CN108884474A - 植物调控元件及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于调节植物中的基因表达的重组DNA分子和构建体以及它们的核苷酸序列。本发明还提供了包含与异源可转录的DNA分子可操作地连接的重组DNA分子的转基因植物、植物细胞、植物部分和种子；以及它们的使用方法。

Description

植物调控元件及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年3月11日提交的美国临时申请号62/306,790的权益，所述申请以引用的方式整体并入。
序列表的并入
命名为“MONS417WO-sequence_listing”的文件中所含的，为29.4KB(正如Microsoft中所测量)，且创建于2017年3月6日的序列表，通过电子投递随函提交并且以引用的方式并入本文。
发明领域
本发明涉及植物分子生物学领域；和植物基因工程领域。更具体地，本发明涉及适用于调节植物中的基因表达的DNA分子。
背景技术
调控元件是通过调节可操作地连接的可转录DNA分子的转录来调控基因活性的遗传元件。这类元件可包括启动子、前导序列、内含子和3'非翻译区，并且用于植物分子生物学和植物基因工程领域。
发明内容
本发明提供了用于植物的新型基因调控元件。本发明还提供了包含调控元件的DNA构建体。本发明还提供了包含调控元件的转基因植物细胞、植物和种子。在一个实施方案中，调控元件与可转录的DNA分子可操作地连接。在某些实施方案中，可转录的DNA分子相对于调控序列可为异源的。因此，在具体实施方案中，本发明提供的调控元件序列可以定义为与异源可转录DNA分子可操作地连接。本发明还提供了制备和使用调控元件的方法、包含调控元件的DNA构建体、以及包含与可转录DNA分子可操作连接的调控元件的转基因植物细胞、植物和种子。
因此，一方面，本发明提供了一种重组DNA分子，其包含选自由以下组成的组的DNA序列：(a)与SEQ ID NO:1-15中的任一个具有至少约85％序列同一性的序列；(b)包含SEQID NO:1-15中任一个的序列；以及(c)SEQ ID NO:1-15中任一个的片段，其中所述片段具有基因调控活性；其中序列与异源可转录的DNA分子可操作地连接。“异源可转录的DNA分子”是指可转录的DNA分子相对于其可操作连接的多核苷酸序列是异源的。在具体的实施方案中，重组DNA分子包含与SEQ ID NO:1-15中任一个的DNA序列有至少约90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的DNA序列。在具体的实施方案中，DNA序列包含调控元件。在一些实施方案中，调控元件包含启动子。在其它实施方案中，异源可转录的DNA分子包含农学上关注的基因，例如能够在植物中提供除草剂抗性的基因，或能够在植物中提供植物害虫抗性的基因。在其它实施方案中，本发明提供了包含本文提供的重组DNA分子的构建体。
另一方面，本文提供了包含重组DNA分子的转基因植物细胞，所述重组DNA分子包含选自由以下组成的组的DNA序列：(a)与SEQ ID NO:1-15中的任一个具有至少约85％序列同一性的序列；(b)包含SEQ ID NO:1-15中任一个的序列；以及(c)SEQ ID NO:1-15中任一个的片段，其中所述片段具有基因调控活性；其中DNA序列与异源可转录的DNA分子可操作地连接。在某些实施方案中，转基因植物细胞是单子叶植物细胞。在其它实施方案中，转基因植物细胞是单子叶植物细胞或双子叶植物细胞。
又一方面，本文进一步提供了一种转基因植物或其部分，其包含重组DNA分子，所述重组DNA分子包含选自由以下组成的组的DNA序列：a)与SEQ ID NO:1-15中的任一个具有至少85％序列同一性的序列；b)包含SEQ ID NO:1-15中任一个的序列；以及c)SEQ ID NO:1-15中任一个的片段，其中所述片段具有基因调控活性；其中序列与异源可转录的DNA分子可操作地连接。在具体的实施方案中，转基因植物是包含重组DNA分子的任何世代的后代植物。本文还提供了包含重组DNA分子的转基因种子，所述转基因种子在生长时产生这种转基因植物。
另一方面，本发明提供了一种生产商品产品的方法，其包括获得含有本发明的重组DNA分子的转基因植物或其部分并由其生产商品产品。在一个实施方案中，商品产品是加工过的种子、谷物、植物部分、油和粗粉。
又一方面，本发明提供了一种产生转基因植物的方法，所述转基因植物包含本发明的重组DNA分子，所述方法包括用本发明的重组DNA分子转化植物细胞以产生转化的植物细胞并从所转化的植物细胞中再生转基因植物。
序列简述
SEQ ID NO:1是调控表达元件组(EXP)的DNA序列，其包含源自与其天然前导序列5’可操作地连接的香瓜(Cucumis melo)推定铁氧还蛋白2(Fe2)蛋白基因的启动子。
SEQ ID NO:2是源自香瓜推定铁氧还蛋白2(Fe2)蛋白基因的启动子序列。
SEQ ID NO:3是源自香瓜推定铁氧还蛋白2(Fe2)蛋白基因的前导序列。
SEQ ID NO:4是EXP的DNA序列，其包含源自与其天然前导序列5’可操作地连接的香瓜叶绿素a-b结合蛋白13基因的启动子。
SEQ ID NO:5是源自香瓜叶绿素a-b结合蛋白13基因的启动子序列。
SEQ ID NO:6是源自香瓜叶绿素a-b结合蛋白13基因的前导序列。
SEQ ID NO:7是EXP的DNA序列，其包含源自与其天然前导序列5'可操作地连接的香瓜B盒锌指蛋白24样基因的启动子。
SEQ ID NO:8是源自香瓜B盒锌指蛋白24样基因的启动子序列。
SEQ ID NO:9是源自香瓜B盒锌指蛋白24样基因的前导序列。
SEQ ID NO:10是EXP的DNA序列，其包含源自与其天然前导序列5'可操作地连接的蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)集光复合蛋白b2基因的启动子。
SEQ ID NO:11是源自蒺藜苜蓿集光复合蛋白b2基因的启动子序列。
SEQ ID NO:12是源自蒺藜苜蓿集光复合蛋白b2基因的前导序列。
SEQ ID NO:13是EXP的DNA序列，其包含源自与其天然前导序列5'可操作地连接的蒺藜苜蓿光系统II叶绿体前体基因的启动子。
SEQ ID NO:14是源自蒺藜苜蓿光系统II叶绿体前体基因的启动子序列。
SEQ ID NO:15是源自蒺藜苜蓿光系统II叶绿体前体基因的前导序列启动子序列。
SEQ ID NO:16是源自蒺藜苜蓿集光复合蛋白b2基因的启动子的增强子序列。
SEQ ID NO:17是具有可加工的内含子的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的编码序列。
SEQ ID NO:18是源自海岛棉(Gossypium barbadense)E6基因的3'UTR序列。
具体实施方式
本发明提供了在植物中具有基因调控活性的DNA分子。这些DNA分子的核苷酸序列提供为SEQ ID NO:1-15。这些DNA分子能够影响可操作连接的可转录的DNA分子在植物组织中的表达，并因此调节转基因植物中可操作连接的转基因的基因表达。本发明还提供了修饰、产生及使用它们的方法。本发明还提供了包含含有本发明重组DNA分子的转基因植物细胞、植物、植物部分和种子的组合物，以及制备和使用它们的方法。
