KR102430885B1 - 식물 조절 요소 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 식물에서의 유전자 발현을 조정하기에 유용한 재조합 DNA 분자 및 작제물, 및 이의 뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 본 발명은 또한 비상동성 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된 재조합 DNA 분자를 포함하는, 형질전환 식물, 식물 세포, 식물 부분 및 종자, 및 이의 사용 방법을 제공한다.
Description
관련 출원에 대한 참조
본 출원은 2016년 3월 11일로 출원된 미국 가출원 제62/306,790호(본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)의 이익을 주장한다.
서열 목록의 포함
(Microsoft Windows(등록상표)에서 측정된 바대로) 29.4KB이고, 2017년 3월 6일자에 생성된 파일명 "MONS417WO-sequence_listing"에 포함된 서열 목록은 전자 제출로 본 명세서에서 파일링되고, 본 명세서에 참고로 포함된다.
기술분야
본 발명은 식물 분자 생물학; 및 식물 유전자 조작의 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 식물에서 유전자 발현을 조정하기에 유용한 DNA 분자에 관한 것이다.
조절 요소는 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자의 전사를 조정함으로써 유전자 활성을 조절하는 유전적 요소이다. 이러한 요소는 촉진자, 리더, 인트론 및 3' 비번역된 영역을 포함할 수 있고, 식물 분자 생물학 및 식물 유전자 조작의 분야에서 유용하다.
본 발명은 식물에서 사용하기 위한 신규한 유전자 조절 요소를 제공한다. 본 발명은 또한 조절 요소를 포함하는 DNA 작제물을 제공한다. 본 발명은 또한 조절 요소를 포함하는 형질전환 식물 세포, 식물 및 종자를 제공한다. 일 실시형태에서, 조절 요소는 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된다. 소정의 실시형태에서, 전사 가능한 DNA 분자는 조절 서열과 관련하여 비상동성일 수 있다. 따라서, 본 발명에 의해 제공된 조절 요소 서열은, 특정한 실시형태에서, 비상동성 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된 것으로 정의될 수 있다. 본 발명은 또한 조절 요소를 제조하고 사용하는 방법, 조절 요소를 포함하는 DNA 작제물, 및 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함하는 형질전환 식물 세포, 식물 및 종자를 제공한다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 1 내지 15 중 임의의 서열과 적어도 약 85%의 서열 동일성을 갖는 서열; (b) 서열 번호 1 내지 15 중 임의의 서열을 포함하는 서열; 및 (c) 서열 번호 1 내지 15 중 임의의 서열의 단편(여기서, 단편은 유전자 조절 활성을 가짐)으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 제공하고; 서열은 비상동성 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된다. "비상동성 전사 가능한 DNA 분자란", 전사 가능한 DNA 분자가 이것이 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드 서열과 관련하여 비상동성이라는 것을 의미한다. 구체적인 실시형태에서, 재조합 DNA 분자는 서열 번호 1 내지 15 중 임의의 서열의 DNA 서열과 적어도 약 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함한다. 특정한 실시형태에서, DNA 서열은 조절 요소를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 조절 요소는 촉진자를 포함한다. 훨씬 다른 실시형태에서, 비상동성 전사 가능한 DNA 분자는 작물학적 관심의 유전자, 예컨대 식물에서 제초제 저항성을 제공할 수 있는 유전자, 또는 식물에서 식물 내충성(pest resistance)을 제공할 수 있는 유전자를 포함한다. 훨씬 다른 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 제공된 바와 같은 재조합 DNA 분자를 포함하는 작제물을 제공한다.
또 다른 양태에서, (a) 서열 번호 1 내지 15 중 임의의 서열과 적어도 약 85%의 서열 동일성을 갖는 서열; (b) 서열 번호 1 내지 15 중 임의의 서열을 포함하는 서열; 및 (c) 서열 번호 1 내지 15 중 임의의 서열의 단편(여기서, 단편은 유전자 조절 활성을 가짐)으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 형질전환 식물 세포가 본 명세서에 제공되고; DNA 서열은 비상동성 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된다. 소정의 실시형태에서, 형질전환 식물 세포는 외떡잎식물 식물 세포이다. 다른 실시형태에서, 형질전환 식물 세포는 외떡잎식물 식물 세포 또는 쌍떡잎식물 식물 세포이다.
훨씬 더 또 다른 양태에서, a) 서열 번호 1 내지 15 중 임의의 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 서열; b) 서열 번호 1 내지 15 중 임의의 서열을 포함하는 서열; 및 c) 서열 번호 1 내지 15 중 임의의 서열의 단편(여기서, 단편은 유전자 조절 활성을 가짐)으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 형질전환 식물, 또는 이의 부분이 본 명세서에 추가로 제공되고; 서열은 비상동성 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된다. 구체적인 실시형태에서, 형질전환 식물은 재조합 DNA 분자를 포함하는 임의의 세대의 자손 식물이다. 성장할 때 이러한 형질전환 식물을 생성하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 형질전환 종자는 본 명세서에 또한 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 DNA 분자를 함유하는 형질전환 식물 또는 이의 부분을 수득하는 단계 및 이로부터 상품 산물(commodity product)을 생성하는 단계를 포함하는 상품 산물을 제조하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 상품 산물은 가공처리된 종자, 곡물, 식물 부분 오일 및 으깬 곡물(meal)이다.
훨씬 더 또 다른 양태에서, 본 발명은 식물 세포를 본 발명의 재조합 DNA 분자에 의해 형질전환하여 형질전환된 식물 세포를 생성하는 단계 및 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재생하는 단계를 포함하는 본 발명의 재조합 DNA 분자를 포함하는 형질전환 식물을 생성하는 방법을 제공한다.
서열의 간단한 설명
서열 번호 1은 네이티브 리더에 5'에 작동 가능하게 연결된 쿠쿠미스 멜로(Cucumis melo) 추정상 페레독신 2(Fe2) 단백질 유전자로부터 유래된 촉진자를 포함하는 조절 발현 요소군(EXP)의 DNA 서열이다.
서열 번호 2는 쿠쿠미스 멜로 추정상 페레독신 2(Fe2) 단백질 유전자로부터 유래된 촉진자 서열이다.
서열 번호 3은 쿠쿠미스 멜로 추정상 페레독신 2(Fe2) 단백질 유전자로부터 유래된 리더 서열이다.
서열 번호 4는 네이티브 리더에 5'에 작동 가능하게 연결된 쿠쿠미스 멜로 엽록소 a-b 결합 단백질 13 유전자로부터 유래된 촉진자를 포함하는 EXP의 DNA 서열이다.
서열 번호 5는 쿠쿠미스 멜로 엽록소 a-b 결합 단백질 13 유전자로부터 유래된 촉진자 서열이다.
서열 번호 6은 쿠쿠미스 멜로 엽록소 a-b 결합 단백질 13 유전자로부터 유래된 리더 서열이다.
서열 번호 7은 네이티브 리더에 5'에 작동 가능하게 연결된 쿠쿠미스 멜로 B-박스 아연 핑거 단백질 24 유사 유전자로부터 유래된 촉진자를 포함하는 EXP의 DNA 서열이다.
서열 번호 8은 쿠쿠미스 멜로 B-박스 아연 핑거 단백질 24 유사 유전자로부터 유래된 촉진자 서열이다.
서열 번호 9는 쿠쿠미스 멜로 B-박스 아연 핑거 단백질 24 유사 유전자로부터 유래된 리더 서열이다.
서열 번호 10은 네이티브 리더에 5'에 작동 가능하게 연결된 메디카고 트룬카툴라(Medicago truncatula) 광 수확 복합 단백질 b2 유전자로부터 유래된 촉진자를 포함하는 EXP의 DNA 서열이다.
서열 번호 11은 메디카고 트룬카툴라 광 수확 복합 단백질 b2 유전자로부터 유래된 촉진자 서열이다.
서열 번호 12는 메디카고 트룬카툴라 광 수확 복합 단백질 b2 유전자로부터 유래된 리더 서열이다.
서열 번호 13은 네이티브 리더에 5'에 작동 가능하게 연결된 메디카고 트룬카툴라 광시스템 II 엽록체 전구체 유전자로부터 유래된 촉진자를 포함하는 EXP의 DNA 서열이다.
서열 번호 14는 메디카고 트룬카툴라 광시스템 II 엽록체 전구체 유전자로부터 유래된 촉진자 서열이다.
서열 번호 15는 메디카고 트룬카툴라 광시스템 II 엽록체 전구체 유전자로부터 유래된 리더 서열 촉진자 서열이다.
서열 번호 16은 메디카고 트룬카툴라 광 수확 복합 단백질 b2 유전자의 촉진자로부터 유래된 증강자 서열이다.
서열 번호 17은 가공 가능한 인트론을 갖는 ß-글루쿠로니다제(GUS)에 대한 코딩 서열이다.
서열 번호 18은 고시피움 바르바덴스(Gossypium barbadense) E6 유전자로부터 유래된 3' UTR 서열이다.
본 발명은 식물에서 유전자 조절 활성을 갖는 DNA 분자를 제공한다. 이 DNA 분자의 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 1 내지 15로서 제공된다. 이 DNA 분자는 식물 조직에서 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자의 발현에 영향을 미치고, 따라서 형질전환 식물에서 작동 가능하게 연결된 전이유전자의 유전자 발현을 조절할 수 있다. 본 발명은 또한 이를 변형시키고 제조하고 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 재조합 DNA 분자를 함유하는 형질전환 식물 세포, 식물, 식물 부분 및 종자를 포함하는 조성물, 및 이를 제조하고 사용하는 방법을 제공한다.
하기 정의 및 방법은 본 발명을 더 양호하게 정의하고 본 발명의 실행 시 숙련자를 안내하도록 제공된다. 달리 기재되지 않는 한, 용어는 관련 분야에서의 숙련자에 의한 종래의 용법에 따라 이해되어야 한다.
DNA 분자
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "DNA" 또는 "DNA 분자"는 게놈 또는 합성 기원의 이중 가닥 DNA 분자, 즉 5' (상류) 말단으로부터 3' (하류) 말단으로 읽히는, 데옥시리보뉴클레오타이드 염기 또는 DNA 분자의 중합체를 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "DNA 서열"은 DNA 분자의 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 본 명세서에 사용된 명명법은 미국 연방 규정집(United States Code of Federal Regulations) § 1.822의 Title 37, 및 WIPO Standard ST.25 (1998), 부록 2, 표 1 및 표 3에서의 표에 기재된 것에 상응한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "재조합 DNA 분자"는 인간 중재 없이 자연에서 함께 발생하지 않는 DNA 분자의 조합을 포함하는 DNA 분자이다. 예를 들어, 재조합 DNA 분자는 서로에 대해 비상동성인 적어도 2개의 DNA 분자, 자연에 존재하는 DNA 서열로부터 벗어난 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자 또는 유전자 형질전환 또는 유전자 편집에 의해 숙주 세포의 DNA로 도입된 DNA 분자를 포함하는 DNA 분자일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "서열 동일성"은 2개의 최적으로 정렬된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 2개의 최적으로 정렬된 폴리펩타이드 서열이 동일한 정도를 의미한다. 최적 서열 정렬은 적절한 내부 뉴클레오타이드 삽입, 결실 또는 갭과의 서열 정렬에서의 뉴클레오타이드 매치의 수를 최대화하기 위해 2개의 서열, 예를 들어 기준 서열 및 또 다른 서열을 수동으로 정렬함으로써 생성된다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "기준 서열"은 서열 번호 1 내지 15로서 제공된 DNA 서열과 관련하여 제공된 DNA 서열을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "서열 동일성 백분율" 또는 "동일성 백분율" 또는 "동일성(%)"은 100을 곱한 동일성 분수이다. 기준 서열과 최적으로 정렬된 서열에 대한 "동일성 분수"는 기준 서열에서의 뉴클레오타이드의 전체 수, 예를 들어 전체 기준 서열의 전장에서의 뉴클레오타이드의 전체 수로 나눈 최적 정렬에서의 뉴클레오타이드 매치의 수이다. 따라서, 본 발명의 일 실시형태는, 서열 번호 1 내지 15로서 본 명세서에 제공된 기준 서열에 최적으로 정렬될 때, 기준 서열에 적어도 약 85% 동일성, 적어도 약 86% 동일성, 적어도 약 87% 동일성, 적어도 약 88% 동일성, 적어도 약 89% 동일성, 적어도 약 90% 동일성, 적어도 약 91% 동일성, 적어도 약 92% 동일성, 적어도 약 93% 동일성, 적어도 약 94% 동일성, 적어도 약 95% 동일성, 적어도 약 96% 동일성, 적어도 약 97% 동일성, 적어도 약 98% 동일성, 적어도 약 99% 동일성, 또는 적어도 약 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 DNA 분자를 제공한다.
