UA120742C2 - Конструйований білок з цинковими пальцями, направлений на гени рослин, залучені до біосинтезу жирних кислот - Google Patents

Конструйований білок з цинковими пальцями, направлений на гени рослин, залучені до біосинтезу жирних кислот Download PDF

Info

Publication number
UA120742C2
UA120742C2 UAA201503228A UAA201503228A UA120742C2 UA 120742 C2 UA120742 C2 UA 120742C2 UA A201503228 A UAA201503228 A UA A201503228A UA A201503228 A UAA201503228 A UA A201503228A UA 120742 C2 UA120742 C2 UA 120742C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
zeo
gene
expression
plants
dna
Prior art date
Application number
UAA201503228A
Other languages
English (en)
Inventor
Расселл Дікелвер
Рассел Дикелвер
Манджу ГУПТА
Джеффрі К. Міллер
Джеффри К. МИЛЛЕР
Стефен НОВАК
Джозеф Ф. Петоліно
Джозеф Ф. Петолино
Original Assignee
ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі
Сангамо Байосайєнсіз, Інк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі, Сангамо Байосайєнсіз, Інк. filed Critical ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі
Publication of UA120742C2 publication Critical patent/UA120742C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01041—Beta-ketoacyl-acyl-carrier-protein synthase I (2.3.1.41)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Винахід стосується конструйованого білка з цинковими пальцями, що модулює експресію ендогенного гена тіоестерази жирних кислот В (FatB) рослин, де білок з цинковими пальцями містить області розпізнавальних спіралей, полінуклеотиду, способу модифікації одного або більше гена FatB у рослинній клітині, рослинної клітини, рослини, насіння рослини та потомства рослини.

Description

Перехресне посилання на споріднені заявки
По заявці заявляється пріоритет попередньої заявки США Мо 61/279528, поданої 22 жовтня 2010 року, опис якої, таким чином, в повному об'ємі включений в цей документ за допомогою посилання.
Галузь техніки
Опис в основному стосується галузей геномної інженерії і експресії білків в рослинах.
Зокрема, даний винахід стосується конструювання ДНК-зв'язувальних доменів, наприклад білків з цинковими пальцями, направлених на гени, залучені до синтезу жирних кислот, і способів використання таких білків з цинковими пальцями для модуляції експресії генів, інактивації генів і направленої модифікації генів для отримання рослин із зміненими профілями жирних кислот.
Попередній рівень техніки
Дієти з високим вмістом насичених жирів збільшують вміст ліпопротеїнів низької густини (ГО), що, в свою чергу, викликає відкладення холестерину на кровоносних судинах, попередня умова тісно корелює з атеросклерозом і ішемічною хворобою серця (Соппег еї аї., Согопагу
Неап бізеазе: Ргемепійоп, Сотріїсайопв5, апа Тгеаїтепі, ..В. І ірріпсоїї, РнпПаае!рнНіа, 1984 рр. 43- 64). На відміну від цього показано, що дієти з високим вмістом мононенасичених жирів послаблюють захворювання серця. Олеїнова кислота, єдина мононенасичена жирна кислота в більшості харчових рослинних олій, знижує І 0. також ефективно, як і лінолева кислота, але не впливає на рівні ліпопротеїнів високої густини (НОЇ) (Мепвіпк еї аї. (1989) Мем Епдіапа у. Мед., 321:436-441). Крім того, дієти з високим вмістом мононенасичених жирних кислот також корелюють зі зниженим систолічним артеріальним тиском (УмМіЙйатв»в еї аїІ. (1987) У. Ат. Меа.
Аввос, 257:3251-3256, 1987).
У світлі впливу жирних кислот на дієту і здоров'я проводилися спроби змінити профіль жирних кислот рослин, що використовуються в харчових і промислових цілях. Однак загальноприйняті способи зміни рослин для поліпшення профілю жирних кислот основані на мутагенезі (наприклад, хімічний, радіаційний і т. д.) і/або селекції і вимагають часу, трудомісткі і не направлені специфічно на вибрані гени. Див., наприклад, патент США Мо 5861187.
Нещодавно, конструйовані ДНК-зв'язувальні домени, такі як ДНК-зв'язувальні домени мегануклеаз і білки з цинковими пальцями (2ЕР), ефективно використовували для селективної
Зо модуляції експресії генів і для направленої зміни послідовностей генів у рослин (див., наприклад, патенти США МоМо 7262054, 7235354, 7220719, 7001768 і 6534261; патентні публікації США МоМо 2008/0182332 і з серійним номером США Мо 12/284888). Білки з цинковими пальцями (2ЕР) являють собою білки, які зв'язуються з ДНК, РНК і/або білком, специфічним для послідовності чином, за допомогою стабілізованого металом домену, відомого як цинковий палець. Див., наприклад, МіПег еї а. (1985) ЕМВО 3. 4:1609-1614; ВНодез вї аї. (1993) 5сі. Атег. 268(2):56-65; і Кішд (1999) 9. Мої. ВіоїЇ. 293:215-218. 2ЕР, як правило, знаходяться у факторах транскрипції, і до цього часу в декількох тисячах відомих або передбачуваних факторах транскрипції ідентифіковано більше 10000 послідовностей цинкових пальців.
ДНК-зв'язувальні домени також можна використовувати з нуклеазними доменами з отриманням сконструйованих нуклеаз. Наприклад, можна змінювати ДНК-зв'язувальний домен хомінг-ендонуклеази з отриманням нової хомінг-ендонуклеази. Подібним чином, домени цинкових пальців також комбінували з нуклеазними розщеплювальними доменами з отриманням нуклеаз з цинковими пальцями (2ЕМ) для специфічного задання дволанцюжкового розриву в області генома, де бажана модифікація (наприклад, делеція, мутація, гомологічна рекомбінація або вставляння екзогенної послідовності) (див., наприклад, публікації патентних заявок США МоМо 2007/0134796; 2005/0064474; 2008/0182332). Конструйовані 2ЕР значно полегшують вставляння екзогенної послідовності або модифікацію ендогенної послідовності в конкретних ділянках-мішенях у рослин і забезпечують направлену зміну геномів рослин з більшою ефективністю, ніж загальноприйняті способи (див., наприклад, патенти США МоМо 1262054, 7235354, 7220719, 7001768 і 6534261).
Проте, зберігається необхідність в композиціях і способах для направленої зміни генів, залучених до синтезу жирних кислот, для отримання рослин і рослинних продуктів (наприклад, рослинних олій), що містить вибрані жирні кислоти. За допомогою продукування видів рослин зі зниженими рівнями конкретних і всіх насичених жирних кислот в олії насіння можна отримувати олійні харчові продукти, що містить менше насичених жирних кислот. Такі продукти приносять користь для охорони здоров'я, знижуючи захворюваність атеросклерозом і ішемічною хворобою серця.
Суть
Даний опис стосується композицій і способів для модуляції експресії і направленої зміни в бо цілих рослинах або в рослинних клітинах одного або декількох генів рослин, залучених до біосинтезу жирних кислот, таким чином, змінюючи склад жирних кислот в цілій рослині або в рослинних клітинах. Цілі рослини або рослинні клітини можуть належати до односім'ядольних (однодольних) або двосім'ядольних (дводольних) видів рослин, включаючи в деяких конкретних варіантах здійснення олієпродукуючі рослини, а також включаючи культивовані клітини, клітини в рослині на будь-якій стадії розвитку і рослинні клітини, виділені з цілої рослини, і які (або їх потомство) регенерують в рослини. Рослинні клітини можуть містити одну або декілька гомеологічних або паралогічних послідовностей генів, будь-яка кількість яких або всі з них можуть бути мішенню для модифікації способами, що описуються в цьому документі.
У одному з аспектів в цьому документі описаний ДНК-зв'язувальний домен (наприклад, білок з цинковими пальцями (2ЕР)), який специфічно зв'язується з геном, залученим до шляху біосинтезу жирних кислот у рослин. У деяких варіантах здійснення ген являє собою ген Вгаззіса пари5. У деяких конкретних варіантах здійснення, ген Вгаззіса парих5 може кодувати ацетил-
КоА-карбоксилазу (АССазу), В-кетоацил-АСР-синтетази (КА5, наприклад, КАБ І-КАБ ІМ), тіоестеразу жирних кислот В (ЕАТВ, наприклад, ЕАТВ1-ЕАТВЬ5, або інші тіоестерази пластид), синтазу жирних кислот (ЕА5), елонгазу жирних кислот (РАЕ, наприклад, ЕАЕЇТ), тіоестеразу жирних кислот А (РаїА), десатуразу жирних кислот (Рад2, Рааз), с-3-Р-дегідрогеназу пластид (СРОН), гліцерокіназу (СК), десатуразу білка-носія стеароїлацилу (З-АСР-ОЕ5) і олеоїл-АСР- гідролазу. У деяких конкретних варіантах здійснення ген може являти собою ортолог або гомолог цих генів у інших видів олієпродукуючих рослин.
У ще одному додатковому аспекті також надані злиті білки, що містить будь-який з ДНК- зв'язувальних доменів (наприклад, ЕР), що описуються в цьому документі. У певних варіантах здійснення злитий білок містить білок з цинковими пальцями і домен регуляції транскрипції (наприклад, домен активації або репресії), також відомий як 2ЕР ТЕ. У інших варіантах здійснення злитий білок містить 2ЕР і нуклеазний домен з утворенням нуклеази з цинковими пальцями (2ЕМ), що розщеплює ген-мішень в області генома, яка представляє інтерес. У певних варіантах здійснення ЕМ включає злитий поліпептид, що містить конструйований зв'язувальний домен цинкових пальців зі специфічністю до гена, залученого до шляху біосинтезу жирних кислот у рослин (наприклад, ген, що кодує АССазу, КАБ І, КАБ ІІ, КАЗ ПП,
КАБ ІМ, ЕАТВІ, РАТВ2, РАТВЗ, ЕАТВ4, ЕАТВ5, ЕА5, РАЕЇТ, РацА, Рад2, Рааз, СРОН, ОК або 5-
Ко) АСР-ОЕ5), і домен розщеплення, і/або один або декілька злитих поліпептидів, що містить конструйований зв'язувальний домен цинкових пальців і напівдомен розщеплення. У певних варіантах здійснення зв'язувальні домени цинкових пальців зв'язуються з ділянкою-мішенню, як показано в таблиці 2 або таблиці 10А. У певних варіантах здійснення зв'язувальні домени цинкових пальців містять послідовність, вибрану з групи, яка складається з білків з цинКовВиМи пальцями, що містить домени розпізнавання (наприклад, одиничного ланцюга), представлені в таблиці 1 або таблиці 108. Домени розщеплення і напівдомени розщеплення можна отримувати, наприклад, з різних рестрикційних ендонуклеаз і/або хомінг-ендонуклеаз. У одному з варіантів здійснення напівдомени розщеплення отримують з рестрикційної ендонуклеази типу 5 (наприклад, ЕоКІ).
У інших аспектах в цьому документі надані полінуклеотиди, які кодують будь-який з ДНК- зв'язувальних доменів (наприклад, білки з цинковими пальцями) і/або злиті білки, що описуються в цьому документі. Певні варіанти здійснення, що описуються в цьому документі, являє собою експресуючий 2ЕР вектор, що містить полінуклеотид, який кодує один або декілька
ЕР, що описуються в цьому документі, функціонально зв'язані з промотором. У одному з варіантів здійснення один або декілька з 2ЕР являють собою 2ЕМ. 2ЕР Її злиті білки, що містить ці 2ЕР, можуть зв'язуватися з геном, залученим до синтезу жирних кислот, і/або розщеплювати його в кодуючій області гена або в некодуючій послідовності в гені або поруч з ним, такий як, наприклад, лідерна послідовність, трейлерна послідовність або інтрон, або в нетранскрибованій області, вище або нижче кодуючої області. У певних варіантах здійснення 72ЕР або ЕМ зв'язуються з кодуючою послідовністю або регуляторною послідовністю гена, залученого до біосинтезу жирних кислот, і/або розщеплюють їх.
У іншому аспекті в цьому документі описані композиції, що містить один або декілька білків, злитих білків або полінуклеотидів, як описано в цьому документі. Рослинні клітини можуть містити один унікальний ген-мішень або декілька паралогічних піків одного і того ж гена. Таким чином, композиції можуть містити один або декілька білків, які містять 2ЕР (і полінуклеотидів, що кодують їх), направлених на один або декілька генів, залучених до синтезу жирних кислот в рослинній клітині. ЕР можуть бути направленими до всіх паралогічних або гомеологічних генів і конкретних вибраних паралогічних або гомеологічних генів в рослинній клітині або їх сполучення.
У іншому аспекті в цьому документі надана рослинна клітина-хазяїн, що містить один або декілька білків або полінуклеотидів (наприклад, експресуючі 2ЕР вектори), як описано в цьому документі. Для полінуклеотидів, рослинна клітина-хазяїн може бути стабільно трансформованою або транзиторно трансфікованою або бути підданою їх сполученню одним або декількома експресуючими 2ЕР векторами. У одному з варіантів здійснення один або декілька експресуючих 2ЕР векторів експресують в рослинній клітині-хазяїні одну або декілька 2ЕМ. У іншому варіанті здійснення один або декілька експресуючих 2ЕР векторів експресують в рослинній клітині-хазяїні один або декілька 2ЕР ТЕ.
У іншому аспекті в цьому документі описаний спосіб модуляції експресії одного або декількох генів, залучених до біосинтезу жирних кислот в рослинній клітині, де спосіб включає: (а) введення в рослинну клітину одного або декількох експресуючих векторів, що кодують один або декілька 2ЕР ТЕ, які зв'язуються з ділянкою-мішенню в одному або декількох генах, залучених до біосинтезу жирних кислот, в таких умовах, що відбувається експресія 2ЕР ТЕ і модуляція одного або декількох генів. Модуляція може являти собою активацію або репресію. У певних варіантах здійснення щонайменше один ділянка-мішень знаходиться в гені(ах) АССази,
КАБ І, КАБ ІЇ, КАБ ПШ, КАБ ІМ, ЕАТВІ, РГАТВ2, ГАТВЗ, ГАТВ4, ГАТВ5, БА, ЕАЕ, РагА, ГРад2г,
Еааз, СРОН, ОК і/або 5-АСР-ОЕЗ5. У інших варіантах здійснення відбувається модуляція більше одного гена, залученого до біосинтезу жирних кислот. У будь-якому зі способів модуляції експресії генів, залучених до біосинтезу жирних кислот, як описано в цьому документі, цими способами отримують рослинні клітини з модифікованим вмістом жирних кислот, наприклад, зі зниженням кількості насичених жирних кислот в рослинних клітинах. У деяких варіантах здійснення модифікований вміст жирних кислот в рослинних клітинах приводить до модифікованого вмісту жирних кислот в насінні рослини, наприклад, до зниження кількості насичених жирних кислот в насінні рослини. У деяких варіантах здійснення рослина являє собою олієпродукуючу рослину з модифікованим вмістом жирних кислот в насінні олієпродукуючої рослини (наприклад, зі зниженим вмістом насичених жирних кислот). У певному конкретному варіанті здійснення рослина являє собою рослину Вгаззіса парив з модифікованим вмістом жирних кислот в насінні рослини Вгабзбзіса пари (наприклад, зі зниженим вмістом насичених жирних кислот).
Зо У іншому аспекті в цьому документі описаний спосіб розщеплення одного або декількох генів, залучених до біосинтезу жирних кислот в рослинній клітині, де спосіб включає: (а) введення в рослинну клітину одного або декількох експресуючих векторів, що кодують одну або декілька нуклеаз (наприклад, 2ЕМ), які зв'язуються з ділянкою-мішенню в одному або декількох генах, залучених до біосинтезу жирних кислот, в таких умовах, що відбувається експресія нуклеаз(и) (наприклад, ЕМ) і розщеплення одного або декількох генів. У певних варіантах здійснення щонайменше одна ділянка-мішень знаходиться в гені, що кодує АССазу, КАЗ І, КА5
ІЇ, КАБ ПШ, КАБ ІМ, ЕАТВІ, ЕАТВ2, ГАТВЗ, ГАТВА, ЕАТВ5, ГАБ5, ЕАЕТ, Гага, Радг, Рааз, СРОН,
СК і/або 5-АСР-ОЕ5. У інших варіантах здійснення розщеплюється більше одного гена, залученого до біосинтезу жирних кислот. Крім того, в будь-якому зі способів, що описуються в цьому документі, розщеплення одного або декількох генів повинно приводити до делеції, додавання і/або заміни нуклеотидів в розщеплюваній області.
У ще одному аспекті в цьому документі описаний спосіб введення в геном рослинної клітини екзогенної послідовності, де спосіб включає стадії: (а) приведення клітини в контакт з екзогенною послідовністю (донорний вектор) і (б) експресію в клітині однієї або декількох нуклеаз (наприклад, нуклеаз з цинковими пальцями), як описано в цьому документі, де одна або декілька нуклеаз розщеплюють хромосомну ДНК так, що розщеплення хромосомної ДНК на етапі (Б) стимулює вбудовування донорного вектора в геном за допомогою гомологічної рекомбінації. У певних варіантах здійснення одна або декілька нуклеаз являють собою злиття домену розщеплення рестрикційної ендонуклеази типу 5 і сконструйованого зв'язувального домену цинкових пальців. У інших варіантах здійснення нуклеаза містить хомінг-ендонуклеазу, наприклад, хомінг-ендонуклеазу з модифікованим ДНК-зв'язувальним доменом. У будь-якому зі способів, що описуються в цьому документі, екзогенна послідовність може кодувати білковий продукт.
У ще одному додатковому аспекті також надана трансгенна або нетрансгенна рослинна клітина, що отримується будь-яким зі способів, описаних в цьому документі.
У іншому аспекті в цьому документі надана рослина, що містить трансгенну або нетрансгенну рослинну клітину, отриману, як описано в цьому документі.
У іншому аспекті в цьому документі надане насіння рослини, що містить трансгенну або нетрансгенну рослинну клітину, отриману, як описано в цьому документі.
У іншому аспекті в цьому документі надана олія з насіння, що отримується з рослини, що містить трансгенну або нетрансгенну рослинну клітину, отриману, як описано в цьому документі.
Короткий опис креслень
Фігура 1 являє собою схематичне зображення шляхів біосинтез жирних кислот в канолі (В. пари). Воно адаптоване по допп Зпапкіїп, ВгооКкпамеп Майопаї І арогагу, Оріоп, МУ (Тпеївп апа Опігодде, 2002, Метабоїїс епдіпеетіпа 4:12-21).
Фігура 2 являє собою схематичне зображення положень ділянок-мішеней в гені КА5БІЇ для різних ілюстративних направлених на КАФІЇ 2ЕР ТЕ. Числа означають ділянки-мішені ЕР, що містяться в конструкціях, приведених в таблиці ІІ. Склади 2ЕР приведені в таблицях | і ЇЇ.
Фігура З являє собою зображення експресії мРНК КАБІЇ в листі рослин То, трансформованому активуючою КАФІЇ конструкцією 2ЕР ТЕ 4695, як визначено за допомогою
КПЛР-РУ, у вигляді діаграми. Для розрахунку кратності зростання експресії, представленої на діаграмі, застосовували середнє по 27 контрольних рослинах. У певних випадках спостерігали більш ніж 3-и кратне зростання експресії МРНК КАФІЇ.
Фігура 4 являє собою зображення відношень експресії КАБІІ-2ЕР ТЕ/губуліну в листі рослин
Ті, детектованій КПЛР-РЧ, у вигляді діаграми. Порівнювали три випадки разом з відповідними нульовими значеннями.
Фігура 5 являє собою зображення у вигляді діаграми середніх відношень експресії мРНК
КАЗІЇ/тубуліну в ТЕ, які містять 2ЕР, і сегрегуючих нуль-рослин Ті, кожної з трьох подій, як визначено за допомогою кПЛР-РЧ. У листя цих рослин Ті: спостерігали 2-3-кратне підвищення експресії МРНК КАФБІЇ.
Фігури бА і 6В являють собою діаграми, отримані із застосуванням статистичного програмного забезпечення УМР для однофакторного аналізу жирних кислот(и)-мішеней, що демонструють узгоджене і значне (р-«0,001) зниження всіх С16 (6А) і зниження відношень всіх
С1б/всіх С18 (68) в позитивних по 2ЕР ТЕ рослин і сестринських нуль-рослин в кожному випадку. Всі С16 включали вміст С16:0 і С16:1, а всі С18 включали вміст С18:0, 18:1, 18:2 і 18:3.
На фігурі 7 приведено вирівнювання послідовностей АЕЗ318307 і АЕ244520. Затінення означає області точної гомології.
На фігурі 8 приведено вирівнювання послідовностей 5ЕО ІЮ МО:3, 5ЕО ІЮ МО:4, 5ЕО І
МО: 46, 5ЕО ІЮ МО:30, АС 189461 і ВН723504. Пунктирними лініями над відповідною послідовністю виділені послідовності прямого і зворотного праймерів (ЗЕО ІО МО:28 і 29) для ампліфікації КДНК р-кетоацил-АСР-синтетази ІІ. Затінення означає області точної гомології.
На фігурі 9 зображена експресія генів РаїВА і РаїВ5 в трансгенних лініях калюсів В. пари5 для різних складів 2ЕР ТЕ, присутніх в конструкціях рОАВ4690-рОАВ4692. Аналізували 17 ліній для контролю і 25 ліній для кожної з конструкцій 2ЕР. Чорні стовпці - експресія мРНК РЕаївВа; сірі стовпці - експресія МРНК Раїв5.
На фігурі 10 представлені експресії РаївВа і РаїВ5 в листі трансгенних рослин То В. парив, які аналізуються з використанням кПЛР-РЧ. У трансгенних рослинах тестували три конструкції, що містить ЕР ТЕ, рравВ4689-рОАВ4691. Загальна кількість незалежних трансгенних рослин Ті, що аналізуються в цьому експерименті, становила 40, 62, 41 ії 22 для ррдіВ4689-ррАВа4691 і рорАВ8210. відповідно. Контроль Мех710 складався з 10 рослин. Позитивними по експресії ЕР
ТЕ були дев'яносто сім процентів випадків перенесення трансгена для З конструкцій 2ЕР ТЕ, як визначено за допомогою аналізу експресії 2ЕР ТЕ (приклад 8.3). Подібні результати отримували, коли за допомогою еталона для нормалізації експресії генів ГаїВ використовували експресію мРНК природного тубуліну. Чорний стовпець - експресія РаїВ4; сірий стовпець - експресія РаїВ5.
Фігура 11 являє собою діаграму, що демонструє лінійну залежність між експресією генів РаЇВ і тубуліну при аналізі рослин Ті. Чорні квадрати - експресія РаїВаА; сірі ромби - експресія РаїВ5.
На фігурі 12 представлена кПЛР-РЧ для експресії РаїВ4 і РаїВ5 в листі рослин Ті, трансгенних по конструкції ЕР ТЕ ррАВ4691. Чорні квадрати - експресія РаїВаА; сірі ромби - експресія РаїВ5.
Фігура 13 являє собою однофакторний аналіз вмісту С18:0 на зразок з використанням статистичного програмного забезпечення МР.
На фігурі 14 представлений однофакторний аналіз загального вмісту С16/С18 на зразок з використанням програмного забезпечення для статистичного аналізу УМР.
На фігурі 15 представлений аналіз профілів ЕРА Т; зрілого насіння, що містить 4 випадки з конструкціями 2ЕР ТЕ, продемонстрований з використанням статистичного програмного забезпечення ОМР. На панелях А і В представлений однофакторний аналіз вмісту С18:0 і вмісту
С16:0/С18:0 на зразок (конструкцію), відповідно.