提供以下定义和方法来更好地限定本发明以及指导本发明的普通技术人员实践本发明。除非另外指出，否则术语应按照相关技术领域的普通技术人员的常规用法来理解。
DNA分子
如本文所用，术语“DNA”或“DNA分子”是指基因组或合成来源的双链DNA分子，即，脱氧核糖核苷酸碱基或DNA分子的聚合物，从5'(上游)末端至3'(下游)末端读取。如本文所用，术语“DNA序列”是指DNA分子的核苷酸序列。本文所用的命名法是美国联邦法规(UnitedStates Code of Federal Regulations)§1.822的第37条所要求的命名法，并且记述于WIPO标准ST.25(1998)的附录2的表1和表3中。
如本文所用，“重组DNA分子”是包含DNA分子的组合的DNA分子，其在没有人为干预的情况下不会天然存在。例如，重组DNA分子可以是由至少两个彼此异源的DNA分子构成的DNA分子、包含与自然界中存在的DNA序列偏离的DNA序列的DNA分子、或通过遗传转化或基因编辑将其整合到宿主细胞DNA中的DNA分子。
如本文所用，术语“序列同一性”是指两个最佳比对的多核苷酸序列或两个最佳比对的多肽序列相同的程度。通过手动比对两个序列(例如，参考序列与另一序列)以最大化在与适当的内部核苷酸插入、缺失或缺口的序列比对中的核苷酸匹配数来创建最佳序列比对。如本文所用，术语“参考序列”是指针对如SEQ ID NO:1-15所提供的DNA序列而提供的DNA序列。
如本文所用，术语“序列同一性百分比”或“同一性百分比”或“同一性％”是同一性分数乘以100。与参考序列最佳比对的序列的“同一性分数”是最佳比对中的核苷酸匹配数除以参考序列中核苷酸的总数，例如，整个参考序列全长中的核苷酸总数。因此，本发明的一个实施方案提供了一种包含以下序列的DNA分子，所述序列在与本文中如SEQ ID NO:1-15所提供的参考序列最佳比对时，与所述参考序列具有至少约85％同一性、至少约86％同一性、至少约87％同一性、至少约88％同一性、至少约89％同一性、至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约92％同一性、至少约93％同一性、至少至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性、或至少约100％同一性。
调控元件
调控元件如启动子、前导序列(也称为5'UTR)、增强子、内含子和转录终止区(或3′UTR)在活细胞中的基因整体表达中发挥不可或缺的作用。如本文所用，术语“调控元件”是指具有基因调控活性的DNA分子。如本文所用，术语“基因调控活性”是指例如通过影响可操作连接的可转录的DNA分子的转录和/或翻译来影响可操作连接的可转录的DNA分子的表达的能力。在植物中起作用的调控元件，如启动子、前导序列、增强子、内含子和3′UTR因此适用于经由基因工程化修饰植物表型。
如本文所用，“调控表达元件组”或“EXP”序列可指的是一组可操作连接的调控元件，如增强子、启动子、前导序列和内含子。因此，调控表达元件组可包含例如与前导序列5'可操作地连接的启动子。可用于实施本发明的EXP包括1、4、7、10和13。
调控元件可表征为其基因表达模式，例如，阳性和/或阴性效应，如组成型表达或时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学反应性表达、及其任何组合，并且还表征为定量或定性指示。如本文所用，“基因表达模式”是可操作连接的DNA分子转录成所转录的RNA分子的任何模式。所转录的RNA分子可被翻译以产生蛋白质分子或可提供反义或其它调控RNA分子，如双链RNA(dsRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、微RNA(miRNA)等。
如本文所用，术语“蛋白质表达”是所转录的RNA分子翻译成蛋白质分子的任何模式。蛋白质表达可表征为其时间、空间、发育或形态学特征以及定量或定性指示。
启动子用作调节可操作连接的可转录DNA分子的表达的调控元件。如本文所用，术语“启动子”通常是指参与RNA聚合酶II和其它蛋白质(如反式作用转录因子)的识别与结合以启动转录的DNA分子。最初可从基因的基因组拷贝的5'非翻译区(5'UTR)分离启动子。或者，启动子可以是合成产生的或操纵的DNA分子。启动子也可以是嵌合的。嵌合启动子是通过两个或更多个异源DNA分子的融合产生。用于实施本发明的启动子包括SEQ ID NO:2、5、8、11和14中任一个内所包含的启动子元件、或其片段或变体。在本发明的具体实施方案中，要求保护的DNA分子及其如本文所述的任何变体或衍生物进一步被定义为包含启动子活性，即能够在宿主细胞中(如在转基因植物中)充当启动子。在更进一步的具体实施方案中，片段可被定义为表现出由其所源自的起始启动子分子所具有的启动子活性，或者片段可包含“最小启动子”，其提供基础转录水平并且是由TATA盒、其它已知的转录因子结合位点基序、或用于识别并结合RNA聚合酶II复合物以启动转录的等同DNA序列构成。
在一个实施方案中，提供了本文所公开的启动子序列的片段。如上所述，启动子片段可包含启动子活性，并且可单独使用或与其它启动子和启动子片段组合用于例如构建嵌合启动子，或与其它EXP和EXP片段组合。在具体的实施方案中，提供启动子的片段，其包含至少约50、至少约75、至少约95、至少约100、至少约125、至少约150、至少约175、至少约200、至少约225、至少约250、至少约275、至少约300、至少约500、至少约600、至少约700、至少约750、至少约800、至少约900或至少约1000个连续核苷酸或更长的具有本文所公开的启动子活性的DNA分子。在某些实施方案中，本发明提供了SEQ ID NO:1-15中任一个的片段，其具有全长序列活性。由起始启动子分子产生这类片段的方法是本领域中公知的。
源自SEQ ID NO:2、5、8、11和14中任一个内所包含的任何启动子元件(如内部或5'缺失)的组合物可例如使用本领域已知的方法产生以改善或改变表达，包括通过去除对表达有正面或负面影响的元件；复制对表达有正面或负面影响的元件；和/或复制或去除对表达具有组织或细胞特异性影响的元件。源自SEQ ID NO:2、5、8、11和14中任一个内所包含且包括3'缺失的任何启动子元件的组合物可用于例如制造增强子元件，在所述启动子元件中TATA盒元件或其等同序列和下游序列被去除。可制造其它缺失以去除对表达具有正面或负面；组织特异性；细胞特异性；或时间特异性(如但不限于昼夜节律)影响的任何元件。SEQID NO:2、5、8、11和14中任一个内所包含的任何启动子元件及由其衍生的片段或增强子可用于制备嵌合转录调控元件组合物。
根据本发明，可分析启动子或启动子片段中是否存在已知的启动子元件，即，DNA序列特征，如TATA盒和其它已知的转录因子结合位点基序。本领域技术人员可使用这些已知启动子元件的鉴定来设计具有与原始启动子相似的表达模式的启动子的变体。