조절 요소
조절 요소, 예컨대 촉진자, 리더(5' UTR로도 공지됨), 증강자, 인트론 및 전사 종결 영역(또는 3' UTR)은 살아 있는 세포에서 유전자의 전체 발현에서의 통합 부분을 맡는다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "조절 요소"는 유전자 조절 활성을 갖는 DNA 분자를 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "유전자 조절 활성"은 예를 들어 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자의 전사 및/또는 번역에 영향을 미침으로써, 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자의 발현에 영향을 미치는 능력을 의미한다. 식물에서 작용하는 조절 요소, 예컨대 촉진자, 리더, 증강자, 인트론 및 3' UTR은 따라서 유전자 조작을 통해 식물 표현형을 변형시키기에 유용하다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "조절 발현 요소군" 또는 "EXP" 서열은 작동 가능하게 연결된 조절 요소, 예컨대 증강자, 촉진자, 리더 및 인트론의 군을 의미할 수 있다. 따라서, 조절 발현 요소군은 예를 들어 리더 서열에 5'에 작동 가능하게 연결된 촉진자를 포함할 수 있다. 본 발명을 실행하는 데 유용한 EXP는 1, 4, 7, 10 및 13을 포함한다.
조절 요소는 이의 유전자 발현 패턴, 예를 들어 양성 및/또는 음성 효과, 예컨대 구성적 발현 또는 일시적, 공간상, 발생상, 조직, 환경학적, 생리학적, 병리학적, 세포 주기, 및/또는 화학적 반응성 발현, 및 임의의 이들의 조합, 및 정량적 또는 정성적 표시를 특징으로 할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "유전자 발현 패턴"은 전사된 RNA 분자로 작동 가능하게 연결된 DNA 분자의 전사의 임의의 패턴이다. 전사된 RNA 분자는 단백질 분자를 생성하도록 번역될 수 있거나, 안티센스 또는 다른 조절 RNA 분자, 예컨대 이중 가닥 RNA(dsRNA), 운반 RNA(tRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 마이크로RNA(miRNA) 등을 제공할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "단백질 발현"은 단백질 분자로의 전사된 RNA 분자의 번역의 임의의 패턴이다. 단백질 발현은 이의 일시적, 공간상, 발생상 또는 형태학적 품질, 및 정량적 또는 정성적 표시를 특징으로 할 수 있다.
촉진자는 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자의 발현을 조정하기 위한 조절 요소로서 유용하다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "촉진자"는 일반적으로 전사를 개시시키기 위해 RNA 중합효소 II 및 다른 단백질, 예컨대 트랜스 작용성 전사 인자의 인식 및 결합에 관여된 DNA 분자를 의미한다. 촉진자는 초기에 유전자의 게놈 카피의 5' 비번역된 영역(5' UTR)으로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, 촉진자는 합성으로 생성되거나 조작된 DNA 분자일 수 있다. 촉진자는 또한 키메라일 수 있다. 키메라 촉진자는 2개 이상의 비상동성 DNA 분자의 융합을 통해 생성된다. 본 발명을 실행하는 데 유용한 촉진자는 서열 번호 2, 5, 8, 11 및 14 중 임의의 서열 내에 포함된 촉진자 요소, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다. 본 발명의 구체적인 실시형태에서, 청구된 DNA 분자 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 이의 변이체 또는 유도체는 촉진자 활성을 포함하는 것으로 추가로 정의되고, 즉 숙주 세포에서, 예컨대 형질전환 식물에서 촉진자로서 작용할 수 있다. 훨씬 추가의 구체적인 실시형태에서, 단편은 이것이 유래된 시작 촉진자 분자가 보유한 촉진자 활성을 나타내는 것으로 정의될 수 있거나, 단편은 전사의 기준 수준을 제공하고 TATA 박스로 이루어진 "최소 촉진자", 다른 공지된 전사 인자 결합 부위 모티프, 또는 전사의 개시를 위한 RNA 중합효소 II 복합체의 인식 및 결합을 위한 동등한 DNA 서열을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 촉진자 서열의 단편이 제공된다. 촉진자 단편은 상기 기재된 바와 같은 촉진자 활성을 포함할 수 있고, 단독으로 또는 예컨대 키메라 촉진자를 작제하는 데 있어서 다른 촉진자 및 촉진자 단편과 조합되어, 또는 다른 EXP 및 EXP 단편과 조합되어 유용할 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 촉진자 활성을 갖는 DNA 분자의 적어도 약 50개, 적어도 약 75개, 적어도 약 95개, 적어도 약 100개, 적어도 약 125개, 적어도 약 150개, 적어도 약 175개, 적어도 약 200개, 적어도 약 225개, 적어도 약 250개, 적어도 약 275개, 적어도 약 300개, 적어도 약 500개, 적어도 약 600개, 적어도 약 700개, 적어도 약 750개, 적어도 약 800개, 적어도 약 900개, 또는 적어도 약 1000개의 이상의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는 촉진자의 단편이 제공된다. 소정의 실시형태에서, 본 발명은 전장 서열의 활성을 갖는 서열 번호 1 내지 15의 임의의 것의 단편을 제공한다. 시작 촉진자 분자로부터 이러한 단편을 제조하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
내부 또는 5' 결실과 같은 서열 번호 2, 5, 8, 11 및 14 중 임의의 서열 내에 포함된 임의의 촉진자 요소로부터 유래된 조성물은 예를 들어 발현에 양성 또는 음성 효과를 갖는 제거 구성요소; 발현에 양성 또는 음성 효과를 갖는 중복 구성요소; 및/또는 발현에 조직 또는 세포 특이적 효과를 갖는 중복 또는 제거 구성요소를 포함하여, 발현을 개선하거나 변경하기 위해 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. TATA 박스 구성요소 또는 이의 동등한 서열 및 하류 서열이 제거된 3' 결실을 포함하는 서열 번호 2, 5, 8, 11 및 14 중 임의의 서열 내에 포함된 임의의 촉진자 요소로부터 유래된 조성물은 예를 들어 증강자 요소를 만들기 위해 사용될 수 있다. 추가의 결실은 발현에 양성 또는 음성; 조직 특이적; 세포 특이적; 또는 시기 특이적(예컨대, 생체리듬(이들로 제한되지는 않음)) 효과를 갖는 임의의 구성요소를 제거하도록 이루어질 수 있다. 서열 번호 2, 5, 8, 11 및 14 중 임의의 서열 내에 포함된 임의의 촉진자 요소 및 이로부터 유래된 단편 또는 증강자는 키메라 전사 조절 요소 조성물을 만들기 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 촉진자 또는 촉진자 단편은 공지된 촉진자 요소, 즉 DNA 서열 특징, 예컨대 TATA 박스 및 다른 공지된 전사 인자 결합 부위 모티프의 존재에 대해 분석될 수 있다. 이러한 공지된 촉진자 요소의 확인은 원래의 촉진자와 유사한 발현 패턴을 갖는 촉진자의 변이체를 설계하기 위해 당해 분야의 숙련자에 의해 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "리더"는 비번역된 5' 영역(5' UTR) 유전자로부터 단리되고, 전사 시작 부위(transcription start site: TSS)와 단백질 코딩 서열 시작 부위 사이의 뉴클레오타이드 분절로서 일반적으로 정의된 DNA 분자를 의미한다. 대안적으로, 리더는 합성으로 제조되거나 조작된 DNA 요소일 수 있다. 리더는 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자의 발현을 조정하기 위한 5' 조절 요소로서 사용될 수 있다. 리더 분자는 비상동성 촉진자 또는 이의 네이티브 촉진자와 사용될 수 있다. 본 발명을 실행하는 데 유용한 리더는 서열 번호 3, 6, 9, 12 및 15, 또는 서열 번호 1, 4, 7, 10 및 13 중 임의의 서열 내에 포함된 임의의 리더 요소 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 이러한 DNA 서열은 예를 들어 형질전환 식물 세포를 포함하는 숙주 세포에서 리더로서 작용할 수 있는 것으로 정의될 수 있다. 일 실시형태에서, 이러한 서열은 리더 활성을 포함하는 것으로 해독된다.
서열 번호 3, 6, 9, 12 및 15, 또는 서열 번호 1, 4, 7, 10 및 13 중 임의의 서열 내에 포함된 임의의 리더 요소로서 제시된 리더 서열(5' UTR이라고도 칭함)은 조절 요소를 포함할 수 있거나, 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자의 전사 또는 번역에 효과를 가질 수 있는 2차 구조를 채택할 수 있다. 서열 번호 3, 6, 9, 12 및 15, 또는 서열 번호 1, 4, 7, 10 및 13 중 임의의 서열 내에 포함된 임의의 리더 요소로서 제시된 리더 서열은 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자의 전사 또는 번역에 영향을 미치는 키메라 조절 요소를 만들도록 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "인트론"은 유전자로부터 단리되거나 확인될 수 있고, 번역 전에 메신저 RNA(mRNA) 가공 동안 스플라이싱된 영역으로서 일반적으로 정의될 수 있는 DNA 분자를 의미한다. 대안적으로, 인트론은 합성으로 제조되거나 조작된 DNA 요소일 수 있다. 인트론은 작동 가능하게 연결된 유전자의 전사에 영향을 미치는 증강자 요소를 함유할 수 있다. 인트론은 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자의 발현을 조정하기 위한 조절 요소로서 사용될 수 있다. 작제물은 인트론을 포함할 수 있고, 인트론은 전사 가능한 DNA 분자와 관련하여 비상동성이거나 그렇지 않을 수 있다. 당해 분야에서 인트론의 예는 쌀 액틴 인트론 및 옥수수 HSP70 인트론을 포함한다.
식물에서, 유전자 작제물에서의 몇몇 인트론의 포함은 인트론이 결여된 작제물에 비해 증가한 mRNA 및 단백질 축적을 발생시킨다. 이 효과는 유전자 발현의 "인트론 매개된 증대"(intron mediated enhancement: IME)라 불린다. 식물에서 발현을 자극하는 것으로 공지된 인트론은 옥수수 유전자(예를 들어, tubA1, Adh1, Sh1 및 Ubi1), 쌀 유전자(예를 들어, tpi) 및 피튜니아(예를 들어, rbcS), 감자(예를 들어, st-ls1) 및 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)(예를 들어, ubq3 및 pat1)로부터의 것과 같은 쌍떡잎식물 식물 유전자에서 확인된다. 인트론의 스플라이스 부위 내의 결실 또는 돌연변이가 유전자 발현을 감소시키는 것으로 밝혀져서, 스플라이싱이 IME에 필요하다는 것을 나타낸다. 그러나, 쌍떡잎식물 식물에서의 IME는 에이. 탈리아나로부터의 pat1 유전자의 스플라이스 부위 내의 점 돌연변이로 나타났다. 하나의 식물에서의 동일한 인트론의 다수의 사용은 단점을 나타내는 것으로 나타났다. 이러한 경우에, 적절한 재조합 DNA 요소의 작제를 위한 기본적인 제어 요소의 수집을 갖는 것이 필요하다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "3' 전사 종결 분자", "3' 비번역된 영역" 또는 "3' UTR"은 mRNA 분자의 3' 부분의 비번역된 영역으로의 전사 동안 사용된 DNA 분자를 의미한다. mRNA 분자의 3' 비번역된 영역은 폴리A 꼬리로서 또한 공지된 특이적 절단 및 3' 폴리아데닐화에 의해 생성될 수 있다. 3' UTR은 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결되고 이의 하류에 위치할 수 있고, 전사, mRNA 가공 또는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 폴리아데닐화 신호 및 다른 조절 신호를 포함할 수 있다. 폴리A 꼬리는 mRNA 안정성 및 번역의 개시에서 작용하는 것으로 생각된다. 당해 분야에서의 3' 전사 종결 분자의 예는 노팔린 합성효소 3' 영역; 밀 hsp17 3' 영역, 완두콩 루비스코 작은 아단위 3' 영역, 면 E6 3' 영역 및 코익신(coixin) 3' UTR이다.
3' UTR은 통상적으로 특이적 DNA 분자의 재조합 발현을 위한 유리한 용도를 발견한다. 약한 3' UTR은 리드-쓰루(read-through)를 생성할 가능성을 갖고, 이것은 이웃하는 발현 카세트에 위치한 DNA 분자의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 전사 종결의 적절한 제어는 하류에 위치한 DNA 서열(예를 들어, 다른 발현 카세트)로의 리드-쓰루를 방지할 수 있고, 유전자 발현을 개선하기 위해 RNA 중합효소의 효율적인 재순환을 추가로 허용할 수 있다. 전사의 효율적인 종결(DNA로부터의 RNA 중합효소 II의 방출)은 전사의 재개시에 전제조건이고, 이로써 전체 전사체 수준에 직접적으로 영향을 미친다. 전사 종결에 후속하여, 성숙 mRNA는 합성의 부위로부터 방출되고, 주형은 세포질로 운반된다. 진핵생물 mRNA는 생체내 폴리(A) 형태로서 축적되어서, 종래의 방법에 의해 전사 종결 부위를 결정하는 것이 어렵게 한다. 그러나, 생물정보 방법에 의한 기능적 및 효율적인 3' UTR의 예측은 효과적인 3' UTR의 용이한 예측을 허용하는 보존된 DNA 서열이 없으므로 어렵다.