На фігурі 16 представлений аналіз профілів ЕРА Т; зрілого насіння, що містить 4 випадки з конструкціями 2ЕР ТЕ, продемонстрований з використанням статистичного програмного забезпечення ОМР. На панелях А і В представлений однофакторний аналіз вмісту С14:0 і вмісту
С16:1 на зразок (конструкцію), відповідно, що підкреслює диференціюючу властивість конструкції ррАБ5Ь227. Аналіз профілів БА Ті: зрілого насіння, що містить 4 випадки з конструкціями 2ЕР ТЕ, продемонстрований з використанням статистичного програмного забезпечення ОМР. На панелях А і В представлений однофакторний аналіз вмісту С14:0 ії С16:1 на зразок (конструкцію), відповідно, що підкреслює диференціюючу властивість конструкції ррАББ227.
На фігурі 17 продемонстроване зниження експресії мРНК Раїв5 (чорні стовпці) в незрілому насінні Т2, трансформованому конструкцією з 2ЕР ТЕ ррАБ5227. Експресія 2ЕР ТЕ представлена експресією ЕКЕЗ (сірі стовпці). Аналізували незріле насіння на 25 САЕ з чотирьох нуль-рослин, трьох гетерозиготних (5227 1221Е-1) і чотирьох гомозиготних (5227 122Е-2) рослин
Ті у випадку 5227-12.
На фігурі 18 представлене зниження експресії мРНК РаїВв5 (чорні стовпці) в незрілому насінні Т», трансформованому конструкцією з 2ЕР ТЕ рОрАБ5212. Експресія МРНК 2ЕР ТЕ представлена експресією ККАВІ (сірі стовпці). Аналізували незріле насіння на 25 БАЕ з п'яти нуль-рослин, трьох гетерозиготних і чотирьох гомозиготних рослин у випадку 5212-4.
На фігурі 19 представлений однофакторний аналіз всіх насичених жирних кислот (насич.) відповідно до зиготності насіння Т2 у випадку 5227-12 з 2ЕР ТЕ. Насіння ТТ», отримане з нуль- рослин, гетерозиготних і гомозиготних вихідних рослин Ті, позначали як 5227-127Е нуль, 52271- 12721) і 5227-1227 (2), відповідно.
На фігурі 20 представлений однофакторний аналіз всіх насичених жирних кислот (насич.) відповідно до зиготності насіння Тг2 у випадку 5227-4 з 2ЕР ТЕ. Насіння ТТ», отримане з рослин негативного контролю, гетерозиготних і гомозиготних вихідних рослин Ті, позначали як 5227- 47Е нуль, 5227-42К(1) і 5227-47 (2), відповідно.
Докладний опис
У даному документі описані композиції і способи, придатні для модуляції експресії і направленого розщеплення і зміни однієї або декількох генів, залученого до синтезу жирних
Зо кислот у рослин. Регуляцію таких генів можна модулювати, наприклад, використовуючи конструйовані фактори транскрипції з ЕР або модифікуючи регуляторні області гена. Гени можна змінювати, наприклад, за допомогою направленого розщеплення з подальшою внутрішньохромосомною гомологічною рекомбінацією або за допомогою направленого розщеплення з подальшою гомологічною рекомбінацією між екзогенним полінуклеотидом (що містить одну або декілька областей гомології з нуклеотидною послідовністю гена) і геномною послідовністю.
Геномні послідовності включають послідовності, присутні в хромосомах, епісомах, геномах органел (наприклад, мітохондрій, пластид), штучних хромосомах і нуклеїновій кислоті будь- якого іншого типу, присутні в клітині, наприклад, такі як ампліфіковані послідовності, подвійні мікрохромосоми і геноми ендогенних або інфікуючих бактерій і вірусів. Геномні послідовності можуть бути нормальними (тобто, дикого типу) або мутантними; мутантні послідовності можуть містити, наприклад, вставляння, делеції, транслокації, перестановки і/або точкові мутації.
Геномна послідовність також може містити один з ряду різних алелів.
Композиції, що описуються в цьому документі, містять один або декілька 2ЕР, що містять конструйовані зв'язувальні домени цинкових пальців, полінуклеотиди, що кодують ці поліпептиди і комбінації ЕР ії кодуючі 2ЕР полінуклеотидів. Зв'язувальний домен цинкових пальців може містити один або декілька цинкових пальців (наприклад, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або більше цинкових пальців), і його можна конструювати для зв'язування з будь-якою геномною послідовністю гена, включаючи регуляторні послідовності, функціонально зв'язані з геном, залученим до біосинтезу жирних кислот.
Як описано в цьому документі, 2ЕР можна використовувати для регуляції експресії гена за допомогою активації або репресії транскрипції гена. Можна конструювати 2ЕР, що містить злиття доменів цинкових пальців, зв'язаних з регуляторними доменами, з отриманням химерних факторів транскрипції, що активують або що репресують транскрипцію. 2ЕР також можна використовувати для направленого розщеплення області геному, яка представляє інтерес, за допомогою зв'язування доменів цинкових пальців з доменами розщеплення нуклеаз (або напівдоменами розщеплення) з отриманням нуклеаз з цинковими пальцями. Таким чином, при ідентифікації області-мішені генома, яка представляє інтерес, для якої бажані регуляція, розщеплення або рекомбінація гена, способами, що описуються в цьому документі, можна бо конструювати білок з цинковими пальцями, що містить один або декілька злитих білків, що містить один або декілька регуляторних доменів і/або доменів розщеплення (або напівдоменів розщеплення), зв'язаних з доменом цинкових пальців, сконструйованим для розпізнавання генної послідовності в цій геномній області. Присутність такого злитого білка (або білків), який (які) містить(тять) 2ЕР, в клітині приводить до зв'язування злитого білка(ів) з його (їх) ділянкою(ами) зв'язування і змінює регуляцію або розщеплення геномної області або області поруч з нею. Крім того, якщо розщеплюють геномну область і в клітині також присутній екзогенний полінуклеотид, гомологічний цій геномній області, між геномною областю і екзогенним полінуклеотидом з високою імовірністю відбувається гомологічна рекомбінація.
Як показано на фігурі 1, існує декілька генів, залучених до біосинтезу жирних кислот. Таким чином, композиції, що описуються в цьому документі, можуть бути направленими на один або декілька з цих генів в рослинній клітині включаючи як необмежувальних приклади генів(а)
АсСсази, КАЗ І, КАБ ІІ, КАЗ І, КА5 ІМ, ЕАТВІ, ЕАТВ2, ЕАТВЗ, ЕАТВ4, ЕАТВ5, ЕА5, ЕАЕТ, РагА,
ЕРад2, Рааз, СРОН, СК або 5-АСР-ОЕЗ і ортологи, паралоги і гомеологи цих генів. Наприклад, білки (наприклад, 2ЕР), що описуються в цьому документі, можуть бути направленими на 1, 2, 3, 4, 5 або більше генів, залучених до біосинтезу жирних кислот. Таким чином, для направлення на бажані гени, які представляють інтерес, в рослині можна комбінувати один або декілька ЕР або експресуючих векторів, що кодують 2ЕР, різної специфічності.
Загальна частина
Якщо не указано інакше, при практичному застосуванні способів, а також при отриманні і застосуванні композицій, які описуються в цьому документі, використовують загальноприйняті способи в галузях молекулярної біології, біохімії, структури і аналізу хроматину, обчислювальної хімії, культивування клітин, рекомбінантних ДНК і пов'язаних областях, як відомо фахівцям в даній галузі. Ці способи повністю описані в літературі. Див., наприклад, ЗатбгоокК еї аї.
МОГ ЕСОГ АВ СІ ОМІМИ: А ГГ АВОВАТОВУ МАМОАЇ,, Зесопа еайіоп, Соїа бргіпд Натбог І арогайгу
Ргез5, 1989 апа Тніка єайіоп, 2001; А!йзибреї єї а, СОВАВЕМТ РАОТОСОЇ 5 ІМ МОГ ЕСШОГ АВ
ВІОГОСУ, уЧопп МуУйеу б Боп5, Мем МогКк, 1987 апа регіодіс ирадаїев; Ше зейез МЕТНООЮ5 ІМ
ЕМ2УМОГ ОСТ, Асадетіс Ргезв, Зап бівєдо; Моїйе, СНВОМАТІМ ЗТАОСТОВЕ АМО РОМСТІОМ,
Тпіга еййіоп, Асадетіс Ргебз5, Зап Оієвєдо, 19985 МЕТНОЮ5 ІМ ЕМ2УМОГ ОС, Мої. 304, "Спготаййп" (Р.М. МУаззаптап апа А.Р. МУоїШНе, ейв.), Асадетіс Ргеб55, Зап Оієдо, 1999; і
Коо) МЕТНООЗ5 ІМ МОГЕСОИЇІ АВ ВІОГ ОСТ, Мої. 119, "Спготаїйіп Ргоїосої!в" (Р.В. ВескКег, вда.) Нитапа
Рге55, Тоїома, 1999.
Визначення
Терміни "нуклеїнова кислота", "полінуклеотид" і "олігонуклеотид" використовують взаємозамінно, і вони стосуються дезоксирибонуклеотидного або рибонуклеотидного полімеру, в лінійній або кільцевій конформації, і в одно- або дволанцюжковій формі. Для цілей даного опису ці терміни не треба розглядати як обмежуючі відносно довжини полімеру. Терміни можуть включати відомі аналоги природних нуклеотидів, а також нуклеотиди, які модифіковані по групах основи, цукру і/або фосфату (наприклад, тіофосфатні каркаси). Як правило, аналог конкретного нуклеотиду має ту ж специфічність спарювання основ; наприклад аналог А утворює пару основ з Т.
Терміни "поліпептид", "пептид" і "білок" використовують взаємозамінно для позначення полімеру з амінокислотних залишків. Термін також використовують для полімерів з амінокислот, в яких одна або декілька амінокислот являють собою хімічні аналоги або модифіковані похідні відповідних природних амінокислот. "Зв'язування" стосується специфічної для послідовності нековалентної взаємодії між макромолекулами (наприклад, між білком і нуклеїновою кислотою). Не всі компоненти зв'язувальної взаємодії повинні бути специфічними для послідовності (наприклад, контакти з фосфатними залишками в каркасі ДНК), за умови, що загалом взаємодія є специфічною для послідовності. Такі взаємодії, як правило, характеризуються константою дисоціації (Ка) 105 М" або нижче. "Афінність" стосується сили зв'язування: більш висока афінність зв'язування корелює з меншою Ка. "Зв'язувальний білок" являє собою білок, здатний нековалентно зв'язуватися з іншою молекулою. Зв'язувальний білок може зв'язуватися, наприклад, з молекулою ДНК (ДНК- зв'язувальний білок), молекулою РНК (РНК-зв'язувальний білок) і/або молекулою білка (білок- зв'язувальний білок). У разі білок-зв'язувального білка, він може зв'язуватися сам з собою (з формуванням гомодимерів, гомотримерів і т. д.), або він може зв'язуватися з однією або декількома молекулами іншого білка або білків. Зв'язувальний білок може мати більше, ніж один тип зв'язувальної активності. Наприклад, білки з цинковими пальцями мають ДНК-зв'язувальну,
РНК-зв'язувальну і білок-зв'язувальну активність.
"ДНК-зв'язувальний білок з цинковими пальцями" (або зв'язувальний домен) являє собою білок або домен в більш великому білку, який зв'язує ДНК специфічним для послідовності чином за допомогою одного або декількох цинкових пальців, які являють собою області амінокислотної послідовності в зв'язувальному домені, структура яких стабілізована за допомогою координаційної взаємодії з іоном цинку. Термін ДНК-зв'язувальний білок з цинковими пальцями часто скорочують як білок з цинковими пальцями або 2ЕР.
Зв'язувальні домени цинкових пальців можуть бути "конструйованими" для зв'язування з попередньо визначеною нуклеотидною послідовністю (наприклад, послідовністю-мішенню в будь-якому гені, залученому до біосинтезу жирних кислот). Необмежувальні приклади способів конструювання білків з цинковими пальцями являють собою складання і відбір. Складений білок з цинковими пальцями являє собою білок, що не зустрічається в природі, склад/композиція якого в основному є результатом раціональних критеріїв. Раціональні критерії складання включають застосування правил замін і комп'ютеризованих алгоритмів для обробки інформації в базі даних, що зберігає інформацію про існуючі конструкції 2ЕР і дані зв'язування. Див., наприклад, патенти США 6140081; 6453242; 6534261 і 6785613; також див. М/О 98/53058; УМО 98/53059; УМО 98/53060; УМО 02/016536 і УМО 03/016496 і патенти США 6746838; 6866997 і 7030215. Таким чином, "конструйований" білок з цинковими пальцями або "неприродний" білок з цинковими пальцями являє собою білок, в якому один або декілька компонентів ДНК- зв'язувальних доменів цинкових пальців (розпізнавальних спіралей) є неприродними і сконструйовані для зв'язування із заздалегідь вибраною ділянкою-мішенню. "Відібраний" білок з цинковими пальцями являє собою білок, що не зустрічається в природі, отримання якого переважно є результатом емпіричного способу, такого як фаговий дисплей, уловлювання взаємодій або відбір гібридів. Див. наприклад, 5 5789538; Ш5 5925523; 5 6007988; 05 6013453; 005 6200759; 05 6733970; 05 КЕ39229 і УМО 95/19431; МО 96/06166; УМО 98/53057; УМО 98/54311; МО 00/27878; МО 01/60970 УМО 01/88197 і МО 02/099084.
Термін "послідовність" стосується нуклеотидної послідовності будь-якої довжини, яка може являти собою ДНК або РНК; може бути лінійною, кільцевою або розгалуженою і може бути одноланцюжковою або дволанцюжковою. Термін "донорна послідовність" стосується нуклеотидної послідовності, яка вставлена в геном. Донорна послідовність може мати будь-яку довжину, наприклад довжину від 2 до 25000 нуклеотидів (або будь-яке цілочисельне значення між ними або більшим), переважно - довжиною приблизно від 100 до 5000 нуклеотидів (або будь-яким цілочисельним значенням між ними), більш переважно - довжиною приблизно від 200 до 2500 нуклеотидів. "Гомологічна послідовність" стосується першої послідовності, яка має певний ступінь ідентичності послідовностей з другою послідовністю, і послідовність якої може бути ідентична послідовності другої послідовності. "Гомологічна неідентична послідовність" стосується першої послідовності, яка має певний ступінь ідентичності послідовностей з другою послідовністю, але послідовність якої не є ідентичною послідовності другої послідовності. Наприклад, полінуклеотид, що містить послідовність дикого типу мутантного гена, гомологічний і неідентичний послідовності мутантного гена. У певних варіантах здійснення ступінь гомології між двома послідовностями є достатнім для забезпечення гомологічної рекомбінації між ними з використанням нормальних клітинних механізмів. Довжина двох гомологічних неідентичних послідовностей може бути будь-якою, а їх ступінь негомологічності може бути настільки малою, як одиничний нуклеотид (наприклад, для корекції точкової геномної мутації за допомогою гомологічної рекомбінації) або настільки великий, як 10 або більше тисячі пар основ (наприклад, для вставляння гена вв попередньо визначену ділянку хромосоми). Довжина двох полінуклеотидів, що містить гомологічні неідентичні послідовності, не повинна бути однаковою.
Наприклад, можна використовувати екзогенний полінуклеотид (тобто, донорний полінуклеотид) довжиною від 20 до 10000 нуклеотидів або пар нуклеотидів.
Способи визначення ідентичності нуклеїнових кислот і амінокислотних послідовностей відомі в даній галузі Як правило, такі способи включають визначення нуклеотидної послідовності мРНК гена і/або визначення амінокислотної послідовності, що кодується нею, і порівняння цих послідовностей з другою нуклеотидною або амінокислотною послідовністю.
Геномні послідовності також можна визначати і порівнювати таким способом. У основному, ідентичність стосується точної відповідності нуклеотид-до-нуклеотиду або амінокислота-до- амінокислоти двох полінуклеотидних або поліпептидних послідовностей, відповідно. Дві або більше послідовності (полінуклеотидних або амінокислотних) можна порівнювати, визначаючи процент їх ідентичності. Процент ідентичності двох послідовностей, послідовностей нуклеїнової кислоти або амінокислотних послідовностей являє собою число точної відповідності між двома 60 вирівняними послідовностями, розділене на довжину більш коротких послідовностей і помножене на 100. Приблизне вирівнювання послідовностей нуклеїнової кислоти забезпечує алгоритм локальної гомології 5тйй апа У/агептпап, Адмапсез іп Арріїєа МаШетаїгісзв 2:482-489 (1981). Цей алгоритм можна застосовувати для амінокислотних послідовностей, використовуючи оцінну матрицю, розроблену Юаупоїйї, Айазх ої Ргоївіп Зедоепсев5 апа 5ігисіиге,
М.О. БОауноїї єд., 5 з,иррі. 3:353-358, Майопа! Віотедіса! Везєагс! ЕРоипааїйоп, УУазпіпдюп, 0.С.,
О5А, і нормалізовану сгір5Ком, Мисі. Асіаз Кев. 14(6):6745-6763 (1986). Ілюстративна реалізація цього алгоритму з визначенням процента ідентичності послідовностей надана сСепеїіс5
Сотршег Сгоимр (Мадізоп, М/І) в практичному додатку "Вевігії". Параметри за умовчанням для цього способу описані в керівництві Умізсопзіп Зедиепсе Апаїузії РасКаде Ргодгат Мапциаї,
Мегзіоп 8 (1995) (доступному в Сепеїїс5 Сотршег Сгоир, Мадізоп, УМ). Переважним способом визначення процента ідентичності в контексті даного опису є використання пакета програм
МРБЗЕСН, що належить Опімегейу ої Едіпригуй, розробленого Удопп Е. Соїйп5 і Зпапе 5. 5шіІТОК і поширюваного ІпіейПКзепеїіс5, Іпс. (Моипіайп Міем7, СА). З цього сімейства пакетів можна використовувати алгоритм Сміта-Уотермана, де для оцінної таблиці використовують параметри за умовчанням (наприклад, штраф за створення пропуску 12, штраф за продовження пропуску - одиниця, і пропуск - шість). У отримуваних даних значення "співпадає" означає ідентичність послідовностей. У даній галузі відомі інші відповідні програми для розрахунку процента ідентичності або схожості між послідовностями, наприклад, іншою програмою вирівнювання є
ВІГАБТ, що використовується з параметрами за умовчанням. Наприклад, можна використовувати ВГАЗТМ і ВГАБТР з використанням наступних параметрів за умовчанням: генетичний код-стандартний; фільтр-відсутній; ланцюг-:обидва; поріг-б0О; очікування-10; матриця-ВІ О5ИМб62; описи-50 послідовностей; сортування-по найбільшому показнику; бази даних-невироджена, СепВапк-ЕєЕМВІ -008.)-РОВ».трансляція СепВапк в СО5ББм/із5 ргоїеіпяЗрирадайенРІК. Подробиці про ці програми можна знайти в Інтернеті. Відносно послідовностей, що описуються в цьому документі, діапазон бажаних ступенів ідентичності послідовностей складає приблизно від 35 95 до 100 95 і будь-яке цілочисельне значення між ними. Як правило, процент ідентичності послідовностей складає щонайменше 35-40 95; 40-45 95; 45-50 90; 50-60 95; 60-70 90; 70-75 95, переважно 80-82 95, більш переважно 85-90 95, навіть більш переважно 92 95, ще більш переважно 95 95, а найбільш переважно 98 95.
Альтернативно, ступінь схожості послідовностей полінуклеотидів можна визначати за допомогою гібридизації полінуклеотидів в умовах, що допускають формування стабільних дуплексів між гомологічними областями, з подальшим розщепленням специфічною до одиночного ланцюга нуклеазою(ами) і визначенням розмірів розщеплених фрагментів. Дві послідовності нуклеїнових кислот або дві поліпептидних послідовності є значною мірою гомологічними одна одній, коли ідентичність послідовностей складає щонайменше приблизно 70-75 95, переважно 80-82 95, більш переважно 85-90 95, навіть більш переважно 92 95, ще більш переважно 95 95, а найбільш переважно 98 95 в порівнянні з певною довжиною молекули, як визначають описаними вище способами. Як застосовують в цьому документі, значною мірою гомологічні також стосується послідовностей, що демонструють повну ідентичність з конкретною послідовністю ДНК або поліпептидною послідовністю. Послідовності ДНК, гомологічні значною мірою, можна ідентифікувати в експерименті гібридизації по Саузерну, наприклад, в жорстких умовах, як визначено для конкретної системи. Визначення відповідних умов гібридизації відоме фахівцям в даній галузі. Див., наприклад, Затьгоок еї аї., вище; Мисієїс
Асіа Нубгіаігайоп: А Ргасіїсаї Арргоаси, єайогх В.О. Натевз апа 5.9. Ніддіпв, (1985). Охіога;
Мазпіпдюп, ОС; ІВ. Ргевзв.
Селективну гібридизацію двох фрагментів нуклеїнової кислоти можна визначати, як зазначено нижче. Ступінь ідентичності послідовностей двох молекул нуклеїнової кислоти впливає на ефективність і силу подій гібридизації між такими молекулами. Частково ідентична послідовність нуклеїнової кислоти щонайменше частково інгібує гібридизацію повністю ідентичної послідовності з молекулою-мішенню. Інгібування гібридизації повністю ідентичної послідовності можна оцінювати з використанням аналізів гібридизації, які добре відомі в даній галузі (наприклад, саузерн-блот (ДНК), нозерн-блот (РНК), гібридизація в розчині або т. п., див. затргоокК, еї аї., МоїІесшаг Сіопіпд: А Іарогаїту Мапиа!ї, Зесопі Еайіоп, (1989) Соїй Б5рііпд
Нагбог, М.У.). Такі аналізи можна проводити з використанням варіюючих ступенів селективності, наприклад, з використанням умов, що варіюють від низької до високої жорсткості. Якщо використовують умови низької жорсткості, відсутність неспецифічного зв'язування можна оцінювати з використанням вторинного зонда з відсутністю навіть часткового ступеня ідентичності послідовностей (наприклад, зонд менше ніж приблизно з 30 95 ідентичності послідовності з молекулою-мішенню) так, що за відсутності подій неспецифічного зв'язування бо вторинний зонд не гібридизується з мішенню.
При використанні системи детекції на основі гібридизації вибирають зонд нуклеїнової кислоти, комплементарний еталонній послідовності нуклеїнової кислоти, а потім за допомогою підбору прийнятних умов зонд і еталонну послідовність селективно гібридизують або зв'язують одне з одним з формуванням дуплексної молекули. Молекула нуклеїнової кислоти, здатна до селективної гібридизації з еталонною послідовністю в помірно жорстких умовах гібридизації, як правило, гібридизується в умовах, що дозволяють детекцію послідовності-мішені нуклеїнової кислоти довжиною щонайменше приблизно 10-14 нуклеотидів щонайменше приблизно з 70 95 ідентичністю послідовності з послідовністю вибраного зонда нуклеїнової кислоти. Жорсткі умови гібридизації, як правило, дозволяють детекцію послідовностей-мішеней нуклеїнової кислоти довжиною щонайменше приблизно 10-14 нуклеотидів з ідентичністю послідовності, більшою ніж приблизно 90-95 95, з послідовністю вибраного зонда нуклеїнової кислоти. Умови гібридизації, придатні для гібридизації зонда/еталонної послідовності, де зонд і еталонна послідовність мають певний ступінь ідентичності послідовностей, можна визначати, як відомо в даній галузі (див., наприклад, Мисієїс Асій НуБбгіаігацноп: А Ргасіїса! Арргоасі, еайог5 В.О. Натез апа 5.9.
Ніддіпв, (1985) Охгога; ММазпіпаїоп, ОС; ІВІ. Ргев5).