如本文所用，术语“前导序列”是指从基因的非翻译5'区(5'UTR)分离的DNA分子，并且通常定义为转录起始位点(TSS)与蛋白质编码序列起始位点之间的核苷酸区段。或者，前导序列可以是合成产生的或操纵的DNA元件。前导序列可用作调节可操作连接的可转录DNA分子的表达的5'调控元件。前导分子可与异源启动子或其天然启动子一起使用。用于实施本发明的前导序列包括SEQ ID NO:3、6、9、12和15或任何SEQ ID NO:1、4、7、10和13内所包含的任何前导元件或其片段或变体。在具体的实施方案中，此类DNA序列可被定义为能够充当宿主细胞(包括例如转基因植物细胞)中的前导序列。在一个实施方案中，此类序列被解码为包含前导序列活性。
表示为SEQ ID NO:3、6、9、12和15的前导序列(也称为5′UTR)或SEQ ID NO:1、4、7、10和13中任一个内所包含的任何前导元件可由调控元件构成，或可采用可对可操作连接的可转录DNA分子的转录或翻译具有影响的二级结构。表示为SEQ ID NO:3、6、9、12和15的前导序列或SEQ ID NO:1、4、7、10和13中任一个内所包含的任何前导元件均可根据本发明用于制备影响可操作连接的可转录DNA分子的转录或翻译的嵌合调控元件。
如本文所用，术语“内含子”是指可从一个基因中分离或鉴定的DNA分子并且一般可被定义为在翻译之前的信使RNA(mRNA)加工期间剪切掉的区域。或者，内含子可以是合成产生的或操纵的DNA元件。内含子可含有增强子元件，其影响可操作连接的基因的转录。内含子可用作调节可操作连接的可转录DNA分子的表达的调控元件。构建体可包含内含子，并且内含子相对于可转录的DNA分子可以是或可以不是异源的。本领域中的内含子的实例包括水稻肌动蛋白内含子和玉米HSP70内含子。
在植物中，相对于缺乏内含子的构建体，在基因构建体中包含一些内含子导致mRNA和蛋白质积聚的增加。这种效应被称为基因表达的“内含子介导的增强”(IME)。已经在以下中鉴定出已知刺激植物中的表达的内含子：玉米基因(例如，tubA1、Adh1、Sh1和Ubi1)、水稻基因(例如tpi)和双子叶植物基因，如来自矮牵牛(例如rbcS)、马铃薯(例如st-ls1)和来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)(例如，ubq3和pat1)的那些基因。已显示内含子的剪接位点内的缺失或突变减少了基因表达，表明剪接可能为IME所需。然而，双子叶植物中的IME已由来自拟南芥的pat1基因的剪接位点内的点突变显示出。在一种植物中多次使用相同的内含子已显示出缺点。在那些情况下，必须具有用于构建合适的重组DNA元件的基本控制元件的集合。
如本文所用，术语“3'转录终止分子”、“3'非翻译区”或“3′UTR”是指在转录成mRNA分子的3'部分的非翻译区期间使用的DNA分子。mRNA分子的3'非翻译区可通过特异性切割及3'聚腺苷酸化(也称为polyA尾)产生。3′UTR可与可转录的DNA分子可操作地连接并位于其下游，并且可包括聚腺苷酸化信号及能够影响转录、mRNA加工或基因表达的其它调控信号。PolyA尾被认为在mRNA稳定性及翻译起始中起作用。本领域中的3'转录终止分子的实例是胭脂碱合成酶3'区；小麦hsp17 3'区、豌豆rubisco小亚基3'区、棉花E63'区和薏苡醇溶蛋白3′UTR。
通常发现3′UTR对特定DNA分子的重组表达有有益用途。弱3′UTR具有产生通读的潜力，其可影响位于相邻表达盒中的DNA分子的表达。对转录终止的适当控制可以防止通读到的DNA序列(例如其它表达盒)，并且可进一步允许RNA聚合酶的有效再循环以改善基因表达。转录的有效终止(从DNA中释放RNA聚合酶II)是重新启动转录的先决条件，从而直接影响整体转录水平。转录终止后，成熟mRNA从合成位点释放，且模板转运至细胞质。真核mRNA以poly(A)形式在体内积聚，使得难以通过常规方法检测转录终止位点。然而，通过生物信息学方法预测功能性和有效的3'UTR是困难的，因为没有保守的DNA序列可以容易地预测有效的3'UTR。
从实际观点来看，表达盒中使用的3'UTR具有以下特征通常是有益的。3′UTR应该能够有效且高效地终止转基因的转录并防止转录物通读到任何相邻的DNA序列(如在多个表达盒驻留在一个转移DNA(T-DNA)中的情况下，该序列可由另一个表达盒构成)或T-DNA已插入的相邻染色体DNA。3′UTR不应导致由用于驱动DNA分子表达的启动子、前导序列、增强子和内含子所赋予的转录活性的降低。在植物生物技术中，3′UTR通常用于引发从转化植物中提取的逆转录RNA的扩增反应，并用于：(1)一旦整合到植物染色体中，便评估表达盒的转录活性或表达；(2)评估植物DNA中插入的拷贝数；以及(3)评估繁殖后所得种子的接合性。3′UTR还用于从转化植物中提取的DNA的扩增反应中，以表征插入盒的完整性。
如本文所用，术语“增强子”或“增强子元件”是指顺式作用调控元件，又名顺式元件，其赋予整体表达模式的一个方面，但通常不足以单独驱动可操作连接的可转录DNA分子的转录。与启动子不同，增强子元件通常不包括转录起始位点(TSS)或TATA盒或等同的DNA序列。启动子或启动子片段可天然地包含一个或多个增强子元件，其影响可操作连接的DNA序列的转录。增强子元件也可以与启动子融合以产生嵌合启动子顺式元件，它赋予基因表达整体调节的一个方面。来源于蒺藜苜蓿集光复合蛋白b2前体基因启动子的增强子元件的一个实例提供为SEQ ID NO:16。
许多启动子增强子元件被认为结合DNA结合蛋白和/或影响DNA拓扑结构，从而产生局部构象，所述构象选择性地允许或限制RNA聚合酶进入DNA模板或促进转录起始位点处双螺旋的选择性打开。增强子元件可以起到结合调控转录的转录因子的作用。一些增强子元件结合多于一个转录因子，并且转录因子可以不同亲和力与多于一个增强子结构域相互作用。增强子元件可通过以下众多技术来鉴别，包括缺失分析，即由5'末端或启动子内部缺失一个或多个核苷酸；使用DNA酶I足迹法、甲基化干扰、电泳迁移率变动分析、通过连接介导的聚合酶链反应(PCR)的体内基因组足迹法及其它常规测定进行的DNA结合蛋白分析；或通过利用常规DNA序列比较方法如BLAST，使用已知的顺式元件基序或增强子元件作为靶序列或靶基序进行DNA序列相似性分析。可通过一种或多种核苷酸的诱变(或取代)或通过本领域已知的其它常规方法进一步研究增强子结构域的精细结构。增强子元件可通过化学合成或通过从包含这些元件的调控元件中分离而获得，并且它们可用含有有用的限制酶位点以促进子序列操纵的额外侧翼核苷酸合成。因此，本发明涵盖根据本文所公开的方法用于调节可操作连接的可转录DNA分子的表达的增强子元件的设计、构建和用途。
如本文所用，术语“嵌合”是指通过将第一DNA分子与第二DNA分子融合而产生的单一DNA分子，其中无论第一DNA分子还是第二DNA分子通常都不会以这种构造(即彼此融合)被发现。因此，嵌合DNA分子是一种在其它情况下在自然中通常未发现的新的DNA分子。如本文所用，术语“嵌合启动子”是指通过DNA分子的这种操纵产生的启动子。嵌合启动子可组合两个或更多个DNA片段；例如，启动子与增强子元件的融合。因此，本发明涵盖根据本文所公开的方法用于调节可操作连接的可转录DNA分子的表达的嵌合启动子的设计、构建和用途。