실현 가능한 관점으로부터, 발현 카세트에서 사용된 3' UTR이 하기 특징을 보유한다는 것이 통상적으로 유리하다. 3' UTR은 전이유전자의 전사를 효율적으로 및 효과적으로 종결시키고 임의의 이웃하는 DNA 서열(하나의 전사체 DNA(T-DNA)에 있는 다수의 발현 카세트의 경우에서처럼 또 다른 발현 카세트를 포함할 수 있음), 또는 T-DNA가 삽입된 이웃하는 염색체 DNA로의 전사체의 리드-쓰루를 막을 수 있어야 한다. 3' UTR은 DNA 분자의 발현을 추진시키도록 사용되는 촉진자, 리더, 증강자 및 인트론에 의해 부여된 전사 활성의 감소를 발생시키지 않아야 한다. 식물 생물공학에서, 3' UTR은 대개 형질전환된 식물로부터 추출된 역전사된 RNA의 증폭 반응의 프라이밍에 사용되고, (1) 식물 염색체로 통합되면 발현 카세트의 전사 활성 또는 발현을 평가하기 위해; (2) 식물 DNA 내의 삽입의 카피 수를 평가하기 위해; 그리고 (3) 육종 후 생성된 종자의 접합성(zygosity)을 평가하기 위해 사용된다. 3' UTR은 또한 삽입된 카세트의 비손상성(intactness)을 규명하기 위해 형질전환된 식물로부터 추출된 DNA의 증폭 반응에 사용된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "증강자" 또는 "증강자 요소"는 전체 발현 패턴의 양태를 부여하지만, 보통 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자의 전사를 추진시키도록 단독으로 불충분한, 시스-요소로도 공지된 시스 작용성 조절 요소를 의미한다. 촉진자와 달리, 증강자 요소는 보통 전사 시작 부위(TSS) 또는 TATA 박스 또는 동등한 DNA 서열을 포함하지 않는다. 촉진자 또는 촉진자 단편은 작동 가능하게 연결된 DNA 서열의 전사에 영향을 미치는 하나 이상의 증강자 요소를 자연에서 포함할 수 있다. 증강자 요소는 또한, 유전자 발현의 전체 조정의 양태를 부여하는, 키메라 촉진자 시스-요소를 생성하기 위한 촉진자에 융합될 수 있다. 메디카고 트룬카툴라 광 수확 복합 단백질 b2 전구체 유전자 촉진자로부터 유래된 증강자 요소의 예는 서열 번호 16으로서 제공된다.
많은 촉진자 증강자 요소는 DNA-결합 단백질을 결합시키고/시키거나, DNA 위상기하학에 영향을 미쳐서, DNA 주형으로의 RNA 중합효소의 접근을 선택적으로 허용하거나 제한하거나, 전사 개시의 부위에서의 이중 나선의 선택적 개방을 수월하게 하는 국소 입체배좌를 생성하는 것으로 생각된다. 증강자 요소는 전사를 조절하는 전사 인자를 결합시키도록 작용할 수 있다. 몇몇 증강자 요소는 하나 초과의 전사 인자를 결합시키고, 전사 인자는 하나 초과의 증강자 도메인과 상이한 친화도로 상호작용할 수 있다. 증강자 요소는 결실 분석, 즉 촉진자에 내부 또는 5' 말단으로부터의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실; DNase I 풋프린팅을 이용한 DNA 결합 단백질 분석, 메틸화 간섭, 전기영동 이동도-이동 검정, 결찰 매개된 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의한 생체내 게놈 풋프린팅 및 다른 종래의 검정; 또는 종래의 DNA 서열 비교 방법과 함께 표적 서열 또는 표적 모티프로서 공지된 시스-요소 모티프 또는 증강자 요소를 사용한 DNA 서열 유사성 분석, 예컨대 BLAST를 포함하는 다수의 기법에 의해 확인될 수 있다. 증강자 도메인의 미세한 구조는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 돌연변이유발(또는 치환) 또는 당해 분야에 공지된 다른 종래의 방법에 의해 추가로 연구될 수 있다. 증강자 요소는 화학 합성에 의해 또는 이러한 요소를 포함하는 조절 요소로부터의 단리에 의해 얻어질 수 있고, 이들은 하위서열 조작을 수월하게 하도록 유용한 제한 효소 부위를 함유하는 추가 플랭킹 뉴클레오타이드에 의해 합성될 수 있다. 따라서, 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자의 발현을 조정하기 위해 본 명세서에 개시된 방법에 따른 증강자 요소의 설계, 구성 및 사용은 본 발명에 의해 포함된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "키메라"는 제1 DNA 분자도 제2 DNA 분자도 보통 그 구성에서 발견되지 않는 경우(즉, 다른 것에 융합) 제1 DNA 분자를 제2 DNA 분자에 융합함으로써 생성된 단일 DNA 분자를 의미한다. 키메라 DNA 분자는 따라서 달리 자연에서 보통 발견되지 않는 새로운 DNA 분자이다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "키메라 촉진자"는 DNA 분자의 이러한 조작을 통해 생성된 촉진자를 의미한다. 키메라 촉진자는 2개 이상의 DNA 단편을 조합할 수 있다; 예를 들어, 증강자 요소에 대한 촉진자의 융합. 따라서, 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자의 발현을 조정하기 위한 본 명세서에 개시된 방법에 따른 키메라 촉진자의 설계, 구성 및 사용은 본 발명에 의해 포함된다.
키메라 조절 요소는 당해 분야에 공지된 다양한 방법, 예컨대 제한 효소 분해 및 결찰, 결찰 독립적 클로닝, 증폭 동안 PCR 산물의 모듈식 어셈블리 또는 조절 요소의 직접적인 화학 합성, 및 당해 분야에 공지된 다른 방법에 의해 작동 가능하게 연결될 수 있는 다양한 구성성분을 포함하도록 설계될 수 있다. 생성된 다양한 키메라 조절 요소는 이들, 또는 이들의 변이체, 구성성분 부분이 작동 가능하게 연결되도록 허용하는 DNA 서열 또는 서열들을 연결하는 것을 포함하는 DNA 서열 또는 DNA 서열들에서 다른 구성성분 요소로 이루어질 수 있다. 본 발명에서, 서열 번호 1 내지 15로서 제공된 DNA 서열은 조절 요소 기준 서열을 제공할 수 있고, 기준 서열을 포함하는 구성성분 요소는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 연결될 수 있고, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 결실, 및/또는 삽입 또는 박테리아 및 식물 세포 형질전환에서 자연에서 발생하는 돌연변이를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "변이체"는 제1 DNA 분자와 조성이 유사하지만 동일하지 않는 제2 DNA 분자, 예컨대 조절 요소를 의미하고, 여기서 제2 DNA 분자는 예를 들어 제1 DNA 분자의 더 많거나 적거나 동등한 전사 활성을 통해 일반적인 기능성, 즉 동일한 또는 유사한 발현 패턴을 여전히 유지한다. 변이체는 제1 DNA 분자의 더 짧거나 절두된 버전 및/또는 제1 DNA 분자의 서열의 변경된 버전, 예컨대 상이한 제한 효소 부위 및/또는 내부 결실, 치환, 및/또는 삽입을 갖는 것일 수 있다. "변이체"는 또한 기준 서열의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 조절 요소를 포함할 수 있고, 유도체 조절 요소는 상응하는 모 조절 분자보다 더 많거나 적거나 동등한 전사 또는 번역 활성을 갖는다. 조절 요소 "변이체"는 또한 박테리아 및 식물 세포 형질전환에서 자연에서 발생하는 돌연변이로부터 생긴 변이체를 포함할 것이다. 본 발명에서, 서열 번호 1 내지 15로서 제공된 폴리뉴클레오타이드 서열은, 원래의 조절 요소의 일반적인 기능성, 즉 동일한 또는 유사한 발현 패턴을 여전히 유지하면서, 원래의 조절 요소의 DNA 서열과 조성이 유사하지만, 동일하지 않은 변이체를 생성하도록 사용될 수 있다. 본 발명의 이러한 변이체의 생성은 본 개시내용의 견지에서 당해 분야의 보통의 기술 내에 잘 있고, 본 발명의 범위 내에 포함된다.
"단리된 DNA 분자"에 대한 본 출원에서의 언급 또는 동등한 용어 또는 구절은 DNA 분자가 단독으로 또는 다른 조성물과 조합되어 존재하지만, 이의 천연 환경 내에 없는 것이라는 것을 의미하도록 의도된다. 예를 들어, 유기체의 게놈의 DNA 내에 자연에서 발견되는 핵산 요소, 예컨대 코딩 서열, 인트론 서열, 비번역된 리더 서열, 촉진자 서열, 전사 종결 서열 등은, 요소가 유기체의 게놈 내에 및 이것이 자연에서 발견되는 게놈 내의 위치에 있는 한, "단리된" 것으로 생각되지 않는다. 그러나, 이들 요소의 각각 및 이들 요소의 하위부분은, 요소가 유기체의 게놈 내에 및 이것이 자연에서 발견되는 게놈 내의 위치에 있지 않은 한, 본 개시내용의 범위 내에 "단리"될 것이다. 본 개시내용의 목적을 위해, 임의의 형질전환 뉴클레오타이드 서열, 즉 식물 또는 박테리아의 세포의 게놈으로 삽입되거나 염색체외 벡터에 존재하는 DNA의 뉴클레오타이드 서열은, 이것이 식물 또는 박테리아의 게놈 내에 세포를 형질전환하도록 사용된 플라스미드 또는 유사한 구조 내에 존재하든, 또는 식물 또는 박테리아로부터 유래된 조직, 자손, 생물학적 샘플 또는 상품 산물에 검출 가능한 양으로 존재하든, 단리된 뉴클레오타이드 서열인 것으로 생각될 것이다.
특정한 전이유전자의 원하는 발현 양태에 대한 본 명세서에 기재된 변형, 중복 또는 결실의 효율은 출발 DNA 분자에서 이루어진 변경 및 이것의 변경의 목표에 따라 변할 수 있는 결과를 검증하도록 안정적이고 일시적인 식물 검정, 예컨대 본 명세서에서의 작업 실시예에 기재된 것에서 경험적으로 시험될 수 있다.
작제물
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "작제물"은, DNA 분자를 포함하는, 게놈 통합 또는 자율 복제할 수 있는, 임의의 공급원으로부터 유래된, 임의의 재조합 DNA 분자, 예컨대 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 파지, 또는 선형 또는 원형 DNA 또는 RNA 분자(여기서, 적어도 하나의 DNA 분자가 기능적으로 작동 가능한 방식으로 또 다른 DNA 분자에 연결된, 즉 작동 가능하게 연결됨)를 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "벡터"는 형질전환, 즉 숙주 세포로의 비상동성 DNA 또는 RNA의 도입의 목적을 위해 사용될 수 있는 임의의 작제물을 의미한다. 작제물은 통상적으로 하나 이상의 발현 카세트를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바대로, "발현 카세트"는 하나 이상의 조절 요소, 통상적으로 적어도 촉진자 및 3' UTR에 작동 가능하게 연결된 적어도 전사 가능한 DNA 분자를 포함하는 DNA 분자를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 제2 DNA 분자에 연결된 제1 DNA 분자를 의미하고, 제1 DNA 분자 및 제2 DNA 분자는 제1 DNA 분자가 제2 DNA 분자의 기능에 영향을 미치도록 배열된다. 2개의 DNA 분자는 단일 인접 DNA 분자의 일부일 수 있거나 그렇지 않을 수 있고, 인접하거나 그렇지 않을 수 있다. 예를 들어, 촉진자는, 촉진자가 세포에서 관심 대상의 전사 가능한 DNA 분자의 전사를 조정하는 경우, 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된다. 리더는 예를 들어 DNA 서열의 전사 또는 번역에 영향을 미칠 수 있을 때 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된다.
본 발명의 작제물은, 일 실시형태에서, 에이. 투메파시엔스 세포에 의해 제공된 전달 분자와 함께 식물 세포의 게놈으로의 T-DNA의 통합을 허용하는 T-DNA를 포함하는 아그로박테륨 투메파시엔스로부터 단리된 Ti 플라스미드의 오른쪽 보더(RB 또는 AGRtu.RB) 및 왼쪽 보더(LB 또는 AGRtu.LB) 영역을 갖는 이중 종양 유도(Ti) 플라스미드 보더 작제물로서 제공될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,603,061호 참조). 작제물은 또한 박테리아 세포에서 복제 기능 및 항생제 선택을 제공하는 플라스미드 골격 DNA 분절, 예를 들어 복제의 에스체리치아 콜라이 기원, 예컨대 ori322, 복제의 넓은 숙주 범위 기원, 예컨대 oriV 또는 oriRi, 및 스펙티노마이신 또는 스트렙토마이신에 내성을 부여하는 Tn7 아미노글라이코사이드 아데닐전환효소(aadA)를 코딩하는 Spec/Strp와 같은 선택 가능한 마커에 대한 코딩 영역, 또는 겐타마이신(Gm, Gent) 선택 가능한 마커 유전자를 함유할 수 있다. 식물 형질전환에 대해, 숙주 박테리아 균주는 대개 에이. 투메파시엔스 ABI, C58 또는 LBA4404이지만; 식물 형질전환의 분야의 숙련자에게 공지된 다른 균주는 본 발명에서 작용할 수 있다.
전사 가능한 DNA 분자가 단백질로서 번역되고 발현되는 기능성 mRNA 분자로 전사되는 방식으로 작제물을 조립하고 이것을 세포로 도입하기 위한 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 본 발명의 실행을 위해, 작제물 및 숙주 세포를 제조하고 사용하기 위한 종래의 조성물 및 방법은 당해 분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있다. 고등 식물에서 핵산의 발현에 유용한 통상적인 벡터는 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 아그로박테륨 투메파시엔스 및 pCaMVCN 전달 제어 벡터의 Ti 플라스미드로부터 유리된 벡터를 포함한다.
