转录试剂盒

III 1st StrandcDNA Synthesis Kit(Vazyme，中国)获得单链cDNA，以单链cDNA为模板，以下述序列为引物，

通过PCR(试剂盒

Flash Master Mix，购于南京诺唯赞生物科技有限公司)获得基因MdZF-HD11的全长序列，PCR扩增电泳图如图2所示。然后回收连接，转化到大肠杆菌DH5α中，选择测序正确的菌液提取质粒。该基因的全长共969bp，序列如SEQ ID NO：1所示，编码322个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.MdZF-HD11基因表达分析

荧光定量PCR步骤：利用CTAB法提取不同处理(对照、乙烯和1-MCP)金冠果实的总RNA，采用反转录试剂盒

III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Vazyme，中国)合成cDNA，并以此为模板，采用SYBRTM Select PCR Master Mix(Appliedbiosystems，美国)试剂盒，使用BIO-RAD(CFX96 optics module，美国)荧光定量PCR仪进行qRT-PCR检测。反应总体积20μL：包括10.0μLSYBRTM Select PCR Master Mix(Appliedbiosystems，美国)，1.0μL模板cDNA，上下游引物各1.0μL(引物浓度10μmol·L^-1)，7.0μLddH₂O。

反应程序：95℃10min；95℃15s，60℃30s，40个循环；95℃15s；然后以每分钟0.5℃的速度下降至60℃。

定量引物序列为：

采用qRT-PCR分析MdZF-HD11基因在不同处理(对照、乙烯和1-MCP)金冠果实采后贮藏过程中的表达量变化。选取Actin(Actin-FP：

Actin-RP：/>

)作为内参基因，用2^-ΔΔCt公式计算基因相对表达量(Livak and Schmittgen，2001)，结果如图3所示。从图3可以看出，与对照组相比，MdZF-HD11基因在乙烯处理软化加快的苹果果实中其表达量被显著诱导上调，而在1-MCP处理硬度保持较好(软化进程被有效延缓)的苹果果实中其表达量受到明显抑制。

3.功能验证

为研究MdZF-HD11基因是否调控苹果果实的成熟软化过程，通过超量表达和VIGS技术沉默苹果果实该基因来分析鉴定其功能。

3.1构建重组载体(1)超表达载体构建

设计带有限制性酶切位点的特异引物扩增MdZF-HD11基因CDS序列，利用同源重组方法将MdZF-HD11基因整合到超表达载体pRI-101上，构建35S：：MdZF-HD11重组质粒，并通过电击法转化至GV3101农杆菌。引物序列如下：

(2)VIGS载体构建

设计带有限制性酶切位点的特异引物，扩增MdZF-HD11基因cDNA非保守区200-400bp片段，利用同源重组方法将所扩增片段插入到TRV2载体中，构建完成pTRV2-MdZF-HD11重组质粒，并通过电击法转化至GV3101农杆菌。引物序列如下：

3.2瞬时过表达MdZF-HD11基因对苹果果实成熟软化的影响

用于做瞬时表达分析的‘金冠’果实于成熟期两周前采摘。将含有35S：：MdZF-HD11重组质粒的农杆菌菌液OD值调至0.8，利用注射法从果实顶部将含有重组质粒的农杆菌菌液接种到果肉中，每个果实注射2mL菌液。以注射含有pRI-101空载的农杆菌菌液果实为对照。将注射过的苹果果实置于20℃冷库中进行采后贮藏，分别于注射后第3d、6d、9d和12d测定果实硬度、乙烯释放和色差等果实成熟软化相关指标，开展耐贮性分析。