嵌合调控元件可被设计成包含各种组成元件，其可通过本领域中已知的以下各种方法可操作地连接，如限制酶消化和连接、连接独立的克隆、PCR产物在扩增期间的模块组装、或调控元件的直接化学合成，以及本领域中已知的其它方法。得到的各种嵌合调控元件可由相同组成元件或相同组成元件但在DNA序列或包含连接DNA序列的DNA序列或允许组成部分可操作地连接的序列上不同的变体构成。在本发明中，作为SEQ ID NO:1-15提供的DNA序列可提供调控元件参考序列，其中包含参考序列的组成元件可通过本领域已知的方法连接，并且可包含一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或插入或在细菌和植物细胞转化中天然存在的突变。
如本文所用，术语“变体”是指第二DNA分子，如调控元件，其在组成上与第一DNA分子相似但不相同，且其中第二DNA分子仍保持一般功能，即第一DNA分子的相同或相似表达模式，例如，通过或多或少等同的转录活性。变体可以是第一DNA分子的较短或截短形式和/或第一DNA分子序列的改变形式，如具有不同限制酶位点和/或内部缺失、取代和/或插入的变体。“变体”还可涵盖具有核苷酸序列的调控元件，所述核苷酸序列包含参考序列的一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或插入，其中衍生调控元件具有与相应的母体调控分子相比或多或少等同的转录或翻译活性。调控元件“变体”还涵盖由细菌和植物细胞转化中天然存在的突变产生的变体。在本发明中，作为SEQ ID NO:1-15提供的多核苷酸序列可用于产生与原始调控元件的DNA序列在组成上相似但不相同的变体，同时仍保持一般功能，即，原始调控元件的相同或相似的表达模式。根据本公开内容，本发明的这类变体的产生完全在本领域普通技术人员的技能范围内，并且涵盖于本发明范围内。
在本申请中，提及“分离的DNA分子”或等同术语或短语，旨在意指该DNA分子是单独或与其它组合物组合存在，但不在其天然环境中的DNA分子。例如，在生物体的基因组的DNA中天然发现的核酸元件如编码序列、内含子序列、非翻译前导序列、启动子序列、转录终止序列等不被认为是“分离的”，只要所述元件位于生物体的基因组内并且在其天然发现的基因组内的位置处。然而，这些元件中的每一个及这些元件的子部分在本公开的范围内将是“分离的”，只要所述元件不在生物体的基因组内并且在其天然发现的基因组内的位置处。为了本公开的目的，任何转基因核苷酸序列，即，插入植物或细菌细胞的基因组中或存在于染色体外载体中的DNA的核苷酸序列，将被认为是分离的核苷酸序列，无论该序列是否存在于用于转化细胞的质粒或类似结构内、在植物或细菌的基因组内、或以可检测的量存在于来源于该植物或细菌的组织、子代、生物样品或商品产品中。
本文所述的修饰、重复或缺失对具体转基因的所需表达方面的功效可在稳定和瞬时植物测定中凭经验测试，如本文工作实施例中所述的测定，以便验证结果，所述结果可根据所做出的改变和起始DNA分子变化的目标而改变。
构建体
如本文所用，术语“构建体”意指源自任何来源的任何重组DNA分子，如质粒、粘粒、病毒、噬菌体、或线性或环状DNA或RNA分子，其能够进行基因组整合或自主复制，包含DNA分子，其中至少一个DNA分子已经以功能上可操作的方式(即可操作地连接)与另一种DNA分子连接。如本文所用，术语“载体”意指可用于转化目的的任何构建体，即，将异源DNA或RNA引入宿主细胞中。构建体通常包括一个或多个表达盒。如本文所用，“表达盒”是指DNA分子，其包含至少一个可转录的DNA分子，所述可转录的DNA分子可操作地连接至一个或多个调控元件，通常至少一个启动子和3′UTR。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指第一DNA分子与第二DNA分子相连，其中第一和第二DNA分子如此排列以使得第一DNA分子影响第二DNA分子的功能。两个DNA分子可为或不为单个连续DNA分子的一部分，并且可以是相邻或不相邻的。例如，如果启动子调节所关注的可转录DNA分子在细胞中的转录，那么启动子可操作地连接至可转录的DNA分子。例如，前导序列当能够影响DNA序列的转录或翻译时便可操作地连接至DNA序列。
在一个实施方案中，本发明的构建体可作为双肿瘤诱导(Ti)质粒边界构建体提供，其具有从根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)分离的Ti质粒的右边界(RB或AGRtu.RB)和左边界(LB或AGRtu.LB)区域，所述Ti质粒包含T-DNA以及由根癌农杆菌细胞提供的转移分子，由此允许T-DNA整合到植物细胞的基因组中(参见，例如美国专利6,603,061)。所述构建体还可含有质粒骨架DNA片段，其在细菌细胞中提供复制功能和抗生素选择，例如，大肠杆菌复制起点如ori322、广宿主范围的复制起点如oriV或oriRi、以及选择性标记的编码区，如编码Tn7氨基糖苷腺苷酰转移酶(aadA)的Spec/Strp，所述转移酶赋予对壮观霉素或链霉素或庆大霉素(Gm，Gent)选择性标记基因的抗性。对于植物转化，宿主细菌菌株通常为根癌农杆菌ABI、C58或LBA4404；然而，植物转化领域技术人员已知的其它菌株也可在本发明中起作用。
本领域已知用于将构建体以如此方式组装并引入细胞中以使得可转录的DNA分子被转录成功能性mRNA分子(其被翻译并表达为蛋白质)的方法。对于本发明的实践，用于制备并使用构建体和宿主细胞的常规组合物和方法是本领域技术人员熟知的。适用于在高等植物中表达核酸的典型载体是本领域熟知的，并且包括源自根癌农杆菌的Ti质粒的载体和pCaMVCN转移控制载体。
各种调控元件可包括在构建体中，包括本文提供的任何构建体。任何此类调控元件可与其它调控元件组合提供。可以设计或修改这种组合以产生期望的调控特征。在一个实施方案中，本发明的构建体包含至少一个与可转录的DNA分子可操作地连接的调控元件，所述可转录的DNA分子与3'UTR可操作地连接。
本发明的构建体可包括本文提供的或本领域已知的任何启动子或前导序列。举例来说，本发明的启动子可与异源非翻译的5'前导序列(如源自热休克蛋白基因的前导序列)可操作地连接。或者，本发明的前导序列可与异源启动子(如花椰菜花叶病毒35S转录启动子)可操作地连接。
表达盒还可包括转运肽编码序列，其编码适用于可操作连接的蛋白质对特别是以下的亚细胞靶向的肽：叶绿体、白色体、或其它质体细胞器；线粒体；过氧化物酶体；液泡；或细胞外位置。许多叶绿体定位蛋白作为前体从核基因中表达并且通过叶绿体转运肽(CTP)靶向至叶绿体。此类分离的叶绿体蛋白的实例包括但不限于与核酮糖-1,5,-二磷酸羧化酶的小亚基(SSU)、铁氧还蛋白、铁氧还蛋白氧化还原酶、集光复合蛋白I和蛋白II、硫氧还蛋白F、及烯醇丙酮酸莽草酸磷酸合成酶(EPSPS)相关联的那些蛋白质。叶绿体转运肽描述于例如美国专利号7,193,133中。已经证明，非叶绿体蛋白可通过表达与编码非叶绿体蛋白的转基因可操作连接的异源CTP而靶向叶绿体。
可转录的DNA分子