Умови гібридизації добре відомі фахівцям в даній галузі. Жорсткість гібридизації стосується ступеня, з яким умови гібридизації несприятливі для формування гібридів, що містить неспівпадаючі нуклеотиди, з більш високою жорсткістю, коюорелюючою з меншою допустимістю для неспівпадаючих гібридів. Фактори, що впливають на жорсткість гібридизації, добре відомі фахівцям в даній галузі і як необмежувальні приклади включають температуру, рн, іонну силу і концентрацію органічних розчинників, наприклад, таких як формамід і диметилсульфоксид. Як відомо фахівцям в даній галузі, жорсткість гібридизації зростає при підвищенні температури, зниженні іонної сили і зниженні концентрації розчинників.
Відносно жорсткості умов гібридизації в даній галузі добре відомо, що для встановлення конкретної жорсткості можна використовувати множину еквівалентних умов, наприклад, варіюючи наступні фактори: довжину і характер послідовностей, склад основ різних послідовностей, концентрації солей і інших компонентів розчину для гібридизації, присутність або відсутність в розчинах для гібридизації блокуючих засобів (наприклад, декстрансульфату і поліетиленгліколю), температуру реакції гібридизації і часові параметри, а також варіювання
Зо умов відмивання. Вибір конкретного набору умов гібридизації проводять відповідно до стандартних способів в даній галузі (див., наприклад, ЗатюбгоокК, еї аї., МоїІесшіаг Сіопіпд: А
І арогаїогу Мапиаї, 5есопа Едійоп, (1989) Соїй 5ргіпд Набог, М.М.). "Рекомбінація" стосується процесу обміну генетичною інформацією між двома полінуклеотидами. Для цілей даного опису "гомологічна рекомбінація (НК)" стосується спеціалізованої форми такого обміну, яка відбувається, наприклад, при відновленні подвійних розривів ланцюга в клітинах. Цей процес вимагає гомології нуклеотидних послідовностей, використовує "донорну" молекулу для відновлення матриці молекули-"мішені" (тобто, молекули, де стався подвійний розрив ланцюга) і під різними назвами відомий як "некросоверна генна конверсія" або "генна конверсія на коротких ділянках", оскільки він приводить до перенесення генетичної інформації від донора до мішені. Без бажання бути пов'язаним якою-небудь конкретною теорією, таке перенесення може залучати корекцію невідповідностей гетеродуплекса ДНК, що формується між розірваною мішенню і донором, і/або "залежний від синтезу відпал ланцюгів", в якому донор застосовують для відтворення генетичної інформації, яка стає частиною мішені і/або пов'язані процеси. Така спеціалізована НК часто приводить до зміни послідовності молекули-мішені так, що в полінуклеотид-мішень вбудовується частина або вся послідовність донорного полінуклеотиду. "Розщеплення" стосується розриву ковалентного каркаса молекули ДНК. Розщеплення можна ініціювати множиною способів, включаючи як необмежувальні приклади ферментативний або хімічний гідроліз фосфодіефірного зв'язку. Можливо одноланцюжкове розщеплення і дволанцюжкове розщеплення, і дволанцюжкове розщеплення може відбуватися як результат двох окремих подій одноланцюжкового розщеплення. Розщеплення ДНК може приводити до утворення тупих кінців або липких кінців. У певних варіантах здійснення для направленого дволанцюжкового розщеплення ДНК використовують злиті поліпептиди. "Домен розщеплення" містить одну або декілька поліпептидних послідовностей, які мають каталітичну активність відносно розщеплення ДНК. Домен розщеплення може міститися в одному поліпептидному ланцюгу, або розщеплювальна активність може бути результатом асоціації двох (або більше) поліпептидів. "Напівдомен розщеплення" являє собою поліпептидну послідовність, яка в поєднанні з другим поліпептидом (ідентичним або відмінним) формує комплекс з розщеплювальною бо активністю (переважно активність розщеплення подвійного ланцюга).
"Хроматин" являє собою нуклеопротеїнову структуру, що містить клітинний геном. Клітинний хроматин містить нуклеїнову кислоту, переважно ДНК, і білки, включаючи гістони і негістонові хромосомні білки. Більшість хроматину еукаріотичних клітин присутня у формі нуклеосом, де ядро нуклеосоми містить приблизно 150 пар основ ДНК, асоційованих з октамером, що містить по два кожного з гістонів Н2А, Н2В, НЗ ії НА; і лінкерну ДНК (змінної довжини залежно від організму), розташовану між ядрами нуклеосом. Молекула гістону Н, як правило, асоційована з лінксерною ДНК. Для цілей даного опису термін "хроматин" призначений для включення всіх типів клітинних нуклеопротеїнів, прокаріотичних і еукаріотичних. Клітинний хроматин включає хромосомний і епісомний хроматин. "Хромосома" являє собою хроматиновий комплекс, що містить весь геном клітини або його частину. Геном клітини часто характеризують за допомогою його каріотипу, що являє собою набір всіх хромосом, що містить геном клітини. Геном клітини може містити одну або декілька хромосом. "Епісома" являє собою нуклеїнову кислоту, яка реплікується, нуклеопротеїновий комплекс або іншу структуру, що містить нуклеїнову кислоту, що не є частиною хромосомного каріотипу клітини. Приклади епісом включають плазміди і певні вірусні геноми. "Досяжна область" являє собою ділянку в клітинному хроматині, в якій ділянка-мішень, присутня в нуклеїновій кислоті, може бути зв'язана екзогенною молекулою, що розпізнає ділянку-мішень. Без бажання бути зв'язаним якою-небудь конкретною теорією, вважають, що досяжна область являє собою область, не упаковану в нуклеосомну структуру. Певну структуру досяжної області часто можна детектувати по її чутливості до хімічних і ферментативних зондів, наприклад, нуклеаз. "Ділянка-мішень" або "послідовність-мішень" являє собою послідовність нуклеїнової кислоти, яка визначає частину нуклеїнової кислоти, з якою зв'язується зв'язувальна молекула за умови наявності умов, достатніх для зв'язування. Наприклад, послідовність 5'-ЯААТТО-3' являє собою ділянку-мішень для рестрикційної ендонуклеази ЕсоВІ. "Екзогенна" молекула являє собою молекулу, яка в нормі не присутня в клітині, але яку можна вводити в клітину одним або декількома генетичними, біохімічними або іншими способами. "Присутність в клітині в нормі" визначають відносно конкретної стадії розвитку
Зо клітини і умов оточуючого її середовища. Таким чином, наприклад, молекула, яка присутня тільки при ембріологічному розвитку м'яза, являє собою екзогенну молекулу відносно дорослої м'язової клітини. Подібним чином, молекула, що індукується тепловим шоком, являє собою екзогенну молекулу відносно клітини поза тепловим шоком. Екзогенна молекула може містити, наприклад, функціонуючу версію неправильно функціонуючої ендогенної молекули або неправильно функціонуючу версію нормально функціонуючої ендогенної молекули.
Зокрема, екзогенна молекула може являти собою низькомолекулярну сполуку, таку як отримують способом комбінаторної хімії, або макромолекулу, таку як білок, нуклеїнова кислота, вуглевод, ліпід, глікопротеїн, ліпопротеїн, полісахарид і будь-яке модифіковане похідне вказаних вище молекул, або будь-який комплекс, що містить одну або декілька з вказаних вище молекул. Нуклеїнові кислоти включають ДНК і РНК, можуть бути одно- або дволанцюжковими; можуть бути лінійними, розгалуженими або кільцевими; і можуть мати будь-яку довжину.
Нуклеїнові кислоти включають нуклеїнові кислоти, здатні до формування дуплексів, а також формуючі триплекси нуклеїнові кислоти. Див., наприклад, патенти США МоМо 5176996 і 5422251.
Білки як необмежувальні приклади включають ДНК-зв'язувальні білки, фактори транскрипції, фактори перебудови хроматину, білки, які зв'язують метиловану ДНК, полімерази, метилази, деметилази, ацетилази, деацетилази, кінази, фосфатази, інтегрази, рекомбінази, лігази, топоіїзомерази, гірази і гелікази.
Екзогенна молекула може бути молекулою того ж типу, що і ендогенна молекула, наприклад, екзогенний білок або нуклеїнова кислота. Наприклад, екзогенна нуклеїнова кислота може включати інфікуючий вірусний геном, Т-ланцюг Адгобасієгцт іШтегасієп5, плазміду або епісому, що вводиться в клітину, або хромосому, яка в нормі не присутня в клітині. Способи введення екзогенних молекул в клітини відомі фахівцям в даній галузі і як необмежувальні приклади включають опосередковуване ліпідами перенесення (тобто, ліпосоми, що містять нейтральні і катіонні ліпіди), електропорацію, пряму ін'єкцію, злиття клітин, бомбардування частинками, співосадження з фосфатом кальцію, опосередковуване ОЕАЕ-декстраном перенесення і опосередковуване вірусним вектором перенесення. Екзогенна молекула, що не є молекулою рослини, може являти собою, наприклад, антитіло ссавця (наприклад, людини або гуманізоване).
На відміну від цього, "ендогенна" молекула являє собою молекулу, яка в нормі присутня в бо конкретній клітині в конкретній стадії розвитку в конкретних умовах навколишнього середовища.
Наприклад, ендогенна нуклеїнова кислота може включати хромосоми, геном мітохондрії, хлоропласта або іншої органели або природну епісомну нуклеїнову кислоту. Додаткові ендогенні молекули можуть включати білки, наприклад, фактори транскрипції і ферменти. "Злита" молекула являє собою молекулу, в якій зв'язані дві або більше молекулярні субодиниці, переважно ковалентно. Молекулярні субодиниці можуть бути молекулами однакового хімічного типу або можуть бути молекулами різних хімічних типів. Приклади злитої молекули першого типу як необмежувальні приклади включають злиті білки (наприклад, що містить 2ЕМ злиття між ДНК-зв'язувальним доменом 2ЕР і доменом розщеплення) і злиті нуклеїнові кислоти (наприклад, нуклеїнова кислота, що кодує злитий білок, описаний вище).
Приклади злитої молекули другого типу як необмежувальні приклади включають злиття між формуючою триплекс нуклеїновою кислотою і поліпептидом і злиття між засобом, який зв'язує малу борозенку, і нуклеїновою кислотою.
Експресія злитого білка в клітині може бути результатом доставки злитого білка в клітину або доставки в клітину полінуклеотиду, що кодує злитий білок, де полінуклеотид транскрибується і транскрипт транслюється з отриманням злитого білка. Також в експресію білка в клітині можуть бути залучені транссплайсинг, розщеплення поліпептидів і лігування поліпептидів. Способи доставки полінуклеотидів і поліпептидів в клітини надані в іншій частині цього опису. "Ген" для цілей даного опису включає область ДНК, що кодує продукт гена (див. нижче), а також всі області ДНК, які регулюють отримання продукту гена, чи є такі регуляторні послідовності прилеглими до кодуючих і/або транскрибованих послідовностей чи ні. Таким чином, ген включає, але не обов'язково обмежений ними, промоторні послідовності, термінатори, послідовності регуляції трансляції, такі як ділянки зв'язування рибосом і внутрішні ділянки зв'язування рибосом, енхансери, сайленсери, інсулятори, граничні елементи, ділянки початку реплікації, ділянки прикріплення до матриксу і області контролю локусів. "Експресія гена" стосується перетворення інформації, що міститься в гені, в продукт гена.
Продукт гена може являти собою безпосередній продукт транскрипції гена (наприклад, мРНК,
ТРНК, рРНК, антисмислова РНК, рибозим, кшеРНК, мікро-РНК, структурна РНК або РНК будь- якого іншого типу) або білок, продукований за допомогою трансляції мРНК. Продукти генів
Зо також включають РНК, що модифікується такими процесами, як кепування, поліаденілування, метилування і редагування, і білки, які модифікуються, наприклад, метилуванням, ацетилуванням, фосфорилуванням, убіквітинілуванням, АДФ-рибозилілуванням, міристилуванням і глікозилуванням. "Модуляція" експресії гена стосується зміни активності гена. Модуляція експресії як необмежувальні приклади може включати активацію генів і репресію генів. "Рослинні" клітини як необмежувальні приклади включають клітини односім'ядольних (однодольних) або двосім'ядольних (дводольних) рослин. Необмежувальні приклади однодольних рослин включають злакові рослини, такі як кукурудза, рис, ячмінь, овес, пшениця, сорго, жито, цукрова тростина, ананас, цибуля, банан і кокос. Необмежувальні приклади дводольних рослин включають тютюн, помідор, соняшник, бавовну, цукровий буряк, картоплю, салат-латук, диню, сою, канолу (ріпак) і люцерну. Рослинні клітини можуть бути з будь-якої частини рослини і/або з будь-якої стадії розвитку рослини. Таким чином, рослинні клітини можуть являти собою клітини з насіння рослин. У деяких варіантах здійснення рослина або рослинна клітина являють собою рослину або походять з рослини, залученої до отримання рослинних олій для харчових і/або промислових видів застосування (тобто, "олієпродукуюча рослина"). Ілюстративні олієпродукуючі рослини як необмежувальні приклади включають види
Вгазвіса (наприклад, Вгазвзіса пари5, що включає сорти каноли), кукурудзу, сою, катран, гірчицю, рициновий біб, арахіс, кунжут, бавовну, насіння льону, сафлор, олійну пальму, льон, соняшник і кокос. "Областю, яка представляє інтерес" є будь-яка область клітинного хроматину, наприклад, така як ген або некодуюча послідовність в гені або прилягаюча до нього, з якою бажано зв'язувати екзогенну молекулу. Зв'язування можна проводити з метою направленого розщеплення ДНК і/або направленої рекомбінації. Область, яка представляє інтерес, може знаходитися, наприклад, в хромосомі, епісомі, геномі органели (наприклад, мітохондрії, хлоропласту) або в інфікуючому вірусному геномі. Область, яка представляє інтерес, може знаходитися в кодуючій області гена, в транскрибованих некодуючих областях, наприклад, таких як лідерні послідовності, трейлерні послідовності або інтрони, або в нетранскрибованих областях, вище або нижче кодуючої області. Довжина області, яка представляє інтерес, може бути наскільки малою як одна нуклеотидна пара або може складати до 25000 пар нуклеотидів, бо або будь-яка цілочисельна кількість пар нуклеотидів.
Терміни "функціональний зв'язок" і "функціонально зв'язаний" використовують взаємозаміно відносно суміжного положення двох або більше компонентів (таких як елементи послідовності), в яких компоненти розташовані так, що обидва компоненти нормально функціонують і допускають можливість того, що щонайменше один з компонентів може опосередковувати функцію, що виконується щонайменше одним з інших компонентів. Як ілюстрація, послідовність регулятора транскрипції, така як промотор, функціонально зв'язана з кодуючою послідовністю, якщо послідовність регулятора транскрипції контролює рівень транскрипції кодуючої послідовності у відповідь на присутність або відсутність одного або декількох факторів регуляції транскрипції. Послідовність регулятора транскрипції, як правило, функціонально зв'язана з кодуючою послідовністю в цис-положенні, але не обов'язково безпосередньо межує з нею.
Наприклад, енхансер являє собою послідовність регулятора транскрипції, який функціонально зв'язаний з кодуючою послідовністю, навіть якщо вони не є суміжними.
Відносно злитих поліпептидів термін "функціонально зв'язаний" може стосуватися того факту, що кожний з компонентів виконує в зв'язку з іншим компонентом ту ж функцію, яку він би виконував, якби вони не були зв'язані. Наприклад, відносно злитого поліпептиду, в якому ДНК- зв'язувальний домен 2ЕР злитий з регуляторним доменом, ДНК-зв'язувальний домен 2РЕР і регуляторний домен знаходяться в функціональному зв'язку, якщо в злитому поліпептиді частина ДНК-зв'язувального домену 2ЕР здатна зв'язуватися зі своєю ділянкою-мішенню і/або своєю ділянкою зв'язування, тоді як регуляторний домен здатний регулювати експресію ДНК, знаходячись поблизу ділянки-мішені. "Функціональний фрагмент" білка, поліпептиду або нуклеїнової кислоти являє собою білок, поліпептид або нуклеїнову кислоту, послідовність яких не ідентична повнорозмірному білку, поліпептиду або нуклеїновій кислоті, але при цьому зберігає ту ж функцію, що і повнорозмірний білок, поліпептид або нуклеїнова кислота. Функціональний фрагмент може містити більше, менше або ту ж кількість залишків, що і відповідна природна молекула, і/або може містити одну або декілька замін амінокислот або нуклеотидів. Способи визначення функції нуклеїнових кислот (наприклад, кодуючої функції, здатності до гібридизації з іншою нуклеїновою кислотою) добре відомі в даній галузі. Подібним чином, добре відомі способи визначення функції білків.
Наприклад, ДНК-зв'язувальну функцію поліпептиду можна визначати, наприклад, за допомогою
Зо зв'язування на фільтрі, зсуву електрофоретичної рухливості або аналізами імунопреципітації.
Розщеплення ДНК можна аналізувати електрофорезом в гелі. Див. А!йзибеї еї аї., вище.
Здатність білка взаємодіяти з іншим білюом можна визначати, наприклад, за допомогою коїмунопреципітації, двогібридних аналізів або комплементацією, генетичною і біохімічною.
Див., наприклад, РіеЇїд5 еї аІ. (1989) Майшге 340:245-246; патент США Мо 5585245 і РСТ МО 98/44350.
Як застосовують в цьому документі, "насичені жирні кислоти" як необмежувальні приклади включають лауринову (С12:0), міристинову (С14:0), пальмітинову (С16:0) і стеаринову (С18:0) кислоти. Подібним чином, "мононенасичені жирні кислоти" і "поліненасичені жирні кислоти" як необмежувальні приклади включають жирні кислоти С18, такі як олеїнова кислота (С18:1), відновлена лінолева кислота (С18:2) і відновлена ліноленова кислота (С18:3).
Ділянки-мішені
Описувані способи і композиції включають злиті білки, що містить ДНК-зв'язувальний домен (наприклад, 2ЕР) і регуляторний домен або домен розщеплення (нуклеазний) (або напівдомен розщеплення), в яких ДНК-зв'язувальний домен (наприклад, домен цинкових пальців), зв'язуючись з послідовністю в клітинному хроматині в гені, залученому до синтезу жирних кислот, направляє активність домену регуляції транскрипції або домену розщеплення (або напівдомену розщеплення) поблизу з послідовністю і, таким чином, модулює транскрипцію або індукує розщеплення поблизу з послідовністю-мішенню.
Як указано в іншій частині цього опису, домен цинкових пальців можна конструювати для зв'язування практично з будь-якою бажаною послідовністю. Таким чином, після ідентифікації області, яка представляє інтерес, що містить послідовність, в якій бажана регуляція, розщеплення або рекомбінація, можна конструювати один або декілька зв'язувальних доменів цинкових пальців зі зв'язуванням однієї або декількох послідовностей в області, яка представляє інтерес.
Вибір ділянки-мішені в області генома, яка представляє інтерес, в клітинному хроматині будь-якого гена, залученого до біосинтезу жирних кислот (наприклад, див. фігуру 1), для зв'язування доменом цинкових пальців (наприклад, ділянка-мішені), можна проводити, наприклад, способами, описаними в патенті, що належить тим же заявникам США Мо 6453242 (17 вересня 2002), в якому також описані способи складання 2ЕР для зв'язування з вибраною бо послідовністю. Фахівцям в даній галузі повинне бути зрозумілим, що для вибору ділянки-мішені також можна використовувати простий візуальний огляд нуклеотидної послідовності. Таким чином, в способах, що заявляються, можна використовувати будь-які засоби вибору ділянки- мішені.
У певних варіантах здійснення 2ЕР, як описано в цьому документі, зв'язуються з ділянкою- мішенню в гені, що кодує АССазу, КАЗ І, КАБ ІЇ, КАБ ПІ, КАБ ІМ, ЕАТВІ1, РАТВ2, ЕАТВЗ, ГАТВА,
ЕАТВ5, ГРАБ, ЕАЕТ, РаїА, Рад2, Райз, СРОН, ОК і/або 5-АСР-ОЕ5.
Ділянки-мішені, як правило, складаються з множини суміжних підділянок-мішеней.
Підділянка-мішень стосується послідовності (як правило, триплету нуклеотидів або квадруплету нуклеотидів, який може перекриватися по одному нуклеотиду із суміжним квадруплетом), що зв'язується окремим цинковим пальцем. Див., наприклад, УМО 02/077227. Якщо ланцюг, з яким білок з цинковими пальцями утворює більшість контактів, позначити як ланцюг-мішень, "ланцюг первинного розпізнавання" або "ланцюг первинного контакту", деякі білки з цинковими пальцями зв'язуються з триплетом з трьох основ в ланцюгу-мішені і з четвертою основою не на ланцюгу- мішені. Як правило, довжина ділянки-мішені складає щонайменше 9 нуклеотидів, і, таким чином, вона зв'язана зв'язувальним доменом цинкових пальців, що містить щонайменше три цинкові пальці. Однак також можливе зв'язування, наприклад, зв'язувального домену з 4 пальцями з ділянкою-мішенню з 12 нуклеотидів, зв'язувального домену з 5 пальцями з ділянкою-мішенню з 15 нуклеотидів або зв'язувального домену з 6 пальцями з ділянкою-мішенню з 18 нуклеотидів.
Очевидно, що також можливе зв'язування більш великих зв'язувальних доменів (наприклад, з 7, 8, 9 і більше пальцями) з більш протяжними ділянками-мішенями.
Для ділянки-мішені необов'язково бути кратною трьом нуклеотидам. Наприклад, у випадках, в яких відбувається взаємодія з перехрещенням ланцюгів (див., наприклад, патент США 6453242 і УМО 02/077227), один або декілька окремих цинкових пальців зв'язувального домену з декількома пальцями може зв'язуватися з квадруплетними підділянками, що перекриваються.
Як результат, білок з трьома пальцями може зв'язувати послідовність з 10 нуклеотидів, де десятий нуклеотид є частиною квадруплета, зв'язаного з кінцевим пальцем, білок з чотирма пальцями може зв'язувати послідовність з 13 нуклеотидів, де тринадцятий нуклеотид є частиною квадруплета, зв'язаного з кінцевим пальцем, і т. д.
Також на зв'язування з послідовністю-мішенню впливає довжина і характер амінокислотних
Зо лінкерних послідовностей між окремими цинковими пальцями в зв'язувальному домені з декількома пальцями. Наприклад, присутність так званого "неканонічного лінкера", "довгого лінкера" або "структурованого лінкера" між сусідніми цинковими пальцями в зв'язувальному домені з декількома пальцями може забезпечувати зв'язок цих пальців з підділянками, які не прилягають одна до одної безпосередньо. Необмежувальні приклади таких лінкерів описані, наприклад, в патенті США Мо 6479626 і М/о 01/53480. Таким чином, одна або декілька підділянок, в ділянки-мішені для зв'язувального домену цинкових пальців, можуть бути відділені одна від одної 1, 2, 3, 4, 5 або більше нуклеотидами. Надаючи усього один приклад, зв'язувальний домен з чотирма пальцями може зв'язувати ділянку-мішень з 13 нуклеотидів, що містять, послідовно, дві суміжні підділянки з З нуклеотидів, проміжний нуклеотид і дві суміжні триплетні підділянки. Також див. заявку США Мо 61/130099 для композицій і способів для зв'язування штучних нуклеаз для зв'язування з ділянками-мішенями, розділеними різною кількістю нуклеотидів. Відстань між послідовностями (наприклад, ділянками-мішенями) стосується кількості нуклеотидів або пар нуклеотидів, що знаходяться між двома послідовностями, як вимірюють від кінців послідовностей, найближчих один до одного.
У певних варіантах здійснення складають ЕР з функцією фактора транскрипції. Для функції як фактора транскрипції все, що в основному необхідно, це просте зв'язування і достатня близькість до промотору. Точне позиціонування відносно промотору, орієнтація і, в певних межах, дистанція не дуже важливі. Ця властивість забезпечує істотну гнучкість у виборі ділянок- мішеней для конструювання штучних факторів транскрипції. Таким чином, ділянка-мішень, розпізнавана 2ЕР, може являти собою будь-яку відповідну ділянку в гені-мішені, яка забезпечує активацію або репресію експресії гена 2ЕР, необов'язково зв'язаного з регуляторним доменом.
