ES2900300T3 - Elementos reguladores de las plantas y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

Una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en: a) una secuencia con al menos un 95 por ciento de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:5; b) una secuencia con al menos un 97 por ciento de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:4, en la que la secuencia tiene actividad promotora; y c) una secuencia que comprende la SEQ ID NO:4 o 5; en la que dicha secuencia está vinculada operativamente a una molécula de ADN transcribible heteróloga.

Description

DESCRIPCIÓN
Elementos reguladores de las plantas y usos de los mismos
INCORPORACIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS
El listado de secuencias que está contenido en el archivo denominado "MONS417WO-sequenceJisting", que tiene 29,4 KB (medidos en Microsoft Windows®) y fue creado el 6 de marzo de 2017, se presenta por vía electrónica.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere al campo de la biología molecular de las plantas y la ingeniería genética de las plantas. Más concretamente, la invención se refiere a moléculas de ADN útiles para modular la expresión génica en las plantas.
ANTECEDENTES
Los elementos reguladores son elementos genéticos que regulan la actividad de los genes modulando la transcripción de una molécula de ADN transcribible vinculada operativamente. Dichos elementos pueden incluir promotores, líderes, intrones y regiones no traducidas 3' y son útiles en el campo de la biología molecular de las plantas y la ingeniería genética de las mismas.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona novedosos elementos reguladores de genes para su uso en plantas. La invención también proporciona constructos de ADN que comprenden los elementos reguladores. La presente invención también proporciona células vegetales transgénicas, plantas y semillas que comprenden los elementos reguladores. En una realización, los elementos reguladores están vinculados operativamente a una molécula de ADN transcribible. En ciertas realizaciones, la molécula de ADN transcribible puede ser heteróloga con respecto a la secuencia reguladora. Así, una secuencia de elemento regulador proporcionada por la invención puede, en realizaciones particulares, definirse como operativamente vinculada a una molécula de ADN transcribible heteróloga. La presente invención también proporciona procedimientos para fabricar y utilizar los elementos reguladores, los constructos de ADN que comprenden los elementos reguladores, y las células vegetales transgénicas, las plantas y las semillas que comprenden los elementos reguladores vinculados operativamente a una molécula de a Dn transcribible.
Así, en un aspecto, la invención proporciona una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en: (a) una secuencia con al menos aproximadamente 95 por ciento de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 5; (b) una secuencia con al menos un 97 por ciento de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:4, en la que la secuencia tiene actividad promotora; y (c) una secuencia que comprende la SEQ ID NO:4 o 5, en la que la secuencia está vinculada operativamente a una molécula de ADN transcribible heteróloga. Por "molécula de ADN transcribible heteróloga" se entiende que la molécula de ADN transcribible es heteróloga con respecto a la secuencia de polinucleótidos a la que está vinculada operativamente. En realizaciones específicas, la molécula de ADN recombinante comprende una secuencia de ADN que tiene al menos aproximadamente 95 por ciento, al menos un 96 por ciento, al menos un 97 por ciento, al menos un 98 por ciento o al menos un 99 por ciento de identidad de secuencia con la secuencia de ADN de cualquiera de las SEQ ID NO: 5. En determinadas realizaciones, la secuencia de ADN comprende una actividad promotora. En todavía otras realizaciones, la molécula de ADN transcribible heteróloga comprende un gen de interés agronómico, como un gen capaz de proporcionar resistencia a los herbicidas en las plantas, o un gen capaz de proporcionar resistencia a las plagas en las plantas.
En otro aspecto, se proporcionan en el presente documento células vegetales transgénicas que comprenden una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en: (a) una secuencia con al menos aproximadamente 95 por ciento de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 5; (b) una secuencia con al menos un 97 por ciento de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:4, en la que la secuencia tiene actividad promotora; y (c) una secuencia que comprende la SEQ ID NO:4 o 5, en la que el fragmento tiene actividad reguladora del gen; en la que la secuencia de ADN está vinculada operativamente a una molécula de ADN transcribible heteróloga. En ciertas realizaciones, la célula vegetal transgénica es una célula vegetal monocotiledónea. En otras realizaciones, la célula vegetal transgénica es una célula vegetal monocotiledónea o una célula vegetal dicotiledónea.
En aún todavía otro aspecto, se proporciona además en el presente documento una planta transgénica, o parte de la misma, que comprende una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN como la descrita anteriormente. En realizaciones específicas, la planta transgénica es una planta progenitora de cualquier generación o una parte de la misma que comprende la molécula de ADN recombinante. También se proporciona en este documento una semilla transgénica que comprende la molécula de ADN recombinante que produce dicha planta transgénica cuando se cultiva.
En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento de producción de un producto básico que comprende la obtención de una planta transgénica o parte de la misma que contiene una molécula de ADN recombinante de la invención y la producción del producto básico a partir de ella. En una realización, el producto básico es un concentrado de proteínas, un aislado de proteínas, un grano, un almidón, unas semillas, una harina, una biomasa o un aceite de semillas.
En aún todavía otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento de expresión de una molécula de ADN transcribible que comprende la obtención de una planta transgénica según la reivindicación 10 y el cultivo de la planta, en el que se expresa el ADN transcribible.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS SEQ ID NO: 1 es una secuencia de ADN de un grupo de elementos reguladores de la expresión (EXP) que comprende un promotor derivado de un gen de la proteína putativa Ferredoxina 2 (Fe2) de Cucumis melo vinculado operativamente en 5' a su líder nativo.
SEQ ID NO: 2 es una secuencia promotora derivada de un gen de la proteína putativa Ferredoxina 2 (Fe2) de Cucumis melo.
SEQ ID NO: 3 es una secuencia líder derivada de un gen de la proteína putativa Ferredoxina 2 (Fe2) de Cucumis melo.
SEQ ID NO: 4 es una secuencia de ADN de un EXP que comprende un promotor derivado de un gen de la proteína 13 de unión a la clorofila a-b de Cucumis melo vinculado operativamente en 5' a su líder nativo.
SEQ ID NO: 5 es una secuencia promotora derivada de un gen de la proteína 13 de unión a la clorofila a-b de Cucumis melo.
SEQ ID NO: 6 es una secuencia líder derivada de un gen de la proteína 13 de unión a la clorofila a-b de Cucumis melo.
SEQ ID NO: 7 es una secuencia de ADN de un EXP que comprende un promotor derivado de un gen tipo proteína 24 de dedo de zinc B-box de Cucumis melo vinculado operativamente en 5' a su líder nativo.
SEQ ID NO: 8 es una secuencia promotora derivada de un gen similar a la proteína 24 de dedos de zinc B-box de Cucumis melo.
SEQ ID NO: 9 es una secuencia líder derivada de un gen similar a la proteína 24 de dedos de zinc B-box de Cucumis melo.
SEQ ID NO: 10 es una secuencia de ADN de un EXP que comprende un promotor derivado de un gen de la proteína b2 del complejo de recolección de luz de Medicago truncatula vinculado operativamente en 5' a su líder nativo. SEQ ID NO: 11 es una secuencia promotora derivada de un gen de la proteína b2 del complejo de recolección de luz de Medicago truncatula.
SEQ ID NO: 12 es una secuencia líder derivada de un gen de la proteína b2 del complejo de recolección de luz de Medicago truncatula.
SEQ ID NO: 13 es una secuencia de ADN de un EXP que comprende un promotor derivado de un gen precursor del cloroplasto del fotosistema II de Medicago truncatula vinculado operativamente en 5' a su líder nativo.
SEQ ID NO: 14 es una secuencia promotora derivada de un gen precursor del cloroplasto del fotosistema II de Medicago truncatula.
SEQ ID NO: 15 es una secuencia promotora líder derivada de un gen precursor del cloroplasto del fotosistema II de Medicago truncatula.
SEQ ID NO: 16 es una secuencia potenciadora derivada del promotor del gen de la proteína b2 del complejo de recolección de luz de Medicago truncatula.
SEQ ID NO: 17 es una secuencia de codificación para la p-glucuronidasa (GUS) con un intrón procesable.
SEQ ID NO: 18 es una secuencia 3' UTR derivada del gen E6 de Gossypium barbadense.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona moléculas de ADN que tienen actividad reguladora de genes en las plantas. Las secuencias de nucleótidos de estas moléculas de ADN se proporcionan como SEQ ID NO: 4 o 5. Estas moléculas de ADN son capaces de afectar a la expresión de una molécula de ADN transcribible vinculada operativamente en los tejidos de la planta y, por tanto, de regular la expresión génica de un transgén vinculado operativamente en las plantas transgénicas. La invención también proporciona procedimientos para modificar, producir y utilizar los mismos. La invención también proporciona composiciones que incluyen células vegetales transgénicas, plantas, partes de plantas y semillas que contienen las moléculas de ADN recombinante de la invención, y procedimientos para preparar y utilizar las mismas.
Las siguientes definiciones y procedimientos se proporcionan para definir mejor la presente invención y para guiar a los expertos en la materia en la práctica de la presente invención. A menos que se indique lo contrario, los términos deben entenderse de acuerdo con el uso convencional de los expertos en la materia.
Moléculas de ADN
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "ADN" o "molécula de ADN" se refiere a una molécula de ADN de doble cadena de origen genómico o sintético, es decir, un polímero de bases desoxirribonucleotídicas o una molécula de ADN, leída desde el extremo 5' (corriente arriba) hasta el extremo 3' (corriente abajo). Tal como se utiliza en el presente documento, el término "secuencia de ADN" se refiere a la secuencia de nucleótidos de una molécula de a Dn . La nomenclatura utilizada en el presente documento corresponde a la del Título 37 del Código de Reglamentos Federales de los Estados Unidos § 1.822, y a la establecida en las tablas de la Norma ST.25 (1998) de la OMPI, Apéndice 2, Tablas 1 y 3.
Tal y como se utiliza en el presente documento, una "molécula de ADN recombinante" es una molécula de ADN que comprende una combinación de moléculas de ADN que no se producirían naturalmente juntas sin la intervención humana. Por ejemplo, una molécula de ADN recombinante puede ser una molécula de ADN compuesta por al menos dos moléculas de ADN heterólogas entre sí, una molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN que se desvía de las secuencias de ADN que existen en la naturaleza, o una molécula de ADN que se ha incorporado al ADN de una célula huésped mediante transformación genética o edición de genes.
Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "identidad de secuencia" se refiere a la medida en que dos secuencias polinucleotídicas óptimamente alineadas o dos secuencias polipeptídicas óptimamente alineadas son idénticas. Una alineación óptima de la secuencia se crea alineando manualmente dos secuencias, por ejemplo, una secuencia de referencia y otra secuencia, para maximizar el número de coincidencias de nucleótidos en la alineación de la secuencia con inserciones, eliminaciones o huecos de nucleótidos internos apropiados. Tal y como se utiliza en este documento, el término "secuencia de referencia" se refiere a una secuencia de ADN proporcionada como SEQ ID NOs: 1-15.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "porcentaje de identidad de secuencia" o "porcentaje de identidad" o "% de identidad" es la fracción de identidad multiplicada por 100. La "fracción de identidad" de una secuencia óptimamente alineada con una secuencia de referencia es el número de coincidencias de nucleótidos en la 5 alineación óptima, dividido por el número total de nucleótidos en la secuencia de referencia, por ejemplo, el número total de nucleótidos en toda la longitud de la secuencia de referencia completa. Así, una molécula de ADN puede comprender una secuencia que, cuando se alinea óptimamente con una secuencia de referencia, proporcionada en el presente documento como SEQ ID NOs: 1-15, tiene al menos aproximadamente 85 por ciento de identidad, al menos aproximadamente 86 por ciento de identidad, al menos aproximadamente 87 por ciento de identidad, al menos aproximadamente 88 por ciento de identidad, al menos aproximadamente 89 por ciento de identidad, al menos aproximadamente 90 por ciento de identidad, al menos aproximadamente 91 por ciento de identidad, al menos aproximadamente 92 por ciento de identidad, al menos aproximadamente 93 por ciento de identidad, al menos aproximadamente 95 por ciento de identidad, al menos aproximadamente 96 por ciento de identidad, al menos aproximadamente 97 por ciento de identidad, al menos aproximadamente 98 por ciento de identidad, al menos aproximadamente 99 por ciento de identidad o al menos aproximadamente 100 por ciento de identidad con la secuencia de referencia.
Elementos reguladores
Los elementos reguladores como los promotores, los líderes (también conocidos como 5' UTRs), los potenciadores, los intrones y las regiones de terminación de la transcripción (o 3' UTRs) juegan un papel integral en la expresión global de los genes en las células vivas. El término "elemento regulador", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula de ADN que tiene una actividad reguladora del gen. El término "actividad reguladora de genes", tal y como se utiliza en este documento, se refiere a la capacidad de afectar a la expresión de una molécula de ADN transcribible vinculada operativamente, por ejemplo, afectando a la transcripción y/o traducción de la molécula de ADN transcribible vinculada operativamente. Los elementos reguladores, como los promotores, los líderes, los potenciadores, los intrones y los 3' UTR que funcionan en las plantas son, por tanto, útiles para modificar los fenotipos de las plantas mediante la ingeniería genética.
Tal y como se utiliza en el presente documento, un "grupo de elementos reguladores de la expresión" o secuencia "EXP" puede referirse a un grupo de elementos reguladores vinculados operativamente, como potenciadores, promotores, líderes e intrones. Así, un grupo de elementos reguladores de la expresión puede estar compuesto, por ejemplo, por un promotor vinculado operativamente en 5' a una secuencia líder. Los EXP útiles en la práctica de la presente invención incluyen 1, 4, 7, 10 y 13.
Los elementos reguladores pueden caracterizarse por su patrón de expresión génica, por ejemplo, efectos positivos y/o negativos como la expresión constitutiva o la expresión temporal, espacial, de desarrollo, tisular, ambiental, fisiológica, patológica, de ciclo celular y/o de respuesta química, y cualquier combinación de las mismas, así como por indicaciones cuantitativas o cualitativas. Tal y como se utiliza en este documento, un "patrón de expresión génica" es cualquier patrón de transcripción de una molécula de ADN operable en una molécula de ARN transcrita. La molécula de ARN transcrita puede traducirse para producir una molécula de proteína o puede proporcionar una molécula de ARN antisentido u otra molécula de a Rn reguladora, como un ARN de doble cadena (ARNBC), un ARN de transferencia (ARNt), un ARN ribosómico (ARNr), un microARN (miARN), y similares.
Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "expresión proteica" es cualquier patrón de traducción de una molécula de ARN transcrita a una molécula proteica. La expresión de las proteínas puede caracterizarse por sus cualidades temporales, espaciales, de desarrollo o morfológicas, así como por indicaciones cuantitativas o cualitativas.
Un promotor es útil como elemento regulador para modular la expresión de una molécula de ADN transcribible vinculada operativamente. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "promotor" se refiere generalmente a una molécula de ADN que participa en el reconocimiento y la unión de la ARN polimerasa II y otras proteínas, como los factores de transcripción de acción trans, para iniciar la transcripción. Un promotor puede aislarse inicialmente de la región no traducida 5' (5' UTR) de una copia genómica de un gen. Alternativamente, los promotores pueden ser moléculas de ADN producidas sintéticamente o manipuladas. Los promotores también pueden ser quiméricos. Los promotores quiméricos se producen mediante la fusión de dos o más moléculas de ADN heterólogas. Los promotores útiles en la práctica de la presente invención incluyen elementos promotores comprendidos en cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11 y 14, o fragmentos o variantes de las mismas. En realizaciones específicas de la invención, las moléculas de ADN reivindicadas y cualesquiera variantes o derivados de las mismas, tal como se describen en el presente documento, se definen además como que comprenden actividad promotora, es decir, que son capaces de actuar como promotor en una célula huésped, como en una planta transgénica. En otras realizaciones específicas, un fragmento puede definirse como que exhibe la actividad promotora que posee la molécula promotora de partida de la que se deriva, o un fragmento puede comprender un "promotor mínimo" que proporciona un nivel basal de transcripción y está compuesto por una caja TATA, otro motivo de sitio de unión del factor de transcripción conocido, o una secuencia de ADN equivalente para el reconocimiento y la unión del complejo de la ARN polimerasa II para el inicio de la transcripción.
En una realización, se proporcionan fragmentos de una secuencia promotora divulgada en el presente documento. Los fragmentos promotores pueden comprender actividad promotora, como se ha descrito anteriormente, y pueden ser útiles solos o en combinación con otros promotores y fragmentos de promotores, como en la construcción de promotores quiméricos, o en combinación con otros EXP y fragmentos de EXP. En realizaciones específicas, se proporcionan fragmentos de un promotor que comprenden al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 75, al menos aproximadamente 95, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 125, al menos aproximadamente 150, al menos aproximadamente 175, al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 225, al menos aproximadamente 250, al menos aproximadamente 275, al menos aproximadamente 300, al menos aproximadamente 500, al menos aproximadamente 600, al menos aproximadamente 700, al menos aproximadamente 750, al menos aproximadamente 800, al menos aproximadamente 900, o al menos aproximadamente 1000 nucleótidos contiguos, o más largos, de una molécula de ADN que tiene actividad promotora como se divulga en el presente documento. En ciertas realizaciones, la invención proporciona fragmentos de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-15, teniendo la actividad de la secuencia de longitud completa. Los procedimientos para producir dichos fragmentos a partir de una molécula promotora inicial son bien conocidos en la técnica.
Composiciones derivadas de cualquiera de los elementos promotores comprendidos en cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11 y 14, como las deleciones internas o 5', por ejemplo, pueden producirse utilizando procedimientos conocidos en la técnica para mejorar o alterar la expresión, incluyendo la eliminación de elementos que tienen efectos positivos o negativos en la expresión; la duplicación de elementos que tienen efectos positivos o negativos en la expresión; y/o la duplicación o eliminación de elementos que tienen efectos específicos en los tejidos o en las células. Composiciones derivadas de cualquiera de los elementos promotores comprendidos en cualquiera de las SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11, y 14 que comprenden deleciones 3' en las que se elimina el elemento de caja TATA o una secuencia equivalente del mismo y la secuencia corriente abajo pueden utilizarse, por ejemplo, para hacer elementos potenciadores. Se pueden realizar otras supresiones para eliminar cualquier elemento que tenga efectos positivos o negativos, específicos de los tejidos, específicos de las células o específicos del tiempo (como, por ejemplo, el ritmo circadiano) en la expresión. Cualquiera de los elementos promotores comprendidos en cualquiera de las SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11 y 14 y los fragmentos o potenciadores derivados de ellos pueden utilizarse para hacer composiciones de elementos reguladores transcripcionales quiméricos.
De acuerdo con la invención, un promotor o fragmento de promotor puede ser analizado para detectar la presencia de elementos promotores conocidos, es decir, características de la secuencia de ADN, como una caja TATA y otros motivos de sitios de unión de factores de transcripción conocidos. La identificación de estos elementos promotores conocidos puede ser utilizada por un experto en la materia para diseñar variantes del promotor que tengan un patrón de expresión similar al del promotor original.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "líder" se refiere a una molécula de ADN aislada de la región 5' no traducida (5' UTR) de un gen y definida generalmente como un segmento de nucleótidos entre el sitio de inicio de la transcripción (TSS) y el sitio de inicio de la secuencia codificante de la proteína. Alternativamente, los líderes pueden ser elementos de ADN producidos sintéticamente o manipulados. Un líder puede utilizarse como elemento regulador 5' para modular la expresión de una molécula de ADN transcribible vinculada operativamente. Las moléculas líderes pueden utilizarse con un promotor heterólogo o con su promotor nativo. Los líderes útiles en la práctica de la presente invención incluyen las SEQ ID NOs: 3, 6, 9, 12 y 15 o cualquiera de los elementos líderes comprendidos en cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 4, 7, 10 y 13 o fragmentos o variantes de las mismas. En realizaciones específicas, dichas secuencias de ADN pueden definirse como capaces de actuar como líderes en una célula huésped, incluyendo, por ejemplo, una célula vegetal transgénica. En una realización, dichas secuencias se decodifican como si comprendieran la actividad del líder.
Las secuencias líderes (también denominadas 5' UTRs) presentadas como SEQ ID NOs: 3, 6, 9, 12 y 15 o cualquiera de los elementos líderes comprendidos en cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 4, 7, 10 y 13 pueden estar compuestos por elementos reguladores, o pueden adoptar estructuras secundarias que pueden tener un efecto sobre la transcripción o la traducción de una molécula de ADN transcribible vinculada operativamente. Las secuencias líderes presentadas como SEQ ID NOs: 3, 6, 9, 12 y 15 o cualquiera de los elementos líderes comprendidos en cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 4, 7, 10 y 13 pueden utilizarse de acuerdo con la invención para hacer elementos reguladores quiméricos que afecten a la transcripción o a la traducción de una molécula de ADN transcribible vinculada operativamente.
Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "intrón" se refiere a una molécula de ADN que puede ser aislada o identificada de un gen y puede definirse generalmente como una región empalmada durante el procesamiento del ARN mensajero (ARNm) antes de la traducción. Alternativamente, un intrón puede ser un elemento de ADN producido o manipulado sintéticamente. Un intrón puede contener elementos potenciadores que afectan a la transcripción de los genes operables. Un intrón puede utilizarse como elemento regulador para modular la expresión de una molécula de ADN transcribible vinculada operativamente. Un constructo puede comprender un intrón, y el intrón puede o no ser heterólogo con respecto a la molécula de ADN transcribible. Ejemplos de intrones en el arte incluyen el intrón de la actina del arroz y el intrón de la HSP70 del maíz.
En las plantas, la inclusión de algunos intrones en constructos genéticos conduce a un aumento del ARNm y de la acumulación de proteínas en relación con los constructos que carecen del intrón. Este efecto se ha denominado "potenciación mediada por el intrón" (IME) de la expresión génica. Los intrones que se sabe que estimulan la expresión en las plantas se han identificado en genes del maíz (por ejemplo, tubAl, Adh1, Sh1 y Ubi1), en genes del arroz (por ejemplo, tpi) y en genes de plantas dicotiledóneas como los de la petunia (por ejemplo, rbcS), la patata (porejemplo, st-1s1) y de Arabidopsis thaliana (por ejemplo, ubq3 y pat1). Se ha demostrado que las deleciones o mutaciones en los sitios de empalme de un intrón reducen la expresión del gen, lo que indica que el empalme podría ser necesario para la IME. Sin embargo, la IME en plantas dicotiledóneas se ha demostrado mediante mutaciones puntuales en los sitios de empalme del gen pat1 de A. thaliana. Se ha demostrado que el uso múltiple del mismo intrón en una planta presenta desventajas. En esos casos, es necesario disponer de una colección de elementos de control básicos para la construcción de elementos de ADN recombinante adecuados.