如本文所用，术语“可转录的DNA分子”是指能够转录成RNA分子的任何DNA分子，包括但不限于具有蛋白质编码序列的那些和产生具有适用于基因抑制的序列的RNA分子的那些。DNA分子的类型可包括但不限于来自相同植物的DNA分子、来自另一植物的DNA分子、来自不同生物的DNA分子、或合成DNA分子，如含有基因的反义信息的DNA分子，或编码人工、合成或其它修饰形式的转基因的DNA分子。用于掺入本发明构建体中的示例性可转录的DNA分子包括例如来自DNA分子所掺入物种以外的物种的DNA分子或基因，或源自同一物种或存在于同一物种中但通过遗传工程方法而非经典育种技术掺入受体细胞中的基因。
“转基因”是指至少就其在宿主细胞基因组中的位置而言与宿主细胞异源的可转录DNA分子和/或在当前或任何前代细胞中人工掺入宿主细胞基因组中的可转录DNA分子。
调控元件如本发明的启动子可与可转录的DNA分子可操作地连接，所述可转录的DNA分子相对于调控元件是异源的。如本文所用，术语“异源”是指两个或更多个DNA分子的组合，其中这种组合通常未见于自然界中。举例来说，两个DNA分子可源自不同物种和/或两个DNA分子可源自不同基因，例如，来自同一物种的不同基因或来自不同物种的相同基因。调控元件因此相对于可操作连接的可转录DNA分子是异源的，如果这种组合通常未见于自然界中的话，即，可转录的DNA分子通常在自然界中不以与调控元件可操作连接的形式存在。
可转录的DNA分子通常可以是需要转录物表达的任何DNA分子。转录物的这种表达可能导致所得mRNA分子的翻译，且由此造成蛋白质表达。或者，例如，可设计可转录的DNA分子以最终使得特定基因或蛋白质的表达减少。在一个实施方案中，这可通过使用以反义方向取向的可转录DNA分子来实现。本领域普通技术人员熟悉使用这种反义技术。可以此方式对任何基因进行负调控，并且在一个实施方案中，可设计可转录的DNA分子，以用于通过dsRNA、siRNA或miRNA分子的表达来抑制特定基因。
因此，本发明的一个实施方案是一种包含本发明的调控元件的重组DNA分子，如提供为SEQ ID NO:1-15的那些，所述调控元件可操作地连接至异源可转录的DNA分子以便当构建体整合到转基因植物细胞的基因组中时，以所需水平或所需模式调节可转录的DNA分子的转录。在一个实施方案中，可转录的DNA分子包含基因的蛋白质编码区，且在另一个实施方案中，可转录的DNA分子包含基因的反义区。
农学上关注的基因
可转录的DNA分子可以是农学上关注的基因。如本文所用，术语“农学上关注的基因”是指当在特定的植物组织、细胞或细胞类型中表达时赋予所需特征的可转录的DNA分子。农学上关注的基因的产物可在植物内起作用，以便对植物形态、生理、生长、发育、产量、谷粒组成、营养特征、疾病或害虫抗性、和/或环境或化学耐受性产生影响，或者可在以植物为食的害虫的食物中充当杀虫剂。在本发明的一个实施方案中，将本发明的调控元件掺入构建体中，使得调控元件与可转录的DNA分子可操作地连接，所述可转录的DNA分子是农学上关注的基因。在含有这种构建体的转基因植物中，农学上关注的基因的表达可赋予有益的农学性状。有益的农学性状可包括例如但不限于除草剂耐受性、昆虫防治、改进的产量、抗病性、病原体抗性、改进的植物生长和发育、改进的淀粉含量、改进的油含量、改进的脂肪酸含量、改进的蛋白质含量、改进的果实成熟、加强的动物和人类营养、生物聚合物产生、耐环境应力、药物肽、改善的加工品质、改善的风味、杂种种子生产效用、改进的纤维生产及期望的生物燃料生产。
本领域已知的农学上关注的基因的实例包括针对以下的那些基因：除草剂抗性(美国专利号6,803,501；6,448,476；6,248,876；6,225,114；6,107,549；5,866,775；5,804,425；5,633,435；和5,463,175)；提高产量(美国专利号USRE38,446；6,716,474；6,663,906；6,476,295；6,441,277；6,423,828；6,399,330；6,372,211；6,235,971；6,222,098；和5,716,837)；昆虫防治(美国专利号6,809,078；6,713,063；6,686,452；6,657,046；6,645,497；6,642,030；6,639,054；6,620,988；6,593,293；6,555,655；6,538,109；6,537,756；6,521,442；6,501,009；6,468,523；6,326,351；6,313,378；6,284,949；6,281,016；6,248,536；6,242,241；6,221,649；6,177,615；6,156,573；6,153,814；6,110,464；6,093,695；6,063,756；6,063,597；6,023,013；5,959,091；5,942,664；5,942,658,5,880,275；5,763,245；和5,763,241)；真菌抗病性(美国专利号6,653,280；6,573,361；6,506,962；6,316,407；6,215,048；5,516,671；5,773,696；6,121,436；6,316,407；和6,506,962)；病毒抗性(美国专利号6,617,496；6,608,241；6,015,940；6,013,864；5,850,023；和5,304,730)；线虫抗性(美国专利号6,228,992)；细菌抗病性(美国专利号5,516,671)；植物生长和发育(美国专利号6,723,897和6,518,488)；淀粉生产(美国专利号6,538,181；6,538,179；6,538,178；5,750,876；6,476,295)；改进的油生产(美国专利号6,444,876；6,426,447；和6,380,462)；高产油量(美国专利号6,495,739；5,608,149；6,483,008；和6,476,295)；改进的脂肪酸含量(美国专利号6,828,475；6,822,141；6,770,465；6,706,950；6,660,849；6,596,538；6,589,767；6,537,750；6,489,461；和6,459,018)；高蛋白质产量(美国专利号6,380,466)；果实成熟(美国专利号5,512,466)；加强的动物和人类营养(美国专利号6,723,837；6,653,530；6,5412,59；5,985,605；和6,171,640)；生物聚合物(美国专利号USRE37,543；6,228,623；及5,958,745和6,946,588)；耐环境应力(美国专利号6,072,103)；药物肽和可分泌肽(美国专利号6,812,379；6,774,283；6,140,075；和6,080,560)；改进的加工性状(美国专利号6,476,295)；改进的消化性(美国专利号6,531,648)；低棉子糖(美国专利号6,166,292)；工业酶生产(美国专利号5,543,576)；改善的风味(美国专利号6,011,199)；固氮(美国专利号5,229,114)；杂种种子生产(美国专利号5,689,041)；纤维生产(美国专利号6,576,818；6,271,443；5,981,834；和5,869,720)；以及生物燃料生产(美国专利号5,998,700)。