Переважні ділянки-мішені включають області поряд, нижче або вище ділянки старту транскрипції. Крім того, ділянки-мішені можуть являти собою ділянки, розташовані в енхансерних областях, репресорних ділянках, ділянках зупинки РНК-полімерази і в особливих регуляторних ділянках (наприклад, ділянки 5Р-1, елементи відповіді на гіпоксію, елементи розпізнавання ядерного рецептора, ділянки зв'язування р5бі3), ділянках в кодуючій області КДНК або в кодуючій області маркерної експресованої послідовності (ЕТ).
У інших варіантах здійснення складають 2ЕР з нуклеазною активністю. Експресія злитого білка, який містить 2ЕМ, що містить зв'язувальний домен цинкових пальців і домен розщеплення 60 (або два злитих білки, де кожний містить зв'язувальний домен цинкових пальців і напівдомен розщеплення), в клітині приводить до розщеплення поблизу послідовності-мішені. У певних варіантах здійснення розщеплення залежить від зв'язування двох злитих молекул з доменами цинкових пальців/напівдоменами розщеплення з розділенням ділянок-мішеней. Дві ділянки- мішені можуть знаходитися на протилежних ланцюгах ДНК, або, альтернативно, обидві ділянки- мішені можуть знаходитися на одному ланцюгу ДНК.
ДНК-зв'язувальні домени
У практичному здійсненні даного винаходу можна використовувати будь-який ДНК- зв'язувальний домен. У певних варіантах здійснення ДНК-зв'язувальний домен містить зв'язувальний домен цинкових пальців з одним або декількома цинковими пальцями (МіЇег еї аї. (1985) ЕМВО 4. 4:1609-1614; Аподез (1993) бсіепіййс Атегісап Рер.:56-65; патент США Мо 6453242). Як правило, довжина одного домену цинкових пальців становить приблизно 30 амінокислот. Структурні дослідження продемонстрували, що кожний домен цинкових пальців (мотив) містить два бета-шари (що втримуються в положенні бета-вигину, що містить два інваріантних залишки цистеїну) і альфа-спіраль (що містить два інваріантних залишки гістидину), які утримуються в конкретній конформації за допомогою координаційних взаємодій двох цистеїнів і двох гістидинів з атомом цинку.
Цинкові пальці включають канонічні цинкові пальці С2Нг (тобто, цинкові пальці, в яких іон цинку координований двома залишками цистеїну і двома залишками гістидину) і неканонічні цинкові пальці, наприклад, такі як цинкові пальці СзН ії С2НС (цинкові пальці, в яких іон цинку координований трьома залишками цистеїну і одним залишком гістидину, див., наприклад, патентну публікацію США Мо 2008/0182332) і цинкові пальці Са (цинкові пальці, в яких іон цинку координований чотирма залишками цистеїну). Також див. ММО 02/057293.
Зв'язувальний домени цинкових пальців можна конструювати для зв'язування вибраної послідовності. Див., наприклад, Веегії еї аіЇ. (2002) Маїшге Віоїесппої. 20:135-141; Раро еї а). (2001) Апп. Веу. Віоспет. 70:313-340; Ізаіап еї аї. (2001) Маїшге ВіоїесНпої. 19:656-660; 5едаї! еї а!. (2001) Ситт. Оріп. Віоїесппої. 12:632-637; Споо еї аї. (2000) Сит. Оріп. 5ігисі. Віої. 10:411-416.
Конструйований (або неприродний) зв'язувальний домен цинкових пальців, в порівнянні з природним білком з цинковими пальцями може мати нову специфічність зв'язування. Способи конструювання як необмежувальні приклади включають, раціональне складання і різні типи відбору. Раціональне складання включає, наприклад, використання баз даних, що містить триплетні (або квадруплетні) нуклеотидні послідовності і конкретні амінокислотні послідовності цинкових пальців, в яких кожна триплетна або квадруплетна нуклеотидна послідовність асоційована з однією або декількома амінокислотними послідовностями цинкових пальців, які зв'язуються з конкретною триплетною або квадруплетною послідовністю. Див., наприклад, патенти СЩА, що належать тим же заявникам 6453242 і 6534261. Додаткові способи складання описані, наприклад, в патентах США 6746838; 6785613; 6866997 і 7030215.
Ілюстративні способи відбору, включаючи фаговий дисплей і двогібридні системи, описані в патентах США 5789538; 5925523; 6007988; 6013453; 6410248; 6140466; 6200759 і 6242568; а також УМО 98/37186; УМО 98/53057; УМО 00/27878; УМО 01/88197 і ОВ 2338237.
Збільшення специфічності зв'язування зв'язувальних доменів цинкових пальців описане, наприклад, в патенті, що належить тим же заявникам США Мо 6794136.
Оскільки окремий цинковий палець зв'язується з послідовністю з трьох нуклеотидів (тобто, триплетом) (або послідовністю з чотирьох нуклеотидів, яка може перекриватися по одному нуклеотиду з ділянкою зв'язування з чотирьох нуклеотидів сусіднього цинкового пальця), довжина послідовності, з якою повинен зв'язуватися конструйований зв'язувальний домен цинкових пальців (наприклад, послідовності-мішені), визначається кількістю цинкових пальців в конструйованому зв'язувальному домені цинкових пальців. Наприклад, для 2ЕР, в яких мотиви з пальцями не зв'язуються з підділянками, що перекриваються, послідовність-мішень з шести нуклеотидів зв'язана зв'язувальним доменом з двома пальцями; послідовність-мішень з дев'яти нуклеотидів зв'язана зв'язувальним доменом з треома пальцями і т. д. Як указано в цьому документі, ділянки зв'язування для окремих цинкових пальців (тобто, підділянки) в ділянки- мішені не обов'язково повинні бути суміжними, але в залежності від довжини і характеру амінокислотних послідовностей між цинковими пальцями (тобто, лінкерів між пальцями) в зв'язувальному домені з декількома пальцями можуть бути розділені одним або декількома нуклеотидами.
У зв'язувальному домені цинкових пальців з декількома пальцями сусідні цинкові пальці можуть бути розділені амінокислотними лінкерними послідовностями приблизно з 5 амінокислот (так звані "канонічні" лінкери між пальцями) або, альтернативно, одним або декількома неканонічними лінкерами. Див., наприклад, патенти США МоМо, що належать тим же заявникам бо 6453242 і 6534261. Для конструйованих зв'язувальних доменів цинкових пальців, що містять більше трьох пальців, переважною може бути вставка між певними цинковими пальцями більш довгих ("неканонічних") лінкерів між пальцями, оскільки вона може збільшити афінність і/або специфічність зв'язування зв'язувальним доменом. Див., наприклад, патент США Мо 6479626 і
УМО 01/53480. Таким чином, зв'язувальні домени цинкових пальців з декількома пальцями також можна характеризувати відносно присутності і положення неканонічних лінкерів між пальцями.
Наприклад, зв'язувальний домен цинкових пальців з шістьма пальцями, що містить три пальці (з'єднаних двома канонічними лінкерами між пальцями), довгий лінкер і три додаткових пальці (з'єднаних двома канонічними лінкерами між пальцями) позначають як конфігурацію 2х3.
Подібним чином, зв'язувальний домен, що містить два пальці (з канонічним лінкером між ними), довгі лінкери і два додаткових пальці (з'єднаних канонічним лінкером), позначають як білок 2х2.
Білок, що містить три одиниці з двома пальцями (в кожній з яких два пальці з'єднані канонічним лінкером), в якому кожна одиниця з двома пальцями з'єднана з сусідніми одиницями з двома пальцями довгим лінкером, позначають як білок 3х2.
Присутність в зв'язувальному домені з декількома пальцями між двома сусідніми цинковими пальцями довгого або неканонічного лінксера між пальцями часто дозволяє двом пальцям зв'язуватися з підділянками, які в послідовності-мішені не є безпосередньо суміжними. Таким чином, між підділянками в ділянки-мішені можуть існувати пропуски в один або декілька нуклеотидів; наприклад, ділянка-мішень може містити один або декілька нуклеотидів, які не контактують з цинковим пальцем. Наприклад, зв'язувальний домен цинкових пальців 2х2 може зв'язуватися з двома послідовностями з шести нуклеотидів, розділених одним нуклеотидом, наприклад, він зв'язується з ділянкою-мішенню з 13 нуклеотидів. Також див. Мооге еї а!. (2001а)
Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА 98:1432-1436; Мооге евї аї. (20010) Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 98:1437- 1441 ї УМО 01/53480.
Як указано раніше, підділянка-мішень являє собою послідовність з трьох або чотирьох нуклеотидів, які зв'язує один цинковий палець. Для певної мети одиницю з двома пальцями позначають як зв'язувальний модуль. Зв'язувальний модуль можна отримувати, наприклад, вибираючи два сусідніх пальці в білку з декількома пальцями (як правило, три пальці), який зв'язує конкретну послідовність-мішень з шести нуклеотидів. Альтернативно, модулі можна конструювати за допомогою збирання окремих цинкових пальців. Також див. УМО 98/53057 і УМО
Коо) 01/53480.
У одному з варіантів здійснення в цьому документі описаний зв'язувальний домен цинкових пальців, що містить амінокислотну послідовність, як представлено в таблиці 1. В іншому варіанті здійснення опис стосується полінуклеотиду, що кодує зв'язувальний домен цинкових пальців, де зв'язувальний домен цинкових пальців містить амінокислотну послідовність, як представлено в таблиці 1.
Альтернативно, ДНК-зв'язувальний домен можна отримати з нуклеази. Наприклад, відомі послідовності, що розпізнають хомінг-ендонуклеаз і мегануклеаз, такі як І-5сеї, І-Сеці, РІ-Рері,
РІ-Зсе, І-5сему, І-Свті, І-Рапі, І-5сеїї, І-Ррої, І-5сепі, І-Стеї, І-Темі, І-Темі! ї І-ТеміїЇ. Також див. патент США Мо 5420032; патент США Мо 6833252; Вейогі еї аї. (1997) Мисієїс Асід5 Ке5. 25:3379- 3388; ЮОціоп еї аї. (1989) Сепе 82:115-118; Репег евї аї. (1994) Мисієїс Асіа5 Вев. 22, 1125-1127;
Уазіп (1996) Ттепавз Сепеї. 12:224-228; Сітрбіе еї аї. (1996) 9. Мої. ВіоІ. 263:163-180; Агдаві еї аї. (1998) У. Мої. Віої. 280:345-353 і каталог Мем/у Епдіапа Віоїар5. Крім того, ДНК-зв'язувальну специфічність хомінг-ендонуклеаз і мегануклеаз можна застосовувати в конструюванні для зв'язування неприродних ділянок-мішеней. Див., наприклад, Спемаїїег еї аї. (2002) Моїес. СеїЇ 10:895-905; Еріпаї еї аї. (2003) Мисієїс Асідб5 Нев. 31:2952-2962; АзПпПУоп еї аї. (2006) Маїшиге 441:656-659; Радиез єї аї. (2007) Ситепі Сепе Тнегару 7:49-66; патентну публікацію США Мо 20070117128.
У інших варіантах здійснення ДНК-зв'язувальний домен містить природний або конструйований (неприродний) ДНК-зв'язувальний домен з ТА -ефектором. Відомо, що патогенні бактерії рослин роду Хапіпотопаєх викликають множину захворювань у важливих сільськогосподарських культур. Патогенність Хапіпотопах залежить від консервативної системи секреції І типу (Т35), що вводить в рослинну клітину більше 25 різних ефекторних білків. Серед цих ін'єктованих білків знаходяться подібні до активаторів транскрипції (ТАГ) ефектори, мімікруючі активатори транскрипції рослин і маніпулюючі транскриптомом рослин (див. Кау єї аї. (2007) бсієпсе 318:648-651). Ці білки містять ДНК-зв'язувальний домен і домен активації транскрипції. Одним з найбільш добре охарактеризованих ТАЇ -ефекторів є АмгВ853 з
Хапіпотопаз сатрезвідгі5 пв. Мевісайогіа (див. Вопаз єї а). (1989) Мо! Сеп Сепеї 218:127-136 і
МО2010079430). ТАІ -ефектори містять централізований домен з тандемних повторів, де кожний повтор містить приблизно 34 амінокислоти, які є ключовими для специфічності бо зв'язування ДНК цими білками. Крім того, вони містять послідовність ядерної локалізації і кислий домен активації транскрипції (для огляду див. Зспогпаск 5, еї аї. (2006) 9. РіІапі Рпузіо|. 163(3):256-272). Крім того, в фітопатогенних бактеріях РаїЇвіопіа зоїіапасеагит в біоварі 1 штаму
СМІ1000 і в біоварі 4 штаму К51000 В. зоІапасєагит знайдені два гени, позначені бго11 і прх17, гомологічні сімейству АмгВ53 Хапіпотопаб5 (див. Нецег еї аі. (2007) Аррі. апа Епміг. Місго 73(13):4379-4384). Ці гени на 98,9 95 ідентичні по нуклеотидній послідовності один одному, але відрізняються делецією 1575 п. н. в домені прх17 з повторами. Однак обидва продукти генів мають менше ніж 40 95 ідентичність послідовності з сімейством білків Ам'В53 Хапіпотопазв.
Специфічність цих ТАЇ-ефекторів залежить від послідовностей, що знаходяться в тандемних повторах. Повторювана послідовність містить приблизно 102 п.н. і повтори, як правило, на 91-100 95 гомологічні один одному (Вопаз еї а!., там же). Поліморфізм повторів, як правило, розташований в положеннях 12 і 13, і вважають, що існує відповідність один-в-один між складом гіперваріабельних подвійних залишків в положеннях 12 і 13 зі складом суміжних нуклеотидів в послідовності-мішені ТАЇ -ефектора (див. Мозсои апа Водаапоме, (2009) Зсіепсе 326:1501 і Восп еї аІ. (2009) Зсіепсе 326:1509-1512). Експериментально, природний код для розпізнавання ДНК цими ТАїЇ -ефекторами визначений так, що послідовність НО в положеннях 12 ї 13 приводить до зв'язування з цитозином (С), МО зв'язуються з Т, МІ з А, С, б або Т, ММ зв'язується з А або б, а ІМО зв'язуються Т. Ці ДНК-зв'язувальні повтори збирають в білки з новими комбінаціями і кількістю повторів з отриманням штучних факторів транскрипції, які здатні взаємодіяти з новими послідовностями і активувати експресію неендогенного репортерного гена в рослинних клітинах (Восп еї аі., там же). Конструйовані ТАЇ -білки зв'язували з напівдоменом розщеплення РокКі з отриманням злитої нуклеази з ТА -ефекторним доменом (ТАГЕМ), що демонструє активність в аналізі з репортером в дріжджах (мішень на основі плазміди). Спгізйнап еї аї. (2010) Сепейсз ериб 10.1534/депеїїсв5. 110.120717).
Регуляторні домени
З регуляторними доменами для модуляції експресії гена необов'язково можна асоціювати
ДНК-зв'язувальні домени (наприклад, ЕР), що описуються в цьому документі. 2ЕР можна ковалентно або нековалентно зв'язувати з одним або декількома регуляторними доменами, альтернативно двома або більше регуляторними доменами, з двома або більше доменами, що є копіями одного домену, або з двома різними доменами. Регуляторні домени можна ковалентно зв'язувати з 2ЕР, наприклад, за допомогою амінокислотного лінкера, як частину злитого білка. 2ЕР також можна зв'язувати з регуляторним доменом за допомогою нековалентного домену димеризації, наприклад лейцинової застібки, М-кінцевого домену білка
ЗТАТ або зв'язувального білка ЕК5Об (див., наприклад, О'Зпеа, Зсіепсе 254:539 (1991),
Вагайтапа-Роитг еї а!., Си. Тор. Місгобіої. Іттипої. 211:121-128 (1996); Кієтт еї аї., Аппи. Неу.
Іттипої. 16:569-592 (1998); Кієтт еї а!., Аппи. Нем. Іттипої. 16:569-592 (1998); Но вї а!., Майшге 382:822-826 (1996); і Ротегап; еї аІ., Віоспет. 37:965 (1998)). Регуляторний домен можна зв'язувати з 2ЕР в будь-якому відповідному положенні, включаючи С- або М-кінець 2ЕР.
Загальні регуляторні домени для додавання до 2ЕР включають, наприклад, ефекторні домени з факторів транскрипції (активатори, репресори, коактиватори, корепресори), сайленсери, рецептори ядерних гормонів, онкогенні фактори транскрипції (наприклад, представники сімейств тус, |Шп, 705, туб, тах, тай, геї, еїб5, рсі, туб, то5 і т.д.); ферменти репарації ДНК ії асоційовані з ними фактори і модифікатори; ферменти перестановок в ДНК і асоційовані з ними фактори і модифікатори; асоційовані з хроматином білки і їх модифікатори (наприклад, кінази, ацетилази і деацетилази) і ферменти модифікації ДНК (наприклад, метилтрансферази, топоіїзомерази, гелікази, лігази, кінази, фосфатази, полімерази, ендонуклеази) і асоційовані з ними фактори і модифікатори.
Поліпептиди факторів транскрипції з яких можна отримувати регуляторний домен, включають поліпептиди, залучені до регульованої і базальної транскрипції. Такі поліпептиди включають фактори транскрипції, їх ефекторні домени, коактиватори, сайленсери, рецептори ядерних гормонів (для огляду білків і елементів нуклеїнових кислот, залучених до транскрипції див., наприклад, Сооагісп еї аї., СеїЇ 84:825-30 (1996); фактори транскрипції в основному розглянуті в Вагпез апа АдсосК, Сіїп. Ехр. АПегду 25 Биррі. 2:46-9 (1995) і Коедег, Мештоав5
Епгутої. 273:165-71(1996)). Фактори транскрипції рецепторів ядерних гормонів описані, наприклад, в Козеп еї аї., У. Мей. Спет. 38:4855-74 (1995). Сімейство факторів транскрипції
С/ЕВР розглянуто в Умедвеї еї аї., Іттипобіоіоду 193:171-85 (1995). Коактиватори і корепресори, які опосередковують регуляцію транскрипції за допомогою рецепторів ядерних гормонів розглянуті, наприклад, в Меїег, Еиг. У. ЕпадосгіпоІЇ. 134(2): 158-9 (1996); Каїбвег єї аї., Тгепав5
Віоспет. сі. 21:342-5 (1996); і ШШеу еї аїЇ., Маїшге 394:498-502 (1998)). Фактори транскрипції
САТА, залучені до регуляцію гемопоезу, описані, наприклад, в Зітоп, Маї. Сепеї. 11:9-11 (1995); 60 МУві55 єї а!., Ехр. Нетапй)!. 23:99-107. Зв'язувальний ТАТА-бокс білок (ТВР) і асоційовані з ним
ТАР-поліпептиди (які включають ТАЕЗО0, ТАЕ55, ТАЕ80, ТАЕ 10, ТАРІ 50 ї ТАЕ250) описані в
Сюооатісн апа Тіап, Си. Оріп. Сеї! Віої. 6:403-9 (1994) і Нигіеу, Сигг. Оріп. Зігисі. Віої. 6:69-75 (1996). Сімейство факторів транскрипції 5 ТАТ розглянуте, наприклад, в Вагаптапа-Роиг єї аї.,
Сит. Тор. Містобріої!. Іттипої. 211:121-8 (1996). Фактори транскрипції, залучені до захворювань, розглянуті в Авзо еї аї., у). Сііп. Іпмев5і. 97:1561-9 (1996).
У одному з варіантів здійснення як репресор транскрипції застосовують репресуючий домен
КЕАВ з білка людини КОХ-1 (ТНієзеп еї аї., Мем/ Віоіодіві 2:363-374 (1990); Магооїїнп еї аї., Ргос.
Май. Асад. сі ОБА 91:4509-4513 (1994); Репдиє еї аї., Мисі. Асід5 Вев. 22:2908-2914 (1994);
МуУїйшоаї! єї аї., Ргос. Май. Асад. осі. ОБА 91:4514-4518 (1994)). В іншому варіанті здійснення спільно з ККАВ застосовують КАР-1, корепресор КЕАВ (Егіедтанп еї аї., Сепе Юеу. 10:2067-2078 (1996)). Альтернативно, КАР-1 можна використовувати з 2ЕР окремо. Інші переважні фактори транскрипції і домени факторів транскрипції, які діють як репресори транскрипція, включають
МАО (див., наприклад, Зотітег еї аї., У. Віої. Спет. 273:6632-6642 (1998); Сиріа єї а!., Опсодепе 16:1149-1159 (1998); Оцема евї аІ., Опсодепе 16:967-977 (1998); І агезоп вї аі!., Опсодепе 15:737- 748 (1997); Іапепу еї аї., Се!! 89:349-356 (1997); і Сийгаго еї аїЇ., Мої. СеїІ ВіоїЇ. 17:2353-2359 (19977)); ЕКНВ (головка в гені рабдосаркоми; Сіпзбего еї аїЇ., Сапсег Ке5. 15:3542-3546 (1998);
Ерзівїп еї а!., Мої. Сеї! Віої. 18:4118-4130 (1998)); ЕБВ-1 (продукт гена раннього фактора росту 1; Мап єї аї., Ргос. Маї!. Асад. 5сі ОБА 95:8298-8303 (1998); і Пи єї аі., Сапсег Сепе Тег. 5:3-28 (1998)); репресорний домен фактора репресії еїз2 (ЕКО; 5доигаз єї аІ.,, ЕМВО 3. 14:4781-4793 (19095)); домен взаємодії 5т5ІМЗ МАЮ (5ІО; Ауег еї аї., Мої. СеїІ Віо!Ї. 16:5772-5781 (1996),); і амфіфільний репресуючий домен ЕКЕЗ (фактор відповіді на етилен 3), ЕАК (Ома, М., еї аї. (2001), Ріапі Сеї! 13:1959-1968).
У одному з варіантів здійснення як активатор транскрипції застосовують активуючий домен
МРІ16 Н5ЗМ (див., наприклад, Надтапп еї аї., У. МігоІ!. 71:5952-5962 (1997)). Інші переважні фактори транскрипції, які можуть забезпечувати активуючі домени, включають активуючий домен МРбА (зеїреї еї аІ., ЕМВО 4. 11:4961-4968 (1996)); рецептори ядерних гормонів (див., наприклад, Тогсопіа еї аїЇ., Сигг. Оріп. СеїЇ Віої. 10:373-383 (1998)); субодиницю рб5 ядерного фактора каппа В (Віко апа ВагіК, у. МігоІ. 72:5610-5618 (1998) і Ооуїе апа Нипі, Мешгогерогі 8:2937-2942 (1997)); ЕСВ-1 (продукт гена раннього фактора росту 1; Хап еї аї., Ргос. Маї). Асай.
Зо Зсі ОБА 95:8298-8303 (1998); і Пи еї аЇ.,, Сапсег бепе Тег. 5:3-28 (1998)); і регуляторний білок шляху біосинтез антоціаніну кукурудзи, С1 (5.А. СОЇ, єї аї., (1991), Сепеїййс5 апа ЮОемеІортепі 5:298-309).
Також як регуляторні домени для 2ЕР придатні кінази, фосфатази і інші модифікуючі поліпептиди білки, залучені до регуляцію генів. Такі модифікатори часто залучені до запуску або зупинки транскрипції, опосередковані, наприклад, гормонами. Кінази, залучені до регуляції транскрипції, розглянуті в Юамі5, Мої. Кергод. Оем. 42:459-67 (1995), даскзоп еї аї., Адм. бесопа
Меззепдег Рпозрпоргоївіп Нез. 28:279-86 (1993), і ВоціКав, Стії. Кем. ЕиКагуої. Сепе Ехрг. 5:1-77 (1995), тоді як фосфатази розглянуті, наприклад, в Зопопіпа! апа 5етіп, Сапсег Віої. 6:239-48 (1995). Ядерні тирозинкінази описані в Ууапу, Тгепаз Віоспет. сі. 19:373-6 (1994).