Tal y como se utiliza en el presente documento, los términos "molécula de terminación de la transcripción 3'", "región no traducida 3'" o "UTR 3'" se refieren a una molécula de ADN que se utiliza durante la transcripción en la región no traducida de la porción 3' de una molécula de ARNm. La región no traducida 3' de una molécula de ARNm puede generarse mediante una escisión específica y una poliadenilación 3', también conocida como cola poliA. Una UTR 3' puede estar vinculada operativamente a una molécula de ADN transcribible y localizada corriente abajo de la misma, y puede incluir una señal de poliadenilación y otras señales reguladoras capaces de afectar a la transcripción, al procesamiento del ARNm o a la expresión génica. Se cree que las colas de los poliA funcionan en la estabilidad del ARNm y en la iniciación de la traducción. Ejemplos de moléculas de terminación de la transcripción 3' en el arte son la región 3' de la nopalina sintasa; la región 3' de la hsp17 del trigo, la región 3' de la subunidad pequeña de la rubisco del guisante, la región 3' de la E6 del algodón y la UTR 3' de la coixina.
Los UTRs 3' suelen encontrar un uso beneficioso para la expresión recombinante de moléculas de ADN específicas. Una UTR 3' débil tiene el potencial de generar una lectura, que puede afectar a la expresión de la molécula de ADN situada en los casetes de expresión vecinos. Un control adecuado de la terminación de la transcripción puede evitar la lectura de secuencias de ADN (por ejemplo, otros casetes de expresión) localizadas corriente abajo y puede permitir además un reciclaje eficiente de la ARN polimerasa para mejorar la expresión del gen. La terminación eficiente de la transcripción (liberación de la ARN polimerasa II del ADN) es un requisito previo para la reiniciación de la transcripción y, por tanto, afecta directamente al nivel global de transcripción. Tras la terminación de la transcripción, el ARNm maduro se libera del lugar de síntesis y el molde se transporta al citoplasma. Los ARNm eucariotas se acumulan como formas poli(A) in vivo, lo que dificulta la detección de los sitios de terminación de la transcripción mediante procedimientos convencionales. Sin embargo, la predicción de UTRs 3' funcionales y eficientes mediante procedimientos bioinformáticos es difícil, ya que no existen secuencias de ADN conservadas que permitan predecir fácilmente una UTR 3' efectiva.
Desde un punto de vista práctico, suele ser beneficioso que una UTR 3' utilizada en un casete de expresión posea las siguientes características. La UTR 3' debe ser capaz de terminar eficiente y eficazmente la transcripción del transgén e impedir la lectura del transcrito en cualquier secuencia de ADN vecina, que puede estar compuesta por otro casete de expresión, como en el caso de los casetes de expresión múltiples que residen en un ADN de transferencia (ADN-T), o el ADN cromosómico vecino en el que se ha insertado el ADN-T. La UTR 3' no debe causar una reducción de la actividad transcripcional impartida por el promotor, el líder, los potenciadores y los intrones que se utilizan para impulsar la expresión de la molécula de a Dn . En la biotecnología vegetal, la UTR 3' se utiliza a menudo para cebar las reacciones de amplificación del ARN transcrito inversamente extraído de la planta transformada y utilizado para: (1) evaluar la actividad transcripcional o la expresión del casete de expresión una vez integrado en el cromosoma de la planta; (2) evaluar el número de copias de las inserciones dentro del ADN de la planta; y (3) evaluar la zigosidad de la semilla resultante tras la reproducción. La UTR 3 'también se utiliza en reacciones de amplificación del ADN extraído de la planta transformada para caracterizar la integridad del casete insertado.
Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "potenciador" o "elemento potenciador" se refiere a un elemento regulador de acción cis, también conocido como elemento cis, que confiere un aspecto del patrón de expresión general, pero que normalmente es insuficiente por sí solo para impulsar la transcripción, de una molécula de ADN transcribible vinculada operativamente. A diferencia de los promotores, los elementos potenciadores no suelen incluir un sitio de inicio de la transcripción (TSS) o una caja TATA o una secuencia de ADN equivalente. Un promotor o un fragmento de promotor puede comprender naturalmente uno o más elementos potenciadores que afectan a la transcripción de una secuencia de ADN operable. Un elemento potenciadortambién puede fusionarse con un promotor para producir un elemento cis promotor quimérico, que confiere un aspecto de la modulación global de la expresión génica. Un ejemplo de elemento potenciador derivado del promotor del gen precursor de la proteína b2 del complejo de recolección de luz de Medicago truncatula se proporciona como SEQ ID NO: 16.
Se cree que muchos elementos potenciadores del promotor se unen a proteínas de unión al ADN y/o afectan a la topología del ADN, produciendo conformaciones locales que permiten o restringen selectivamente el acceso de la a Rn polimerasa al molde de ADN o que facilitan la apertura selectiva de la doble hélice en el lugar de la iniciación transcripcional. Un elemento potenciador puede funcionar para unir factores de transcripción que regulan la transcripción. Algunos elementos potenciadores se unen a más de un factor de transcripción, y los factores de transcripción pueden interactuar con diferentes afinidades con más de un dominio potenciador. Los elementos potenciadores pueden identificarse mediante una serie de técnicas, como el análisis de deleción, es decir la supresión de uno o más nucleótidos del extremo 5' o del interior de un promotor; el análisis de la proteína de unión al ADN utilizando la huella de la DNasa I, la interferencia de la metilación, los ensayos de desplazamiento de la movilidad por electroforesis, la huella genómica in vivo mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediada por ligadura, y otros ensayos convencionales; o mediante el análisis de similitud de la secuencia de ADN utilizando motivos conocidos de elementos cis o elementos potenciadores como secuencia objetivo o motivo objetivo con procedimientos convencionales de comparación de secuencias de ADN, como BLAST. La estructura fina de un dominio potenciador puede estudiarse más a fondo mediante mutagénesis (o sustitución) de uno o más nucleótidos o mediante otros procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Los elementos potenciadores pueden obtenerse por síntesis química o por aislamiento a partir de elementos reguladores que incluyan dichos elementos, y pueden sintetizarse con nucleótidos de flanqueo adicionales que contengan sitios útiles de enzimas de restricción para facilitar la manipulación de la subsecuencia. Por lo tanto, el diseño, la construcción y el uso de elementos potenciadores de acuerdo con los procedimientos divulgados en el presente documento para modular la expresión de moléculas de ADN transcribibles enlazadas operativamente están comprendidos en la invención.
Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "quimérico" se refiere a una molécula de ADN única producida por la fusión de una primera molécula de ADN con una segunda molécula de ADN, en la que ni la primera ni la segunda molécula de ADN se encontrarían normalmente en esa configuración, es decir, fusionadas entre sí. La molécula de ADN quimérico es, por tanto, una nueva molécula de ADN que no se encuentra normalmente en la naturaleza. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "promotor quimérico" se refiere a un promotor producido a través de dicha manipulación de moléculas de ADN. Un promotor quimérico puede combinar dos o más fragmentos de ADN; por ejemplo, la fusión de un promotor con un elemento potenciador. Por lo tanto, el diseño, la construcción y el uso de promotores quiméricos de acuerdo con los procedimientos divulgados en el presente documento para modular la expresión de moléculas de ADN transcribibles enlazadas de forma operable están comprendidos en la presente invención.
Los elementos reguladores quiméricos pueden diseñarse para que comprendan varios elementos constitutivos que pueden unirse operativamente mediante varios procedimientos conocidos en la técnica, como la digestión y la ligadura con enzimas de restricción, la clonación independiente de la ligadura, el ensamblaje modular de productos de PCR durante la amplificación o la síntesis química directa del elemento regulador, así como otros procedimientos conocidos en la técnica. Los diversos elementos reguladores quiméricos resultantes pueden estar compuestos por los mismos elementos constitutivos, o por variantes de los mismos, pero difieren en la secuencia o secuencias de ADN que comprenden la secuencia o secuencias de ADN de enlace que permiten que las partes constitutivas se vinculen operativamente. Una secuencia de ADN proporcionada como SEQ IDs NO: 1-15 puede proporcionar una secuencia de referencia de elementos reguladores, en la que los elementos constitutivos que comprenden la secuencia de referencia pueden unirse mediante procedimientos conocidos en la técnica y pueden comprender sustituciones, supresiones y/o inserciones de uno o más nucleótidos o mutaciones que se producen naturalmente en la transformación de células bacterianas y vegetales.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "variante" se refiere a una segunda molécula de ADN, como un elemento regulador, que tiene una composición similar, pero no idéntica, a una primera molécula de ADN, y en la que la segunda molécula de ADN sigue manteniendo la funcionalidad general, es decir, el mismo o similar patrón de expresión, por ejemplo mediante una actividad transcripcional más o menos equivalente, de la primera molécula de a Dn . Una variante puede ser una versión más corta o truncada de la primera molécula de ADN y/o una versión alterada de la secuencia de la primera molécula de ADN, como una con diferentes sitios de enzimas de restricción y/o deleciones, sustituciones y/o inserciones internas. Una "variante" también puede abarcar un elemento regulador que tenga una secuencia de nucleótidos que comprenda una sustitución, supresión y/o inserción de uno o más nucleótidos de una secuencia de referencia, en la que el elemento regulador derivado tenga una actividad transcripcional o traslacional mayor o menor o equivalente que la correspondiente molécula reguladora madre. Las "variantes" de los elementos reguladores también abarcarán las variantes derivadas de las mutaciones que se producen de forma natural en la transformación de las células bacterianas y vegetales. Una secuencia de polinucleótidos proporcionada como SEQ ID NOs: 1-15 puede utilizarse para crear variantes de composición similar, pero no idéntica, a la secuencia de ADN del elemento regulador original, manteniendo la funcionalidad general, es decir, el mismo o similar patrón de expresión, del elemento regulador original. La producción de tales variantes de la invención está bien dentro de la experiencia normal en la técnica a la luz de la divulgación y se abarca dentro del alcance de la invención.
La referencia en esta solicitud a una "molécula de ADN aislada", o un término o frase equivalente, pretende significar que la molécula de ADN es una que está presente sola o en combinación con otras composiciones, pero no dentro de su entorno natural. Por ejemplo, los elementos de ácido nucleico, como una secuencia codificadora, una secuencia de intrones, una secuencia líder no traducida, una secuencia promotora, una secuencia de terminación transcripcional, y similares, que se encuentran de forma natural dentro del ADN del genoma de un organismo, no se consideran "aislados" siempre que el elemento se encuentre dentro del genoma del organismo y en el lugar del genoma en el que se encuentra de forma natural. Sin embargo, cada uno de estos elementos, y las subpartes de estos elementos, estarían "aislados" dentro del ámbito de esta divulgación siempre que el elemento no esté dentro del genoma del organismo y en el lugar del genoma en el que se encuentra de forma natural. A efectos de la presente divulgación, cualquier secuencia de nucleótidos transgénica, es decir, la secuencia de nucleótidos del ADN insertado en el genoma de las células de una planta o bacteria, o presente en un vector extracromosómico, se consideraría una secuencia de nucleótidos aislada, tanto si está presente dentro del plásmido o estructura similar utilizada para transformar las células, dentro del genoma de la planta o bacteria, o presente en cantidades detectables en tejidos, progenie, muestras biológicas o productos básicos derivados de la planta o bacteria.