或者，农学上关注的基因可通过编码RNA分子影响以上提及的植物特征或表型，所述RNA分子例如通过以下实现内源基因的基因表达的靶向调节：反义(参见，例如美国专利5,107,065)；抑制性RNA(“RNAi”，包括通过miRNA-、siRNA-、反式作用siRNA-和阶段sRNA介导的机制调节基因表达，例如，如公开的申请U.S.2006/0200878和U.S.2008/0066206及美国专利申请11/974,469中所述)；或共抑制介导的机制。RNA也可以是催化性RNA分子(例如核酶或核糖开关；参见，例如U.S.2006/0200878)，其被工程化以切割所需的内源mRNA产物。本领域已知用于以某种方式构建构建体并将其引入细胞中以使得可转录的DNA分子转录成能够引起基因抑制的分子的方法。
选择性标记
选择性标记转基因也可与本发明的调控元件一起使用。如本文所用，术语“选择性标记转基因”是指任何可转录的DNA分子，其在转基因植物、组织或细胞中的表达或其缺乏可以某种方式进行筛选或评分。用于本发明实践的选择性标记基因及其相关选择和筛选技术是本领域已知的，包括但不限于编码以下的可转录DNA分子：β-葡糖醛酸酶(GUS)、绿色荧光蛋白(GFP)、赋予抗生素抗性的蛋白质和赋予除草剂耐受性的蛋白质。选择性标记转基因的一个实例提供为SEQ ID NO:17。
细胞转化
本发明还涉及一种产生转化的细胞和植物的方法，所述转化的细胞和植物包含与可转录的DNA分子可操作地连接的一个或多个调控元件。
术语“转化”是指将DNA分子引入受者宿主中。如本文所用，术语“宿主”是指细菌、真菌或植物，包括所述细菌，真菌或植物的任何细胞、组织、器官或后代。特别关注的植物组织和细胞包括原生质体、愈伤组织、根、块茎、种子、茎、叶、幼苗、胚和花粉。
如本文所用，术语“转化的”是指其中引入了外源DNA分子(如构建体)的细胞、组织、器官或生物体。引入的DNA分子可被整合到受者细胞、组织、器官或生物体的基因组DNA中，使得引入的DNA分子由随后的后代遗传。“转基因”或“转化的”细胞或生物体还可包括细胞或生物体的后代及由育种程序产生的后代，所述育种程序使用这样的转基因生物作为杂交亲本并且表现出由于外源DNA分子的存在而改变的表型。所引入的DNA分子也可瞬时引入受者细胞中，以使得所引入的DNA分子不被随后的后代遗传。术语“转基因”是指含有一种或多种异源DNA分子的细菌、真菌或植物。
本领域技术人员熟知许多用于将DNA分子引入植物细胞中的方法。所述方法一般包括选择合适的宿主细胞，用载体转化宿主细胞并获得转化的宿主细胞的步骤。在本发明的实践中通过将植物构建体引入植物基因组中来转化植物细胞的方法和材料可包括任何公知和证实的方法。合适的方法包括但不限于细菌感染(例如，农杆菌属)、二元BAC载体、直接递送DNA(例如，通过PEG介导的转化、干燥/抑制介导的DNA摄取、电穿孔、用碳化硅纤维的搅动以及DNA包被颗粒的加速)、基因编辑(例如，CRISPR-Cas系统)等。
宿主细胞可以是任何细胞或生物体，如植物细胞、藻类细胞、藻类、真菌细胞、真菌、细菌细胞或昆虫细胞。在具体的实施方案中，宿主细胞和转化的细胞可包括来自作物植物的细胞。
随后可从本发明的转基因植物细胞再生转基因植物。使用常规育种技术或自花授粉，可以从该转基因植物产生种子。这类种子和从这种种子生长的后代植物将含有本发明的重组DNA分子，因此是转基因的。
本发明的转基因植物可以自花授粉以便为本发明的纯合转基因植物提供种子(对于重组DNA分子是纯合的)或与非转基因植物或不同的转基因植物杂交以为本发明的杂合转基因植物提供种子(对于重组DNA分子是杂合的)。这种纯合和杂合转基因植物在本文中均称为“后代植物”。后代植物是传代自原始转基因植物并含有本发明的重组DNA分子的转基因植物。可以收获使用本发明的转基因植物产生的种子并用于培育几代转基因植物，即，包含本发明的构建体并表达农学上关注的基因的本发明的后代植物。常用于不同作物的育种方法的说明可见于以下若干参考书之一者中：参见，例如Allard,Principles of PlantBreeding,John Wiley&Sons,NY,U.of CA,Davis,CA,50-98(1960)；Simmonds,Principlesof Crop Improvement,Longman,Inc.,NY,369-399(1979)；Sneep和Hendriksen,Plantbreeding Perspectives,Wageningen(编著),Center for Agricultural Publishing andDocumentation(1979)；Fehr,Soybeans:Improvement,Production and Uses,第2版,Monograph,16:249(1987)；Fehr,Principles of Variety Development,Theory andTechnique,(第1卷)和Crop Species Soybean(第2卷),Iowa State Univ.,MacmillanPub.Co.,NY,360-376(1987)。
可以分析转化的植物中一种或多种目标基因的存在以及由本发明的调控元件所赋予的表达水平和/或谱。本领域技术人员知道可用于分析所转化的植物的许多方法。例如，用于植物分析的方法包括但不限于DNA印迹或RNA印迹、基于PCR的方法、生物化学分析、表型筛选方法、现场评估和免疫诊断测定。可转录的DNA分子的表达可使用制造商描述的(Applied Biosystems,Foster City,CA)试剂和方法测量，并使用Testing Matrix测定PCR循环时间。或者，制造商描述的(Third WaveTechnologies,Madison,WI)试剂和方法可用于评估转基因表达。
本发明还提供了本发明植物的部分。植物部分包括但不限于叶、茎、根、块茎、种子、胚乳、胚珠和花粉。本发明的植物部分可为存活的、非存活的、可再生的和/或不可再生的。本发明还包括并提供了转化的植物细胞，其包含本发明的DNA分子。本发明的转化的或转基因植物细胞包括可再生和/或不可再生的植物细胞。
本发明还提供了一种商品产品，其是由含有本发明的重组DNA分子的转基因植物或其部分产生。本发明的商品产品包含可检测量的DNA，所述DNA包含选自由SEQ ID NO:1-15组成的组的DNA序列。如本文所用，“商品产品”是指由源自含有本发明的重组DNA分子的转基因植物、种子、植物细胞或植物部分的材料构成的任何组合物或产品。商品产品包括但不限于加工的种子、谷粒、植物部分和粗粉。本发明的商品产品含有可检测量的对应于本发明重组DNA分子的DNA。检测样品中的一个或多个该DNA可用于确定商品产品的含量或来源。可使用DNA分子的任何标准检测方法，包括本文所公开的检测方法。
通过参考以下实施例可以更容易地理解本发明，除非另有说明，这些实施例是以举例说明的方式提供，并且不旨在限制本发明。本领域技术人员应了解在下面的实施例中所公开的技术代表本发明者发现在实践本发明时发挥良好作用的技术。然而，本领域技术人员根据本公开内容了解到可在不背离本发明的精神和范围的情况下在所公开的具体实施方案中做出许多改变并且仍获得同样或类似的结果，因此，在附图中阐述或示出的所有内容都被解释为说明性而非限制性意义。
实施例
实施例1
调控元件的鉴定和克隆