다양한 조절 요소는 본 명세서에 제공된 임의의 것을 포함하여 작제물에 포함될 수 있다. 임의의 이러한 조절 요소는 다른 조절 요소와 조합되어 제공될 수 있다. 이러한 조합은 원하는 조절 특징을 생성하도록 설계되거나 변형될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 작제물은 3' UTR에 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 조절 요소를 포함한다.
본 발명의 작제물은 본 명세서에 제공되거나 당해 분야에 공지된 임의의 촉진자 또는 리더를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 촉진자는 비상동성 비번역된 5' 리더, 예컨대 열 쇼크 단백질 유전자로부터 유래된 것에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 리더는 비상동성 촉진자, 예컨대 양배추 모자이크 바이러스 35S 전사체 촉진자에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
발현 카세트는 또한 특히 엽록체, 백색체, 또는 다른 색소체 세포소기관; 미토콘드리아; 퍼옥시좀; 액포; 또는 세포외 위치에 작동 가능하게 연결된 단백질을 표적화하는 suB 세포에 유용한 펩타이드를 코딩하는 운반 펩타이드 코딩 서열을 포함할 수 있다. 많은 엽록체 국재화 단백질은 전구체로서 핵 유전자로부터 발현되고, 엽록체 운반 펩타이드(CTP)에 의해 엽록체로 표적화된다. 이러한 단리된 엽록체 단백질의 예는 리불로스-1,5-비스포스페이트 카복실라제의 작은 아단위(SSU)와 연관된 것, 페레독신, 페레독신 산화환원효소, 광 수확 복합 단백질 I 및 단백질 II, 티오레독신 F 및 엔올피류빌 시키메이트 포스페이트 합성효소(EPSPS)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 엽록체 운반 펩타이드는 예를 들어 미국 특허 제7,193,133호에 기재되어 있다. 비엽록체 단백질이 비엽록체 단백질을 코딩하는 전이유전자에 작동 가능하게 연결된 비상동성 CTP의 발현에 의해 엽록체로 표적화될 수 있다는 것이 입증되었다.
전사 가능한 DNA 분자
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "전사 가능한 DNA 분자"는 단백질 코딩 서열을 갖는 것 및 유전자 억제에 유용한 서열을 갖는 RNA 분자를 생성하는 것(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 RNA 분자로 전사될 수 있는 임의의 DNA 분자를 의미한다. DNA 분자의 유형은 동일한 식물로부터의 DNA 분자, 또 다른 식물로부터의 DNA 분자, 상이한 유기체로부터의 DNA 분자 또는 합성 DNA 분자, 예컨대 유전자의 안티센스 메시지를 함유하는 DNA 분자, 또는 전이유전자의 인공, 합성 또는 달리 변형된 버전을 코딩하는 DNA 분자를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 발명의 작제물로의 도입을 위한 예시적인 전사 가능한 DNA 분자는 예를 들어 DNA 분자가 도입된 종과 다른 종으로부터의 DNA 분자 또는 유전자 또는 동일한 종으로부터 기원하거나 이것에 존재하지만, 전통적인 육종 기법보다 유전자 조작 방법에 의해 수혜자 세포로 도입된, 유전자를 포함한다.
"전이유전자"는 숙주 세포 게놈에서 적어도 이의 위치와 관련하여 숙주 세포에 비상동성인 전사 가능한 DNA 분자 및/또는 현재의 또는 임의의 이전의 세포의 생성에서 숙주 세포의 게놈으로 인공으로 도입된 전사 가능한 DNA 분자를 의미한다.
본 발명의 조절 요소, 예컨대 촉진자는 조절 요소와 관련하여 비상동성인 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "비상동성"은 2개 이상의 DNA 분자의 조합이 보통 자연에서 발견되지 않을 때 이러한 조합을 의미한다. 예를 들어, 2개의 DNA 분자는 상이한 종으로부터 유래될 수 있고/있거나, 2개의 DNA 분자는 상이한 유전자, 예를 들어 동일한 종으로부터의 상이한 유전자 또는 상이한 종으로부터의 동일한 유전자로부터 유래될 수 있다. 조절 요소는 따라서, 이러한 조합이 자연에서 보통 발견되지 않는 경우, 즉 전사 가능한 DNA 분자가 조절 요소에 작동 가능하게 연결되어 자연에서 발생하지 않는 경우, 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자와 관련하여 비상동성이다.
전사 가능한 DNA 분자는 일반적으로 전사체의 발현의 원해지는 임의의 DNA 분자일 수 있다. 전사체의 이러한 발현은 생성된 mRNA 분자의 번역, 및 이에 따라 단백질 발현을 발생시킬 수 있다. 대안적으로, 예를 들어 전사 가능한 DNA 분자는 특정한 유전자 또는 단백질의 감소한 발현을 궁극적으로 발생시키도록 설계될 수 있다. 일 실시형태에서, 이것은 안티센스 방향으로 배향된 전사 가능한 DNA 분자를 사용함으로써 달성될 수 있다. 당해 분야의 숙련자는 이러한 안티센스 기술을 이용하는 것에 친숙하다. 임의의 유전자는 이러한 방식으로 부정적으로 조절될 수 있고, 일 실시형태에서, 전사 가능한 DNA 분자는 dsRNA, siRNA 또는 miRNA 분자의 발현을 통해 특정한 유전자의 억제를 위해 설계될 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 실시형태는 본 발명의 조절 요소를 포함하는 재조합 DNA 분자, 예컨대 작제물이 형질전환 식물 세포의 게놈에서 통합될 때 원하는 수준에서 또는 원하는 패턴으로 전사 가능한 DNA 분자의 전사를 조정하도록 비상동성 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된 서열 번호 1 내지 15로서 제공된 것이다. 일 실시형태에서, 전사 가능한 DNA 분자는 유전자의 단백질 코딩 영역을 포함하고, 또 다른 실시형태에서 전사 가능한 DNA 분자는 유전자의 안티센스 영역을 포함한다.
작물학적 관심 대상의 유전자
전사 가능한 DNA 분자는 작물학적 관심 대상의 유전자일 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "작물학적 관심 대상의 유전자"는, 특정한 식물 조직, 세포 또는 세포 유형에서 발현될 때, 원하는 특징을 부여하는 전사 가능한 DNA 분자를 의미한다. 작물학적 관심 대상의 유전자의 산물은 식물 형태학, 생리학, 성장, 발육, 수율, 곡물 조성, 영양학적 프로필, 질환 또는 내충성, 및/또는 환경적 또는 화학적 관용성에 효과를 야기하도록 식물 내에 작용할 수 있거나, 식물을 먹는 해충의 식이에서 살충제로서 작용할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명의 조절 요소는 조절 요소가 작물학적 관심 대상의 유전자인 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결되도록 작제물로 도입된다. 이러한 작제물을 함유하는 형질전환 식물에서, 작물학적 관심 대상의 유전자의 발현은 유리한 작물학적 특질을 부여할 수 있다. 유리한 작물학적 특질은 제초제 저항성, 방제, 변형된 수율, 질환 저항, 병원균 내성, 변형된 식물 성장 및 발육, 변형된 전분 함량, 변형된 오일 함량, 변형된 지방산 함량, 변형된 단백질 함량, 변형된 과일 성숙, 증대된 동물 및 인간 영양, 바이오중합체 생성, 환경학적 스트레스 저항, 약제학적 펩타이드, 개선된 가공 품질, 개선된 풍미, 하이브리드 종자 생성 이용성, 개선된 섬유 생성 및 원하는 바이오연료 생성을 포함할 수 있지만, 예를 들어 이들로 제한되지는 않는다.
당해 분야에 공지된 작물학적 관심 대상의 유전자의 예는 제초제 저항성(미국 특허 제6,803,501호; 제6,448,476호; 제6,248,876호; 제6,225,114호; 제6,107,549호; 제5,866,775호; 제5,804,425호; 제5,633,435호; 및 제5,463,175호), 증가한 수율(미국 특허 제USRE38,446호; 제6,716,474호; 제6,663,906호; 제6,476,295호; 제6,441,277호; 제6,423,828호; 제6,399,330호; 제6,372,211호; 제6,235,971호; 제6,222,098호; 및 제5,716,837호), 방제(미국 특허 제6,809,078호; 제6,713,063호; 제6,686,452호; 제6,657,046호; 제6,645,497호; 제6,642,030호; 제6,639,054호; 제6,620,988호; 제6,593,293호; 제6,555,655호; 제6,538,109호; 제6,537,756호; 제6,521,442호; 제6,501,009호; 제6,468,523호; 제6,326,351호; 제6,313,378호; 제6,284,949호; 제6,281,016호; 제6,248,536호; 제6,242,241호; 제6,221,649호; 제6,177,615호; 제6,156,573호; 제6,153,814호; 제6,110,464호; 제6,093,695호; 제6,063,756호; 제6,063,597호; 제6,023,013호; 제5,959,091호; 제5,942,664호; 제5,942,658호; 제5,880,275호; 제5,763,245호; 및 제5,763,241호), 균류 질환 내성(미국 특허 제6,653,280호; 제6,573,361호; 제6,506,962호; 제6,316,407호; 제6,215,048호; 제5,516,671호; 제5,773,696호; 제6,121,436호; 제6,316,407호; 및 제6,506,962호), 바이러스 내성(미국 특허 제6,617,496호; 제6,608,241호; 제6,015,940호; 제6,013,864호; 제5,850,023호; 및 제5,304,730호), 선충 내성(미국 특허 제6,228,992호), 박테리아 질환 내성(미국 특허 제5,516,671호), 식물 성장 및 발육(미국 특허 제6,723,897호 및 제6,518,488호), 전분 생성(미국 특허 제6,538,181호; 제6,538,179호; 제6,538,178호; 제5,750,876호; 제6,476,295), 변형된 오일 생성(미국 특허 제6,444,876호; 제6,426,447호; 및 제6,380,462호), 고 오일 생성(미국 특허 제6,495,739호; 제5,608,149호; 제6,483,008호; 및 제6,476,295호), 변형된 지방산 함량(미국 특허 제6,828,475호; 제6,822,141호; 제6,770,465호; 제6,706,950호; 제6,660,849호; 제6,596,538호; 제6,589,767호; 제6,537,750호; 제6,489,461호; 및 제6,459,018호), 고 단백질 생성(미국 특허 제6,380,466호), 과일 숙성(미국 특허 제5,512,466호), 증대된 동물 및 인간 영양(미국 특허 제6,723,837호; 제6,653,530호; 제6,5412,59호; 제5,985,605호; 및 제6,171,640호), 바이오중합체(미국 특허 USRE37,543; 제6,228,623호; 및 제5,958,745호 및 제6,946,588호), 환경 스트레스 저항(미국 특허 제6,072,103호), 약제학적 펩타이드 및 분비 가능한 펩타이드(미국 특허 제6,812,379호; 제6,774,283호; 제6,140,075호; 및 제6,080,560호), 변형된 가공 특질(미국 특허 제6,476,295호), 개선된 분해성(미국 특허 제6,531,648호), 저 라피노스(미국 특허 제6,166,292호), 산업용 효소 생성(미국 특허 제5,543,576호), 개선된 풍미(미국 특허 제6,011,199호), 질소 고정(미국 특허 제5,229,114호), 하이브리드 종자 생성(미국 특허 제5,689,041호), 섬유 생성(미국 특허 제6,576,818호; 제6,271,443호; 제5,981,834호; 및 제5,869,720호) 및 바이오연료 생성(미국 특허 제5,998,700호)에 대한 것을 포함한다.
대안적으로, 작물학적 관심 대상의 유전자는 예를 들어 안티센스(예를 들어 미국 특허 제5,107,065호 참조); 저해성 RNA("RNAi", 예를 들어 공개 출원 미국 제2006/0200878호 및 미국 제2008/0066206호 및 미국 특허 출원 제11/974,469호에 기재된 바와 같은 miRNA-, siRNA-, 트랜스 작용성 siRNA- 및 페이징된 sRNA 매개된 기전에 의한 유전자 발현의 조정을 포함); 또는 동시억제 매개된 기전에 의해 내인성 유전자의 유전자 발현의 표적화된 조정을 야기하는 RNA 분자를 코딩함으로써 상기 언급된 식물 특징 또는 표현형에 영향을 미칠 수 있다. RNA는 또한 원하는 내인성 mRNA 산물을 절단하도록 조작된 촉매 RNA 분자(예를 들어, 리보자임 또는 리보스위치; 예를 들어 미국 제2006/0200878호 참조)일 수 있다. 전사 가능한 DNA 분자가 유전자 억제를 야기할 수 있는 분자로 전사되는 방식으로 작제물을 작제하고 세포로 도입하기 위한 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
선택 가능한 마커
선택 가능한 마커 전이유전자는 또한 본 발명의 조절 요소와 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "선택 가능한 마커 전이유전자"는 형질전환 식물, 조직 또는 세포에서의 발현 또는 이의 결여가 몇몇 방식으로 스크리닝되거나 점수 매겨지는 임의의 전사 가능한 DNA 분자를 의미한다. 본 발명의 실행에서 사용하기 위한 선택 가능한 마커 유전자 및 이의 연관된 선택 및 스크리닝 기법은 당해 분야에 공지되어 있고, ß-글루쿠로니다제(GUS)를 코딩하는 전사 가능한 DNA 분자, 녹색 형광성 단백질(GFP), 항생제 내성을 부여하는 단백질 및 제초제 관용성을 부여하는 단백질을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 선택 가능한 마커 전이유전자의 예는 서열 번호 17로서 제공된다.