瞬时过表达MdZF-HD11基因后金冠果实表型如图4A所示，在采后贮藏至第12d时，与空载对照相比，转基因果实颜色明显偏黄，说明过表达MdZF-HD11基因促进了苹果果实成熟。MdZF-HD11的基因表达分析如图4B所示。苹果果实乙烯释放速率测定结果如图4C所示，过表达MdZF-HD11基因的果实乙烯释放量显著高于对照果实；苹果果实硬度测定结果如图4D所示，过表达MdZF-HD11基因的果实硬度均显著低于对照果实；可溶性固形物含量(TSS)检测如图4E所示，过表达MdZF-HD11基因的果实其TSS稍高于对照果实；果实色差测定结果如图4F所示，过表达MdZF-HD11基因的果实其L*、a*和b*值与对照比均明显升高，表明过表达MdZF-HD11基因促进了苹果果实色泽由绿变黄的过程。

3.3VIGS诱导苹果果实MdZF-HD11基因沉默

VIGS(病毒诱导的基因沉默)诱导苹果果实基因沉默的方法参照(Wu et al.，2020.Plant Biotechnology Journal，19，1022-1037；Hu et al.，2020.The PlantJournal，103，937-950)等方法进行。分别将构建好的沉默表达载体pTRV2-MdZF-HD11和pTRV1的农杆菌菌液OD值调至0.8，然后将菌液按1∶1等体积混合后，利用注射法从果实顶部将混合好的农杆菌菌液接种到果肉中，每个果实注射2mL菌液。以注射含有pTRV1和pTRV2等量混合的菌液的果实为对照。将注射过的苹果果实置于20℃冷库中进行采后贮藏，分别于注射后第3d、6d、9d和12d测定果实硬度、乙烯释放和色差等果实成熟软化相关指标，开展耐贮性分析。

VIGS诱导MdZF-HD11基因沉默后金冠果实表型如图5A所示，在采后贮藏至第12d时，与空载对照相比，转基因果实颜色明显偏青，说明沉默MdZF-HD11基因延缓了苹果果实成熟。MdZF-HD11基因表达分析如图5B所示。苹果果实乙烯释放速率测定结果如图5C所示，在采后贮藏至第6d，9d，12d时，沉默表达MdZF-HD11基因的果实乙烯释放量显著低于对照果实；苹果果实硬度测定结果如图5D所示，沉默MdZF-HD11基因的果实硬度在第12d时显著高于对照果实；可溶性固形物含量(TSS)检测如图5E所示，沉默表达MdZF-HD11基因的果实其TSS含量稍低于对照果实；果实色差测定结果如图5F所示，沉默MdZF-HD11基因的苹果果实其L*和a*值与对照果实比均显著降低，b*值稍低于对照果实，表明沉默MdZF-HD11基因抑制了苹果果实色泽由绿变黄的过程。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