Як описано, придатні домени також можна отримувати з продуктів генів онкогенів (наприклад, представників сімейств тус, |Шп, 705, тур, тах, тай, геї, еїб5, БсіІ, туб, тов) і асоційованих з ними факторів і модифікаторів. Онкогени описані, наприклад, в Соорег,
Опсодепев, 2пйа ед., Тне допе5 апа Вапієй 5егіев іп Віоіоду, Во5іоп, Маз5., допез5 апа Вапієй
Рибріїзпег5, 1995. Фактори транскрипції еї5 розглянуті в УмавзімІК еї а!., Єшиг. У. Віоспет. 211:7-18 (1993) і Стерієих еї аї!., Стї. Кем. Опсод. 5:615-38 (1994). Онкогени тус розглянуті, наприклад, в
Вуап сеї аї., Віоспет. 9. 314:713-21 (1996). Фактори транскрипції |шп їі то5 описані, наприклад, в
Те Ео5 апа дип Раптійев ої Тгапзсгіріоп Расіог5, Апдеї апа Нептпісп, еаз. (1994). Онкоген тах розглянутий в Нитгіїп еї аї., СоїЯ 5ргіпд Нагб. Зутр. Омцапі. ВіоїЇ. 59:109-16. Сімейство генів тур розглянуте в Капеї-ІвНії єї а), Сит. Тор. Містовріо!Ї. Іттипої. 211:89-98 (1996). Сімейство то5 розглянуте в Уему еї аї., Сигт. Оріп. Сепеї. Оєум. 3:19-25(1993).
ДЕР можуть містити регуляторні домени, що отримуються з ферментів репарації ДНК і асоційованих з ними факторів і модифікаторів. Системи репарації ДНК розглянуті, наприклад, в
Моз, Ст. Оріп. Сеї! Вісі. 4:385-95 (1992); Запсаг, Апп. Неу. Сепеї. 29:69-105 (1995); ептапп,
Сепеї. Епа. 17:1-19 (1995); і Му/оод, Апп. Кем. Віоспет. 65:135-67 (1996). Також як регуляторні домени можна використовувати ферменти перестановок в ДНК ії асоційовані з ними фактори і модифікатори (див., наприклад, Сапдіоїї еї аї., Ехрегпіепійа 50:261-9 (1994); ЗадомуеКі, ЕАБЗЕВ У. 7:760-7 (1993)).
Подібним чином, регуляторні домени можна отримувати з ферментів модифікації ДНК (наприклад, ДНК-метилтрансфераз, -топоіїзомераз, -геліказ, -лігаз, -кіназ, -фосфатаз, - бо полімераз) і асоційованих з ними факторів і модифікаторів. Гелікази розглянуті в Маїзоп еї аї.,
Віоеззаув, 16:13-22 (1994), а метилтрансферази описані в Спепод, Сигт. Оріп. Зігисі. Віої. 5:4-10 (1995). Також придатними доменами вибору для додавання в 2ЕР є асоційовані з хроматином білки і їх модифікатори (наприклад, кінази, ацетилази і деацетилази), такі як деацетилаза гістонів (МуоШе, Зсіепсе 272:371-2 (1996)). В одному з переважних варіантів здійснення регуляторний домен являє собою ДНК-метилтрансферазу, яка діє як репресор транскрипції (див., наприклад, Мап деп Ууупдаєг!і єї аІ., РЕВ5 І ей. 426:283-289 (1998); Ріупп еї аї., У. Мої. Віої. 279:101-116 (1998); ОКапо еї аї., Мисієїс Асіає Вез. 26:2536-2540 (1998); і 7агдо апа Саїага, 3.
ВіоІ. Спет. 273:16517-16520 (1998)). В іншому переважному варіанті здійснення як репресори транскрипції, які діють за допомогою розщеплення генів, використовують ендонуклеази, такі як
ЕоКІ (див., наприклад, УМО95/09233 ії РСТ/О594/01201).
Також для отримання химерних білків можна використовувати фактори, які контролюють структуру, переміщення і локалізацію хроматину і ДНК і асоційовані з ними фактори і модифікатори; фактори, що отримуються з мікроорганізмів (наприклад, прокаріот, еукаріот і вірусів), і фактори, асоційовані з ними або що модифікують їх. У одному з варіантів здійснення як регуляторні домени використовують рекомбінази і інтегрази. У одному з варіантів здійснення як активатор транскрипції застосовують гістонацетилтрансферазу (див., наприклад, іп апа
ЗсоНо, Мої. Сеї! Віої. 18:4377-4384 (1998); М/оїШНе, Зсієпсе 272:371-372 (1996); Ташпоп еї аї.,
Зсіепсе 272:408-411 (1996); і Наззвід еї аї., Ргос. Май). Асад. Зсі ОБА 95:3519-3524 (1998)). В іншому варіанті здійснення як репресор транскрипції застосовують гістондеацетилазу (див., наприклад, діп апа Зсойо, Мої. СеїІ Віої. 18:4377-4384 (1998); Зупііїснакі апа ТНігеов, у. Віо!.
Спет. 273:24414-24419 (1998); ЗаКкадисні еї аі., сепев Оєу. 12:2831-2841 (1998); і Мапіпе? еї аї,
У. ВіоІ. Спет. 273:23781-23785 (1998)).
Можна включати лінкерні домени між поліпептидними доменами, наприклад, між двома 2ЕР або між 2ЕР і регуляторним доменом. Такі лінкери, як правило, являють собою поліпептидні послідовності, такі як послідовності полі-ді(у довжиною приблизно від 5 до 200 амінокислот.
Лінкери можуть являти собою гнучкі або жорсткі підпослідовності амінокислот, що синтезуються як частина злитого рекомбінантного білка. Див., наприклад, патент США Мо 6534261; ім еї аї.,
Ргос. Маї. Асад. 5сі. ОБА, 95:5525-5530 (1997); Ротегапі; еї аЇ., Рос. Маї. Асад. осі. ОБ5БА 92:9752-9756 (1995); Кіт еї а!., Ргос. Маї. Асад. сі. ОБА 93:1156-1160 (1996); повністю включені
Зо в цей документ за допомогою посилання. Альтернативно, гнучкі лінкнери можна раціонально складати з використанням комп'ютерної програми, здатної до моделювання ділянок зв'язування
ДНК і самих пептидів (Оезіагіаїє апа Вего, Ргос. Маї. Асай. сі. ОБА 90:2256-2260 (1993),
Резіапаїв апа Вега, Ргос. Маї. Асад. сі. ОБА 91:11099-11103 (1994), або способами фагового дисплея.
У інших варіантах здійснення для зв'язування синтетично або рекомбінантно отримуваних послідовностей доменів використовують хімічний лінкер. Такі гнучкі лінкери відомі фахівцям в даній галузі. Наприклад, в ЗПпеагулайег Роїутегв, Іпс. НипізміПе, Аа доступні полі(етиленгліколеві) лінкери. Ці лінкери необов'язково містять амідні зв'язки, сульфгідрильні зв'язки або гетерофункціональні зв'язки. Крім ковалентного зв'язку 2ЕР з регуляторними доменами, для отримання молекул з 2ЕР, зв'язаними з регуляторними доменами, можна використовувати нековалентні способи.
Домени розщеплення
Як указано вище, ДНК-зв'язувальний домен також можна зв'язувати з доменом розщеплення (нуклеазою). Наприклад, можна модифікувати специфічність зв'язування ДНК хомінг- ендонуклеаз, зберігаючи нуклеазну функцію. Крім того, білюм з цинковими пальцями також можна зливати з доменом розщеплення з формуванням нуклеаз з цинковими пальцями (2ЕМ).
Частина домену розщеплення злитих білків, що описуються в цьому документі, можна отримувати з будь-якої ендонуклеази або екзонуклеази. Ілюстративні ендонуклеази, з яких можна отримувати домен розщеплення, як необмежувальні приклади включають рестрикційні ендонуклеази і хомінг-ендонуклеази. Див., наприклад, Каталог 2002-2003, Мем Епдіапа Віоїарв,
Вемепу, МА; і Вегогї еї а. (1997) Мисієїс Асіаз Кев5. 25:3379-3388. Відомі додаткові ферменти, що розщеплюють ДНК (наприклад, нуклеаза 51; нуклеаза бобів мунг; панкреатична ДНКаза І; мікрококова нуклеаза; ендонуклеаза дріжджів Но; також див. І іпп еї аї. (ед5.) Мисієазев5, Соїа
Зргіпд Нагбог І абогафогу Ргев55, 1993). Один або декілька з цих ферментів (або їх функціональні фрагменти) можна використовувати як джерела доменів розщеплення і напівдоменів розщеплення.
Подібним чином, з будь-якої нуклеази або її частини, як указано вище, можна отримувати напівдомен розщеплення, якому для вияву розщеплюючої активності необхідна димеризація. Як правило, якщо злиті білки містять напівдомени розщеплення, для розщеплення необхідні два 60 злиті білки. Альтернативно, можна використовувати один білок, що містить два напівдомени розщеплення. Два напівдомени розщеплення можна отримувати з однієї і тієї ж ендонуклеази (або її функціональних фрагментів), або кожний напівдомен розщеплення можна отримувати з різних ендонуклеаз (або їх функціональних фрагментів). Крім того, ділянки-мішені для двох злитих білків переважно розташовані одна відносно одної так, щоб зв'язування двох злитих білків з їх відповідними ділянками-мішенями вміщувало напівдомени розщеплення в просторовій орієнтації один відносно одного отак, щоб забезпечувати формування напівдоменами розщеплення функціонального домену розщеплення, наприклад, за допомогою димеризації. Таким чином, в певних варіантах здійснення найближчі межі ділянок-мішеней розділені 5-8 нуклеотидами або 15-18 нуклеотидами. Однак між двома ділянками-мішенями може знаходитися будь-яка цілочисельна кількість нуклеотидів або пара нуклеотидів (наприклад, від 2 до 50 пар нуклеотидів або більше). Як правило, ділянка розщеплення розташована між ділянками-мішенями.
Рестрикційні ендонуклеази (рестрикційні ферменти) існують у багатьох видів і здатні до специфічного для послідовності зв'язування з ДНК (в ділянки розпізнавання) і розщеплення ДНК в ділянки зв'язування або поруч з нею. Певні рестрикційні ферменти (наприклад, типу ІІ5) розщеплюють ДНК в ділянках поза ділянкою розпізнавання і містять роздільні домени зв'язування і розщеплення. Наприклад, фермент типу 5 Рок! каталізує дволанцюжкове розщеплення ДНК, в 9 нуклеотидах від його ділянки розпізнавання на одному ланцюгу і в 13 нуклеотидах від його ділянки розпізнавання на іншому. Див., наприклад, патенти США 5356802; 5436150 і 5487994; а також І і еї а. (1992) Ргос. Май. Асай. сі. ОБА 89:4275-4279; | | вї а. (1993)
Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА 90:2764-2768; Кіт еї а. (1994а) Ргос. Маїй!. Асад. сі. ОБА 91:883-887;
Кіт еї аї. (199460) 9. ВіоІ. Снет. 269:31978-31982. Таким чином, в одному з варіантів здійснення злиті білки містять домен розщеплення (або напівдомен розщеплення) щонайменше з одного рестрикційного ферменту типу ІІ5 і один або декілька зв'язувальних доменів цинкових пальців, які можуть бути такими, що конструюються або ні.
Ілюстративним рестрикційним ферментом типу ІІ5, домен розщеплення якого знаходиться окремо від зв'язувального домену, є РОКІ. Цей конкретний фермент активний як димер. Війпайе еї аІ. (1998) Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 95:10570-10575. Таким чином, для цілей даного опису, частину ферменту ЕоКІ, що використовується в описуваних злитих білках, розглядають як
Зо напівдомен розщеплення. Таким чином, для направленого дволанцюжкового розщеплення і/або направленого заміщення клітинних послідовностей з використанням злиття цинковий палець-
ЕоКІ, для відновлення каталітично активного домену розщеплення можна використовувати два злитих білки, де кожний містить напівдомен розщеплення ГоОКІ. Альтернативно, також можна використовувати одну поліпептидну молекулу, що містить зв'язувальний домен цинкових пальців і два напівдомени розщеплення ЕоКкІ. Параметри для направленого розщеплення і направленої зміни послідовності з використанням злиття цинковий палець-РокКіІ надані в іншій частині даного опису.
Домен розщеплення або напівдомен розщеплення може являти собою будь-яку частину білка, що зберігає розщеплювальну активність або зберігає здатність до мультимеризації (наприклад, димеризації) з формуванням функціонального домену розщеплення.
Ілюстративні рестрикційні ферменти типу ІІ5 описані в міжнародній публікації УМО 07/014275, повністю включеній в цей документ. Також окремі домени зв'язування і розщеплення містять додаткові рестрикційні ферменти, і передбачені в даному описі. Див., наприклад, Кобегів еї аї. (2003) Мисівіс Асіа5 Нев. 31:418-420.
У певних варіантах здійснення домен розщеплення містить один або декілька конструйованих напівдоменів розщеплення (що також позначаються як мутантні домени, які димеризуються), що мінімізують або запобігають гомодимеризації, як описано, наприклад, в патентних публікаціях США МоМо 20050064474; 20060188987; 20080131962, всі описи яких повністю включені в цей документ за допомогою посилання. Мішенями для впливу на димеризацію напівдоменів розщеплення РГокКі є амінокислотні залишки в положеннях 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 і 538 ГоКІ.
Ілюстративні конструйовані напівдомени розщеплення оКІ, що формують облігатні гетеродимери, включають пару, в якій перший напівдомен розщеплення містить мутації по амінокислотних залишках в положеннях 490 і 538 ГоОКІ, а другий напівдомен розщеплення містить мутації по амінокислотних залишках 486 і 499.
Таким чином, в певних варіантах здійснення мутація в 490 замінює Сіи (Е) на ГГ ув (К); мутація в 538 замінює ізо (І) на Гув (К); мутація в 486 замінює Сіп (0) на Сім (Е); а мутація в положенні 499 замінює ізо (І) на Гуз (К). Зокрема, конструйовані напівдомени розщеплення, що описуються в цьому документі, отримували за допомогою внесення мутацій в положення 490 бо (Е-К) ії 538 (І-К) в одному з напівдоменів розщеплення з отриманням конструйованого напівдомену розщеплення, що позначається "Е490ОК:І5З8К", і за допомогою внесення мутацій в положення 486 (0-ЄЕ) і 499 (1-1) в іншому напівдомені розщеплення з отриманням сконструйованого напівдомену розщеплення, що позначається "О486Е:1499К". Конструйовані напівдомени розщеплення, що описуються в цьому документі, є облігатними мутантними гетеродимерами, в яких мінімізоване або усунене порушене розщеплення. Див., наприклад, приклад 1 патентної публікації США Мо 2008/0131962, опис якої повністю включений за допомогою посилання для всіх цілей. Також див. 52с7ерек еї аї. (2007) Ммаї Віоїесппої! 25:786- 793. В певних варіантах здійснення конструйований напівдомен розщеплення містить мутації в положеннях 486, 499 і 496 (що нумеруються відносно РОКІ дикого типу), наприклад, мутації, які замінюють залишок дикого типу СіІп (С) в положенні 486 на залишок Сім (Е), залишок дикого типу І5з0о (І) в положенні 499 на залишок ГГ еи (І) і залишок дикого типу Азп (М) в положенні 496 на
Ар (0) або залишок Сіи (Е) (що також позначається як домени "ЕГО" і "ЕГЕ", відповідно). У інших варіантах здійснення конструйований напівдомен розщеплення містить мутації в положеннях 490, 538 і 537 (що нумеруються відносно РОКІ дикого типу), наприклад, мутації, які замінюють залишок дикого типу СІ (Е) в положенні 490 на залишок Гуз (К), залишок дикого типу І5зо (І) в положенні 538 на залишок Гуз (К) і залишок дикого типу Ні (Н) в положенні 537 на залишок Гуз (К) або залишок Агуд (К) (що також позначається як домени "ККК" і "ККК", відповідно). У інших варіантах здійснення конструйований напівдомен розщеплення містить мутації в положеннях 490 і 537 (що нумеруються відносно РОКІ дикого типу), наприклад, мутації, які замінюють залишок дикого типу Сім (Е) в положенні 490 на залишок Гуз (К) і залишок дикого типу Ні (Н) в положенні 537 на залишок ГІ уз (К) або залишок Ага (К) (що також позначається як домени "КІК" і "КІК", відповідно). (Див. попередню заявку США 61/337769, подану 8 лютого 2010 року). У інших варіантах здійснення конструйований напівдомен розщеплення містить мутації "Зпагкеу" і/або "Знагкеу" (див. Сцо еї аї., (2010) 9. Мої. Віої. дої:10,10167/.|тр.2010,04,060).
Конструйовані напівдомени розщеплення, що описуються в цьому документі можна отримувати будь-яким прийнятним способом, наприклад, за допомогою сайтспецифічного мутагенезу напівдоменів розщеплення дикого типу (РОКІ), як описано в патентних публікаціях
США МоМо 20050064474 і 20080131962.
Іншим переважним рестрикційним ферментом типу ІЗ є Вії (див. 7агетрва еї аї., (2004) у.
Зо Мої! Віої. 336(1):81-92). Домен розщеплення цього ферменту можна відділяти від його ДНК- зв'язувального домену і функціонально зв'язувати з ДНК-зв'язувальним доменом цинкових пальців з отриманням 2ЕМ.
Злиті білки
Способи складання і конструювання злитих білків (і полінуклеотиди, що кодують їх) відомі фахівцям в даній галузі. Наприклад, способи складання і конструювання злитих білків, що містить ДНК-зв'язувальний домени (наприклад, домени цинкових пальців) і регуляторні домени або домени розщеплення (або напівдомени розщеплення), і полінуклеотидів, що кодують такі злиті білки, описані в патентах США, що належать тим же заявникам 6453242 і 6534261 і публікаціях патентних заявок США 2007/0134796 і 2005/0064474; повністю включених в цей документ за допомогою посилання.
У певних варіантах здійснення конструюють полінуклеотиди, що кодують злиті білки. Ці полінуклеотиди можна вставляти у вектор, а вектор вводити в клітину (див. нижче для додаткового опису векторів і способів введення полінуклеотидів в клітини).
Як указано вище, в певних варіантах здійснення злитий білок містить білок з цинковими пальцями, що зв'язується з ділянкою-мішенню в гені, залученому до біосинтезу жирних кислот, і щонайменше один домен регуляції транскрипції, наприклад, активуючий або репресуючий домен.
У інших варіантах здійснення способів, що описуються в цьому документі, нуклеази з цинковими пальцями містять злитий білок, що містить зв'язувальний домен цинкових пальців і напівдомен розщеплення з рестрикційного ферменту РОКІ, і в клітині експресуються два таких білки. Експресія двох злитих білків в клітині може бути результатом доставки в клітину двох білків; доставки в клітину одного білка і однієї нуклеїнової кислоти, що кодує один з білків; доставки в клітину двох нуклеїнових кислот, де кожна кодує один з білків; або доставки в клітину однієї нуклеїнової кислоти, що кодує обидва білки. У додаткових варіантах здійснення злитий білок містить один поліпептидний ланцюг, що містить два напівдомени розщеплення і зв'язувальний домен цинкових пальців. У цьому випадку в клітині експресується один злитий білок і, не бажаючи бути пов'язаним теорією, вважають, що він розщеплює ДНК в результаті формування внутрішньомолекулярного димера з напівдоменів розщеплення.
У певних варіантах здійснення компоненти нуклеаз з цинковими пальцями (наприклад, бо злиття 7ЕР-РоКІ) розташовані так, що домен цинкових пальців розташований ближче до М-кінця злитого білка, а напівдомен розщеплення розташований ближче до С-кінця. Це є дзеркальним відображенням відносної орієнтації домену розщеплення в природних доменах розщеплення, які димеризуються, таких як домени, які походять з ферменту РОКІ, в якому ДНК-зв'язувальний домен розташований ближче до М-кінця, а напівдомен розщеплення розташований ближче до
С-кінця. У цих варіантах здійснення димеризація напівдоменів розщеплення з формуванням функціональної нуклеази зумовлена зв'язуванням злитих білків з ділянками на протилежних ланцюгах ДНК, де 5'-кінці ділянок зв'язування розташовані проксимально один відносно одного.
У додаткових варіантах здійснення компоненти злитих білків (наприклад, злиття 7ЕМ-ЕоКІ) розташовані так, що напівдомен розщеплення розташований ближче до М-кінця злитого білка, а домен цинкових пальців розташований ближче до С-кінця. У цих варіантах здійснення димеризація напівдоменів розщеплення з формуванням функціональної нуклеази зумовлена зв'язуванням злитих білків з ділянками на протилежних ланцюгах ДНК, де 3'-кінці ділянок зв'язування розташовані проксимально один відносно одного.
У додаткових варіантах здійснення перший злитий білок містить напівдомен розщеплення ближче до М-кінця злитого білка, а домен цинкових пальців ближче до С-кінця, а другий злитий білок сконструйований так, що домен цинкових пальців розташований ближче до М-кінця злитого білка, а напівдомен розщеплення розташований ближче до С-кінця. У цих варіантах здійснення обидва злитих білки зв'язуються з одним і тим же ланцюгом ДНК, де ділянка зв'язування першого злитого білка, яка містить домен цинкових пальців ближче до С-кінця, розташована з 5'-кінця від ділянки зв'язування другого злитого білка, що містить домен цинкових пальців ближче до М-кінця.
У певних варіантах здійснення описаних злитих білків амінокислотна послідовність між доменом цинкових пальців і доменом розщеплення (або напівдоменом розщеплення) означають "2С-лінкер". 2С-лінкер потрібно відрізняти від лінкерів між пальцями, описаних вище.
Для подробиць отримання 2С-лінкерів, що оптимізують розщеплення, див., наприклад, патентні публікації США 20050064474А1 і 20030232410 і міжнародну патентну публікацію МУО05/084190.
У одному з варіантів здійснення опис стосується білка, який містить 2ЕМ, з цинковими пальцями з амінокислотними послідовностями з розпізнавальними спіралями, представленими в таблиці 1 або таблиці 10. У іншому варіанті здійснення в цьому документі наданий
Зо експресуючий ЕМ вектор, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує 2ЕР з розпізнавальними спіралями, представленими в таблиці 1 або таблиці 10.
Регуляція експресії гена
Для визначення того, чи модуля є 2ЕР експресію генів, можна використовувати множину аналізів. Активність конкретного 2ЕР можна оцінювати з використанням множини аналізів іп міо і іп мімо, вимірюючи, наприклад, рівні білка або мРНК, рівні продуктів, активність ферменту; активацію або репресію транскрипції репортерного гена, наприклад, з використанням імунологічних аналізів (наприклад, ЕГІЗА і імуногістохімічних аналізів з антитілами), аналізів гібридизації (наприклад, захисти від РНКази, нозерн-блот, гібридизацію іп 5їш, дослідження олігонуклеотидних панелей), колориметричних аналізів, аналізів ампліфікації, аналізів активності ферментів, аналізів фенотипу і т. п.