세포 형질전환
본 발명은 또한 형질전환된 세포 및 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 조절 요소를 포함하는 식물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
용어 "형질전환"은 수혜자 숙주로의 DNA 분자의 도입을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "숙주"는 박테리아, 균류, 또는 식물, 예를 들어 임의의 세포, 조직, 기관, 또는 박테리아, 균류 또는 식물의 자손을 의미한다. 특정한 관심 대상의 식물 조직 및 세포는 원형질체, 캘러스, 뿌리, 괴경, 종자, 줄기, 잎, 묘목, 배아 및 화분을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "형질전환된"은 외래 DNA 분자, 예컨대 작제물이 도입되는 세포, 조직, 기관 또는 유기체를 의미한다. 도입된 DNA 분자는 수혜자 세포, 조직, 기관 또는 유기체의 게놈 DNA로 통합될 수 있어서, 도입된 DNA 분자는 후속하는 자손에 의해 유전된다. "형질전환" 또는 "형질전환된" 세포 또는 유기체는 또한 세포 또는 유기체의 자손 및 이러한 형질전환 유기체를 교배에서 모체로서 사용하고 외래 DNA 분자의 존재로부터 생성된 변경된 표현형을 나타내는 육종 프로그램으로부터 생성된 자손을 포함할 수 있다. 도입된 DNA 분자는 또한 일시적으로 수혜자 세포로 도입될 수 있어서, 도입된 DNA 분자는 후속하는 조손에 의해 유전되지 않는다. 용어 "형질전환"은 하나 이상의 비상동성 DNA 분자를 함유하는 박테리아, 균류 또는 식물을 의미한다.
식물 세포로 DNA 분자를 도입하기 위한 당해 분야의 숙련자에게 널리 공지된 많은 방법이 있다. 상기 공정은 일반적으로 적합한 숙주 세포를 선택하는 단계, 숙주 세포를 벡터에 의해 형질전환하는 단계 및 형질전환된 숙주 세포를 수득하는 단계를 포함한다. 본 발명의 실행에서 식물 게놈으로 식물 작제물을 도입함으로써 식물 세포를 형질전환하기 위한 방법 및 재료는 임의의 널리 공지되고 입증된 방법을 포함할 수 있다. 적합한 방법은 무엇보다도 박테리아 감염(예를 들어, 아그로박테륨), 바이너리 BAC 벡터, DNA의 직접 전달(예를 들어, PEG 매개된 형질전환, 건조/저해 매개된 DNA 흡수, 전기천공, 탄화규소 섬유에 의한 아지테이션 및 DNA 코팅된 입자의 가속에 의함), 유전자 편집(예를 들어, CRISPR-Cas 시스템)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
숙주 세포는 임의의 세포 또는 유기체, 예컨대 식물 세포, 조류 세포, 조류, 균류 세포, 균류, 박테리아 세포 또는 곤충 세포일 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 숙주 세포 및 형질전환된 세포는 작물 식물로부터의 세포를 포함할 수 있다.
형질전환 식물은 후속하여 본 발명의 형질전환 식물 세포로부터 재생될 수 있다. 종래의 육종 기법 또는 자가수분을 이용하여, 종자는 이 형질전환 식물로부터 생성될 수 있다. 이러한 종자 및 이러한 종자로부터 성장한 생성된 자손 식물은 본 발명의 재조합 DNA 분자를 함유할 것이고, 따라서 형질전환일 것이다.
본 발명의 형질전환 식물은 본 발명의 동형접합성 형질전환 식물(재조합 DNA 분자에 대해 동형접합성)에 대한 종자를 제공하도록 자가수분하거나, 본 발명의 이형접합성 형질전환 식물(재조합 DNA 분자에 대해 이형접합성)에 대한 종자를 제공하도록 비형질전환 식물 또는 상이한 형질전환 식물에 의해 교배될 수 있다. 이러한 동형접합성 및 이형접합성 형질전환 식물 둘 다는 본 명세서에서 "자손 식물"이라 불린다. 자손 식물은 원래의 형질전환 식물로부터 내려오고 본 발명의 재조합 DNA 분자를 함유하는 형질전환 식물이다. 본 발명의 형질전환 식물을 사용하여 생성된 종자는 형질전환 식물, 즉 본 발명의 작제물을 포함하고 관심 대상의 작물의 유전자를 발현하는 본 발명의 자손 식물의 세대를 성장시키도록 수확되고 사용될 수 있다. 상이한 작물에 흔히 사용되는 육종 방법의 설명은 몇몇 참고문헌 책 중 하나에서 발견될 수 있고, 예를 들어 문헌[Allard, Principles of Plant Breeding, John Wiley & Sons, NY, U. of CA, Davis, CA, 50-98 (1960); Simmonds, Principles of Crop Improvement, Longman, Inc., NY, 369-399 (1979); Sneep and Hendriksen, Plant breeding Perspectives, Wageningen (ed), Center for Agricultural Publishing and Documentation (1979); Fehr, Soybeans: Improvement, Production and Uses, 2nd Edition, Monograph, 16:249 (1987); Fehr, Principles of Variety Development, Theory and Technique, (Vol. 1) 및 Crop Species Soybean (Vol. 2), Iowa State Univ., Macmillan Pub. Co., NY, 360-376 (1987)]을 참조한다.
형질전환된 식물은 관심 대상의 유전자 또는 유전자들의 존재 및 본 발명의 조절 요소에 의해 부여된 발현 수준 및/또는 프로필에 대해 분석될 수 있다. 당해 분야의 숙련자는 형질전환된 식물의 분석에 이용 가능한 많은 방법을 알고 있다. 예를 들어, 식물 분석을 위한 방법은 싸우던 블롯 또는 노던 블롯, PCR 기반 접근법, 생화학 분석, 표현형 스크리닝 방법, 임상 평가 및 면역진단학적 검정을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 전사 가능한 DNA 분자의 발현은 제조사에 의해 기재된 바와 같은 TaqMan(등록상표)(Applied Biosystems(캘리포니아주 포스터 시티)) 시약 및 방법 및 TaqMan(등록상표) 시험 매트릭스를 이용하여 결정된 PCR 사이클 시간을 이용하여 측정될 수 있다. 대안적으로, 제조사에 의해 기재된 바와 같은 Invader(등록상표)(Third Wave Technologies(위스콘신주 매디슨)) 시약 및 방법은 전이유전자 발현을 평가하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 식물의 부분을 제공한다. 식물 부분은 잎, 줄기, 뿌리, 괴경, 종자, 배젖, 밑씨 및 화분을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 발명의 식물 부분은 생존가능, 생존불가, 재생성 및/또는 비재생성일 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 DNA 분자를 포함하는 형질전환된 식물 세포를 포함하고 제공한다. 본 발명의 형질전환된 또는 형질전환 식물 세포는 재생성 및/또는 비재생성 식물 세포를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 재조합 DNA 분자를 함유하는 형질전환 식물 또는 이의 부분으로부터 생성된 상품 산물을 제공한다. 본 발명의 상품 산물은 서열 번호 1 내지 15로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 DNA의 검출 가능한 양을 함유한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "상품 산물"은 본 발명의 재조합 DNA 분자를 함유하는 형질전환 식물, 종자, 식물 세포 또는 식물 부분으로부터 유래된 재료를 포함하는 임의의 조성물 또는 생성물을 의미한다. 상품 산물은 가공된 종자, 곡물, 식물 부분 및 으깬 곡물을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 발명의 상품 산물은 본 발명의 재조합 DNA 분자에 상응하는 DNA의 검출 가능한 양을 함유할 것이다. 샘플 내의 이 DNA 중 하나 이상의 검출은 상품 산물의 함량 또는 공급원을 결정하도록 이용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 검출 방법을 포함하는 DNA 분자를 위한 검출의 임의의 표준 방법을 이용할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 대한 참조를 통해 더 용이하게 이해될 수 있고, 이 실시예는 예시로 제공되고, 달리 기재되지 않는 한, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 하기 실시예에 개시된 기법이 본 발명의 실행에서 잘 기능하도록 본 발명자들에 의해 개발된 기법을 나타낸다는 것이 당해 분야의 숙련자에 의해 이해되어야 한다. 그러나, 당해 분야의 숙련자는, 본 개시내용의 견지에서, 많은 변화가 개시된 구체적인 실시형태에서 이루어질 수 있고, 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 여전히 동일한 또는 유사한 결과를 얻고, 따라서 동반된 도면에 기재되거나 도시된 모든 주제가 예시이고 제한 의미가 아닌 것으로 해석되어야 한다는 것을 이해해야 한다.
실시예
실시예 1
조절 요소의 확인 및 클로닝
신규한 전사 조절 요소 및 조절 발현 요소군(EXP)을 확인하고, 쌍떡잎식물 종 쿠쿠미스 멜로(WSH-39-1070AN) 및 메디카고 트룬카툴라의 게놈 DNA로부터 클로닝하였다.
대두(글라이신 맥스(Glycine max)) 및 아라비돕시스에서 수행된 전사 프로파일링 실험으로부터 도출된 독점적 및 공공 마이크로어레이 데이터, 및 독점적 쿠쿠미스 멜로 및 독점적 및 공공 메디카고 트룬카툴라 서열에 대해 쿼리로서 공지된 쌍떡잎식물 서열을 사용한 상동성 기반 조사에 기초하여 전사 조절 요소를 선택하였다.
확인된 서열을 사용하여, 생물정보 분석을 수행하여 증폭된 DNA 내의 조절 요소를 확인하였다. 예를 들어, 생물정보 분석은 전사 시작 부위(TSS) 및 서열에 존재하는 임의의 이방향성, 인트론 또는 상류 코딩 서열을 확인하도록 수행되었다. 이 분석의 결과를 이용하여, 조절 요소는 조절 요소를 증폭시키도록 설계된 DNA 서열 및 프라이머 내에 한정되었다. 쿠쿠미스 멜로 및 메디카고 트룬카툴라로부터 단리된 게놈 DNA 및 고유한 제한 효소 부위를 함유하는 프라이머를 갖는 표준 중합효소 연쇄 반응 조건을 이용하여 각각의 조절 요소에 대한 상응하는 DNA 분자를 증폭시켰다. 상용성 제한 부위의 표준 제한 효소 분해 및 DNA 결찰 방법을 이용하여 기본 식물 발현 벡터로 생성된 DNA 단편을 결찰하였다.
형질전환된 식물 조직을 사용하여 조절 요소 TSS 및 인트론/엑손 스플라이스 연접부의 분석을 수행할 수 있다. 간단히 말하면, 비상동성 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된 클로닝된 DNA 단편을 포함하는 식물 발현 벡터에 의해 식물을 형질전환시켰다. 다음에, 생산된 mRNA 전사체의 DNA 서열을 분석함으로써 조절 요소 TSS 및 인트론/엑손 스플라이스 연접부를 확인하기 위해 5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, 버전 2.0(Invitrogen(캘리포니아주 92008 칼스바드))을 이용하였다.
쿠쿠미스 및 메디카고 전사 조절 발현 요소군을 코딩하는 DNA 서열 또는 리더 요소에 작동 가능하게 연결된 촉진자 요소로 이루어진 EXP 서열은 이의 상응하는 촉진자 및 리더와 함께 표 1에 제시된다.
실시예
2
안정적으로 형질전환된 대두 식물에서의 GUS 발현을 추진시키는 조절 요소의 분석
대두 식물을 β-글루쿠로니다제(GUS) 전이유전자의 발현을 추진시키는 시험 조절 요소를 함유하는 벡터, 구체적으로 식물 발현 벡터에 의해 형질전환시켰다. 발현에 대한 선택된 조절 요소의 효과를 평가하기 위해 생성된 식물을 GUS 단백질 발현에 분석하였다.
대두 식물을 표 2에 기재된 식물 GUS 발현 작제물에 의해 형질전환시켰다. 조절 요소를 당해 분야에 공지된 표준 방법을 이용하여 기본 식물 발현 벡터로 클로닝하였다. 생성된 식물 발현 벡터는 아그로박테륨 투메파시엔스로부터의 오른쪽 보더 영역(B-AGRtu.오른쪽 보더), 제초제 글라이포세이트 또는 항생제, 스펙티노마이신에 대한 내성을 부여하는 형질전환된 식물 세포의 선택에 사용된 제1 전이유전자 선택 카세트; 고시피움 바르바덴스 E6 유전자로부터의 3' 종결 영역(T-Gb.E6-3b:3b:1, 서열 번호 18)에 5' 작동 가능하게 연결된, 감자 광 유도성 조직 특이적 ST-LS1 유전자(유전자은행 기탁: X04753)로부터 유래된 가공 가능한 인트론을 함유하는 β-글루쿠로니다제(GUS, GOI-Ec.uidA+St.LS1:1:1, 서열 번호 17)에 대한 코딩 서열에 5' 작동 가능하게 연결된, EXP 서열을 포함하는 조절 요소의 활성을 평가하기 위한 제2 전이유전자 카세트; 및 아그로박테륨 투메파시엔스로부터의 왼쪽 보더 영역(B-AGRtu.왼쪽 보더)을 함유하였다.