La eficacia de las modificaciones, duplicaciones o supresiones descritas en el presente documento sobre los aspectos de expresión deseados de un transgén particular puede probarse empíricamente en ensayos de plantas estables y transitorias, como los descritos en los ejemplos de trabajo del presente documento, a fin de validar los resultados, que pueden variar en función de los cambios realizados y del objetivo del cambio en la molécula de ADN de partida.
Constructos
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "constructo" significa cualquier molécula de ADN recombinante, como un plásmido, cósmido, virus, fago o molécula de ADN o ARN lineal o circular, derivada de cualquier fuente, capaz de integración genómica o replicación autónoma, que comprende una molécula de ADN en la que al menos aproximadamentea molécula de ADN se ha unido a otra molécula de ADN de forma funcionalmente operativa, es decir, unida de forma operable. Tal y como se utiliza en este documento, el término "vector" significa cualquier constructo que pueda utilizarse para la transformación, es decir, la introducción de ADN o ARN heterólogo en una célula huésped. Un constructo suele incluir uno o más casetes de expresión. Tal y como se utiliza en el presente documento, un "casete de expresión" se refiere a una molécula de ADN que comprende al menos aproximadamentea molécula de ADN transcribible vinculada operativamente a uno o más elementos reguladores, típicamente al menos un promotor y una UTR 3'.
Tal y como se utiliza en este documento, el término "vinculado operativamente" se refiere a una primera molécula de ADN unida a una segunda molécula de ADN, en la que la primera y la segunda moléculas de a Dn están dispuestas de tal manera que la primera molécula de ADN afecta a la función de la segunda molécula de ADN. Las dos moléculas de ADN pueden o no formar parte de una única molécula de ADN contigua y pueden o no ser adyacentes. Por ejemplo, un promotor está vinculado operativamente a una molécula de ADN transcribible si el promotor modula la transcripción de la molécula de ADN transcribible de interés en una célula. Un líder, por ejemplo, está vinculado operativamente a la secuencia de ADN cuando es capaz de afectar a la transcripción o traducción de la secuencia de ADN.
Los constructos de la invención pueden proporcionarse, en una realización, como constructos de doble borde de plásmido inductor de tumores (Ti) que tienen las regiones del borde derecho (RB o AGRtu.RB) y del borde izquierdo (LB o AGRtu.LB) del plásmido Ti aislado de Agrobacterium tumefaciens que comprende un ADN-T que, junto con las moléculas de transferencia proporcionadas por las células de A. tumefaciens, permiten la integración del ADN-T en el genoma de una célula vegetal (véase, por ejemplo, La patente estadounidense 6.603.061). Los constructos también pueden contener los segmentos de ADN de la columna vertebral del plásmido que proporcionan la función de replicación y la selección de antibióticos en las células bacterianas, por ejemplo un origen de replicación de Escherichia coli como ori322, un origen de replicación de amplio rango de huéspedes como oriV u oriRi, y una región de codificación para un marcador seleccionable como Spec/Strp que codifica para la adeniltransferasa de aminoglucósidos Tn7 (aadA) que confiere resistencia a la espectinomicina o estreptomicina, o un gen marcador seleccionable de gentamicina (Gm, Gent). Para la transformación de plantas, la cepa bacteriana huésped suele ser A. tumefaciens ABI, C58 o LBA4404; sin embargo, otras cepas conocidas por los expertos en el arte de la transformación de plantas pueden funcionar en la invención.
Se conocen procedimientos en el arte para ensamblar e introducir constructos en una célula de tal manera que la molécula de ADN transcribible se transcribe en una molécula de ARNm funcional que se traduce y expresa como una proteína. Para la práctica de la invención, las composiciones y los procedimientos convencionales para preparar y utilizar los constructos y las células huésped son bien conocidos por los expertos en la materia. Los vectores típicos útiles para la expresión de ácidos nucleicos en plantas superiores son bien conocidos en la técnica e incluyen vectores derivados del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens y el vector de control de transferencia pCaMVCN.
Se pueden incluir diversos elementos reguladores en un constructo, incluyendo cualquiera de los previstos en el presente documento. Cualquiera de estos elementos reguladores puede proporcionarse en combinación con otros elementos reguladores. Dichas combinaciones pueden ser diseñadas o modificadas para producir características reguladoras deseables. En una realización, los constructos de la invención comprenden al menos un elemento regulador vinculado operativamente a una molécula de ADN transcribible unida de forma operable a una UTR 3'.
Los constructos de la invención pueden incluir cualquier promotor o líder proporcionado en el presente documento o conocido en el arte. Por ejemplo, un promotor de la invención puede estar vinculado operativamente a un líder 5' no traducido heterólogo, como uno derivado de un gen de la proteína de choque térmico. Alternativamente, un líder de la invención puede estar vinculado operativamente a un promotor heterólogo como el promotor de la transcripción 35S del virus del mosaico de la coliflor.
Los casetes de expresión también pueden incluir una secuencia codificadora de péptidos de tránsito que codifica un péptido que es útil para la orientación subcelular de una proteína vinculada operativamente, en particular a un cloroplasto, leucoplasto u otro orgánulo plastidial; mitocondria; peroxisoma; vacuola; o una ubicación extracelular. Muchas proteínas localizadas en el cloroplasto se expresan a partir de genes nucleares como precursores y se dirigen al cloroplasto mediante un péptido de tránsito del cloroplasto (CTP). Ejemplos de tales proteínas aisladas del cloroplasto incluyen, pero no se limitan a, las asociadas con la subunidad pequeña (SSU) de la ribulosa-1,5,-bisfosfato carboxilasa, la ferredoxina, la ferredoxina oxidorreductasa, la proteína I y la proteína II del complejo recolector de luz, la tiorredoxina F y la enolpiruvil shikimato fosfato sintasa (EPSPS). Los péptidos de tránsito del cloroplasto se describen, por ejemplo, en la Patente estadounidense n° 7.193.133. Se ha demostrado que las proteínas que no son del cloroplasto pueden dirigirse al cloroplasto mediante la expresión de una CTP heteróloga vinculada operativamente al transgén que codifica una proteína que no es del cloroplasto.
Moléculas de ADN transcribibles
Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "molécula de ADN transcribible" se refiere a cualquier molécula de ADN capaz de ser transcrita en una molécula de ARN, incluyendo, pero sin limitarse a, las que tienen secuencias de codificación de proteínas y las que producen moléculas de ARN con secuencias útiles para la supresión de genes. El tipo de molécula de ADN puede incluir, pero no se limita a, una molécula de ADN de la misma planta, una molécula de ADN de otra planta, una molécula de ADN de un organismo diferente, o una molécula de ADN sintética, como una molécula de ADN que contenga un mensaje antisentido de un gen, o una molécula de ADN que codifique una versión artificial, sintética o modificada de otro modo de un transgén. Las moléculas de ADN transcribibles ejemplares para su incorporación en los constructos de la invención incluyen, por ejemplo, moléculas de ADN o genes de una especie distinta a la especie a la que se incorpora la molécula de ADN o genes que se originan en la misma especie o están presentes en ella, pero que se incorporan a las células receptoras mediante procedimientos de ingeniería genética en lugar de técnicas clásicas de reproducción.
Un "transgén" se refiere a una molécula de ADN transcribible heteróloga a una célula huésped al menos con respecto a su ubicación en el genoma de la célula huésped y/o una molécula de ADN transcribible incorporada artificialmente al genoma de una célula huésped en la generación actual o en cualquier generación anterior de la célula.
Un elemento regulador, como un promotor de la invención, puede estar vinculado operativamente a una molécula de ADN transcribible que es heteróloga con respecto al elemento regulador. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "heterólogo" se refiere a la combinación de dos o más moléculas de ADN cuando dicha combinación no se encuentra normalmente en la naturaleza. Por ejemplo, las dos moléculas de ADN pueden proceder de especies diferentes y/o las dos moléculas de ADN pueden proceder de genes diferentes, por ejemplo, de genes diferentes de la misma especie o de los mismos genes de especies diferentes. Por lo tanto, un elemento regulador es heterólogo con respecto a una molécula de ADN transcribible vinculada operativamente si dicha combinación no se encuentra normalmente en la naturaleza, es decir, la molécula de ADN transcribible no se encuentra naturalmente vinculada operativamente al elemento regulador.
La molécula de ADN transcribible puede ser generalmente cualquier molécula de ADN para la que se desea la expresión de una transcripción. Esta expresión de un transcrito puede dar lugar a la traducción de la molécula de ARNm resultante y, por tanto, a la expresión de proteínas. Alternativamente, por ejemplo, una molécula de ADN transcribible puede ser diseñada para causar en última instancia la disminución de la expresión de un gen o proteína específica. En una realización, esto puede lograrse utilizando una molécula de ADN transcribible que está orientada en la dirección antisentido. Un experto en la materia está familiarizado con el uso de esta tecnología antisentido. Cualquier gen puede ser regulado negativamente de esta manera y, en una realización, una molécula de ADN transcribible puede ser diseñada para la supresión de un gen específico a través de la expresión de una molécula de ARNbc, ARNip o miARN.
Así, una realización de la invención es una molécula de ADN recombinante que comprende un elemento regulador de la invención, como SEQ ID NO: 4 o 5, vinculada operativamente a una molécula de ADN transcribible heteróloga para modular la transcripción de la molécula de ADN transcribible a un nivel deseado o en un patrón deseado cuando el constructo se integra en el genoma de una célula vegetal transgénica. En una realización, la molécula de ADN transcribible comprende una región codificadora de proteínas de un gen y en otra realización la molécula de ADN transcribible comprende una región antisentido de un gen.
Genes de interés agronómico
Una molécula de ADN transcribible puede ser un gen de interés agronómico. Tal y como se utiliza en este documento, el término "gen de interés agronómico" se refiere a una molécula de ADN transcribible que, cuando se expresa en un determinado tejido vegetal, célula o tipo de célula, confiere una característica deseable. El producto de un gen de interés agronómico puede actuar dentro de la planta para causar un efecto sobre la morfología, la fisiología, el crecimiento, el desarrollo, el rendimiento, la composición del grano, el perfil nutricional, la resistencia a las enfermedades o a las plagas, y/o la tolerancia ambiental o química de la planta, o puede actuar como agente pesticida en la dieta de una plaga que se alimenta de la planta. En una realización de la invención, un elemento regulador de la invención se incorpora a un constructo de tal manera que el elemento regulador está vinculado operativamente a una molécula de ADN transcribible que es un gen de interés agronómico. En una planta transgénica que contenga dicho constructo, la expresión del gen de interés agronómico puede conferir un rasgo agronómico beneficioso. Un rasgo agronómico beneficioso puede incluir, por ejemplo, pero sin limitarse a ello, la tolerancia a los herbicidas, el control de los insectos, la modificación del rendimiento, la resistencia a las enfermedades, la resistencia a los patógenos, la modificación del crecimiento y el desarrollo de las plantas, la modificación del contenido de almidón, la modificación del contenido de aceite, la modificación del contenido de ácidos grasos, la modificación del contenido de proteínas, la modificación de la maduración de los frutos, la mejora de la nutrición animal y humana, la producción de biopolímeros, la resistencia al estrés ambiental, los péptidos farmacéuticos, la mejora de las cualidades de procesamiento, la mejora del sabor, la utilidad de la producción de semillas híbridas, la mejora de la producción de fibras y la producción deseable de biocombustibles.