Як правило, 2ЕР спочатку тестують на активність іп міо з використанням аналізів ЕГІЗА, а потім з використанням клітин нирки. Часто 2ЕР спочатку тестують з використанням системи транзиторної експресії з репортерним геном, а потім тестують регуляцію ендогенного гена- мішені в клітинах і в цілих рослинах, іп мімо і ех мімо. ЕР можна рекомбінантно експресувати в клітині, рекомбінантно експресувати в клітинах, трансплантованих в рослину, або рекомбінантно експресувати в трансгенній рослині, а також вводити в рослину або клітину у вигляді білка з використанням доставляючих носіїв, описаних нижче. Клітини можуть бути іммобілізовані, знаходитися в розчині, їх можна ін'єктувати в рослину, або вони можуть знаходитися в природі в трансгенній або нетрансгенній рослині.
Модуляцію експресії гена тестують з використанням одного з аналізів іп міїго або іп мімо, що описуються в цьому документі. Зразки або аналізи обробляють 2ЕР і порівнюють з контрольними зразками без тестованої сполуки для дослідження ступеня модуляції. Для регуляції ендогенної експресії гена, 2ЕР, як правило, має Ка 200 нМ або менше, більш переважно - 100 нМ або менше, більш переважно - 50 нМ, найбільш переважно - 25 нМ або менше.
Ефекти 2ЕР можна вимірювати, досліджуючи будь-який з параметрів, описаних вище. Для оцінки впливу 2ЕР можна використовувати будь-яку відповідну зміну експресії гена, фенотипову або фізіологічну зміну. Коли функціональні наслідки визначають з використанням інтактних клітин або рослин, також можна вимірювати ряд таких ефектів, як ріст рослин, зміни бо транскрипції відомих і неохарактеризованих генетичних маркерів (наприклад, дослідження нозерн-блотингу або олігонуклеотидних панелей), зміни клітинного метаболізму, такі як зміни росту клітин або рн, і зміни внутрішньоклітинних вторинних месенджерів, таких як СМР.
Переважні аналізи для регуляції ЕР ендогенної експресії гена можна проводити іп міо. У одному з переважних форматів аналізу іп міго, регуляцію 2ЕР ендогенної експресії гена в культивованих клітинах вимірюють, досліджуючи продукцію білка з використанням аналізу
ЕГІ5ЗА. Тестований зразок порівнюють з контрольними клітинами, що обробляються пустим вектором або стороннім 2ЕР, який направлений на інший ген.
У іншому варіанті здійснення регуляцію 2ЕР ендогенної експресії гена визначають іп міїго, вимірюючи рівень експресії мРНК гена-мішені. Рівень експресії гена вимірюють з використанням ампліфікації, наприклад, з використанням ПЛР, СК або аналізів гібридизації, наприклад, нозерн-гібридизації, захисти від РНКази, дот-блотингу. У одному з варіантів здійснення використовують захист від РНКази. Рівень білька або мРНК детектують з використанням безпосередньо або опосередковано мічених засобів для детекції, наприклад, флуоресцентно або радіоактивно мічених нуклеїнових кислот, радіоактивно або ферментативно мічених антитіл і т. п., як описано в цьому документі.
Альтернативно, можна розробляти систему з репортерним геном з використанням промотору гена-мішені, функціонально зв'язаного з репортерним геном, таким як люцифераза, зелений флуоресцентний білок, САТ або В-дам. Як правило, репортерну конструкцію котрансфікують в культивовану клітину. Після обробки вибраним 2ЕР кількісно вимірюють транскрипцію, трансляцію або активність репортерного гена стандартними способами, відомими фахівцям в даній галузі.
Також як переважний варіант винаходу для дослідження регуляції ендогенної експресії гена іп мімо використовують трансгенні і нетрансгенні рослини. Трансгенні рослини можуть стабільно експресувати вибраний 2ЕР. Альтернативно, можна використовувати рослини, які транзиторно експресують вибраний 2ЕР або в які вводять 2ЕР в доставляючому носії. Регуляцію ендогенної експресії гена тестують з використанням будь-якого з аналізів, що описуються в цьому документі.
Способи направленого розщеплення
Описувані способи і композиції можна використовувати для розщеплення ДНК в області, яка
Зо представляє інтерес, в клітинному хроматині (наприклад, в бажаній або визначеній наперед ділянці геному, наприклад в гені, залученому до біосинтезу жирних кислот, або поруч з нею).
Для такого направленого розщеплення ДНК, зв'язувальний домен цинкових пальців конструюють для зв'язування з ділянкою-мішенню у визначеній наперед ділянці розщеплення або поруч з нею, і злитий білок, що містить конструйований зв'язувальний домен цинкових пальців і домен розщеплення, експресують в клітині. Після зв'язування частини злитого білка з цинковими пальцями з ділянкою-мішенню, домен розщеплення розщеплює ДНК поруч з ділянкою-мішенню. Точна ділянка розщеплення може залежати від довжини 2С-лінкера.
Альтернативно, в клітині експресують два злитих білки, де кожний містить зв'язувальний домен цинкових пальців і напівдомен розщеплення, і зв'язують з ділянками-мішенями, які розташовані поруч таким чином, що відновлюється функціональний домен розщеплення |і розщеплює ДНК поруч з ділянками-мішенями. У одному з варіантів здійснення розщеплення відбувається між ділянками-мішенями двох зв'язувальних доменів цинкових пальців. Один або обидва зв'язувальні домени цинкових пальців можуть бути конструйованими.
Для направленого розщеплення з використанням злитого поліпептиду із зв'язувального домену цинкових пальців-домену розщеплення ділянка зв'язування може містити ділянку розщеплення, або ближній кінець ділянки зв'язування може розташовуватися на відстані 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 25, 50 або більше нуклеотидів (або на будь-якому цілочисельному значенні від 1 до нуклеотидів) від ділянки розщеплення. Точне положення ділянки зв'язування відносно ділянки розщеплення залежить від конкретного домену розщеплення і довжини 2С-лінкера. Для 50 способів, в яких використовують два злитих поліпептиди, де кожний містить зв'язувальний домен цинкових пальців і напівдомен розщеплення, ділянки зв'язування, як правило, розташовані з двох сторін від ділянки розщеплення. Таким чином, ближній кінець першої ділянки зв'язування може розташовуватися на відстані 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 25 або більше нуклеотидів (або на будь-якому цілочисельному значенні від 1 до 50 нуклеотидів) від однієї зі сторін від ділянки розщеплення, і ближній кінець другої ділянки зв'язування може розташовуватися на відстані 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 25 або більше нуклеотидів (або на будь-якому цілочисельному значенні від 1 до 50 нуклеотидів) від іншої сторони ділянки розщеплення.
Способи картування ділянок розщеплення іп міїго і іп мімо відомі фахівцям в даній галузі.
Таким чином, в способах, що описуються в цьому документі, можна використовувати бо конструйований зв'язувальний домен цинкових пальців, злитий з доменом розщеплення. У цих випадках зв'язувальний домен конструюють для зв'язування з послідовністю-мішенню в місці, де бажане розщеплення, або поруч з ним. Злитий білок або полінуклеотид, що кодує його, вводять в рослинну клітину. Після введення в клітину або експресії в ній злитий білок зв'язується з послідовністю-мішенню і проводить розщеплення в послідовності-мішені або поруч з нею. Точна ділянка розщеплення залежить від характеру домену розщеплення і/або присутності і/або характеру лінкерних послідовностей між доменами зв'язування і розщеплення.
У випадках, коли використовують два злитих білки, де кожний містить напівдомен розщеплення, відстань між найближчими межами ділянок зв'язування може становити 1,2, 3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 25 або більше нуклеотидів (або будь-яке цілочисельне значення від 1 до 50 нуклеотидів).
Оптимальні рівні розщеплення також можуть залежати від відстані між ділянками зв'язування двох злитих білків (див., наприклад, 5ітійй еї аї. (2000) Мисієїс Асід5 Ке5. 28:3361-3369; Вірікома еї аїІ. (2001) Мої. СеїІ. ВіоїЇ. 21:289-297) і довжини 2С-лінкерів в кожному злитому білку. Також див. патентну публікацію США 20050064474А1 і міжнародні патентні публікації УУО05/084190,
УМО05/014791 і МУО03/080809.
У певних варіантах здійснення домен розщеплення містить два напівдомени розщеплення, які обидва є частиною одного поліпептиду, що містить зв'язувальний домен, перший напівдомен розщеплення і другий напівдомен розщеплення. Напівдомени розщеплення можуть мати однакову амінокислотну послідовність або різні амінокислотні послідовності за умови, що вони функціонують з розщепленням ДНК.
Напівдомени розщеплення також можна надавати в окремих молекулах. Наприклад, в клітину можна вводити два злитих поліпептиди, де кожний поліпептид містить зв'язувальний домен і напівдомен розщеплення. Напівдомени розщеплення можуть мати однакову амінокислотну послідовність або різні амінокислотні послідовності за умови, що вони функціонують з розщепленням ДНК. Крім того, зв'язувальні домени зв'язуються з послідовностями-мішенями, які, як правило, розташовані таким чином, що після зв'язування злитих поліпептидів, два напівдомени розщеплення представляються один відносно одного в просторовій орієнтації що забезпечує відновлення домену розщеплення (наприклад, за допомогою димеризації напівдоменів), таким чином, розташовуючи напівдомени один відносно одного з формуванням функціонального домену розщеплення, що приводить до розщеплення
Зо клітинного хроматину в області, яка представляє інтерес. Як правило, розщеплення відновленим доменом розщеплення відбувається в ділянці, розташованій між двома послідовностями-мішенями. Один або обидва білки можуть бути сконструйовані для зв'язування з їх ділянкою-мішенню.
Два злитих білки можуть зв'язуватися в області, яка представляє інтерес, в одній і тій же або протилежній полярності, і їх ділянки зв'язування (тобто, ділянки-мішені) можуть розділятися будь-якою кількістю нуклеотидів, наприклад, від 0 до 200 нуклеотидів або будь-яким цілочисельним значенням між ними. У певних варіантах здійснення ділянки зв'язування для двох злитих білків, де кожна містить зв'язувальний домен цинкових пальців і напівдомен розщеплення, можуть розташовуватися на відстані від 5 до 18 нуклеотидів, наприклад, на відстані 5-8 нуклеотидів, або на відстані 15-18 нуклеотидів або на відстані 6 нуклеотидів або на відстані 16 нуклеотидів, як вимірюють від кінця кожної ділянки зв'язування, найближчого до іншої ділянки зв'язування, а розщеплення відбувається між ділянками зв'язування.
Ділянка, в якій розщеплюється ДНК, як правило, розташована між ділянками зв'язування для двох злитих білків. Дволанцюжковий розрив ДНК часто є результатом двох одноланцюжкових розривів або "ніків" зі зміщенням на 1, 2, 3, 4, 5, 6 або більше нуклеотидів (наприклад, розщеплення дволанцюжкової ДНК природної БокІ є результатом одноланцюжкових розривів зі зміщенням на 4 нуклеотиди). Таким чином, розщеплення не обов'язково відбувається точно на протилежних сторонах кожного ланцюга ДНК. Крім того, структура злитих білків і відстань між ділянками-мішенями може впливати на те, чи станеться розщеплення поруч з однією парою нуклеотидів, або розщеплення станеться в різних ділянках.
Однак для більшості застосувань, включаючи направлену рекомбінацію і направлений мутагенез (див. нижче), як правило, достатньо розщеплення в деякому діапазоні нуклеотидів, і розщеплення між конкретними парами основ не потрібно.
Як указано вище, злитий білок(ки) можна вводити у вигляді поліпептидів і/або у вигляді полінуклеотидів. Наприклад, в клітину можна вводити два полінуклеотиди, де кожний містить послідовності, що кодують один з вказаних вище поліпептидів, і коли поліпептиди експресуються і кожний зв'язується з його послідовністю-мішенню, відбувається розщеплення в послідовності-мішені або поруч з нею. Альтернативно, в клітину вводять один полінуклеотид, що містить послідовності, що кодують обидва злитих поліпептиди. Полінуклеотиди можуть 60 являти собою ДНК, РНК або будь-які модифіковані форми або аналоги ДНК і/або РНК.
Для збільшення специфічності розщеплення в способах, що описуються в цьому документі, можна використовувати додаткові композиції. Наприклад, одиночні напівдомени розщеплення можуть виявляти обмежену активність розщеплення двох ланцюгів. У способах, де в клітину вводять два злитих білки, де кожний містить домен цинкових пальців з треома пальцями і напівдомен розщеплення, кожний білок визначає ділянку-мішень приблизно з 9 нуклеотидів.
Хоча сукупна послідовність-мішень з 18 нуклеотидів, ймовірно, є унікальною в геномах ссавцях і рослин, будь-яка дана ділянка-мішень з 9 нуклеотидів в середньому в геномі людини зустрічається приблизно 23000 разів. Таким чином, може відбуватися неспецифічне розщеплення, внаслідок специфічного зв'язування одного напівдомену з ділянкою. Таким чином, способи, що описуються в цьому документі, передбачають використання домінантно- негативного мутанта напівдомену розщеплення, такого як РОКІ (або нуклеїнової кислоти, що кодує його), який експресується в клітині разом з двома злитими білками. Домінантно- негативний мутант здатний до димеризації, але не здатний до розщеплення, а також блокує розщеплювальну активність напівдомену з яким він димеризується. Забезпечуючи молярний надлишок домінантно-негативного мутанта по відношенню до злитих білок, тільки в областях, в яких зв'язані обидва злиті білки, буде міститися досить висока локальна концентрація функціональних напівдоменів розщеплення для проходження димеризації і розщеплення. У ділянках, де зв'язаний тільки один з двох злитих білків, його напівдомен розщеплення формує димер з домінантно-негативним мутантним напівдоменом, і небажаного, неспецифічного розщеплення не відбувається.
Експресуючі вектори
Нуклеїнову кислоту, що кодує один або декілька білків (наприклад, ЕР), як описано в цьому документі, можна клонувати у вектор для трансформації в прокаріотичні або еукаріотичні клітини для реплікації і/або експресії. Вектори можуть являти собою прокаріотичні вектори, наприклад, плазміди або човникові вектори, вектори комах, вірусні вектори або еукаріотичні вектори. Нуклеїнову кислоту, що кодує 2ЕР, також можна клонувати в експресуючий вектор для введення в рослинну клітину.
Для експресії 2ЕР, послідовності, що кодують 2ЕР, як правило, субклонують в експресуючий вектор, що містить промотор, який контролює транскрипцію. Прийнятні бактерійні і еукаріотичні промотори добре відомі в даній галузі і описані, наприклад, в Затргоок еї аї., МоІесшіаг Сіопіпод,
А Іарогаїгу Мапиа! (2па єд. 1989; Зга єйд., 2001); Кпедієї, Сепе Тгапвієї апа Ехргевзвіоп: А
Гарогаїгу Мапиа! 5(осКіоп Ргеб5, Мем/ МогК (1990); і Сиггепі РгоїосоЇ5 іп МоїІесшаг Віоіоду (АйМзибеї еї аїЇ., вище). Бактерійні експресуючі системи для експресії 2ЕР доступні, наприклад, для Е. соїї, видах Васійшв5 і ЗаІтопеїІа (Раїма еї а), Сепе 22:229-235 (1983)). Набори для таких експресуючих систем є комерційно доступними. Еукаріотичні експресуючі системи для клітин ссавців, рослин, дріжджів і комах добре відомі фахівцям в даній галузі і також є комерційно доступними.
Промотор, що використовується для контролю експресії кодуючої 2ЕР нуклеїнової кислоти, залежить від конкретного застосування. Наприклад, для експресії і очищення 2ЕР, як правило, використовують сильний конститутивний промотор, прийнятний для клітини-хазяя.
На відміну від цього, коли 2ЕР вводять іп мімо для регуляції генів рослини (див., розділ "доставка нуклеїнових кислот в рослинні клітини", нижче), залежно від конкретного застосування
ЕР використовують або конститутивний або індуцибельний промотор. Необмежувальні приклади промоторів рослин включають промоторні послідовності, що отримуються з убіквітину-
З А. Інаїйапа (ирі-3) (Саїїв, єї аї!., 1990, У. Віої. Спет. 265-12486-12493); манопинсинтази А. їштеїасієпо5 (Дтав) (Рейоїїпо еї аіІ., патент США Мо 6730824); і/або вірус мозаїки жилок маніоки (С5УМУ) (Мегаадиег єї аї., (1996), Ріапі МоїІєсшаг Віоіоду 31:1129-1139). Також див. розділ прикладів.
Крім промотору, експресуючий вектор, як правило, містить транскрипційну одиницю або експресуючу касету, яка містить всі додаткові елементи, необхідні для експресії нуклеїнової кислоти в клітинах-хазяїнах, прокаріотичних або еукаріотичних. Таким чином, типова експресуюча касета містить промотор, функціонально зв'язаний, наприклад, з послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує 2ЕР, і сигнали, необхідні, наприклад, для ефективного поліаденілування транскрипту, термінації транскрипції, ділянок зв'язування рибосом або термінації трансляції. Додаткові елементи касети можуть включати, наприклад, енхансери, гетерологічні сигнали сплайсингу і/або сигнал ядерної локалізації (МІ 5).
Конкретний експресуючий вектор, що використовується для перенесення генетичної інформації в клітину, вибирають, враховуючи плановане застосування 2ЕР, наприклад, експресію у рослин, тваринних, бактерій, грибів, найпростіших і т.д. (див. експресуючі вектори, бо описані нижче). У даній галузі відомі і детально описані стандартні експресуючі вектори бактерій і тварин, наприклад, в патентній публікації США 20050064474А1 і в міжнародних патентних публікаціях МУО05/084190, ММО05/014791 і УУС0О3/080809.
Для отримання ліній клітин бактерій, ссавців, рослин, дріжджів або комах, які експресують великі кількості білка, які потім можна очищати стандартними способами, можна використовувати стандартні способи трансфекції (див., наприклад, СоїІеу еї аї., у). Віої. Спет. 264:17619-17622 (1989); Сюпіде тю Ргоївіп Ритгіїсайоп, іп МеїШйосй5 іп Епгутоїіоаду, мої. 182 (Оєсш5спег, ей., 1990)). Трансформацію еукаріотичних і прокаріотичних клітин проводять стандартними способами (див., наприклад, Могїтізоп, У. Васі. 132:349-351 (1977); Сіатк-Сипів5 апа Сипівв, Меїйодз іп Еплутоіоду 101:347-362 (Ми єї а)ї., едв., 1983).
Можна використовувати будь-який з добре відомих способів введення чужорідних нуклеотидних послідовностей в такі клітини-хазяїни. Вони включають використання трансфекції з фосфатом кальцію, полібрену, злиття протопластів, електропорації, ультразвукових способів (наприклад, сонопорації), ліпосом, мікроін'єкції, "голих" ДНК, плазмідних векторів, вірусних векторів, епісомного і інтегративного способу і будь-якого з інших добре відомих способів введення клонованої геномної ДНК, кКДНК, синтетичної ДНК або іншого чужорідного генетичного матеріалу в клітину-хазяя (див., наприклад, ЗатбгооКк еї аїЇ., вище). Необхідно тільки, щоб конкретним використовуваним способом генетичної інженерії можна було результативно вводити в клітину-хазяїна, здатну до експресії вибраного білка, щонайменше один ген.
Доставка нуклеїнових кислот в рослинні клітини
Як указано вище, конструкції ДНК можна вводити в (наприклад, в геном) бажану рослину- хазяїна множиною загальноприйнятих способів. Для огляду таких способів див., наприклад,
МУеів5басп апа МУвіззрбаси МеїШйод5 їог Ріапі Моїіесшаг Віоіоду (1988, Асадетіс Ргевз5, М.М.) зЗесіп МІ, рр. 421-463; і Сгіегєоп апі Согеу, Ріапі Моїесшіаг Віоіоду (1988, 2а Еа.), ВіаскКіє,
Гопаоп, Сп. 7-9.
Наприклад, конструкцію ДНК можна вводити безпосередньо в геномну ДНК рослинної клітини з використанням таких способів, як електропорація і мікроін'єкція в протопласти рослинної клітини, або конструкції ДНК можна вводити безпосередньо в тканину рослини з використанням біолістичних способів, таких як бомбардування частинками з ДНК (див., наприклад, Кіеїп еї аї.,, (1987) Маїшге 327:70-73). Альтернативно, конструкції ДНК можна
Зо комбінувати з відповідними фланкуючими областями Т-ДНК і вводити в загальноприйнятому векторі-хазяїні Адгобасієегцт іштеїасієпе. Опосередковані Адгобасієгішт іШтеїасієпе способи трансформації, включаючи нейтралізацію і використання бінарних векторів, добре описані в науковій літературі. Див., наприклад, Ногзгсп еї аї., (1984) Зсіепсе 233:496-498 і ЕгаїІеу еї аї., (1983) Ргос. Маї!. Асад. 5сі. ОБА 80:4803.
Крім того, перенесення генів можна здійснювати із застосуванням Адгобасієгійт бактерій, що не є або вірусів, таких як види АПігобішт МОИВ234, біпогпі2гороїт теїоїї, Мезогпі2горішт ої, вірус картоплі Х, вірус мозаїки цвітної капусти і вірус мозаїки жилок маніоки і/або вірус тютюнової мозаїки. Див., наприклад, Спипо еї аї. (2006) Тгепаз Ріапі 5сі. 11(1): 1-4.
Вірулентна дія хазяїна Адгобрасієгішт іШтеїасіеп5, коли клітину інфікують бактеріями з використанням бінарного вектора Т-ДНК (Вемап (1984) Мис. Асій Ке5. 12:8711-8721) або способів спільного культивування (Ног5сп еї аЇ. (1985) Зсіепсе 227:1229-1231), зумовлює вставляння конструкції і прилеглого маркера в ДНК рослинної клітини. Як правило, систему трансформації з Адгобасієгит застосовують для конструювання дводольних рослин (Вемап еї аІ,, (1982) Апп. Рем. Сепеї 16:357-384; Водегїв єї а!., (1986) Мештоа5 Епгутої. 118:627-641).
Систему трансформації з Адгобрасієгішт також можна використовувати для трансформації, а також перенесення ДНК в однодольні рослини і рослинні клітини. Див. патент США Мо 5591616;
Негпаї!5іееп еї аї., (1984) ЕМВО .4). 3:3039-3041; НосуКаз5-Мап 5іодієтеп еї аї., (1984) Машгте 311:763-764; Сиітвіеу єї аІ. (1987) Майте 325:1677-179; ВошМоп еї аї!., (1989) Ріапі Мої. Віо|. 12:31-40.; і сощшіа еї аї., (1991) Ріапі Рпузіо!. 95:426-434.
Альтернативні способи перенесення генів і трансформації як необмежувальні приклади включають трансформацію протопластів за допомогою опосередковуваного кальцієм, поліетиленгліколем (РЕС) або електропорацією захоплення "голої" ДНК (див. Раз2Кому»кКі еї аї. (1984) ЕМВО 3. 3:2717-2722, Роїгукиз єї аї!. (1985) Моїес. Сеп. Сепеї. 199:169-177; Еготт еї аї. (1985) Рос. Маї. Асад. Осі. ОБА 82:5824-5828; і Зпітатоїо (1989) Маїшге 338:274-276) і електропорації тканин рослин (ОС'Наїйміп еї аї!. (1992) Ріапі Сеї! 4:1495-1505). Додаткові способи трансформації рослинних клітин включають мікроін'єкцію, опосередковане карбідом кремнію захоплення ДНК (Каеррієг еї аїЇ. (1990) Ріапі Се Керогіег 9:415-418) і бомбардування мікрочастинками (див. Ківїп еї аї. (1988) Ргос. Маї. Асад. 5сі. ОБА 85:4305-4309; і сСогаоп-Катт еї а. (1990) Ріапі Сеї! 2:603-618) або наночастинками.
Описувані способи і композиції можна використовувати для вставляння екзогенних послідовностей у визначені наперед положення в геномі рослинної клітини. Це є корисним, в зв'язку з тим, що експресія рослини трансгена, що вводиться в геном, критично залежить від його ділянки інтеграції. Таким чином, гени, що кодують, наприклад, поживні речовини, антибіотики або терапевтичні молекули, можна вводити за допомогою направленої рекомбінації в області геномів рослин, прийнятні для їх експресії.