대두 식물 세포를 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 아그로박테륨 매개된 형질전환에 의해 상기 기재된 바이너리 형질전환 벡터 작제물을 사용하여 형질전환시켰다. 생성된 형질전환된 식물 세포를 유도하여 전체 대두 식물을 형성하였다.
형질전환된 식물의 정성적 및 정량적 발현 분석에 조직화학적 GUS 분석을 이용하였다. 전체 조직 절편을 적절한 시간 길이 동안 GUS 염색 용액 X-Gluc(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-b-글루쿠로나이드)(1밀리그램/밀리리터)와 항온처리하고, 세정하고, 청색 착색에 대해 가시적으로 검사하였다. 직접적인 가시적인 검사 또는 선택된 식물 기관 및 조직을 사용한 현미경 하 검사에 의해 GUS 활성을 정성적으로 결정하였다.
GUS 발현의 정량적 분석을 위해, 형질전환된 대두 식물의 선택된 조직으로부터 전체 단백질을 추출하였다. 1마이크로그램의 전체 단백질을 50마이크로리터의 전체 반응 용적 중에 형광원성 기질 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루쿠로나이드(MUG)와 사용하였다. 4-메틸움벨리페론(4-MU)인 반응 생성물은 고 pH에서 최대로 형성성이고, 여기서 하이드록실기는 이온화된다. 탄산나트륨의 염기성 용액의 첨가는 동시에 검정을 중단시키고 형광성 생성물을 정량화하기 위해 pH를 조정하였다. 여기 2㎚ 및 방출 3㎚에서 설정된 슬릿 폭으로 마이크로맥스 판독기를 갖는 플루오로맥스-3을 사용하여 365㎚에서의 여기, 445㎚에서의 방출에 의해 형광을 측정하였다. 값은 n㏖ GUS/시간/mg 전체 단백질의 단위로 제공된다.
R0 세대에서 GUS 발현에 대해 하기 조직을 샘플링하였다; Vn5 단계 침하 잎, 근원 잎 및 뿌리; R1 단계 잎자루, 근원 잎, 꽃 및 떡잎; R3 단계 꼬투리 및 미숙 종자; 및 황색 꼬투리 단계 배아 및 떡잎. 하기 표 3 및 표 4는 표 2에 제시된 조절 요소에 의해 추진된 샘플링된 조직의 각각에 대한 평균 정량적 GUS 발현을 보여준다.
표 3 및 표 4에서 볼 수 있는 것처럼, 조절 요소의 각각은 샘플링된 조직에서 고유한 발현 패턴을 갖는다. EXP-CUCme.Fe2:1(서열 번호 1) 및 EXP-CUCme.CipLhcb:1(서열 번호 4) 둘 다는 R3 꼬투리에서 매우 발현하고, R3 미숙 종자, Vn5 뿌리, R5 떡잎, 및 황색 꼬투리 단계 배아 및 떡잎에서의 가장 낮은 발현 수준을 보여준다. EXP-CUCme.Fe2:1에 의해 추진된 GUS 발현은 Vn5 단계 침하 및 근원 잎 및 R1 단계 잎자루, 근원 잎 및 꽃에서 또한 높았다. 조절 요소 EXP-CUCme.Bbz:1(서열 번호 7)은 Vn5 단계 침하 및 근원 잎 및 R3 단계 꼬투리에서 가장 높은 발현을 입증하였다. EXP-Mt.Lhcb2:1:1(서열 번호 10)에 의해 추진된 GUS 발현은 Vn5 단계 근원 및 R1 잎자루에서 가장 높았다. EXP-Mt.PSII-T:1:1(서열 번호 13)은 R1 단계 근원 잎에서의 가장 높은 발현을 입증하였다.
각각의 조절 요소는 발현에 대한 원하는 조직 선호도에 따라 상이한 전이유전자의 발현을 최적으로 추진시키기 위해 사용될 수 있는 고유한 발현 패턴을 제공한다.
실시예
3
조절 요소로부터
유래된
증강자 요소
증강자는 서열 번호 2, 5, 8, 11 및 14로서 제시된 촉진자 요소로부터 유래된다. 증강자 요소는, 촉진자 요소에 5' 또는 3'에 작동 가능하게 연결되거나, 촉진자에 작동 가능하게 연결된 추가 증강자 요소에 5' 또는 3'에 작동 가능하게 연결될 때, 전사 가능한 DNA 분자의 발현 수준을 증대시키거나 조정하거나, 특정한 세포 유형 또는 식물 기관에서 또는 발생 또는 생체 리듬에서의 특정한 시점에서 전사 가능한 DNA 분자의 발현을 제공할 수 있는, 하나 이상의 시스 조절 요소로 구성될 수 있다. 증강자는 TATA 박스 또는 기능적으로 유사한 요소 및 서열 번호 2, 5, 8, 11 및 14로서 제시된 서열 또는 이의 단편과 같은 촉진자 서열로부터 전사가 개시되는 것을 허용하는 촉진자로부터의 임의의 하류 서열을 제거함으로써 제조될 수 있다.
식물 촉진자에서의 TATA 박스는 몇몇 다른 진핵생물 유기체에서처럼 고도로 보존되지 않는다. 따라서, 증강자로서 단편을 한정하기 위해, 유전자의 전사 시작 부위(TSS)를 확인해야 하고, 여기서 5' UTR은 처음에 전사된다. 예를 들어, EXP-Mt.Lhcb2:1:1(서열 번호 10)인 전사 조절 요소는 촉진자 요소, 5' UTR 또는 리더 요소에 작동 가능하게 연결된 P-Mt.Lhcb2-1:2:1(서열 번호 11), L-Mt.Lhcb2-1:2:1(서열 번호 12)로 구성된다. 1837bp 촉진자 요소 내에, 추정상 코어 TATA 유사 요소인 P-Mt.Lhcb2-1:2:1(서열 번호 11)은 1798번 내지 1803번 뉴클레오타이드 내에 발견된다. P-Mt.Lhcb2-1:2:1로부터 유래된 증강자 단편은 서열 번호 11의 1번 내지 1797번 뉴클레오타이드를 포함할 수 있어서, 서열 번호 16(E-Mt.Lhcb2)으로서 제시된 서열을 생성시킨다. P-Mt.Lhcb2-1:2:1(서열 번호 11)인 촉진자로부터 유래된 증강자는 E-Mt.Lhcb2의 더 작은 단편(서열 번호 16)을 추가로 포함할 수 있다. P-Mt.Lhcb2-1:2:1(서열 번호 11)인 촉진자로부터 유래된 증강자 요소의 효율성은, 촉진자 및 리더에 작동 가능하게 연결되고 안정적인 또는 일시적인 식물 검정에서 전사 가능한 DNA 분자, 예컨대 GUS의 발현을 추진시키도록 사용된, P-Mt.Lhcb2-1:2:1(서열 번호 11)인 촉진자로부터 유래된 증강자를 포함하는 키메라 전사 조절 요소를 구축함으로써 경험적으로 결정된다.
증강자 요소의 추가의 개선은 필요할 수 있고, 경험적으로 검증된다. 또한, 키메라 전사 조절 요소 내의 각각의 요소의 순서가 각각의 요소의 상대 위치에 따라 상이한 효과를 부여할 수 있으므로, 키메라 전사 조절 요소 내의 다른 요소에 대한 증강자 요소의 위치는 또한 경험적으로 결정된다. 몇몇 촉진자 요소는 다수의 TATA 박스 또는 TATA 박스 유사 요소 및 잠재적으로 다수의 전사 개시 부위를 가질 것이다. 이 상황 하에, 처음에 제1 TSS가 위치한 곳을 확인하고 이후 추정상 증강자 요소 내에 전사의 잠재적 개시가 생기는 것을 막도록 제1 TSS를 사용하여 증강자를 설계하는 것을 시작하는 것이 필요할 수 있다.
서열 번호 2, 5, 8, 11 및 14로서 제시된 촉진자 요소로부터 유래된 증강자 요소를, 촉진자 요소에 5' 또는 3'에 작동 가능하게 연결되거나, 촉진자에 작동 가능하게 연결된 추가 증강자 요소에 5' 또는 3'에 작동 가능하게 연결되도록 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여, 클로닝한다. 대안적으로, 증강자 요소는 증강자의 2개 이상의 카피로 이루어진 더 큰 증강자 요소를 제공하도록 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 클로닝되고, 촉진자 요소에 5' 또는 3'에 작동 가능하게 연결되거나, 촉진자에 작동 가능하게 연결된 추가 증강자 요소에 5' 또는 3'에 작동 가능하게 연결되도록 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 클로닝되어서, 키메라 전사 조절 요소를 생성시킬 수 있다. 증강자 요소는 상이한 속 유기체로부터 유래된 촉진자 요소에 5'에 작동 가능하게 연결되거나, 동일한 또는 상이한 속 유기체로부터 유래된 촉진자에 작동 가능하게 연결된 다른 속 유기체로부터 유래된 추가 증강자 요소에 5' 또는 3'에 작동 가능하게 연결되도록 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 또한 클로닝되어서, 키메라 전사 조절 요소를 생성시킬 수 있다. GUS 발현 식물 형질전환 벡터는, 생성된 식물 발현 벡터가 아그로박테륨 투메파시엔스로부터의 오른쪽 보더 영역(B-AGRtu.right border), 항생제, 스펙티노마이신에 대한 내성을 부여하는 형질전환된 식물 세포의 선택에 사용된 제1 전이유전자 선택 카세트; 및 촉진자 요소에 5' 또는 3'에 작동 가능하게 연결되거나, 추가 증강자 요소에 5' 또는 3'에 작동 가능하게 연결된(결국 고시피움 바르바덴스 E6 유전자로부터의 3' 종결 영역(T-Gb.E6-3b:3b:1, 서열 번호 18)에 작동 가능하게 연결된, 감자 광 유도성 조직 특이적 ST-LS1 유전자(유전자은행 기탁; X04753)로부터 유래된 가공 가능한 인트론을 함유하는 ß-글루쿠로니다제(GUS, GOI-Ec.uidA+St.LS1:1:1, 서열 번호 17)에 대한 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된, 리더 요소에 5'에 작동 가능하게 연결된 촉진자에 작동 가능하게 연결됨), 증강자 요소로 이루어진 증강자 요소를 시험하기 위한 제2 전이유전자 카세트, 및 에이. 투메파시엔스투메파시엔스로부터의 왼쪽 보더 영역(B-AGRtu.왼쪽 보더)을 함유하는, 상기 실시예 2에 기재된 작제물과 유사한 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 작제될 수 있다. 생성된 플라스미드는 상기 기재된 방법에 의해 대두 식물 또는 다른 속 식물을 형질전환하도록 사용된다. 대안적으로, 대두 또는 다른 속 식물로부터 유래된 원형질체 세포는 일시적 검정을 수행하기 위해 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 형질전환된다.
하나 이상의 증강자를 포함하는 조절 요소에 의해 추진된 GUS 발현은 전사 가능한 DNA 분자의 발현에 대한 증강자 요소의 효과를 결정하기 위해 안정적인 또는 일시적인 식물 검정에서 평가된다. 하나 이상의 증강자 요소에 대한 변형 또는 하나 이상의 증강자 요소의 중복은 경험적 실험 및 각각의 조절 요소 조성물을 사용하여 관찰된 생성된 유전자 발현 조절에 기초하여 수행될 수 있다. 생성된 조절 또는 키메라 조절 요소에서의 하나 이상의 증강자의 상대 위치를 변경하는 것은 조절 또는 키메라 조절 요소의 특이성 또는 전사 활성에 영향을 미칠 수 있고, 옥수수 식물 또는 다른 속 식물 내의 원하는 전이유전자 발현 프로필에 대한 최고의 증강자를 확인하기 위해 경험적으로 결정된다.
* * * * * * *
본 발명의 원칙이 예시되고 기재되어 있지만, 본 발명이 이러한 원칙을 벗어나지 않으면서 배열 및 세부사항에서 변형될 수 있다는 것이 당해 분야의 숙련자에게 명확해야 한다. 본 발명자들은 청구항의 사상 및 범위 내인 모든 변형을 청구한다. 본 명세서에 인용된 모든 공보 및 공개 특허 문헌은, 각각의 개별 공보 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참고로 포함된 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Monsanto Technology LLC
<120> PLANT REGULATORY ELEMENTS AND USES THEREOF
<130> WO2017/156091
<140> PCT/US2017/021310
<141> 2017-03-08
<150> US 62/306790
<151> 2016-03-11
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2001
<212> DNA
<213> Cucumis melo
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2001)
<223> EXP sequence derived from a Cucumis melo putative Ferredoxin 2
protein gene comprised of a promoter operably linked 5' to its
native leader.
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protein 13 gene comprised of a promoter operably linked 5' to its
native leader.