Ejemplos de genes de interés agronómico conocidos en la técnica incluyen los de resistencia a los herbicidas (Patente de EE.UU. n° 6.803.501; 6.448.4766.248.876 6.225.114; 6.107.549; 5.866.775; 5.804.425; 5.633.435; y 5.463.175), el aumento del rendimiento (Patente de EE.UU. núm USRE38.446; 6.716.474; 6.663.906; 6.476.295; 6.441.277; 6.423.828; 6.399.330; 6.372.211; 6.235.971; 6.222.098; y 5.716.837), el control de insectos (Patente de EE.UU. n° 6.809.078; 6.713.063; 6.686.452; 6.657.046; 6.645.497; 6.642.030; 6.639.054; 6.620.988; 6.593.293, 6.555.655; 6.538.109, 6.537.756; 6.521.442; 6.501.009; 6.468.523; 6.326.351; 6.313.378; 6.284.949; 6.281.016; 6.248.536; 6.242.241; 6.221.649; 6.177.615; 6.156.573; 6.153.814 6.110.464 6.093.695 6.063.756 6.063.597 6.023.013 5.959.091 5.942.664 5.942.658, 5.880.275 5.763.245 y 5.763.241), la resistencia a las enfermedades fúngicas (Patente de EE.UU. n° 6.653.2806.573.361 6.506.9626.316.4076.215.0485.516.671 5.773.6966.121.4366.316.407 y 6.506.962), la resistencia a los virus (Patente de EE.UU. n° 6.617.496 6.608.241 6.015.940 6.013.864 5.850.023 y 5.304.730), la resistencia a los nematodos (Patente de EE.UU. n° 6.228.992), la resistencia a las enfermedades bacterianas (Patente estadounidense n° 5.516.671), el crecimiento y el desarrollo de las plantas (Patente estadounidense n°6.723.897y 6.518.488), la producción de almidón (Patente estadounidense n°6.538.181 6.538.179 6.538.1785.750.8766.476.295), la producción de aceites modificados (Patente de EE.UU. n° 6.444.876; 6.426.447 y 6.380.462), la alta producción de aceite (Patente de EE.UU. n° 6.495.739; 5.608.149; 6.483.008 y 6.476.295), contenido de ácidos grasos modificados (Patente de EE.UU. n° 6.828.475; 6.822.141; 6.770.465; 6.706.950; 6.660.849; 6.596.538; 6.589.767; 6.537.750; 6.489.461 y 6.459.018), la producción de alto contenido en proteínas (Patente de EE.UU. n° 6.380.466), la maduración de la fruta (Patente estadounidense n° 5.512.466), la mejora de la nutrición animal y humana (Patente estadounidense n° 6.723.837; 6.653.530; 6.5412.59; 5.985.605 y 6.171.640), los biopolímeros (Patente de los EE.UU. Nos USRE37.543; 6.228.623 y 5.958.745 y 6.946.588), la resistencia al estrés ambiental (Patente de EE.UU. n° 6.072.103), péptidos farmacéuticos y péptidos secretables (Patente estadounidense n° 6.812.379; 6.774.283; 6.140.075 y 6.080.560), rasgos de procesamiento mejorados (Patente de EE.UU. n° 6.476.295), la mejora de la digestibilidad (Patente estadounidense n° 6.531.648), baja rafinosa (Patente estadounidense n° 6.166.292), producción industrial de enzimas (Patente estadounidense n° 5.543.576), la mejora del sabor (Patente estadounidense n° 6.011.199), la fijación de nitrógeno (Patente estadounidense n° 5.229.114), la producción de semillas híbridas (Patente estadounidense n° 5.689.041), la producción de fibra (Patente estadounidense n° 6.576.818; 6.271.443; 5.981.834 y 5.869.720) y la producción de biocombustibles (Patente estadounidense n° 5.998.700).
Alternativamente, un gen de interés agronómico puede afectar a las características o fenotipos de la planta mencionados anteriormente codificando una molécula de ARN que provoca la modulación dirigida de la expresión de un gen endógeno, por ejemplo mediante antisentido (véase, por ejemplo Patente estadounidense 5.107.065); ARN inhibidor ("ARNi", incluida la modulación de la expresión génica mediante mecanismos mediados por miARN, ARNsi, ARNsi de acción transitoria y ARNs en fase, por ejemplo, como se describe en las solicitudes publicadas U.S.
2006/0200878 y U.S. 2008/0066206y en la Solicitud de patente estadounidense 11/974.469); o mecanismos mediados por la cosupresión. El ARN también puede ser una molécula de ARN catalítico (por ejemplo, una ribozima o un riboswitch; véase, porejemplo,U.S. 2006/0200878) diseñada para escindir un producto de ARNm endógeno deseado. Se conocen procedimientos en la técnica para construir e introducir constructos en una célula de manera que la molécula de ADN transcribible se transcriba en una molécula capaz de provocar la supresión de genes.
Marcadores seleccionables
Los transgenes marcadores seleccionables también pueden utilizarse con los elementos reguladores de la invención. Tal como se utiliza en este documento, el término "transgén marcador seleccionable" se refiere a cualquier molécula de ADN transcribible cuya expresión en una planta, tejido o célula transgénica, o su ausencia, puede ser examinada o puntuada de alguna manera. Los genes marcadores seleccionables, y sus técnicas de selección y cribado asociadas, para su uso en la práctica de la invención son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, moléculas de ADN transcribibles que codifican p-glucuronidasa (GUS), proteína verde fluorescente (GFP), proteínas que confieren resistencia a los antibióticos y proteínas que confieren tolerancia a los herbicidas. Un ejemplo de un transgén marcador seleccionable se proporciona como SEQ ID NO:17.
Transformación celular
La invención también se dirige a un procedimiento de producción de células y plantas transformadas que comprenden uno o más elementos reguladores vinculados operativamente a una molécula de ADN transcribible.
El término "transformación" se refiere a la introducción de una molécula de ADN en un huésped receptor. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "huésped" se refiere a las bacterias, hongos o plantas, incluyendo cualquier célula, tejido, órgano o progenie de las bacterias, hongos o plantas. Los tejidos y células vegetales de especial interés son los protoplastos, los callos, las raíces, los tubérculos, las semillas, los tallos, las hojas, las plántulas, los embriones y el polen.
Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "transformado" se refiere a una célula, tejido, órgano u organismo en el que se ha introducido una molécula de ADN extraña, como un constructo. La molécula de ADN introducida puede integrarse en el ADN genómico de la célula, el tejido, el órgano o el organismo receptor, de forma que la molécula de ADN introducida sea heredada por la progenie posterior. Una célula u organismo "transgénico" o "transformado" también puede incluir la progenie de la célula u organismo y la progenie producida a partir de un programa de cruzamiento que emplee dicho organismo transgénico como progenitor en un cruce y que presente un fenotipo alterado como resultado de la presencia de una molécula de ADN extraña. La molécula de ADN introducida también puede ser introducida transitoriamente en la célula receptora de manera que la molécula de ADN introducida no sea heredada por la progenie posterior. El término "transgénico" se refiere a una bacteria, hongo o planta que contiene una o más moléculas de ADN heterólogas.
Hay muchos procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia para introducir moléculas de ADN en las células vegetales. El proceso generalmente comprende los pasos de seleccionar una célula huésped adecuada, transformar la célula huésped con un vector y obtener la célula huésped transformada. Los procedimientos y materiales para transformar células vegetales introduciendo un constructo vegetal en un genoma vegetal en la práctica de esta invención pueden incluir cualquiera de los procedimientos conocidos y demostrados. Los procedimientos adecuados incluyen, pero no se limitan a, la infección bacteriana (por ejemplo, Agrobacterium), los vectores binarios BAC, el suministro directo de ADN ( por ejemplo, mediante transformación mediada por PEG, la captación de ADN mediada por desecación/inhibición, la electroporación, la agitación con fibras de carburo de silicio y la aceleración de partículas recubiertas de ADN), la edición de genes ( por ejemplo, los sistemas CRISPR-Cas), entre otros.
Las células huésped pueden ser cualquier célula u organismo, como una célula vegetal, una célula de algas, un alga, una célula fúngica, un hongo, una célula bacteriana o una célula de insecto. En determinadas realizaciones, las células huésped y las células transformadas pueden incluir células de plantas de cultivo.
Una planta transgénica puede regenerarse posteriormente a partir de una célula vegetal transgénica de la invención. Mediante técnicas convencionales de reproducción o autopolinización, se pueden producir semillas de esta planta transgénica. Dicha semilla, y la planta progenitora resultante cultivada a partir de dicha semilla, contendrá la molécula de ADN recombinante de la invención, y por tanto será transgénica.
Las plantas transgénicas de la invención pueden autopolinizarse para proporcionar semillas de plantas transgénicas homocigotas de la invención (homocigotas para la molécula de ADN recombinante) o cruzarse con plantas no transgénicas o con diferentes plantas transgénicas para proporcionar semillas de plantas transgénicas heterocigotas de la invención (heterocigotas para la molécula de a Dn recombinante). Tanto estas plantas transgénicas homocigóticas como las heterocigóticas se denominan aquí "plantas progenitoras". Las plantas progenitoras son plantas transgénicas que descienden de la planta transgénica original y que contienen la molécula de ADN recombinante de la invención. Las semillas producidas utilizando una planta transgénica de la invención pueden cosecharse y utilizarse para cultivar generaciones de plantas transgénicas, es decir, plantas progenitoras de la invención, que comprenden el constructo de esta invención y expresan un gen de interés agronómico. Las descripciones de los procedimientos de mejora que se utilizan habitualmente para diferentes cultivos pueden encontrarse en uno de los diversos libros de referencia, véase, por ejemplo Allard, Principles of Plant Breeding, John Wiley & Sons, NY, U. of CA, Davis, CA, 50-98 (1960) Simmonds, Principles of Crop Improvement, Longman, Inc., NY, 369-399 (1979) Sneep y Hendriksen, Plant breeding Perspectives, Wageningen (ed), Center for Agricultural Publishing and Documentation (1979) Fehr, Soja: Improvement, Production and Uses, 2a edición, Monografía, 16:249 (1987) Fehr, Principles of Variety Development, Theory and Technique, (Vol. 1) y Crop Species Soybean (Vol. 2), lowa State Univ., Macmillan Pub. Co., NY, 360-376 (1987).