由双子叶植物物种香瓜(WSH-39-1070AN)和蒺藜苜蓿的基因组DNA中鉴定并克隆新型转录调控元件和调控表达元件组(EXP)。
转录调控元件是基于以下来选择：在大豆(大豆(Glycine max))和拟南芥中进行的转录谱分析实验得到的专有和公共微阵列数据，以及使用已知的双子叶植物序列作为针对专有的香瓜及专有的公共的蒺藜苜蓿序列的查询的基于同源性的搜索。
使用所鉴定的序列，进行生物信息学分析以鉴定所扩增的DNA内的调控元件。例如，进行生物信息学分析以鉴定序列中存在的转录起始位点(TSS)和任何双向性、内含子或上游编码序列。使用此分析的结果，在经设计以扩增调控元件的DNA序列和引物中限定调控元件。使用标准聚合酶链反应条件扩增每个调控元件的相应DNA分子，其中引物含有独特的限制性酶位点及从香瓜和蒺藜苜蓿中分离的基因组DNA。使用相容的限制性位点的标准限制酶消化和DNA连接方法，将所得DNA片段连接到基础植物表达载体中。
可使用所转化的植物组织进行调控元件TSS和内含子/外显子剪接点的分析。简言之，用植物表达载体转化植物，所述植物表达载体包含与异源可转录的DNA分子可操作连接的克隆DNA片段。接下来，通过分析所产生的mRNA转录物的DNA序列，使用RapidAmplification of cDNA Ends,2.0版(Invitrogen,Carlsbad,California 92008)的5'RACE系统来确认调控元件TSS和内含子/外显子剪接点。
编码黄瓜属和苜蓿属转录调控表达元件组或EXP序列的DNA序列及其相应的启动子和前导序列示于表1中，所述DNA序列是由与前导元件可操作连接的启动子元件构成。
表1.由香瓜和蒺藜苜蓿中分离的转录调控表达元件组、启动子、前导序列和内含子
实施例2
驱动GUS在稳定转化的大豆植物中的表达的调控元件的分析
用载体(特别是植物表达载体)转化大豆植物，所述载体含有驱动β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)转基因的表达的测试调控元件。分析所生成的植物的GUS蛋白表达，以评估所选调控元件对表达的影响。
用表2中列出的植物GUS表达构建体转化大豆植物。使用本领域已知的标准方法将调控元件克隆到基础植物表达载体中。所生成的植物表达载体含有来自根癌农杆菌的右边界区(B-AGRtu.右边界)；第一转基因选择盒，其是用于选择赋予对除草剂草甘膦或抗生素壮观霉素的抗性的转化植物细胞；用于评估调控元件活性的第二转基因盒，其包含EXP序列，所述EXP序列5’可操作地连接至含有源自马铃薯光诱导组织特异性ST-LS1基因(Genbank登录号：X04753)的可加工内含子的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS，GOI-Ec.uidA+St.LS1:1:1，SEQ ID NO:17)的编码序列，5’可操作地连接至来自海岛棉E6基因(T-Gb.E6-3b:3b:1，SEQ ID NO:18)的3’终止区；以及来自根癌农杆菌的左边界区(B-AGRtu.左边界)。
表2.调控元件和相应的GUS表达质粒构建体
使用本领域已知的方法，通过农杆菌属介导的转化，使用上述二元转化载体构建体转化大豆植物细胞。诱导所得的转化植物细胞以形成完整的大豆植物。
将组织化学GUS分析用于所转化的植物的定性和定量表达分析。将整个组织切片与GUS染色溶液X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-葡糖苷酸)(1毫克/毫升)一起培育适当的时间，漂洗，并目视检查蓝色。通过直接目视检查或使用选择的植物器官和组织在显微镜下检查来定性地确定GUS活性。
为了定量分析GUS表达，从所转化的大豆植物的选定组织中提取总蛋白。将1微克总蛋白与荧光底物4-甲基伞形酮酰基-β-D-葡糖苷酸(MUG)一起使用，总反应体积为50微升。反应产物4-甲基伞形酮(4-MU)在高pH下最大程度地发荧光，其中羟基被电离。添加碱性碳酸钠溶液同时停止测定并调节pH以定量荧光产物。使用具有Micromax读数器的Fluoromax-3，在365nm激发，445nm发射下测量荧光，其中狭缝宽度设定为激发2nm和发射3nm。值是以nmol GUS/小时/mg总蛋白为单位提供。
取样以下组织用于以下中的GUS表达：R0代；Vn5阶段库叶、源叶和根；R1阶段叶柄、源叶、花和子叶；R3阶段荚和未成熟的种子；以及黄荚阶段胚胎和子叶。下表3和4示出了由表2中所示的调控元件驱动的每个取样组织的平均定量GUS表达。
表3.在由源自香瓜的调控元件驱动的稳定转化的大豆植物中的平均定量GUS表达
表4.在由源自蒺藜苜蓿的调控元件驱动的稳定转化的大豆植物中的平均定量GUS表达
阶段 器官 EXP-Mt.Lhcb2:1:1 EXP-Mt.PSII-T:1:1
Vn5 库叶 108 22
Vn5 根 21 11
Vn5 源叶 148 42
R1 叶柄 153 83
R1 源叶 94 118
R1 花 39 21
R5 子叶 13 9
R3 荚 85 33
R3 不成熟的种子 5 9
黄荚 胚胎 4 0
黄荚 子叶 4 0
从表3和4中可以看出，每个调控元件在取样的组织中都具有独特的表达模式。EXP-CUCme.Fe2:1(SEQ ID NO:1)和EXP-CUCme.CipLhcb:1(SEQ ID NO:4)均在R3荚中高度表达并且在R3未成熟的种子、Vn5根、R5子叶和黄荚阶段胚和子叶中显示最低表达水平。由EXP-CUCme.Fe2:1驱动的GUS表达在Vn5阶段库叶和源叶及R1阶段叶柄、源叶和花中也较高。调控元件EXP-CUCme.Bbz:1(SEQ ID NO:7)在Vn5阶段库叶和源叶及R3阶段荚中表现出最高表达。由EXP-Mt.Lhcb2:1:1(SEQ ID NO:10)驱动的GUS表达在Vn5阶段源叶和R1叶柄中最高。EXP-Mt.PSII-T:1:1(SEQ ID NO:13)在R1阶段源叶中表现出最高表达。
每个调控元件提供独特的表达模式，其可用于最佳地驱动不同转基因的表达，这取决于所需的组织表达偏好。
实施例3
源自调控元件的增强子元件
增强子是源自SEQ ID NO:2、5、8、11和14所示的启动子元件。增强子元件可包含一个或多个顺式调控元件，当与启动子元件5'或3'可操作地连接，或与可操作地连接到启动子上的其它增强子元件5'或3'可操作连接时，其可提高或调节可转录的DNA分子的表达水平，或提供可转录DNA分子在特定细胞类型或植物器官中或在发育或昼夜节律的特定时间点的表达。增强子是通过去除TATA盒或功能上相似的元件和来自启动子的任何下游序列而制得，所述启动子允许从启动子序列例如SEQ ID NO:2、5、8、11和14所示的序列或其片段起始转录。