Трансформовані рослинні клітини, що отримуються будь-яким з вказаних вище способів трансформації, можна культивувати з регенерацією цілої рослини, яка має трансформований генотип і, таким чином, бажаний фенотип. Такі способи регенерації основані на маніпуляціях з певними фітогормонами в середовищі для вирощування культур тканин, як правило, основуючись на біоцидному і/або гербіцидному маркері, що вводиться спільно з бажаними нуклеотидними послідовностями. Регенерація рослин з культивованих протопластів описана в
Емапзв, єї аї., "Ргоюріавзів ІзоЇайоп апа Сийите" іп Напароок ої Ріапі Сеїї Сипитге, рр. 124-176,
МастійШап Рибіїзєпіпд Сотрапу, Мем/ МогК, 1983; і Віпадіпо, Кедепегайоп ої Ріапіє5, Ріапі
Ргогоріавзів, рр. 21-73, СКС Ргез5, Воса Кап, 1985. Регенерацію також можна здійснювати з калюсу, тканин, органів, пилка, ембріонів рослин або їх частин. Такі способи регенерації в основному описані в Кіеєе еї аї. (1987) Апп. Кем. ої Ріапі Рпуз. 38:467-486.
Нуклеїнові кислоти, що вводяться в рослинну клітину, можна використовувати для надання бажаних ознак по суті будь-якій рослині. З використанням конструкцій нуклеїнових кислот за даним описом і різних способів трансформації, вказаних вище, можна сконструювати широку множину рослин і систем рослинних клітин з бажаними фізіологічними і агрономічними характеристиками, що описуються в цьому документі. У переважних варіантах здійснення рослини-мішені і рослинні клітини-мішені для конструювання як необмежувальні приклади включають однодольні і дводольні рослини, такі як сільськогосподарські культури, включаючи зернові культури (наприклад, пшеницю, кукурудзу, рис, просо, ячмінь), плодові культури (наприклад, помідор, яблуко, груша, полуниці, апельсин), кормові культури (наприклад, люцерна), коренеплоди (наприклад, морква, картопля, цукровий буряк, батат), листові овочеві культури (наприклад, салат-латук, шпинат); квітучі рослини (наприклад, петунія, троянда, хризантема), хвойні і соснові дерева (наприклад, сосна, ялиця, ялина); рослини, що
Зо використовуються в фітомедицині (наприклад, рослини, що акумулюють важкі метали); олійні культури (наприклад, соняшник, насіння ріпаку, соя), і рослини, що використовуються в експериментальних цілях (наприклад, Агарідорзів). Таким чином, описувані способи і композиції знаходять застосування для широкого діапазону рослин, включаючи як необмежувальні приклади види родів Азрагадив, Амепа, Вгаззіса, Спгив, СИигиПи5, Сарвзісит, Сисигріта, Оайсив,
Егпідегоп, Сіусіпе, совззуріит, Ногаеит, І асіиса, І оїїшт, І усорегвзісоп, Мав, Мапіної, Місоїйапа,
Огуспорнгадтив, Огула, Регзєа, Ріазеоіив, Рівит, Ругив5, Ргипив, Нарпапив, бесаїє, боіагит, зогдпит, Тийісит, Міїв, Мідпа і 7еа.
Фахівцеві в даній галузі зрозуміло, що після стабільного вбудовування експресуючої касети в трансгенні рослини і підтвердження функціонування, її можна вводити в інші рослини за допомогою статевого схрещування. Можна використовувати будь-який зі стандартних способів селекції залежно від схрещуваних видів.
Трансформовані клітини, калюс, тканину рослини або рослину можна ідентифікувати і виділяти за допомогою відбору або скринінгу конструйованого рослинного матеріалу рослин на ознаки, що кодуються маркерними генами, що знаходяться в трансформованій ДНК. Наприклад, відбір можна проводити по росту конструйованого рослинного матеріалу на середовищах, які містять інгібуючу кількість антибіотика або гербіциду, до яких трансформована генна конструкція додає стійкості. Крім того, трансформовані рослини і рослинні клітини також можна ідентифікувати за допомогою скринінгу на активність видимих маркерних генів (наприклад, генів
В-глюкуронідази, люциферази, В або Ст), які можуть знаходитися на рекомбінантних конструкціях нуклеїнових кислот. Такі способи відбору і скринінгу добре відомі фахівцям в даній галузі.
Також для ідентифікації трансформантів рослин або рослинних клітин, що містять вбудовані генні конструкції можна використовувати фізичні і біохімічні способи. Ці способи як необмежувальні приклади включають: 1) Саузерн-аналіз або ампліфікацію ПЛР для детекції і визначення структури вставляння рекомбінантної ДНК; 2) Нозерн-блот, захист від РНКази 51, добудування праймера або ампліфікацію ПЛР із зворотною транскриптазою для детекції і дослідження РНК-транскриптів генних конструкцій; 3) ферментативні аналізи для детекції ферментативної або рибозимної активності, коли генна конструкція кодує такі продукти генів; 4) електрофорез білків в гелі, способи вестерн-блотингу, імунопреципітацію або імуноферментні бо аналізи, коли продуктами генної конструкції є білки. Для детекції присутності або експресії рекомбінантної конструкції в конкретних органах і тканинах рослин також можна використовувати додаткові способи, такі як гібридизація іп 5йш, ферментне фарбування і імунозабарвлювання. Способи проведення всіх цих аналізів добре відомі фахівцям в даній галузі.
Ефекти маніпуляцій з генами способами, що описуються в цьому документі, можна спостерігати, наприклад, за допомогою нозерн-блотингу РНК (наприклад, мРНК), виділеної з тканин, які представляють інтерес. Як правило, якщо кількість МРНК зростає, можна вважати, що відповідний ендогенний ген експресується більшою мірою, ніж раніше. Можна використовувати інші способи вимірювання активності гена і/або СУР74В. Можна використовувати різні типи ферментативних аналізів залежно від використовуваного субстрату і способу детекції зростання або зниження кількості продукту реакції або побічного продукту. Крім того, можна імунохімічно, тобто за допомогою ЕГІ5А, КІА, ЕЇА їі інших основаних на антитілах аналізів, добре відомих фахівцям в даній галузі таких як аналіз за допомогою електрофоретичного визначення (з фарбуванням або з вестерн-блотингом), вимірювати рівні експресованого білка СУР74В. Трансген можна селективно експресувати в певних тканинах або на певних стадіях розвитку рослин, або трансген можна експресувати по суті у всіх тканинах рослин, по суті протягом всьому життєвого циклу. Однак також застосовний будь-який комбінаторний режим експресії.
Даний опис також стосується насіння трансгенних рослин, описаних вище, де насіння містить трансген або генну конструкцію, і включає насіння з бажаними модифікованими профілями олій. Крім того, даний опис стосується потомства, клонів, клітинних ліній або клітин трансгенних рослин, описаних вище, де вказане потомство, клон, клітинна лінія або клітина містять трансген або генну конструкцію.
Введення ефективних кількостей проводять будь-якими маршрутами, що звичайно використовуються для приведення 2ЕР в максимальний контакт з оброблюваною рослинною кліткою. 2ЕР вводять будь-яким відповідним способом, переважно з прийнятними носіями.
Відповідні способи введення таких модуляторів є доступними і добре відомі фахівцям в даній галузі, і, хоч для введення конкретної композиції можна використовувати більше одного маршруту, конкретний маршрут часто забезпечує більш швидку і більш ефективну реакцію, ніж
Зо інший маршрут.
Також можна використовувати носії і їх частково визначає конкретна композиція, що вводиться, а також конкретний спосіб, що застосовується для введення композиції. Таким чином, існує широка множина доступних відповідних складів композицій.
Застосування
Як указано вище, направлену модуляцію генів, залучених до синтезу жирних кислот, можна використовувати для швидкого і ефективного отримання рослинних олій з бажаним профілем жирних кислот.
Зміна складу жирних кислот рослинних олій олієпродукуючих рослин, наприклад, таких як канола, має принципове значення для харчового виробництва і, таким чином, для здорової дієти. Наприклад, олійне насіння сортів Вгаззіса якості каноли зі зниженими рівнями насичених жирних кислот в олії насіння можна використовувати для отримання харчових продуктів, які сприяють здоров'ю серцево-судинної системи. Способи і композиції, що описуються в цьому документі, можна використовувати для отримання олієпродукуючих рослин з низьким вмістом пальмітинової і/або стеаринової кислот, який знижує рівні насичених жирних кислот в рослинній олії. Подібним чином, отримання олієпродукуючих рослин із збільшеними рівнями вмісту олеїнової кислоти також знижує кількість насичених жирних кислот в рослинній олії.
Крім того, способи і композиції, що описуються в цьому документі, можна використовувати для збільшення вмісту пальмітинової кислоти, наприклад, в оліях, що отримуються з таких рослин. Олії з високим вмістом пальмітинової кислоти особливо придатні в складі маргаринів.
Крім того, направлену зміну профілів жирних кислот, як описано в цьому документі, можна використовувати для отримання рослин (і рослинних олій) з низьким вмістом ліноленової кислоти. Олії з низьким вмістом ліноленової кислоти демонструють підвищену стабільність; харчові продукти, що отримуються з використанням цих олій, не псуються відносно аромату або запаху так швидко, як продукти, що отримуються з рослинних матеріалів з високими концентраціями ліноленової кислоти.
Приклади
Нижче надані приклади конкретних варіантів здійснення для здійснення даного опису.
Приклади надані виключно з ілюстративними цілями і не призначені для обмеження об'єму даного опису яким би то не було чином.
Виконані зусилля для забезпечення точності відносно використовуваних чисел (наприклад, кількостей, температур і т. д.), але, зрозуміло, потрібно допускати деякі експериментальні помилки і відхилення.
Приклад 1: Ідентифікація послідовностей-мішеней в Вгазвіса париб5 І. 111 Ідентифікація послідовності-мішені
У цьому прикладі ідентифіковані ендогенні послідовності ДНК, що кодують фермент В- кетоацил-АСР-синтетазу ІЇ (КАЗ ІЇ), що знаходяться у Вгазвіса париз ГІ. (канола) в природі. Ці гени вибирали як ілюстративну мішень для демонстрації регуляції транскрипції за допомогою конструйованих факторів транскрипції білками з цинковими пальцями (2ЕР ТЕ), що приводить до бажаної модифікації біосинтезу жирних кислот і одночасно змінених профілів в олії насіння.
Фермент Д-кетоацил-АСР-синтетаза ІІ каталізує перетворення 16:0-АСР в 18:0-АСР і подальше утворення олеїнової кислоти (Опігодде апа Вгомузе, 1995, Те Ріапі СеїІ, 7:957-970). Описаний мутант гена ВД-кетоацил-АСР-синтетаза ІІ Агарідорвзів ІПаїійапа тар! приводив до 65 95 зниження активності ферменту і одночасного збільшення вмісту стеаринової кислоти на 7 95 і З 95 в листі і корінні, відповідно (МУ еї аїЇ.,, 1994, Ріапі Рпузіоіоду, 106:143-150). Стабільна експресія трансформованого трансгена В-кетоацил-АСР-синтетази І! сої в канолі знижувала вміст пальмітинової кислоти в насінні на 0,8 956, а введення того ж гена в тютюн знижувало вміст пальмітинової кислоти на 2 95 (патентна публікація Японії Мо 501446/1995).
Описані послідовності кКДНК В-кетоацил-АСР-синтетази ІІ з множини видів рослин, включаючи Агабідорвзів ІНайапа (СепВапк: АЕ318307) і Вгаззіса пари5 (сепВапк: АЕг244520).
Вирівнювання послідовностей кКДНК А. ІНаїйапа і В. пари5 (СепВапк: АЕЗ318307 і АР244520, відповідно) продемонструвало, що послідовність АЕ244520 була неповною (фігура 7). У цій укороченій послідовності ДНК В. парих було відсутньо декілька сотень пар основ на 5'-кінці. Крім того, оскільки В. пари5 являє собою амфідиплоїдний вид, що є результатом комбінації наборів хромосом В. гара (2п-20, АА) і В. оіІегасеа (21-18, СС) (Могіпада, 1934, Суюіодіа, 6:62-67; 0.М., 1935, дарапезе у. Вої., 7:389-452), передбачають, в цьому виді може існувати більше одного гена Д-ксетоацил-АСР-синтетази ІІ. Ідентифіковані і отримані додаткові послідовності 5'-0ТЕК, що знаходяться в послідовностях кКДНК. Ці 5'-послідовності генів В-кетоацил-АСР-синтетази ЇЇ в даних прикладах служили як мішені для активації транскрипції за допомогою 2ЕР-ТЕ. 1.2 Виділення тотальної РНК
Тотальну РНК виділяли з незрілого насіння Вгаззіса пари5 (канола) з генотипом Мех710 (Стор Сепіїїйсаїє 99-7049208-501) через 15 діб після цвітіння (САЕ) з використанням набору
Оіадеп'є ЕМЕАЗТУО РІ АМТ МІМІ КІТ (Оіадеп, МаіІепсіа, СА). Тотальну МРНК обробляли ДНКазою, яка не містить РНКаз, відповідно до рекомендацій виробника для видалення будь-яких контамінуючих ДНК, які можуть ампліфікуватися при кількісної ПЛР-РЧ. 1.3 У КАСЕ і аналіз послідовностей
Швидку ампліфікацію кінців КДНК (КАСЕ), специфічну для 5'-кінця кКДНК ВД-кетоацил-АСР- синтетази ІІ В. пари5 (сепВапк АЕ244520), проводили з використанням набору РІЕ5ТСНОЇСЕФ
ВІМ-КЕАСЕ з Атрбіоп (Атрбіоп, А!йвііп, ТХ) по рекомендаціях виробника. Для отримання 5'-кінця послідовності КДНК, з некепованою 5''областю мРНК випалювали синтетичний РНК-адаптор.
Праймер, що поставляється З набором (5-
Сс,абаспсАТоСаААСАСсТасатттастааст ТаАТОаААА-3) (ЗЕО ІЮ МО:1), і другий праймер (5'- стоесАдастастАстастааттоСа,аатасАспспАссСо-3) (5БО 10 МО:2), які складені для зв'язування всередині часткової послідовності кКДНК В. парих (СепВапк АРг244520), використовували для ампліфікації фрагмента для визначення невідомої розташованої вище послідовності. За допомогою ампліфікації 5" КАСЕ ідентифікували приблизно 500 пар основ нових послідовностей В. пари5. При вирівнюванні ампліфікованих послідовностей ідентифіковані контиги чотирьох виразно розрізнюваних 5'-послідовностей кДНК генів Д- кетоацил-АСР-синтетази ІЇ (ЗЕО ІЮО МО:З3, 5ЕО ІЮ МО:4, 5ЕО ІЮ МО:46 ії БЕО ІЮО МО:30) (фігура 8). Ці 5'-послідовності продемонстрували високі рівні гомології з послідовностями В. гара (СепВапк: АС 189461) і В. оіІєгасеа (сепВапк: ВН723504) з тієї ж області.
У 5'-послідовностях КкКДНК генів Д-кетоацил-АСР-синтетази ІЇ ідентифікували зв'язування послідовностей 2ЕР ТЕ. Як мішені для зв'язування 2ЕР ТЕ (таблиця 1) служили послідовності з розташованої вище генів ВД-кетоацил-АСР-синтетази ІІ області (таблиця 2). Конструкції плазмід: рорАВ4695, рраВ4696, ррАВ4697 і ррАВ.4698, що містять конструйовані склади 2ЕР ТЕ, застосовували для стабільної трансформації В. пари5, як описано в наступних розділах.
Передбачали, що конструйовані 2ЕР ТЕ після експресії в рослинних клітинах будуть зв'язуватися з ендогенними мішенями ДВ-кетоацил-АСР-синтетази ІІ, приводячи до модифікованої експресії МРНК мішені.
Приклад 2: Конструювання ДНК-зв'язувальних доменів 2ЕР, специфічних до гена рД- кетоацил-АСР-синтетази ІІ
Конструювали білки з цинковими пальцями до різних ділянок-мішеней області промотору і
Б'-сетрансльованої і трансльованої області гена ВД-кетоацил-АСР-синтетази ІІ В. пари5. Див., фігуру 2. Розпізнавальні спіралі для характерних конструкцій 7ЕР представлені нижче в таблиці 1. Ділянок-мішені для конструкцій цинкових пальців представлені нижче в таблиці 2.
Таблиця 1
Конструкції цинкових пальців для ВД-кетоацил-АСР-синтетази ЇЇ
ТЕР ін Е2 ЕЗ Е4 Е5 Е6
ВАБОМІ 5МУ ОКІМ ОМ ВАБОТІ ЗЕ ТАБЗВІМ ВБ5ОРАГАН 14025 (ЗЕО І (ЗЕО ІЮ (ЗЕО ІЮ (ЗЕО І (ЗЕО ІЮ н/д
МО:5) МО:6) МО:7) МО:8) МО:9) 14033 ВЗОНІ5ЗА тТ555ВІМ ВАБОМІ АВ ОВАЗНІ АН ВАБОМІ ЗЕ АМАНАТ (ЗЕО І (ЗЕО ІЮ (ЗЕО ІЮ (ЗЕО І (ЗЕО ІЮ Т (ЗЕО ІЮ
МО:10) МО:11) МО-12) МО:13) МО :14) МО: 15)
ОБОМІАВ /АБОНІ ЗЕ ОКАМАТ вБООІ ТА ТЗАМІ ЗА 14035 (ЗЕО І (ЗЕО ІЮ К(ЗЕО ІЮ (ЗЕО І (ЗЕО ІЮ н/д
МО:16) МО:17) МО:18) МО:19) МО:20) вБООІЗК ВБАМІ ТА вот ВЗОНІЗЕ ркамМАк 14047 (ЗЕО Ір (ЗЕО ІЮ (ЗЕО ІЮ (ЗЕО І К(ЗЕО І н/д
МО:21 МО:22 МО:19 МО:17 МО2г3
Таблиця 2
Ділянки-мішені В-ксетоацил-АСР-синтетази ЇЇ для цинкових пальців
Мішень 2ЕР/5ЕО ІО Мо., де
ТЕР Ділянка-мішень (від 5' до 3") знаходиться ділянка зв'язування 14025 сатапАпАССІСААААса (ЗЕО ІЮ МО:24) 3,4,46130 14033 адасААлдасасасцпАпАААдаса (ЗЕ ІО МО:25) 3і4 14035 апАтТасСаТААСАсСаААа (5ЕО ІЮ МО С 26) 3,4,46130 14047 стассасасааАдИатос (5ЕО І МО:27 3,430
Конструкції з ДВ-кетоацил-АСР-синтетази І вбудовували в експресуючі цинкові пальці вектори, що кодують білок щонайменше з одним пальцем зі структурою ССНС. Див., патентну публікацію США Мо 2008/0182332. Зокрема, останній палець в кожному білку мав структуру (будову) ССНС.
Потім кодуючі послідовності цинкових пальців зливали з послідовностями, що кодують активуючий домен МРІ1б і сигнал ядерної локалізації орадце-2. Експресію злитих білків вміщували під контроль відносно сильного конститутивного промотору, такого як промотор, який походить з промотору убіквітину 10 Агабрідорзіз Шаїїапа (АШБі10). Ілюстративні вектори приведені в таблиці З нижче.
Приклад 3: Опосередковане 2ЕР ТЕ підвищення експресії природного гена(ів) В-кетоацил-
АСР-синтетази ІІ В. пари5
Для оцінки функціональності складених білків з цинковими пальцями в рослинних клітинах використовували способи експресії таких білків в живих рослинних клітинах. ДНК, що кодують білки з цинковими пальцями, можна доставляти в рослинні клітини в умовах, коли ДНК не вбудована в геном рослинної клітини. Таким чином, молекула ДНК транзиторно присутня в рослинних клітинах і діє як матриця для експресії генів. Альтернативно, ДНК, що кодують білки з цинковими пальцями, можна доставляти в рослинні клітини в умовах, що забезпечують вбудовування ДНК в геном рослинної клітини, що приводить до трансгенезу генів, що кодують білки з цинковими пальцями так, що молекула ДНК стабільно присутня в рослинних клітинах і діє як матриця для експресії генів. Для оцінки функціональності білків з цинковими пальцями в
Зо живих рослинних клітинах фахівець в даній галузі може використовувати транзиторну або трансгенну експресію ДНК, що кодують ці білки. 3.1 Складання конструкцій
Бінарні плазміди, складені і сконструйовані для цього проекту, перераховані в таблиці 3.