Las plantas transformadas pueden analizarse para detectar la presencia del gen o genes de interés y el nivel y/o perfil de expresión conferido por los elementos reguladores de la invención. Los expertos en la materia conocen los numerosos procedimientos disponibles para el análisis de plantas transformadas. Por ejemplo, los procedimientos para el análisis de plantas incluyen, pero no se limitan a, transferencias Southern o transferencias northern, enfoques basados en la PCR, análisis bioquímicos, procedimientos de selección fenotípica, evaluaciones de campo y ensayos de inmunodiagnóstico. La expresión de una molécula de ADN transcribible puede medirse utilizando los reactivos y procedimientos TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA) descritos por el fabricante y los tiempos de ciclo de la PCR determinados utilizando la matriz de prueba TaqMan®. Como alternativa, pueden utilizarse los reactivos y procedimientos Invader® (Third Wave Technologies, Madison, WI) descritos por el fabricante para evaluar la expresión del transgén.
La invención también proporciona partes de una planta de la invención. Las partes de la planta incluyen, pero no se limitan a, las hojas, los tallos, las raíces, los tubérculos, las semillas, el endospermo, el óvulo y el polen. Las partes vegetales de la invención pueden ser viables, no viables, regenerables y/o no regenerables. La invención también incluye y proporciona células vegetales transformadas que comprenden una molécula de ADN de la invención. Las células vegetales transformadas o transgénicas de la invención incluyen células vegetales regenerables y/o no regenerables.
La invención también proporciona un producto básico que se produce a partir de una planta transgénica o parte de la misma que contiene la molécula de ADN recombinante de la invención. Los productos básicos de la invención contienen una cantidad detectable de ADN que comprende una secuencia de ADN de la invención. Tal y como se utiliza en este documento, un "producto básico" se refiere a cualquier composición o producto que esté compuesto por material derivado de una planta transgénica, semilla, célula vegetal o parte de la planta que contenga la molécula de ADN recombinante de la invención. Los productos básicos incluyen, pero no se limitan, a las semillas procesadas, los granos, las partes de plantas y las harinas. Un producto básico de la invención contendrá una cantidad detectable de ADN correspondiente a la molécula de ADN recombinante de la invención. La detección de uno o varios de estos ADN en una muestra puede servir para determinar el contenido o el origen del producto básico. Se puede utilizar cualquier procedimiento estándar de detección de moléculas de ADN, incluyendo los procedimientos de detección aquí divulgados.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Identificación y clonación de elementos reguladores
Se identificaron y clonaron novedosos elementos reguladores transcripcionales y grupos de elementos reguladores de expresión (EXP) a partir del ADN genómico de las especies dicotiledóneas Cucumis melo (WSH-39-1070AN) y Medicago truncatula.
Los elementos reguladores transcripcionales se seleccionaron basándose en datos de microarreglos de propiedad privada y públicos derivados de experimentos de perfiles transcripcionales realizados en soja (Glycine max) y Arabidopsis, así como en búsquedas basadas en la homología utilizando secuencias conocidas de dicotiledóneas como consultas contra secuencias propias de Cucumis melo y secuencias propias y públicas de Medicago truncatula.
Utilizando las secuencias identificadas, se realizó un análisis bioinformático para identificar los elementos reguladores dentro del ADN amplificado. Por ejemplo, se realizó un análisis bioinformático para identificar el sitio de inicio de la transcripción (TSS) y cualquier bidireccionalidad, intrones o secuencia codificante corriente arriba presente en la secuencia. A partir de los resultados de este análisis, se definieron elementos reguladores dentro de las secuencias de ADN y se diseñaron cebadores para amplificar los elementos reguladores. La molécula de ADN correspondiente a cada elemento regulador se amplificó utilizando condiciones estándar de reacción en cadena de la polimerasa con cebadores que contenían sitios únicos de enzimas de restricción y ADN genómico aislado de Cucumis melo y Medicago truncatula. Los fragmentos de ADN resultantes se ligaron en vectores de expresión de plantas base utilizando la digestión estándar de enzimas de restricción de sitios de restricción compatibles y procedimientos de ligación de ADN.
El análisis del elemento regulador TSS y de las uniones de empalme intrón/exón puede realizarse utilizando tejido vegetal transformado. En resumen, las plantas se transforman con los vectores de expresión de plantas que comprenden los fragmentos de ADN clonados vinculados operativamente a una molécula de ADN transcribible heteróloga. A continuación, se utiliza el sistema RACE 5' para la amplificación rápida de extremos de ADNc, versión 2.0 (Invitrogen, Carlsbad, California 92008) para confirmar el TSS del elemento regulador y las uniones de empalme intrón/exón mediante el análisis de la secuencia de ADN de los transcritos de ARNm producidos.
Las secuencias de ADN que codifican los grupos de elementos reguladores de la expresión transcripcional de Cucumis y Medicago o las secuencias EXP que se componen de un elemento promotor, vinculado operativamente a un elemento líder se presentan en la Tabla 1 junto con sus correspondientes promotores y líderes.
Tabla 1. Grupos de elementos reguladores de la expresión transcripcional, promotores, líderes e intrones aislados de Cucumis melo y Medicago truncatula
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Ejemplo 2
Análisis de los elementos reguladores que impulsan la expresión de GUS en
Plantas de soja transformadas de forma estable
Las plantas de soja se transformaron con vectores, específicamente vectores de expresión vegetal, que contenían un elemento regulador de prueba que impulsaba la expresión del transgén de la p-glucuronidasa (GUS). Las plantas resultantes fueron analizadas para la expresión de la proteína GUS, para evaluar el efecto de los elementos reguladores seleccionados en la expresión.
Las plantas de soja se transformaron con llos constructos de expresión de GUS para plantas enumeradas en la Tabla 2. Los elementos reguladores se clonaron en un vector de expresión de plantas base utilizando procedimientos estándar conocidos en la técnica. Los vectores de expresión vegetal resultantes contenían una región del borde derecho de Agrobacterium tumefaciens (B-AGRtu.borde derecho), un primer casete de selección de transgenes utilizado para la selección de las células vegetales transformadas que confiere resistencia al herbicida glifosato o al antibiótico espectinomicina; un segundo casete de transgenes para evaluar la actividad del elemento regulador, que comprendía una secuencia EXP vinculada operativamente en 5' a una secuencia codificante para la p-glucuronidasa (GUS, GOI-Ec.uidA+St.LS1:1:1, SEQ ID NO: 17) que contiene un intrón procesable derivado del gen ST-LS1 de la patata, inducible por la luz, específico de los tejidos (Genbank Accession: X04753), vinculado operativamente en 5' a una región de terminación en 3' del gen E6 de Gossypium barbadense (T-Gb.E6-3b:3b:1, SEQ ID NO: 18); y una región del borde izquierdo de Agrobacterium tumefaciens (B-AGRtu.borde izquierdo).
Tabla 2. Elementos reguladores y constructos de plásmidos de expresión de GUS correspondientes
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Las células vegetales de soja se transformaron utilizando los constructos de vectores de transformación binarios descritas anteriormente mediante transformación mediada por Agrobacterium, utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Las células vegetales transformadas resultantes se indujeron para formar plantas de soja enteras.
Se utilizó el análisis histoquímico de GUS para el análisis cualitativo y cuantitativo de la expresión de las plantas transformadas. Las secciones enteras de tejido se incubaron con la solución de tinción de g Us X-Gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-glucurónido) (1 miligramo/mililitro) durante un tiempo adecuado, se enjuagaron y se inspeccionaron visualmente para comprobar la coloración azul. La actividad de GUS se determinó cualitativamente mediante inspección visual directa o inspección al microscopio utilizando órganos y tejidos vegetales seleccionados.
Para el análisis cuantitativo de la expresión de GUS, se extrajo la proteína total de tejidos seleccionados de plantas de soja transformadas. Se utilizó un microgramo de proteína total con el sustrato fluorogénico 4-metileumbeliferil-p-D-glucurónido (MUG) en un volumen de reacción total de 50 microlitros. El producto de la reacción, la 4-metilumbeliferona (4-MU), es máximamente fluorescente a pH alto, donde el grupo hidroxilo está ionizado. La adición de una solución básica de carbonato sódico detiene simultáneamente el ensayo y ajusta el pH para cuantificar el producto fluorescente. La fluorescencia se midió con excitación a 365 nm y emisión a 445 nm utilizando un Fluoromax-3 con Micromax Reader, con un ancho de hendidura fijado en 2 nm de excitación y 3nm de emisión. Los valores se proporcionan en unidades de nmol GUS/hora/mg de proteína total.
Se tomaron muestras de los siguientes tejidos para la expresión de GUS en la generación Ro; hoja de sumidero, hoja de origen y raíz en la etapa Vn5; pecíolo, hoja de origen, flor y cotiledón en la etapa R1; vaina y semilla inmadura en la etapa R3; y embrión y cotiledón en la etapa de vaina amarilla. Las Tablas 3 y 4 que figuran a continuación muestran la media de la expresión cuantitativa de GUS para cada uno de los tejidos muestreados impulsados por los elementos reguladores presentados en la Tabla 2.
Tabla 3. Expresión cuantitativa media de GUS en plantas de soja transformadas de forma estable e impulsadas por elementos reguladores derivados de Cucumis melo
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Tabla 4. Expresión cuantitativa media de GUS en plantas de soja transformadas de forma estable y dirigidas por elementos reguladores derivados de Medicago truncatula
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Como se puede ver en las Tablas 3 y 4, cada uno de los elementos reguladores tiene un patrón único de expresión en los tejidos muestreados. Tanto EXP-CUCme.Fe2:1 (SEQ ID NO: 1) como EXP-CUCme.CipLhcb:1 (SEQ ID NO: 4) se expresan en gran medida en la vaina R3 y muestran el nivel más bajo de expresión en la semilla inmadura R3, la raíz Vn5, el cotiledón R5 y el embrión y el cotiledón en etapa de vaina amarilla. La expresión de GUS impulsada por EXP-CUCme.Fe2:1 también fue elevada en la etapa Vn5 de la hoja de origen y del pecíolo de la etapa R1, de la hoja de origen y de la flor. El elemento regulador EXP-CUCme.Bbz:1 (SEQ ID NO: 7) demostraron la máxima expresión en la hoja de origen y de sumidero en la etapa Vn5 y en la vaina en la etapa R3. La expresión de GUS impulsada por EXP-Mt.Lhcb2:1:1 (SEQ ID NO: 10) fue mayor en la hoja de origen de la etapa Vn5 y en el pecíolo R1. EXP-Mt.PSII-T:1:1 (SEQ ID NO: 13) demostraron la máxima expresión en la Hoja de origen de la etapa R1.
Cada elemento regulador proporciona un patrón único de expresión que puede utilizarse para impulsar de forma óptima la expresión de diferentes transgenes, dependiendo de la preferencia de tejido deseada para la expresión.