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tttctaaaag attgtatcca agaagtaaaa tttacatgga aaataaaatg cctataaatt 360
aaaaaatgtt atattttcgt gacctttaac cttaggaaca tttgataact attactttga 420
gattgcagtc ataggcaaca caaggtcttg gacaaacatg ttcgtgacac caaacacccc 480
cctcaaaatt aagtatatta taccaactca tttcatttgc ttgttacggt tgtgttttat 540
caatccttcc tcgtcttgtt ttttcctcca aatttgtaat cttaaaattg gtgaaacatc 600
acatatttga ttctcaatct tagattttct accttttagg taatctatat tttgaaattg 660
aaattgaaat tgaattccgt gtaaaatcta taatatggga acccaattcg aatttaatgt 720
tttatgtaaa ggccaataat gttccaaatt tatttcctta ttattattgt atattttgtc 780
cccaagtaca tcatagattg gctttcaatt ccaaatccat catggtatat ttttaggtgc 840
aaactattgt cgtagattta atcccctagt tttgttgatt ttttaaaata gtactttcaa 900
caattttaaa ttttatttga ttggttataa acttcgggtg tgatttagtt gtccaatttg 960
gattatattg tcattttcat acataaattt atttattttt gaaaaagtta tcttttagtc 1020
tttgaaattg aaatttttat gaatatgtgg atttagtccc tcaattctca aattaaccat 1080
cttcacaaga gtgagaaaca gagatgggag ggagaaaaat ggaaagataa aaaaagtatt 1140
tttcttcctc catgttatta ggtcacatca atatttataa tattttatat taaatttaat 1200
gatttctttt gggagaggta ctcttagacc tattttttta acaaaaatta ttggactcat 1260
aattttttaa ttgtccttta atttctttta tttgtatcta gactttataa agtttgagag 1320
ttttatattt taaggagaaa tatattaaaa tataaggtta gttttcatac actagataga 1380
cttatgatct tatacgagtg aatgagttaa actctcaatt aaaattattt gaattttttc 1440
aaaaattaaa atcatccatt ttgttaaatt aaaatttgaa gaaatttata ggatgcgtaa 1500
gaattgatgc cttgttaatt ttcaaatata attatagtaa aaattcttaa ttagtttact 1560
aacaacgatt taaaagttta ctttgatgtg ttgaacaata tttatcaaac caaatttgat 1620
caagtggata tactaacaaa agttcaagat cttaaacttt aagtgaatta attttgacat 1680
atatatatat ataaaaaaaa aaagttaggt gttaaaagaa aactgaaaat tgttaaaaga 1740
aaagaaaagg agggtataga taaaatgtgg atagaaagag atgagttgta gatgcaaaaa 1800
aatctttaga aacaatatga ttggctaact aagccctctc attaccccac aaaatttctc 1860
atatctttca ctcttcacca ctcatctcct cgtttcctc 1899
<210> 6
<211> 102
<212> DNA
<213> Cucumis melo
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(102)
<223> Leader sequence derived from a Cucumis melo chlorophyll a-b
binding protein 13 gene.
<400> 6
ataatattcc cccacttcca ctctctctca cacaatctcc aacactactg cccattcctc 60
tgttctttct ctctactctc aaccacagag cttcaagtac cc 102
<210> 7
<211> 1014
<212> DNA
<213> Cucumis melo
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1014)
<223> EXP sequence derived from a Cucumis melo B-box zinc finger
protein 24-like gene comprised of a promoter operably linked 5'
to its native leader.
<400> 7
aggctttttc gatctaaaat cacctgtaac aagtttaata atcgagaatt agtgaaagtg 60
tacctatttt aaaatagtaa ttagtatttt attcaataga tatgtttgaa atctaaaaaa 120
ttctcttata acttggaaat ttagataaca atgatgcaaa ccgcaaaaga gtatatacta 180
aacattgaat aaactattag cttaatactc taaaatcagt ggttggaaaa aaaacttcca 240
cttacattta cgtgaaaagc gtcaaaatta agaaaaatca tttgttacaa tcacacataa 300
ataattctaa gcactctttt ttcactatta gattagagaa taccagaaaa aaatttgatt 360
tgagttagta cactttgaga tgaaaacatt tataactaga acaatttgaa ataaagtaag 420
atgttccatt tatagggcat cgaatctatg actattttgt ttttttggtg agttaaatgg 480
gatgaggaat cggaaaagaa agagcatttg attactacaa gaagagtttg ttgtttccca 540
tcgtacaaaa tcaatcgata gtgtgttgtt gttcgttgtt catccctaaa caaaaagaga 600
tggtgtgaag aatcaaaagc atttagctaa ttttttagag ctcctaaatt cctcagccac 660
aaaccaacgg agcttcacag ccacacaaat ggcctcctct cttttccgcc ttgttgtctc 720
caccatcttt cttgattttg atttccctga atcctcaacc cttatcccct cacccaccct 780
tctctttcct tcttcaatcc tccacctttt acttctcttt ctctatcccc ttctttctcc 840
attcttattc tctaataccc acttttcctc ttcttcttcc cttccatctc tccggcgcca 900
ctgttctact ggcggtttaa tttcatgggt tcttcttgat cttggagtag gaaacaggga 960
agtggagttt cggcgaatct attcaaaatc ttagtggttg ttcagaggga gaag 1014
<210> 8
<211> 815
<212> DNA
<213> Cucumis melo
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(815)
<223> Promoter sequence derived from a Cucumis melo B-box zinc finger
protein 24-like gene.
<400> 8
aggctttttc gatctaaaat cacctgtaac aagtttaata atcgagaatt agtgaaagtg 60
tacctatttt aaaatagtaa ttagtatttt attcaataga tatgtttgaa atctaaaaaa 120
ttctcttata acttggaaat ttagataaca atgatgcaaa ccgcaaaaga gtatatacta 180
aacattgaat aaactattag cttaatactc taaaatcagt ggttggaaaa aaaacttcca 240
cttacattta cgtgaaaagc gtcaaaatta agaaaaatca tttgttacaa tcacacataa 300
ataattctaa gcactctttt ttcactatta gattagagaa taccagaaaa aaatttgatt 360
tgagttagta cactttgaga tgaaaacatt tataactaga acaatttgaa ataaagtaag 420
atgttccatt tatagggcat cgaatctatg actattttgt ttttttggtg agttaaatgg 480
gatgaggaat cggaaaagaa agagcatttg attactacaa gaagagtttg ttgtttccca 540
tcgtacaaaa tcaatcgata gtgtgttgtt gttcgttgtt catccctaaa caaaaagaga 600
tggtgtgaag aatcaaaagc atttagctaa ttttttagag ctcctaaatt cctcagccac 660
aaaccaacgg agcttcacag ccacacaaat ggcctcctct cttttccgcc ttgttgtctc 720
caccatcttt cttgattttg atttccctga atcctcaacc cttatcccct cacccaccct 780
tctctttcct tcttcaatcc tccacctttt acttc 815
<210> 9
<211> 199
<212> DNA
<213> Cucumis melo
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(199)
<223> Leader sequence derived from a Cucumis melo B-box zinc finger
protein 24-like gene.
<400> 9
tctttctcta tccccttctt tctccattct tattctctaa tacccacttt tcctcttctt 60
cttcccttcc atctctccgg cgccactgtt ctactggcgg tttaatttca tgggttcttc 120
ttgatcttgg agtaggaaac agggaagtgg agtttcggcg aatctattca aaatcttagt 180
ggttgttcag agggagaag 199
<210> 10
<211> 1887
<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1887)
<223> EXP sequence derived from a Medicago truncatula light harvesting
complex protein b2 gene comprised of a promoter operably linked
5' to its native leader.
<400> 10
agtagtagta ggtgttgaca tttctttttt ttttgaacaa gaggagttga catttctaag 60
gtggctttgt taccacttga tagactttta gaatgtatgt caataagaat agaaaagaac 120
acaggtggtt taaattttga tctgaatgag acaatatttg catgaagtaa agtttagatt 180
tcaaatatgc atacttaatg tgtctattgt gatatttaag gcatcattca tctctcttgc 240
ctcttgccct cggtatatat gtatcggacc ataaagggaa ccaaaaatga tttcagatac 300
ataaaattaa ttttcacatg tttaagtaat ctcaattgaa atggatttta ttccatcatt 360
aattctaaca tgaaattata tgtagttttt aactccaaac ataatttctc acttgtccac 420
taacatatta attaacattg tcattccaaa agaaaaacaa aactgaatag aggtggagat 480
caacatgtga cttgaattat acatgtacgg ttgagaatta tattaaaaat ctaaagttgg 540
ggtcaacttg tgaaatagat tctcttcatt gtattttttt cacatttgat attatatagg 600
atagttgtga attgtgaaat tagataacca cgtgagccaa ttttgtaatt tagttgggat 660
taactgccac cttgtgttct tgaggttgaa cagtttacag ccaagtcttc ctttgcctgt 720
ttgtcttgta catcttcata ttcacgtggt ttaagccact tattttcgtg tttttttttc 780
tctcttttct cttcaacata tagttgtaat aatagataat atagggtttg atatgttttt 840
agttcttata gtgtgtttta gcctcacatt tttttctttt cattgaccaa cagcatacac 900
ttttttttgt gtatatttta gagactaaag tgcaatgaaa tcttatttat atggaaataa 960
aaaaaatgag catttttttg ttagtgaata tgtatgcagg atttgaaaaa ggaatgagat 1020
tcggagcctg ttcttttcat gactcctctt aattgagaca tgaaattcaa tgcttgacgt 1080
aaggataagt gttctattca atacgcgtaa gaaaagaatg agcagttcag atcaaatcga 1140
actttttatt cttgtaattg taatgttatt tttcgggtca cacaattaag ttttgtttgc 1200
acattagtct gtaattcttc gggttattca catttcattt gatggtcaga ggcaaattga 1260
aagctaagca gtggtaattc taaagattcc cccgggaaaa aatagaaatg tctcctacgt 1320
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ttctgtattt ctctcagctt tggtggacct aatttccttg gctcacattc acctctccaa 1620
aacatctaag caaccagatc aatgcatcca catggcacaa agagagccac aatatcacta 1680
caaaatataa gcttgggaat ccacatacta attcaccacc aataagatgt tgctgacttg 1740
tgcatatcct aatctacaat atcttatgat ttccaccgtg gccactccca acacttctat 1800
aaacctttgt atcctttctt cattcttcac aacaacacta gcttatacca ctaaagagaa 1860
caaacatcaa gaaacctcaa cgccctc 1887
<210> 11
<211> 1837
<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1837)
<223> Promoter sequence derived from a Medicago truncatula light
harvesting complex protein b2 gene.
<400> 11
agtagtagta ggtgttgaca tttctttttt ttttgaacaa gaggagttga catttctaag 60
gtggctttgt taccacttga tagactttta gaatgtatgt caataagaat agaaaagaac 120
acaggtggtt taaattttga tctgaatgag acaatatttg catgaagtaa agtttagatt 180
tcaaatatgc atacttaatg tgtctattgt gatatttaag gcatcattca tctctcttgc 240
ctcttgccct cggtatatat gtatcggacc ataaagggaa ccaaaaatga tttcagatac 300
ataaaattaa ttttcacatg tttaagtaat ctcaattgaa atggatttta ttccatcatt 360
aattctaaca tgaaattata tgtagttttt aactccaaac ataatttctc acttgtccac 420
taacatatta attaacattg tcattccaaa agaaaaacaa aactgaatag aggtggagat 480
caacatgtga cttgaattat acatgtacgg ttgagaatta tattaaaaat ctaaagttgg 540
ggtcaacttg tgaaatagat tctcttcatt gtattttttt cacatttgat attatatagg 600
atagttgtga attgtgaaat tagataacca cgtgagccaa ttttgtaatt tagttgggat 660
taactgccac cttgtgttct tgaggttgaa cagtttacag ccaagtcttc ctttgcctgt 720
ttgtcttgta catcttcata ttcacgtggt ttaagccact tattttcgtg tttttttttc 780
tctcttttct cttcaacata tagttgtaat aatagataat atagggtttg atatgttttt 840
agttcttata gtgtgtttta gcctcacatt tttttctttt cattgaccaa cagcatacac 900
ttttttttgt gtatatttta gagactaaag tgcaatgaaa tcttatttat atggaaataa 960
aaaaaatgag catttttttg ttagtgaata tgtatgcagg atttgaaaaa ggaatgagat 1020
tcggagcctg ttcttttcat gactcctctt aattgagaca tgaaattcaa tgcttgacgt 1080
aaggataagt gttctattca atacgcgtaa gaaaagaatg agcagttcag atcaaatcga 1140
actttttatt cttgtaattg taatgttatt tttcgggtca cacaattaag ttttgtttgc 1200
acattagtct gtaattcttc gggttattca catttcattt gatggtcaga ggcaaattga 1260
aagctaagca gtggtaattc taaagattcc cccgggaaaa aatagaaatg tctcctacgt 1320
tacctatact atgtgtaata tttaatttat tttgtcacat tgtatcaaat tagtttctca 1380
cattatgtac atttcaaaat gattcattaa attgcaatta aattcaccca tccgtttaac 1440
attaagttgg taatttctga gatgtatttg aaattattat gtaaacgaga tgcatttgat 1500
agcaaaataa aaagatgttg ctgtttttca ctcaaactcc caatccaaac ccttccaagt 1560
ttctgtattt ctctcagctt tggtggacct aatttccttg gctcacattc acctctccaa 1620
aacatctaag caaccagatc aatgcatcca catggcacaa agagagccac aatatcacta 1680
caaaatataa gcttgggaat ccacatacta attcaccacc aataagatgt tgctgacttg 1740
tgcatatcct aatctacaat atcttatgat ttccaccgtg gccactccca acacttctat 1800
aaacctttgt atcctttctt cattcttcac aacaaca 1837
<210> 12
<211> 50
<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(50)
<223> Leader sequence derived from a Medicago truncatula light
harvesting complex protein b2 gene.