植物启动子中的TATA盒不像其他一些真核生物那样高度保守。因此，为了将片段定义为增强子，首先必须鉴定基因的转录起始位点(TSS)，其中首先转录5'UTR。例如，转录调控元件EXP-Mt.Lhcb2:1:1(SEQ ID NO:10)是由与5'UTR或前导元件L-Mt.Lhcb2-1:2:1(SEQ ID NO:12)可操作连接的启动子元件P-Mt.Lhcb2-1:2:1(SEQ ID NO:11)构成。在1837bp启动子元件P-Mt.Lhcb2-1:2:1(SEQ ID NO:11)内，在核苷酸1798至1803内发现推定的核心TATA样元件。源自P-Mt.Lhcb2-1:2:1的增强子片段可包含SEQ ID NO:11的核苷酸1至1797，产生如SEQ ID NO:16所示的序列(E-Mt.Lhcb2)。源自启动子P-Mt.Lhcb2-1:2:1(SEQ ID NO:11)的增强子可进一步包含E-Mt.Lhcb2的较小片段(SEQ ID NO:16)。源自启动子P-Mt.Lhcb2-1:2:1(SEQ ID NO:11)的增强子元件的有效性是通过构建嵌合转录调控元件凭经验确定，所述嵌合转录调控元件包含源自启动子P-Mt.Lhcb2-1:2:1(SEQ ID NO:11)的增强子，其与启动子和前导序列可操作地连接，并且用于在稳定或瞬时植物测定中驱动可转录的DNA分子如GUS的表达。
可能需要进一步细化增强子元件并且凭经验验证。此外，增强子元件相对于嵌合转录调控元件内的其它元件的位置也是凭经验确定，因为嵌合转录调控元件内每个元件的顺序可赋予不同的效果，这取决于每个元件的相对位置。一些启动子元件将具有多个TATA盒或TATA盒样元件并且可能具有多个转录起始位点。在这些情况下，可能有必要首先确定第一TSS所处的位置，然后开始使用第一TSS设计增强子，以防止在推定的增强子元件内发生转录的潜在启动。
使用本领域已知的方法克隆源自由SEQ ID NO:2、5、8、11和14所示的启动子元件的增强子元件，以便与启动子元件5'或3'可操作地连接，或与可操作地连接至启动子的另外的增强子元件5'或3'可操作地连接。或者，可使用本领域已知的方法克隆增强子元件，以提供更大的增强子元件，所述增强子元件由两个或更多个增强子拷贝构成，并使用本领域已知的方法克隆，以便与启动子元件5'或3'可操作地连接，或与另外的增强子元件5'或3'可操作地连接，所述另外的增强子元件又与产生嵌合转录调控元件的启动子可操作地连接。还可以使用本领域已知的方法克隆增强子元件，使所述增强子元件与源自不同属生物的启动子元件5'可操作地连接，或者与源自其他属生物的其他增强子元件5'或3'可操作地连接，所述其他增强子元件与源自相同或不同属的生物的启动子可操作地连接，产生嵌合转录调控元件。GUS表达植物转化载体可使用本领域已知的方法构建，类似于上文实施例2中描述的构建体，其中所得的植物表达载体含有：来自根癌农杆菌的右边界区(B-AGRtu.右边界)；第一转基因选择盒，用于选择赋予抗生素、壮观霉素抗性的所转化的植物细胞；和第二转基因盒，用于测试增强子元件，所述增强子元件是由与启动子元件5'或3'可操作连接或与另外的增强子元件5'或3'可操作连接的的增强子元件构成，所述另外的增强子元件又与启动子可操作地连接，所述启动子与前导元件5'可操作地连接，所述前导元件与β-葡糖醛酸酶(GUS，GOI-Ec.uidA+St.LS1:1:1，SEQ ID NO:17)的编码序列可操作地连接，所述编码序列含有源自马铃薯光诱导组织特异性ST-LS1基因(Genbank登录号：X04753)的可加工内含子，其与来自海岛棉E6基因(T-Gb.E6-3b:3b:1，SEQ ID NO:18)的3'终止区可操作地连接；以及来自根癌农杆菌的左边界区(B-AGRtu.左边界)。将所得质粒用于通过上述方法转化大豆植物或其它属植物。或者，使用本领域已知的方法转化源自大豆或其它属植物的原生质体细胞以进行瞬时测定
在稳定或瞬时植物测定中评估由包含一个或多个增强子的调控元件驱动的GUS表达，以便确定增强子元件对可转录DNA分子的表达的影响。可基于经验实验及使用每种调控元件组合物观察到的所得基因表达调控来进行对一个或多个增强子元件的修饰或一个或多个增强子元件的复制。改变一个或多个增强子在所得调控或嵌合调控元件中的相对位置可影响调控或嵌合调控元件的转录活性或特异性，并且凭经验确定以鉴定玉米植物或其它属植物中所需转基因表达谱的最佳增强子。
*******
已经说明和描述了本发明的原理，对于本领域技术人员而言显而易见的是，在不背离这些原理的情况下，可以在排列和细节上对本发明进行修改。我们要求保护在权利要求的精神和范围内的所有修改。本文引用的所有出版物和公开专利文献都特此以引用方式并入本文，其程度等同于具体并分别指出各个出版物或专利申请以引用方式并入本文。

Claims (17)

1.一种重组DNA分子，其包含选自由以下组成的组的DNA序列：
a)与SEQ ID NO:1-15中任一个具有至少85％序列同一性的序列；
b)包含SEQ ID NO:1-15中任一个的序列；及
c)SEQ ID NO:1-15中任一个的片段，其中所述片段具有基因调控活性；
其中所述序列与异源可转录的DNA分子可操作地连接。
2.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述序列与SEQ ID NO:1-15中任一个的DNA序列具有至少90％的序列同一性。
3.如权利要求2所述的重组DNA分子，其中所述序列与SEQ ID NO:1-15中任一个的DNA序列具有至少95％的序列同一性。
4.如权利要求3所述的重组DNA分子，其中所述序列包含SEQ ID NO:1-15中任一个的DNA序列。
5.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述DNA序列包含基因调控活性。
6.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述异源可转录的DNA分子包含农学上关注的基因。
7.如权利要求6所述的重组DNA分子，其中所述农学上关注的基因赋予植物除草剂耐受性。
8.如权利要求6所述的重组DNA分子，其中所述农学上关注的基因赋予植物害虫抗性。
9.一种包含重组DNA分子的转基因植物细胞，所述重组DNA分子包含选自由以下组成的组的序列：
a)与SEQ ID NO:1-15中任一个具有至少85％序列同一性的序列；
b)包含SEQ ID NO:1-15中任一个的序列；及
c)SEQ ID NO:1-15中任一个的片段，其中所述片段具有基因调控活性；
其中所述序列与异源可转录的DNA分子可操作地连接。
10.如权利要求9所述的转基因植物细胞，其中所述转基因植物细胞是单子叶植物细胞。
11.如权利要求9所述的转基因植物细胞，其中所述转基因植物细胞是双子叶植物细胞。
12.一种转基因植物或其部分，其包含权利要求1所述的重组DNA分子。
13.如权利要求12所述的转基因植物的后代植物或其部分，其中所述后代植物或其部分包含所述重组DNA分子。
14.一种转基因种子，其中所述种子包含权利要求1所述的重组DNA分子。
15.一种生产商品产品的方法，所述方法包括获得根据权利要求12的转基因植物或其部分，并由此生产所述商品产品。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述商品产品是蛋白质浓缩物、蛋白质分离物、谷物、淀粉、种子、粗粉、面粉、生物质或种子油。
17.一种表达可转录的DNA分子的方法，所述方法包括获得根据权利要求12的转基因植物及培养植物，其中表达所述可转录的DNA。
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