Ejemplo 3
Elementos potenciadores derivados de los elementos reguladores
Los potenciadores se derivan de los elementos promotores presentados como SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11 y 14. El elemento potenciador puede estar compuesto por uno o más elementos reguladores cis que, cuando están vinculados operativamente en 5' o 3' a un elemento promotor, o vinculados operativamente en 5' o 3' a elementos potenciadores adicionales que están vinculados operativamente a un promotor, pueden mejorar o modular los niveles de expresión de una molécula de ADN transcribible, o proporcionar la expresión de una molécula de ADN transcribible en un tipo de célula u órgano vegetal específico o en un momento determinado del desarrollo o del ritmo circadiano. Los potenciadores se hacen eliminando la caja TATA o elementos funcionalmente similares y cualquier secuencia corriente abajo de los promotores que permiten iniciar la transcripción a partir de una secuencia promotora, por ejemplo las secuencias presentadas como SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11 y 14 o fragmentos de las mismas.
La caja TATA en los promotores de las plantas no está tan conservada como en otros organismos eucariotas. Por lo tanto, para definir un fragmento como potenciador, primero hay que identificar el sitio de inicio de la transcripción (TSS) del gen, donde se transcribe por primera vez la UTR 5'. Por ejemplo, el elemento regulador transcripcional, EXP-Mt.Lhcb2:1:1 (SEQ ID NO: 10) está compuesto por el elemento promotor, P-Mt.Lhcb2-1:2:1 (SEQ ID NO: 11), vinculado operativamente a la UTR 5' o elemento líder, L-Mt.Lhcb2-1:2:1 (SEQ ID NO: 12). Dentro del elemento promotor de 1837 pb, P-Mt.Lhcb2-1:2:1 (SEQ ID NO: 11), el núcleo putativo del elemento tipo TATA se encuentra entre los nucleótidos 1798 y 1803. Un fragmento potenciador derivado de la P-Mt.Lhcb2-1:2:1 podría comprender los nucleótidos 1 a 1797 de la SEQ ID NO: 11, dando como resultado la secuencia presentada como SEQ ID NO: 16 (E-Mt.Lhcb2). Los potenciadores derivados del promotor, P-Mt.Lhcb2-1:2:1 (SEQ ID NO: 11) puede comprender además fragmentos más pequeños de E-Mt.Lhcb2 (SEQ ID NO: 16). La eficacia de los elementos potenciadores derivados del promotor, P-Mt.Lhcb2-1:2:1 (SEQ ID NO: 11) se determina empíricamente construyendo un elemento regulador transcripcional quimérico que comprende un potenciador derivado del promotor, P-Mt.Lhcb2-1:2:1 (SEQ ID NO: 11), que se une de forma operativa a un promotor y a un líder y se utiliza para impulsar la expresión de una molécula de ADN transcribible, como GUS, en un ensayo vegetal estable o transitorio.
Puede ser necesario un mayor refinamiento del elemento potenciador, que se valida empíricamente. Además, la posición del elemento potenciador en relación con otros elementos dentro de un elemento regulador transcripcional quimérico también se determina empíricamente, ya que el orden de cada elemento dentro del elemento regulador transcripcional quimérico puede impartir efectos diferentes, dependiendo de las posiciones relativas de cada elemento.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en:
a) una secuencia con al menos un 95 por ciento de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:5;
b) una secuencia con al menos un 97 por ciento de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:4, en la que la secuencia tiene actividad promotora; y
c) una secuencia que comprende la SEQ ID NO:4 o 5;
en la que dicha secuencia está vinculada operativamente a una molécula de ADN transcribible heteróloga.
2. La molécula de ADN recombinante de la reivindicación 1, en la que:
(a) dicha secuencia tiene al menos un 97 por ciento de identidad de secuencia con la secuencia de ADN de la SEQ ID NO:5;
(b) dicha secuencia tiene al menos un 98 por ciento de identidad de secuencia con la secuencia de ADN de la SEQ ID NO:5; o
(c) dicha secuencia comprende la secuencia de ADN de SEQ ID NO:4 o 5.
3. La molécula de ADN recombinante de la reivindicación 1, en la que la secuencia de ADN comprende actividad promotora.
4. La molécula de ADN recombinante de la reivindicación 1, en la que la molécula de ADN transcribible heteróloga comprende un gen de interés agronómico.
5. La molécula de ADN recombinante de la reivindicación 4, en la que el gen de interés agronómico confiere tolerancia a los herbicidas en las plantas.
6. La molécula de ADN recombinante de la reivindicación 4, en la que el gen de interés agronómico confiere resistencia a las plagas en las plantas.
7. Una célula vegetal transgénica que comprende una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
a) una secuencia con al menos un 95 por ciento de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:5, en la que la secuencia tiene actividad promotora;
b) una secuencia con al menos un 97 por ciento de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:4, en la que la secuencia tiene actividad promotora; y
c) una secuencia que comprende la SEQ ID NO:4 o 5;
en la que dicha secuencia está vinculada operativamente a una molécula de ADN transcribible heteróloga.
8. La célula vegetal transgénica de la reivindicación 7, en la que dicha célula vegetal transgénica es una célula vegetal monocotiledónea.
9. La célula vegetal transgénica de la reivindicación 7, en la que dicha célula vegetal transgénica es una célula vegetal dicotiledónea.
10. Una planta transgénica, o parte de la misma, que comprende la molécula de ADN recombinante de la reivindicación 1.
11. Una planta progenitora de la planta transgénica de la reivindicación 10, o una parte de la misma, en la que la planta progenitora o una parte de la misma comprende dicha molécula de ADN recombinante.
12. Una semilla transgénica, en la que la semilla comprende la molécula de ADN recombinante de la reivindicación 1.
13. Un procedimiento de producción de un producto básico que comprende la obtención de una planta transgénica o una parte de la misma según la reivindicación 10 y la producción del producto básico a partir de la misma.
14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que el producto básico es concentrado de proteínas, aislado de proteínas, grano, almidón, semillas, harina, biomasa o aceite de semillas.
15. Un procedimiento de expresión de una molécula de ADN transcribible que comprende la obtención de una planta transgénica según la reivindicación 10 y el cultivo de la planta, en el que se expresa el ADN transcribible.
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ZA (1) ZA201805832B (es)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2017229608B2 (en) 2016-03-11 2022-12-01 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof
US11377662B2 (en) 2018-01-10 2022-07-05 Wisconsin Alumni Research Foundation Agrobacterium-mediated and particle bombardment transformation method for cowpea and dry bean meristem explants
CN114395022B (zh) * 2022-01-27 2023-06-13 河南农业大学 苹果锌指蛋白转录因子MdZF-HD11及应用

Family Cites Families (109)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE71981T1 (de) 1984-12-10 1992-02-15 Monsanto Co Einsetzung des bacillus thuringiensis kristallproteingens in pflanzen kolonisierende mikroorganismen und deren verwendung.
US6774283B1 (en) 1985-07-29 2004-08-10 Calgene Llc Molecular farming
US6617496B1 (en) 1985-10-16 2003-09-09 Monsanto Company Effecting virus resistance in plants through the use of negative strand RNAs
US6608241B1 (en) 1985-10-29 2003-08-19 Monsanto Technology Llc Protection of plants against viral infection
US5107065A (en) 1986-03-28 1992-04-21 Calgene, Inc. Anti-sense regulation of gene expression in plant cells
TR27832A (tr) 1987-04-29 1995-08-31 Monsanto Co Zararli ucucu hasarata mukavim bitkiler.
US5229114A (en) 1987-08-20 1993-07-20 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Approaches useful for the control of root nodulation of leguminous plants
EP0342926B1 (en) 1988-05-17 1994-09-28 Mycogen Plant Science, Inc. Plant ubiquitin promoter system
US5597718A (en) 1988-10-04 1997-01-28 Agracetus Genetically engineering cotton plants for altered fiber
CA2024811A1 (en) 1989-02-24 1990-08-25 David A. Fischhoff Synthetic plant genes and method for preparation
US5550318A (en) * 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5689041A (en) 1989-08-10 1997-11-18 Plant Gentic Systems N.V. Plants modified with barstar for fertility restoration
US6426447B1 (en) 1990-11-14 2002-07-30 Monsanto Technology Llc Plant seed oils
US5543576A (en) 1990-03-23 1996-08-06 Mogen International Production of enzymes in seeds and their use
US5969214A (en) 1990-06-11 1999-10-19 Calgene, Inc. Glycogen biosynthetic enzymes in plants
US5498830A (en) 1990-06-18 1996-03-12 Monsanto Company Decreased oil content in plant seeds
CA2081885C (en) 1990-06-18 2000-10-31 Ganesh M. Kishore Increased starch content in plants
JP3173784B2 (ja) 1990-06-25 2001-06-04 モンサント カンパニー グリホセート耐性植物
USRE38446E1 (en) 1990-07-20 2004-02-24 Calgene, Llc. Sucrose phosphate synthase (SPS), its process for preparation its cDNA, and utilization of cDNA to modify the expression of SPS in plant cells
US6483008B1 (en) 1990-08-15 2002-11-19 Calgene Llc Methods for producing plants with elevated oleic acid content
US5633435A (en) 1990-08-31 1997-05-27 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
US5866775A (en) 1990-09-28 1999-02-02 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthases
EP0564524A1 (en) 1990-12-26 1993-10-13 Monsanto Company Control of fruit ripening and senescence in plants
US5304730A (en) 1991-09-03 1994-04-19 Monsanto Company Virus resistant plants and method therefore
US5763245A (en) 1991-09-23 1998-06-09 Monsanto Company Method of controlling insects
US6015940A (en) 1992-04-07 2000-01-18 Monsanto Company Virus resistant potato plants
US5850023A (en) 1992-11-30 1998-12-15 Monsanto Company Modified plant viral replicase genes
US6011199A (en) 1992-12-15 2000-01-04 Commonwealth Scientific Method for producing fruiting plants with improved fruit flavour
US6013864A (en) 1993-02-03 2000-01-11 Monsanto Company Plants resistant to infection by luteoviruses
US5322687A (en) 1993-07-29 1994-06-21 Ecogen Inc. Bacillus thuringiensis cryet4 and cryet5 toxin genes and proteins toxic to lepidopteran insects
AU7925094A (en) 1993-09-30 1995-04-18 Agracetus, Inc. Transgenic cotton plants producing heterologous peroxidase
BR9408140A (pt) 1993-11-24 1997-08-12 Monsanato Company Processo para controle de agentes patonênicos às plantas
WO1998055632A1 (en) 1997-06-05 1998-12-10 Calgene Llc FATTY ACYL-CoA: FATTY ALCOHOL ACYLTRANSFERASES
US6828475B1 (en) 1994-06-23 2004-12-07 Calgene Llc Nucleic acid sequences encoding a plant cytoplasmic protein involved in fatty acyl-CoA metabolism
US6140075A (en) 1994-07-25 2000-10-31 Monsanto Company Method for producing antibodies and protein toxins in plant cells
US6080560A (en) 1994-07-25 2000-06-27 Monsanto Company Method for producing antibodies in plant cells
US5750876A (en) 1994-07-28 1998-05-12 Monsanto Company Isoamylase gene, compositions containing it, and methods of using isoamylases
US5716837A (en) 1995-02-10 1998-02-10 Monsanto Company Expression of sucrose phosphorylase in plants
US6091002A (en) 1996-03-13 2000-07-18 Monsanto Company Polyhydroxyalkanoates of narrow molecular weight distribution prepared in transgenic plants
US6946588B2 (en) 1996-03-13 2005-09-20 Monsanto Technology Llc Nucleic acid encoding a modified threonine deaminase and methods of use
US5958745A (en) 1996-03-13 1999-09-28 Monsanto Company Methods of optimizing substrate pools and biosynthesis of poly-β-hydroxybutyrate-co-poly-β-hydroxyvalerate in bacteria and plants
US5773696A (en) 1996-03-29 1998-06-30 Monsanto Company Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi
US6166292A (en) 1996-04-26 2000-12-26 Ajinomoto Co., Inc. Raffinose synthetase gene, method of producing raffinose and transgenic plant
US5985605A (en) 1996-06-14 1999-11-16 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Dept. Of Agriculture & Agri-Food Canada DNA sequences encoding phytases of ruminal microorganisms
US5998700A (en) 1996-07-02 1999-12-07 The Board Of Trustees Of Southern Illinois University Plants containing a bacterial Gdha gene and methods of use thereof
US5750848A (en) 1996-08-13 1998-05-12 Monsanto Company DNA sequence useful for the production of polyhydroxyalkanoates
US6063756A (en) 1996-09-24 2000-05-16 Monsanto Company Bacillus thuringiensis cryET33 and cryET34 compositions and uses therefor
US6093695A (en) 1996-09-26 2000-07-25 Monsanto Company Bacillus thuringiensis CryET29 compositions toxic to coleopteran insects and ctenocephalides SPP
WO1998018949A2 (en) 1996-10-29 1998-05-07 Calgene Llc Plant cellulose synthase and promoter sequences
US6713063B1 (en) 1996-11-20 2004-03-30 Monsanto Technology, Llc Broad-spectrum δ-endotoxins
US6017534A (en) 1996-11-20 2000-01-25 Ecogen, Inc. Hybrid Bacillus thuringiensis δ-endotoxins with novel broad-spectrum insecticidal activity
AP9901541A0 (en) 1996-11-20 1999-06-30 Ecogen Inc Broad-spectrum delta-endotoxins.