<400> 12
ctagcttata ccactaaaga gaacaaacat caagaaacct caacgccctc 50
<210> 13
<211> 594
<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(594)
<223> EXP sequence derived from a Medicago truncatula photosystem II
chloroplast precursor gene comprised of a promoter operably
linked 5' to its native leader.
<400> 13
ttactgttgg ttttggctaa atttgttatg ttgtgctatc tgttgagaaa aatgttgggt 60
agcttatatt actccatatc agataagcct gacctcactc ccattagaag gaaacaaata 120
tattaaagta caatattcat ttttttttgg gaatagatta attttgatgc attttcggtg 180
taaaacattt tacatgctca acaaatctca aaccatcttt tgtatgactt tttggattta 240
agatagatat gataaaagtc aaatatttta atgatccaat agttatcatt gattgtcttg 300
tacaaaattt ttacactgcc ggtacctatt agcatctttc ttatccttta aattcacatt 360
aattaacaag catcaacaca agccccccaa aaccatttct agcattatca actattcaac 420
gtggcattaa cttattggtc atatcattaa tgagataaga taatgtatgg tcctacccta 480
ccacaaaagc tcccattttt gtatgattta cattccatat attcattctt ccacttgccc 540
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<210> 14
<211> 552
<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(552)
<223> Promoter sequence derived from a Medicago truncatula photosystem
II chloroplast precursor gene.
<400> 14
ttactgttgg ttttggctaa atttgttatg ttgtgctatc tgttgagaaa aatgttgggt 60
agcttatatt actccatatc agataagcct gacctcactc ccattagaag gaaacaaata 120
tattaaagta caatattcat ttttttttgg gaatagatta attttgatgc attttcggtg 180
taaaacattt tacatgctca acaaatctca aaccatcttt tgtatgactt tttggattta 240
agatagatat gataaaagtc aaatatttta atgatccaat agttatcatt gattgtcttg 300
tacaaaattt ttacactgcc ggtacctatt agcatctttc ttatccttta aattcacatt 360
aattaacaag catcaacaca agccccccaa aaccatttct agcattatca actattcaac 420
gtggcattaa cttattggtc atatcattaa tgagataaga taatgtatgg tcctacccta 480
ccacaaaagc tcccattttt gtatgattta cattccatat attcattctt ccacttgccc 540
acaatagaag ct 552
<210> 15
<211> 42
<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(42)
<223> Leader sequence derived from a Medicago truncatula photosystem II
chloroplast precursor gene.
<400> 15
atcacataga gactagttca gaatccagat cacattgtag aa 42
<210> 16
<211> 1797
<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1797)
<223> Enhancer sequence derived from a Medicago truncatula light
harvesting complex protein b2 gene.
<400> 16
agtagtagta ggtgttgaca tttctttttt ttttgaacaa gaggagttga catttctaag 60
gtggctttgt taccacttga tagactttta gaatgtatgt caataagaat agaaaagaac 120
acaggtggtt taaattttga tctgaatgag acaatatttg catgaagtaa agtttagatt 180
tcaaatatgc atacttaatg tgtctattgt gatatttaag gcatcattca tctctcttgc 240
ctcttgccct cggtatatat gtatcggacc ataaagggaa ccaaaaatga tttcagatac 300
ataaaattaa ttttcacatg tttaagtaat ctcaattgaa atggatttta ttccatcatt 360
aattctaaca tgaaattata tgtagttttt aactccaaac ataatttctc acttgtccac 420
taacatatta attaacattg tcattccaaa agaaaaacaa aactgaatag aggtggagat 480
caacatgtga cttgaattat acatgtacgg ttgagaatta tattaaaaat ctaaagttgg 540
ggtcaacttg tgaaatagat tctcttcatt gtattttttt cacatttgat attatatagg 600
atagttgtga attgtgaaat tagataacca cgtgagccaa ttttgtaatt tagttgggat 660
taactgccac cttgtgttct tgaggttgaa cagtttacag ccaagtcttc ctttgcctgt 720
ttgtcttgta catcttcata ttcacgtggt ttaagccact tattttcgtg tttttttttc 780
tctcttttct cttcaacata tagttgtaat aatagataat atagggtttg atatgttttt 840
agttcttata gtgtgtttta gcctcacatt tttttctttt cattgaccaa cagcatacac 900
ttttttttgt gtatatttta gagactaaag tgcaatgaaa tcttatttat atggaaataa 960
aaaaaatgag catttttttg ttagtgaata tgtatgcagg atttgaaaaa ggaatgagat 1020
tcggagcctg ttcttttcat gactcctctt aattgagaca tgaaattcaa tgcttgacgt 1080
aaggataagt gttctattca atacgcgtaa gaaaagaatg agcagttcag atcaaatcga 1140
actttttatt cttgtaattg taatgttatt tttcgggtca cacaattaag ttttgtttgc 1200
acattagtct gtaattcttc gggttattca catttcattt gatggtcaga ggcaaattga 1260
aagctaagca gtggtaattc taaagattcc cccgggaaaa aatagaaatg tctcctacgt 1320
tacctatact atgtgtaata tttaatttat tttgtcacat tgtatcaaat tagtttctca 1380
cattatgtac atttcaaaat gattcattaa attgcaatta aattcaccca tccgtttaac 1440
attaagttgg taatttctga gatgtatttg aaattattat gtaaacgaga tgcatttgat 1500
agcaaaataa aaagatgttg ctgtttttca ctcaaactcc caatccaaac ccttccaagt 1560
ttctgtattt ctctcagctt tggtggacct aatttccttg gctcacattc acctctccaa 1620
aacatctaag caaccagatc aatgcatcca catggcacaa agagagccac aatatcacta 1680
caaaatataa gcttgggaat ccacatacta attcaccacc aataagatgt tgctgacttg 1740
tgcatatcct aatctacaat atcttatgat ttccaccgtg gccactccca acacttc 1797
<210> 17
<211> 2001
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Coding sequence for beta-glucuronidase (GUS) with a processable
intron.
<400> 17
atggtccgtc ctgtagaaac cccaacccgt gaaatcaaaa aactcgacgg cctgtgggca 60
ttcagtctgg atcgcgaaaa ctgtggaatt gatcagcgtt ggtgggaaag cgcgttacaa 120
gaaagccggg caattgctgt gccaggcagt tttaacgatc agttcgccga tgcagatatt 180
cgtaattatg cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaagtct ttataccgaa aggttgggca 240
ggccagcgta tcgtgctgcg tttcgatgcg gtcactcatt acggcaaagt gtgggtcaat 300
aatcaggaag tgatggagca tcagggcggc tatacgccat ttgaagccga tgtcacgccg 360
tatgttattg ccgggaaaag tgtacgtaag tttctgcttc tacctttgat atatatataa 420
taattatcat taattagtag taatataata tttcaaatat ttttttcaaa ataaaagaat 480
gtagtatata gcaattgctt ttctgtagtt tataagtgtg tatattttaa tttataactt 540
ttctaatata tgaccaaaat ttgttgatgt gcaggtatca ccgtttgtgt gaacaacgaa 600
ctgaactggc agactatccc gccgggaatg gtgattaccg acgaaaacgg caagaaaaag 660
cagtcttact tccatgattt ctttaactat gccggaatcc atcgcagcgt aatgctctac 720
accacgccga acacctgggt ggacgatatc accgtggtga cgcatgtcgc gcaagactgt 780
aaccacgcgt ctgttgactg gcaggtggtg gccaatggtg atgtcagcgt tgaactgcgt 840
gatgcggatc aacaggtggt tgcaactgga caaggcacta gcgggacttt gcaagtggtg 900
aatccgcacc tctggcaacc gggtgaaggt tatctctatg aactgtgcgt cacagccaaa 960
agccagacag agtgtgatat ctacccgctt cgcgtcggca tccggtcagt ggcagtgaag 1020
ggcgaacagt tcctgattaa ccacaaaccg ttctacttta ctggctttgg tcgtcatgaa 1080
gatgcggact tgcgtggcaa aggattcgat aacgtgctga tggtgcacga ccacgcatta 1140
atggactgga ttggggccaa ctcctaccgt acctcgcatt acccttacgc tgaagagatg 1200
ctcgactggg cagatgaaca tggcatcgtg gtgattgatg aaactgctgc tgtcggcttt 1260
aacctctctt taggcattgg tttcgaagcg ggcaacaagc cgaaagaact gtacagcgaa 1320
gaggcagtca acggggaaac tcagcaagcg cacttacagg cgattaaaga gctgatagcg 1380
cgtgacaaaa accacccaag cgtggtgatg tggagtattg ccaacgaacc ggatacccgt 1440
ccgcaaggtg cacgggaata tttcgcgcca ctggcggaag caacgcgtaa actcgacccg 1500
acgcgtccga tcacctgcgt caatgtaatg ttctgcgacg ctcacaccga taccatcagc 1560
gatctctttg atgtgctgtg cctgaaccgt tattacggat ggtatgtcca aagcggcgat 1620
ttggaaacgg cagagaaggt actggaaaaa gaacttctgg cctggcagga gaaactgcat 1680
cagccgatta tcatcaccga atacggcgtg gatacgttag ccgggctgca ctcaatgtac 1740
accgacatgt ggagtgaaga gtatcagtgt gcatggctgg atatgtatca ccgcgtcttt 1800
gatcgcgtca gcgccgtcgt cggtgaacag gtatggaatt tcgccgattt tgcgacctcg 1860
caaggcatat tgcgcgttgg cggtaacaag aaagggatct tcactcgcga ccgcaaaccg 1920
aagtcggcgg cttttctgct gcaaaaacgc tggactggca tgaacttcgg tgaaaaaccg 1980
cagcagggag gcaaacaatg a 2001
<210> 18
<211> 315
<212> DNA
<213> Gossypium barbadense
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(315)
<223> 3' UTR sequence derived from the Gossypium barbadense E6 gene.
<400> 18
tgatcacctg tcgtacagta tttctacatt tgatgtgtga tttgtgaaga acatcaaaca 60
aaacaagcac tggctttaat atgatgataa gtattatggt aattaattaa ttggcaaaaa 120
caacaatgaa gctaaaattt tatttattga gccttgcggt taatttcttg tgatgatctt 180
tttttttatt ttctaattat atatagtttc ctttgctttg aaatgctaaa ggtttgagag 240
agttatgctc tttttttctt cctctttctt ttttaacttt atcatacaaa ttttgaataa 300
aaatgtgagt acatt 315
Claims (19)
- 서열 번호 1 또는 2의 DNA 서열을 포함하고, 상기 서열이 비상동성 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된, 재조합 DNA 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 DNA 서열이 유전자 조절 활성을 포함하는 것인, 재조합 DNA 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 비상동성 전사 가능한 DNA 분자가 작물학적 관심 대상의 유전자를 포함하는 것인, 재조합 DNA 분자.
- 제3항에 있어서, 상기 작물학적 관심 대상의 유전자가 식물에서 제초제 관용성을 부여하는 것인, 재조합 DNA 분자.
- 제3항에 있어서, 상기 작물학적 관심 대상의 유전자가 식물에서 내충성(pest resistance)을 부여하는 것인, 재조합 DNA 분자.
- 서열 번호 1 또는 2의 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 포함하고, 상기 서열이 비상동성 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된, 형질전환 식물 세포.
- 제6항에 있어서, 외떡잎식물 식물 세포인 형질전환 식물 세포.
- 제6항에 있어서, 쌍떡잎식물 식물 세포인 형질전환 식물 세포.
- 제1항의 재조합 DNA 분자를 포함하는, 형질전환 식물.
- 제9항의 형질전환 식물의 부분.
- 제1항의 재조합 DNA 분자를 포함하는, 제9항의 형질전환 식물의 자손 식물.
- 제11항의 자손 식물의 부분.
- 제1항의 재조합 DNA 분자를 포함하는, 형질전환 종자.
- 제9항에 따른 형질전환 식물을 수득하는 단계 및 이로부터 상품 산물을 제조하는 단계를 포함하는, 상품 산물(commodity product)을 제조하는 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 상품 산물이 단백질 농축물, 단백질 단리물, 곡물, 전분, 종자, 으깬 곡물(meal), 밀가루, 바이오매스 또는 종자 오일인, 상품 산물을 제조하는 방법.
- 제9항에 따른 형질전환 식물을 수득하고, 상기 식물을 배양하여 전사 가능한 DNA가 발현되도록 하는 것을 포함하는, 전사 가능한 DNA 분자를 발현시키는 방법.
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- 삭제
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