序列表

<110> 河南农业大学

<120> 苹果锌指蛋白转录因子MdZF-HD11及应用

<130> 2022

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 969

<212> DNA

<213> Malus Domestica

<400> 1

atggacttta ccaccgtgac cgccaccatc caaaccccag atacggacac cgaaccgccg 60

tcgccgacgg accccaaatt caacttcttc agtggcaggt ccttatcctt caccagcggc 120

gcattccagc ctcagccgaa gcgaacaagg gtggttgcct acaaagaatg tctcaagaac 180

catgctgcca gcttaggtgg ccacgctctc gacggttgcg gcgagttcat gccttcccct 240

tcctccaacc cagctgaccc cacctcgcta aaatgcgccg cttgtggctg tcaccgcaac 300

ttccactgcc gtgatcagta cagacccaaa aataatgtta ttcgcaaccg cctgctacca 360

gcgccgaaaa cagctcacaa caaccacagc tcaagctcca gcccgagctc cagccccaac 420

cctactttga gcccgcagtc tccgccgcca gtctcccact tgcccccctc ctatttcgct 480

gccccgccgc aaatgctact tgctctcagc tccggctttt ctggtccgcc cgatgagcac 540

ccccaccagc accagctcaa tccgacggct gtgatgaaaa cggagaagta cccaggtgag 600

aaaaagagat ccagaacaaa gttcagccag gagcaaaagg aaaagatgtc gtcttttgcc 660

gagaaagtcg ggtggagagt gcaaaagagc gacgaaagat cggtggagga tttttgcagc 720

gaggtgggga ttgggagggg agtttttaag gtttggatgc acaataacaa gcacggtctc 780

aggaggagat tggagagatc ggccggcgta ggcggcggcg ggaatatgat tattaacagc 840

aatgtcagtg agatcaacgg tgagggtgaa agacatggtt ttgactccat gaatgctcac 900

atcgccgaca acaatgtcaa tgccaacccc cttcaccttt ccaacaatgg gtcgtcttct 960

tcgtcgtga 969

<210> 2

<211> 322

<212> PRT

<213> Malus Domestica

<400> 2

Met Asp Phe Thr Thr Val Thr Ala Thr Ile Gln Thr Pro Asp Thr Asp

1 5 10 15

Thr Glu Pro Pro Ser Pro Thr Asp Pro Lys Phe Asn Phe Phe Ser Gly

20 25 30

Arg Ser Leu Ser Phe Thr Ser Gly Ala Phe Gln Pro Gln Pro Lys Arg

35 40 45

Thr Arg Val Val Ala Tyr Lys Glu Cys Leu Lys Asn His Ala Ala Ser

50 55 60

Leu Gly Gly His Ala Leu Asp Gly Cys Gly Glu Phe Met Pro Ser Pro

65 70 75 80

Ser Ser Asn Pro Ala Asp Pro Thr Ser Leu Lys Cys Ala Ala Cys Gly

85 90 95

Cys His Arg Asn Phe His Cys Arg Asp Gln Tyr Arg Pro Lys Asn Asn

100 105 110

Val Ile Arg Asn Arg Leu Leu Pro Ala Pro Lys Thr Ala His Asn Asn

115 120 125

His Ser Ser Ser Ser Ser Pro Ser Ser Ser Pro Asn Pro Thr Leu Ser

130 135 140

Pro Gln Ser Pro Pro Pro Val Ser His Leu Pro Pro Ser Tyr Phe Ala

145 150 155 160

Ala Pro Pro Gln Met Leu Leu Ala Leu Ser Ser Gly Phe Ser Gly Pro

165 170 175

Pro Asp Glu His Pro His Gln His Gln Leu Asn Pro Thr Ala Val Met

180 185 190

Lys Thr Glu Lys Tyr Pro Gly Glu Lys Lys Arg Ser Arg Thr Lys Phe

195 200 205

Ser Gln Glu Gln Lys Glu Lys Met Ser Ser Phe Ala Glu Lys Val Gly

210 215 220

Trp Arg Val Gln Lys Ser Asp Glu Arg Ser Val Glu Asp Phe Cys Ser

225 230 235 240

Glu Val Gly Ile Gly Arg Gly Val Phe Lys Val Trp Met His Asn Asn

245 250 255

Lys His Gly Leu Arg Arg Arg Leu Glu Arg Ser Ala Gly Val Gly Gly

260 265 270

Gly Gly Asn Met Ile Ile Asn Ser Asn Val Ser Glu Ile Asn Gly Glu

275 280 285

Gly Glu Arg His Gly Phe Asp Ser Met Asn Ala His Ile Ala Asp Asn

290 295 300

Asn Val Asn Ala Asn Pro Leu His Leu Ser Asn Asn Gly Ser Ser Ser

305 310 315 320

Ser Ser

Claims

1.苹果锌指蛋白转录因子MdZF-HD11或苹果锌指蛋白转录因子MdZF-HD11编码的蛋白在促进苹果果实成熟软化中的应用，所述转录因子MdZF-HD11的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述转录因子MdZF-HD11基因或者蛋白能够加速苹果果实硬度的下降、增加乙烯释放量、提高果实可溶性固形物含量以及促进果实色泽由绿变黄。

3.沉默苹果锌指蛋白转录因子MdZF-HD11的物质在抑制苹果果实成熟软化中的应用，所述转录因子MdZF-HD11的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将苹果锌指蛋白转录因子MdZF-HD11沉默能够延缓苹果果实硬度的下降、减少乙烯释放量、减少果实可溶性固形物含量以及抑制果实色泽由绿变黄。