US5942664A (en) 1996-11-27 1999-08-24 Ecogen, Inc. Bacillus thuringiensis Cry1C compositions toxic to lepidopteran insects and methods for making Cry1C mutants
US6121436A (en) 1996-12-13 2000-09-19 Monsanto Company Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi
US6171640B1 (en) 1997-04-04 2001-01-09 Monsanto Company High beta-conglycinin products and their use
AR013633A1 (es) 1997-04-11 2001-01-10 Calgene Llc METODO PARA LA ALTERACIoN DE LA COMPOSICIoN DE ÁCIDOS GRASOS DE CADENA MEDIA EN SEMILLAS VEGETALES QUE EXPRESAN UNA TIOESTERASA QUE PREFIERE CADENA MEDIA VEGETAL HETERoLOGA.
US5972664A (en) 1997-04-11 1999-10-26 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
US6372211B1 (en) 1997-04-21 2002-04-16 Monsanto Technolgy Llc Methods and compositions for controlling insects
US6380466B1 (en) 1997-05-08 2002-04-30 Calgene Llc Production of improved rapeseed exhibiting yellow-seed coat
US6441277B1 (en) 1997-06-17 2002-08-27 Monsanto Technology Llc Expression of fructose 1,6 bisphosphate aldolase in transgenic plants
US6716474B2 (en) 1997-06-17 2004-04-06 Monsanto Technology Llc Expression of fructose 1,6 bisphosphate aldolase in transgenic plants
US6072103A (en) 1997-11-21 2000-06-06 Calgene Llc Pathogen and stress-responsive promoter for gene expression
US6023013A (en) 1997-12-18 2000-02-08 Monsanto Company Insect-resistant transgenic plants
US6063597A (en) 1997-12-18 2000-05-16 Monsanto Company Polypeptide compositions toxic to coleopteran insects
US6060594A (en) 1997-12-18 2000-05-09 Ecogen, Inc. Nucleic acid segments encoding modified bacillus thuringiensis coleopteran-toxic crystal proteins
US6653530B1 (en) 1998-02-13 2003-11-25 Calgene Llc Methods for producing carotenoid compounds, tocopherol compounds, and specialty oils in plant seeds
US6107549A (en) 1998-03-10 2000-08-22 Monsanto Company Genetically engineered plant resistance to thiazopyr and other pyridine herbicides
US6284948B1 (en) 1998-05-18 2001-09-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genes and methods for control of nematodes in plants
US6444876B1 (en) 1998-06-05 2002-09-03 Calgene Llc Acyl CoA: cholesterol acyltransferase related nucleic acid sequences
EP1086236B1 (en) 1998-06-12 2007-09-05 Calgene LLC Polyunsaturated fatty acids in plants
JP4514952B2 (ja) 1998-07-02 2010-07-28 カルジーン エルエルシー ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼタンパク質
EP1097211B1 (en) 1998-07-10 2007-04-18 Calgene LLC Expression of eukaryotic peptides in plant plastids
US6476294B1 (en) 1998-07-24 2002-11-05 Calgene Llc Plant phosphatidic acid phosphatases
DE69937354T2 (de) 1998-08-04 2008-07-24 Cargill, Inc., Wayzata Promotoren der fettsäuren-desaturase aus pflanzen
US6723897B2 (en) 1998-08-10 2004-04-20 Monsanto Technology, Llc Methods for controlling gibberellin levels
US6365802B2 (en) 1998-08-14 2002-04-02 Calgene Llc Methods for increasing stearate content in soybean oil
US6468523B1 (en) 1998-11-02 2002-10-22 Monsanto Technology Llc Polypeptide compositions toxic to diabrotic insects, and methods of use
DK1135511T3 (da) 1998-11-17 2009-07-27 Monsanto Technology Llc Phosphonatmetaboliserende planter
US6531648B1 (en) 1998-12-17 2003-03-11 Syngenta Participations Ag Grain processing method and transgenic plants useful therein
ATE358723T1 (de) 1999-04-15 2007-04-15 Calgene Llc Nukleinsäuresequenzen für proteine die an der isoprenoid-synthese beteiligt sind
CA2371442A1 (en) 1999-05-04 2000-11-09 Monsanto Technology Llc Coleopteran-toxic polypeptide compositions and insect-resistant transgenic plants
BR0010530A (pt) 1999-05-13 2002-04-23 Monsanto Technology Llc Genes de resistência adquirida em plantas
WO2000075350A2 (en) 1999-06-08 2000-12-14 Calgene Llc Nucleic acid sequences encoding proteins involved in fatty acid beta-oxidation and methods of use
US6770465B1 (en) 1999-06-09 2004-08-03 Calgene Llc Engineering B-ketoacyl ACP synthase for novel substrate specificity
US7105730B1 (en) 1999-07-12 2006-09-12 Monsanto Technology L.L.C. Nucleic acid molecules and other molecules associated with sterol synthesis and metabolism
US6603061B1 (en) 1999-07-29 2003-08-05 Monsanto Company Agrobacterium-mediated plant transformation method
US6501009B1 (en) 1999-08-19 2002-12-31 Monsanto Technology Llc Expression of Cry3B insecticidal protein in plants
AU7491600A (en) 1999-09-15 2001-04-17 Monsanto Technology Llc Lepidopteran-active bacillus thuringiensis delta-endotoxin compositions and methods of use
US6573361B1 (en) 1999-12-06 2003-06-03 Monsanto Technology Llc Antifungal proteins and methods for their use
EP1632576B1 (en) * 1999-12-16 2017-05-31 Monsanto Technology, LLC Novel plant expression constructs
US6657046B1 (en) 2000-01-06 2003-12-02 Monsanto Technology Llc Insect inhibitory lipid acyl hydrolases
CA2396422A1 (en) 2000-01-06 2001-07-12 Monsanto Technology Llc Preparation of deallergenized proteins and permuteins
US6803501B2 (en) 2000-03-09 2004-10-12 Monsanto Technology, Llc Methods for making plants tolerant to glyphosate and compositions thereof using a DNA encoding an EPSPS enzyme from Eleusine indica
US6518488B1 (en) 2000-07-21 2003-02-11 Monsanto Technology Llc Nucleic acid molecules and other molecules associated with the β-oxidation pathway
WO2002008403A2 (en) 2000-07-25 2002-01-31 Calgene Llc Nucleic acid sequences encoding beta-ketoacyl-acp synthase and uses thereof
CA2734624A1 (en) 2004-06-09 2005-12-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plastid transit peptides
CA2581452A1 (en) * 2004-09-24 2006-04-06 Monsanto Technology Llc Promoter molecules for use in plants
US20060200878A1 (en) 2004-12-21 2006-09-07 Linda Lutfiyya Recombinant DNA constructs and methods for controlling gene expression
EP3287524A1 (en) 2006-08-31 2018-02-28 Monsanto Technology LLC Phased small rnas
AR070340A1 (es) 2008-01-31 2010-03-31 Nat Inst For Biolog Sciences Plantas que tienen crecimiento y/o desarrollo alterado mediante modulacion de la expresion de un acido nucleico que codifica una proteasa especifica de ubiquitina (ubp) proveniente de arabipdosis y oryza
US8168859B2 (en) 2008-08-27 2012-05-01 Pioneer Hi Bred International Inc Ubiquitin regulatory elements
US8846892B2 (en) * 2008-09-25 2014-09-30 Monsanto Technology Llc Chimeric plant promoters and their uses in plants
EP2491127B1 (en) 2009-10-22 2017-09-20 Dow AgroSciences LLC Engineered zinc finger proteins targeting plant genes involved in fatty acid biosynthesis
KR102003177B1 (ko) * 2011-03-25 2019-07-24 몬산토 테크놀로지 엘엘씨 식물 조절 요소 및 그의 용도
US9487792B2 (en) * 2011-05-05 2016-11-08 Plant Sensory Systems, Llc Regulatory sequences to control gene expression in plants
EA031587B1 (ru) * 2011-05-13 2019-01-31 Монсанто Текнолоджи Ллс Регуляторные элементы растений и их применение
WO2014100009A2 (en) * 2012-12-19 2014-06-26 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof
EP3575308A1 (en) * 2013-03-14 2019-12-04 Monsanto Technology LLC Plant regulatory elements and uses thereof
AU2017229608B2 (en) 2016-03-11 2022-12-01 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
CL2019002971A1 (es) 2020-02-07
CA2960502A1 (en) 2017-09-11
PH12018501939A1 (en) 2019-06-17
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US20210246461A1 (en) 2021-08-12
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US11851667B2 (en) 2023-12-26
KR102633642B1 (ko) 2024-02-06
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KR20220116066A (ko) 2022-08-19
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AR121010A2 (es) 2022-04-06
IL261507A (en) 2018-10-31
CN108884474A (zh) 2018-11-23
US10443066B2 (en) 2019-10-15
CN115125253A (zh) 2022-09-30
EA201892043A1 (ru) 2019-01-31
AR121011A2 (es) 2022-04-06
JP2019508047A (ja) 2019-03-28
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CL2018002597A1 (es) 2018-10-26
NI201800087A (es) 2018-10-24
SV2018005741A (es) 2019-01-28
WO2017156091A1 (en) 2017-09-14
EP3426788B1 (en) 2021-09-08
US20200080098A1 (en) 2020-03-12
US20200080099A1 (en) 2020-03-12
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US20170260541A1 (en) 2017-09-14
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