Таблиця З
Опис конструкцій для 2ЕР ТЕ, направлених на КАЗ ІІ В. пари
З.М. ЕР Мо конструкції Касета генів
АТШирі10/2ЕРІ1- ! 14025 рОАВЯб95 С Урів/дюоОВе23/с5УММра/довВе
АїШирі10/АЕР2- 2 14033 рорАВл696 Мрів/АшШоОВЕ23/с5УМУ/ра/дішовЕ
АїШирі10/ЕРЗ-
З 14035 роАВаб97 Мрів/АшШоОВЕг23/с5УМУ/ра/дшове
АЇТШирі10/АЕРА- й 14047 рОАВЯ698 07 Уртв/дюоВег3/с5 УМУ/ра/дішовВм
АШБІі10 - промотор убіквітину 10 Агабрідорзі Іпаійапа, СЄМММ - промотор вірус мозаїки жилок маніоки, 2ЕР : ген білка з цинковими пальцями, раї - ген фосфінотрицинацилтрансферази,
АшОВЕ1-3-ОТК 1 Адговбасіегіцт іштегасієп5 і ЛШОКЕ23-3-ОТА 23 Адгобвасієгійт
Іштегасіепв5. рорАВ4695 являє собою бінарну плазміду, що містить генні експресійні касети 14025 м3З/Л/Р 16 і раї. Ця конструкція містить наступні генетичні елементи: ху3 МАК КВ? (область прикріплення до матриксу (Потрзоп еї аї., 1997, УМО9727207)):м2 промотору АШБІі10 (промотор убіквітину 10
Агабідорвзів ІНаїїапа (Саїйв, єї аї., 1990, 9). Віої. Снпет. 265-12486-12493)):злиття УЗ цинкового пальця 14025//Р16:м1 3-ОТА ОВЕ23 Аш (3'-нетрансльована область відкритої рамки зчитування 23 Адгобасієпит їштегасієп5 (Сеїміп еї аіІ., 1987, ЕР222493)):м2 промотору СЗХМММ (промотор віруси мозаїки жилок маніоки (Мегааднег еї аї., 1996, Ріапі МоїІесшаг Віоіоду 31:1129- 1139))м5 раї (фосфінотрицинацетилтрансфераза (/мопІереп еї а!., 1988, СбСепе 70:25-37)) ма 3-
ТА АшОВЕ1 (З3'-нетрансльована область відкритої рамки зчитування 1 Адгобасієгійт їштеїасіеєпе (Ниапу еї аї., у. Васіегіої. 172:1814-1822)). Бінарну плазміду конструювали за допомогою клонування фрагмента ДНК, що містить злиття мЗ цинкового пальця 14025//Р16, в рОрАВЗ916 по ділянках рестрикції МсоІ-Засі. Отримана конструкція, яку позначали як ррАВ8221, містила генну експресійну касету м2 промотору АШБрі1ТО:злиття м3 цинкового пальця 14025//РІ16:м1 3-ОТК ОКЕ23 Аш. рраАВ8221 клонували в бінарну плазміду ррАВ7309 за допомогою реакції І-К Сагеулау?є Кеасіп (Іпмігодеп, Сагізрай, СА). У даній реакції отримували рорАВ4695 і підтверджували за допомогою розщеплень рестрикційними ферментами і реакцій секвенування. рорАВ4696 являє собою бінарну плазміду, що містить генні експресійні касети м3 14033//Р 16 ї раї. Ця конструкція містить наступні генетичні елементи: м3 МАК КВ7:м2 промотору
АШБІі10:злиття мЗ цинкового пальця 14033/Л/РІ16:м1 3-0ЮТК ОКЕ23 АїШш:м2 промотору С5МММ: раї м5:ма4 3-ОТК АшОКЕ1. Бінарну плазміду конструювали за допомогою клонування фрагмента
ДНК, що містить злиття уЗ3 цинкового пальця 14033/Л/Р16, в ррАВЗ916 по ділянках рестрикції
Мео1І-засі. Отримана конструкція, яку позначали як ррАВ8222, містила генну експресійну касету м2 промотору АШБІ1Т0О:злиття УЗ цинкового пальця 14033/М/Р16:м1 3'-ОТА ОВЕ23 Аш. ррадв8222 клонували в бінарну плазміду рОАВ7З309 за допомогою реакції Ї-К Саїеулау?» Кеасійоп (Іпмігодеп, Сагізрай, СА). У даній реакції отримували ррАВ4696 і підтверджували за допомогою
Зо розщеплень рестрикційними ферментами і реакцій секвенування. рорАВ4697 являє собою бінарну плазміду, що містить генні експресійні касети м3 14035/Л/Р 16 ї раї. Ця конструкція містить наступні генетичні елементи: м3 МАК КВ7:м2 промотору
АШБІ1ТО:злиття уЗ цинкового пальця 14035//Р16:м1 3'-ОТК ОМКЕ23 Аш:м2 промотору СУММУ :раї м5:ма4 3-ОТК АшОКЕ1. Бінарну плазміду конструювали за допомогою клонування фрагмента
ДНК, що містить злиття уЗ3 цинкового пальця 14035/Л/РІ16, в ррАВЗ916 по ділянках рестрикції
Мео1І-засі. Отримана конструкція, яку позначали як ррАВ8223, містила генну експресійну касету м2 промотору АШБІ1ТО:злиття УЗ цинкового пальця 14035/М/Р16:м1 3'-ОТА ОВЕ23 Аш. рраАвВ8223 клонували в бінарну плазміду рОАВ7309 за допомогою реакції Ї-К Саїежау? Реасійп (Іпмігодеп, Сагізрай, СА). У даній реакції отримували ррАВ4697 і підтверджували за допомогою розщеплень рестрикційними ферментами і реакцій секвенування. рорАВ4698 являє собою бінарну плазміду, що містить генні експресійні касети у3 14047/Л/Р 16 ї раї. Ця конструкція містить наступні генетичні елементи: м3 МАК КВ7:м2 промотору
Зо
АШБІ1ТО:злиття уЗ цинкового пальця 14047//Р16:м1 3'-ОТК ОМКЕ23 Аш:м2 промотору СУММУ :раї м5:ма4 3-ОТК АшОКЕ1. Бінарну плазміду конструювали за допомогою клонування фрагмента
ДНК, що містить злиття м3 цинкового пальця 14047//Р16, в ррАВЗ916 по ділянках рестрикції
Мео1І-засі. Отримана конструкція, яку позначали як ррАВ8224, містила генну експресійну касету м2 промотору АШБІ1ТО:злиття уЗ цинкового пальця 14047/М/Р16:м1 3'-ОТА ОВЕ23 Аш. ррадв8224 клонували в бінарну плазміду рОАВ7309 за допомогою реакції Ї-К Саїежау? Реасійп (Іпмігодеп, Сагізрай, СА). У даній реакції отримували ррАВ4698 і підтверджували за допомогою розщеплень рестрикційними ферментами і реакцій секвенування. 3.2 Трансформація Адгобасієгйт
Клітини Адгорасієйцт отримували для електропорації з використанням протоколу, описаного в УмМеіїде! О., СіІалергоокК 9. Агарідорвіє: А І абогаїгу МапиаЇ. Соїй бргіпд Нагтбог
Іарогаїогу Ргеб55, 2002: стор. 123-124. У протоколі проводили незначні модифікації, що забезпечують оптимальний ріст Адгобасіеглцт (тобто середовище МЕР замінювали на І В). У 50 мкл клітин Адгобасієгішт їштеїасіеєп5 С58:277075 незалежно додавали 1,5-3 мкг плазмідної ДНК для кожної конструкції і обережно змішували. Суміш переносили в холодні 0,2 см кювети СЕМЕ
РИОЇГ.ЗЕКФ (ВіоКкаа Негсиіев, СА) і вміщували на лід. Потім кювети вміщували в холодний штатив
СЕМЕ РОЇ 5ЕКФ (ВіоКай, Негсшев5, СА) і піддавали електропорації при наступних умовах: вихідна місткість 25 мкФарад, ємнісний компенсатор - 960 мкФ, опір - 200 Ом і напруга - 2,5 кВ.
Відразу після електропорації додавали 950 мкл середовища 5ОС (Іпмігодеп, Сагізрай, СА) і суміш переносили в пробірку Раісоп 2059 (Весіоп бісКіпвоп апа Со., ЕгапКіїп І аКе5, МУ) або еквівалент. Потім трансформовані клітини інкубували при 28 "С протягом 1 години. Після інкубації 50 мкл, 100 мкл їі 200 мкл клітин висівали на окремі чашки із середовищем МЕР (10 г дріжджового екстракту, 10 г пептону, 5 г Масі, 10 г сахарози і 15 г агару в 1 літрі води), яка при необхідності містить антибіотики. Вирощування проводили в обернених чашках при 28 С приблизно протягом 36-48 годин. Окремі колонії прожарювали і вирощували в 50 мл рідкого
МЕР (10 г дріжджового екстракту, 10 г пептону, 5 г Масі ї 10 г сахарози в 1 літрі води), що містить при необхідності антибіотики, при 28 "С приблизно протягом 36 годин.
Штам Адгобасіейцт їштеїасієпе підтверджували кетолактозним тестом. Приблизно трансформовані колонії штрихами наносили на агар з лактозою і інкубували при 28 "С протягом 48 годин. Потім чашки заповнювали розчином Бенедикта. Проводили спостереження за чашками; нанесені штрихами ізоляти, що перетворюють розчин Бенедікта з синього в жовтий, підтверджували як Адгобасієейцт (Воилаг, Н., допев, у)., Візпор, А. "Зітріе Сийига! Тевів ог
Ідепійісайоп ої Адгобасієгт Віомаг5". Меїпод5 іп МоїІесшціаг Віоіоду, Моїште 44. Нитапа Ргев5, 1995: 9-13).
Після проведення протоколу ОІАСЕМФ Іом/ сору тіпі-ргер (Оіадеп, МаІепсіа, СА) отримували очищену плазмідну ДНК з бактерійних культур. Цілісність ДНК оцінювали за допомогою рестрикційних фрагментів. Ідентифікували клони з очікуваним малюнком смуг і отримували маточні розчини з гліцерином, додаючи 500 мкл бактерійної культури в 500 мкл стерильного гліцерину (Зідта Со., 91. І оці5, МО) і перевертаючи для перемішування. Маточні розчини з гліцерином заморожували на сухому льоду і зберігали при -80 "С. 3.3 Трансформація 2ЕР ТЕ В. пари
Отримання гіпокотильних сегментів: поверхню насіння В. пари5 генотипу Мех 710 стерилізували 1095 комерційним відбілювачем протягом 10 хвилин і З рази промивали стерильною дистильованою водою. Насіння сушили стерильною паперовою серветкою, потім вміщували в РВПуїа-їгау, що містить "середовище для проростання", що складається з мінімального середовища М5 половинної концентрації (Мигазпіде апа 5Коод, Рпузіої Ріапі 15(3): 473-497, 1962), 20 г/л сахарози і 8 г/л агару ТС (РпуїоТесппоїоду І арогафогіє5, Зпампеєе Міззіоп,
КБ), і підтримували в умовах режиму вирощування при 23 "С ії зі світловим періодом 16 год. світла/8 год. темряви.
На 5 добу сходи перевіряли на стерильність, Рпуїа-їгтау вміщували у витяжну шафу з ламінарним потоком ЕОСЕСАКОФ (Те ВакКкег Сотрапу, Заптога, МЕ) для підтримки стерильності. Використовуючи стерильний пінцет і анатомічні ножиці, рослини видаляли з
Рпуїа-ігау і надземні області (меристему і сім'ядолю) і коріння відділяли і відкидали. Гіпокотилі вміщували в чашку Петрі 100х25 мм, що містить стерильну дистильовану воду, необхідну для запобігання висушуванню. Гіпокотилі вміщували на кришку чашки Петрі 100х25 мм і нарізали в поперечному напрямку на З-мм сегменти з використанням скальпеля Мо 10. Сегменти гіпокотилів вміщували на "середовище для індукції калюсу", що складалося з середовища М5, що містить 30 г/л сахарози, 1 мг/л кінетину і 1 мг/л 2,4-О, яка отверджена 7 г/л агару ТС, що містить стерильний фільтрувальний папір. Чашки вміщували в чисту ванну 5ТЕКІСІТЕФ і бо підтримували при тому ж режимі вирощування протягом З діб, як попередньої обробки.
Потім на доби 8 сегменти переносили в стерильні чашки Петрі 100х25, які містять 20 мл "рідкого середовища для культивування", що складається з мінімального середовища
Лінсмайера і Скуга (1965), що містить 30 г/л глюкози, вітаміни половинної концентрації Затрога (1968), 215,2 мг/л кінетину і 221,04 мг/л 2,4-ЮО0 для попередньої обробки протягом 1 години. "Рідке середовище для культивування" з гіпокотильних сегментів видаляли і 40 мл суспензії
Адгорасієгішт (яка містить ррАВ4695, рОрАВ4696, ррАВ4697 або рраАВ4698 в 77075) короткочасно перемішували на "центрифузі вортекс" 50 КіІей і наливали в чашку Петрі 100х25 мм, що містить гіпокотильні сегменти для обробки протягом 30 хвилин. Через 30 хвилин всю суспензію Аагорасіейцт видаляли з використанням подвійної зістикованої піпетки. Оброблені гіпокотилі вміщували назад на "середовище для індукції калюсу" з фільтрувальним папером, повертали у ванну ЗТЕКІІТЕФ, накривали темною кришкою і повертали в приміщення для культивування при тому ж режимі вирощування, як указано вище, на З доби періоду спільного культивування. Через З доби гіпокотилі вміщували безпосередньо на "середовище для індукції калюсу", що містить 1 мг/л НЕКВІАСЕФ, вміщували назад у ванну з прозорою кришкою і повертали в приміщення для культивування, підтримуючи той же режим вирощування, як указано вище. Через 1 тиждень гіпокотилі переносили безпосередньо в "середовище для індукції калюсу" з відбором на З мг/л НЕКВІАСЕЄФ протягом 2 тижнів для додаткового розвитку калюсу і переносили в "середовище для індукції калюсу" з відбором на 5 мг/л НЕКВІАСЕ протягом 2-8 тижнів для додаткового розвитку калюсу. Після отримання достатньої кількості калюсу, його піддавали молекулярному аналізу.
Регенерація рослин з витриманого калюсу каноли: тканину калюс каноли вміщували на "середовище для регенерації втеч", що складається з середовища М5, що містить 30 г/л сахарози, З мг/л бензиламінопурину, 0,5 г/л МЕЗ |(2-(М-морфоліон)етансульфонової кислоти), 5 мг/л нітрату срібла, 1 мг/л зеатину, 250 мг/л карбеніциліну, 300 мг/л тиментину і 7 г/л агару ТС з відбором на 5 мг/л НЕКВІАСЕФ, чашки обертали стрічкою ЗМ і вміщували в умови режиму вирощування при 23 "С і зі світловим періодом 16 год. світла/8 год. темряви. Потім тканини вміщували в "середовище для росту паростків", що складається з середовища М5, що містить 0,5 г/л МЕ5, 300 мг/л тиментину, 20 г/л сахарози і 7 г/л агару ТС з відбором на 5 мг/л
НЕКВІАСЕФ. Паростки переносили на "середовище для вкорінення", що складається з
Зо середовища М5 половинної концентрації, що містить 10 г/л сахарози, 0,5 мг/л індолілмасляної кислоти, 300 мг/л тиментину і 8 г/л агару ТС з відбором на 5 мг/л НЕКВІАСЕФ).
Після розвитку на паростках коріння іп міо, їх пересаджували в горщики 13,34 см, що містять суміш Меїго Міх 360. Кожну з рослин накривали прозорим окремим ковпаком і вміщували в Сопмігоп для акліматизації. Через 48-72 годин ковпаки видаляли для забезпечення циркуляції повітря. Через сім діб горщики переміщували з Сопмігоп в тепличний лоток для подальшого розвитку. Рослини вирощували зі світловим періодом 16:8 годин, з денною і нічною температурою 22-24 "С. Після початку подовження первинного квіткового стебла і формування квіткових бутонів, всю рослину закривали мішком для самозапилення для запобігання ауткросингу. Насіння, що отримується при самозапиленні, збирали приблизно через чотири місяці після пересадження.
Отримання Аагобрасієтішт: Адгобрасієгшт з маточного розчину в гліцерині за четверо діб перед обробкою штрихами наносили на "напівтверде середовище для вирощування бактерій", що складається з 10 г/л пептону, 10 г/л дріжджового екстракту, 5 г/л Масі, 10 г/л сахарози і 100 мг/л спектиноміцину і 250 мг/л стрептоміцину і отвердженого 15 г/л агару Васіо, і вирощували протягом двох діб в інкубаторі (Рієпег Зсіепіййс Ізоїетр Іпсирайог) при 28 "С. Через 2 доби невелику петлю Адгобасієйцт вміщували в 500 мл стерильну одноразову колбу з відбивачами, яка містить 150 мл "рідкого середовища для вирощування бактерій" (таке ж, як указано вище, але без стверджувального засобу), 250 мг/л стрептоміцину і 100 мг/л спектиноміцину, вирощували протягом 16 годин протягом ночі при 28 "С в темряві на закритому шейкері (шейкер з охолоджуваним інкубатором Мем Вгип5м/іскК Зсіепійс Іппома 4330) при 200 об./хв. Через 16 годин культуру Адгобасієгішт виймали з шейкера і вміщували аліквоти в 50-мл центрифугальні пробірки (одну, яка містить 35 мл для отримання, і дві, що містить 50 мл, для повторного підтвердження). Центрифугальні пробірки вміщують в центрифугу (центрифуга Весктап Моаеї 92-21) і центрифугують при 6000 об./хв. протягом 15 хвилин, а потім ресуспендують в "рідкому середовищі для культивування" до кінцевої густини КіІей 50 з червоним фільтром.
Приклад 4: Аналіз трансформованих зразків калюсу
Приблизно трансформовані зразки калюсу В. пари5 аналізували на зміни експресії мРНК ендогенного гена рД-кетоацил-АСР-синтетази ІЇ, ендогенного гена тубуліну і трансгена 2ЕР ТЕ.
Рівні мРНК тубуліну використовували як внутрішній контроль для нормалізації експресії мРНК бо ЕР ТЕ ї Д-кетоацил-АСР-синтетази ІІ. Дані про експресію мРНК 2ЕР ТЕ використовували для підтвердження присутності в трансформованих калюсах щонайменше одного функціонального трансгена 2ЕР ТЕ. 4.1 Отримання зразків калюсу
Після трансформації тканини гіпокотилю Мех710 отримували приблизно 40-50 зразків калюсу В. парих у віці восьми тижнів. Їх індивідуально трансформували конструкціями 7ЕР ТЕ, ррАВ4695, ррадавВ4696, рраВ4697 і ррАВ4698, як описано вище в прикладі 3.3. Контрольні зразки отримували за допомогою трансформації контрольною бінарною конструкцією, що містить генну експресійну касету раї (м2 промотору АШБІіТО:раї мз3м3 3-ОТК ОКЕ1 Ам). Всі зразки до їх збору вирощували в доповненому НЕКВІАСЕ середовищі для культивування клітин.
Зі свіжої тканини калюсу отримували тотальну РНК з використанням набору ОІДСЕМ
ЕМЕАБУ 96 Кії (Оіадеп, МаІепсіа, СА). РНК обробляли ДНКазою, яка не містить РНКаз, по інструкціях до набору для видалення будь-якої контамінуючої геномної ДНК. Синтез першого ланцюга проводили по інструкціях виробника ферменту зворотної транскриптази Зирег5сгірке ПІ (Іпмігодеп, Сагізрай, СА), а як праймери використовували випадкові гексамери. Синтезовані ланцюги кКДНК розбавляли водою до відношень 1:10 і 1:50 (вони забезпечували достатню кількість матриці для ампліфікації декількох мішеней за допомогою ПЛР). Кожну аліквоту зберігали при -20 "С на невизначений термін. 4.2 Аналіз експресії МРНК рД-кетоацил-АСР-синтетази ІІ
Реакційні суміші КПЛР-РЧ складали для ампліфікації КДНК ДВ-кетоацил-АСР-синтетази ФІ таким чином: 7,5 мкл 2Х основного буфера /С480 Ргобез Мавзіег Виїег (Воспе Оіадповіїс,
Іпаіапароїїв5, ІМ), 0,3 мкл 10 мкМ маточного розчину геноспецифічного прямого праймера (ЗЕ
ІО МО:28: 5-ТТОАСстТоадастастТАСТОас-3"; положення нуклеотидів 544-563 для 5ЕО ІЮ МО:З на вирівнюванні на фігурі 8), 0,3 мкл 10 мкМ маточного розчину геноспецифічного зворотного праймера (5ЕО ІЮ МО:29: 5-ТТТОСАТАТССАТСОССААСА-3; положення нуклеотидів 588-607 для 5ЕО ІЮ МО:З на вирівнюванні на фігурі 8), 0,15 мкл зонди ОРІ. Ме25 з І ІЗНТСУСІ ЕКО 480
Ргобез Мавієг (Восне Оіадповіїйс, Іпаіапароїї5, ІМ), 1,5 мкл 10 95 (мас/об.) полівінілпіролідону-40 (РМР-40) і 3,9 мкл води. Зонд ОРІ. (Коспе Оіадповійс5, Іпаіапароїї5, ОБА) являє собою закриту нуклеїнову кислоту і, таким чином, має більш високу Тт, ніж розрахована в інших випадках.
Зо Перед обробкою стандартів і невідомих проб всі компоненти вміщували в морозильник.
Розмічали і маркували 384-ямковий мікропланшет, додавали 13,5 мкл основної суміші на ямку.
До мікропланшета несильно прикріплювали герметизуючу фольгу. Планшет центрифугували протягом 1 хвилини при 3000 об./хв. в центрифузі для мікропланшетів Оіадеп. Додавали 1,5 мкл розморожених розведених синтезованих ланцюгів кКДНК. Крім того, в окрему ямку додавали 1,5 мкл стандартів кількості піків, додавали плазмідну ДНК в ряді розведень від найменших до найбільших концентрацій, ці стандарти порівнювали з кКДНК р-кетоацил-АСР-синтетази (синтезованою з тотальної мРНК) з кількісним підрахунком кількості піків. Отримували ряд стандартів кількості піків ДНК ВД-кетоацил-АСР-синтетази ІІ за допомогою клонування амплікона- мішені в плазміді РСК2.1 (Іпмігодеп, Сагізрай, СА) і отримуючи ряд розведень для кількісного визначення кількості піків. До планшета міцно прикріпляли герметизуючу покришку з фольгою і центрифугували, як описано раніше. Програму ПЛР проводили таким чином: і. активація при 95"С протягом 5 хвилин; ії. денатурація при 95"С протягом 10 сек... (Фф 4,8 "С/сек.; її. відпал/елонгація при 60 С протягом 25 сек... (Ф 2,5 "С/сек...; ім. добудування при 72" протягом 1 сек... (Ф 4,8 "С/сек...; повторення етапів ії-їм ще 40-50 разів; охолоджування до 38 С протягом 5 сек... ДНК ампліфікували в пристрої для ПЛР з детекцією в реальному часі І С480 (Коспе, Іпаіапароїї5, ІМ) або еквівалентному. Розмір амплікона становив 64 пари основ.
Використовувані в цьому аналізі ПЛР послідовності прямого і зворотного праймерів точно співпадали з відповідними послідовностями, що знаходяться в двох генах-мішенях В-кетоацил-
АСР-синтетази ІІ, ЗЕО ІО МОЗ їі 30 (фігура 8). Таким чином, цей аналіз являє собою кількісне визначення експресії двох генів-мішеней ВД-кетоацил-АСР-синтетази ІІ. 4.3 Аналіз експресії мРНК тубуліну
Ген тубуліну, природний ген Вгаззіса пари (СепВапк: АЕ258790 і СепВапк: 0О106489), використовували як еталонний стандарт для точної нормалізації сигналу експресії мРНК у всіх генах в аналізах КПЛР-РЧ. кДНК, синтезовану для аналізу КПЛР-РЧ р-кетоацил-АСР-синтетази ІЇ (описаного в прикладі 4.1), також використовували в аналізі КПЛР-РЧ тубуліну, як описано нижче.
КПЛР-РЧ для детекції і кількісного визначення ДНК складали з 0,3 мкл геноспецифічного прямого праймера (5ЕО ІЮ МО:31: 5-АСАДЯССАТТаССТАСАдДОЦаИ-3) (10 мкМ маточний розчин) і 0,3 мкл геноспецифічного зворотного праймера (ЗЕО ІО МО:32: 5- 60 АВАТаСТТААСаАТСАССАДАСІИЇ-3) (10 мкМ маточний розчин), 1,5 мкл 10 95 (мас/об.) РМР-40,
3,9 мкл води і 7,5 мкл 2Х основної суміші ГІЗНТСУСІЕКФ 480 УВК Огееп І (Коспе,
Іпаіапароїїв, ІМ). Маркували і позначали 384-ямковий мікропланшет, додавали 13,5 мкл основної суміші на ямку. До мікропланшета несильно прикріпляли герметизуючу фольгу. Планшет центрифугували протягом 1 хвилини при 3000 об./хв. в центрифузі для мікропланшетів Оіадеп.
Герметизуючу фольгу видаляли і додавали 1,5 мкл розморожених розведених синтезованих ланцюгів кКДНК. Крім того, в окремі ямки додавали 1,5 мкл стандартів кількості піків, додавали плазмідної ДНК серед розведення від найменших до найбільших концентрацій, ці стандарти порівнювали з кКДНК тубуліну (синтезованої з тотальної мРНК) з кількісним підрахунком кількості піків. Отримували ряд стандартів кількості піків ДНК тубуліну за допомогою клонування амплікона-мішені в плазміді рРСК2.1 (Іпмігодеп, Сагізрай, СА) і отримуючи ряд розведень для кількісного визначення кількості піків. До планшета міцно прикріпляли герметизуючу покришку з фольгою і центрифугували, як описано раніше. Програму ПЛР проводили таким чином: |і. активація при 95"С протягом 10 хвилин; ії. денатурація при 95"С протягом 10 сек... (Ф 4,8 "С/сек...; ії. відпал/елонгація при 55,5 "С протягом 20 сек... (Ф 2,5 "С/сек...; ім. добудування при 72"С протягом 20 сек... (Фф 4,8 "С/сек...; повторення етапів ії-їм ще 39 разів; мі. охолоджування до 38 "С протягом 5 сек... ДНК ампліфікували в пристрої для ПЛР з детекцією в реальному часі І С480 або еквівалентному. У цій реакції ампліфікували амплікон довжиною 307 пар основ. Зворотний праймер для цієї реакції перекриває інтрон довжиною 78 п.н. на основі послідовності зепВапкК. Таким чином, амплікони, які амплифікуються з геномної ДНК, не будуть переважними, і контамінанти геномної ДНК будуть більшої молекулярної маси і їх можна легко диференціювати від ампліконів КкДНК, за допомогою запуску ампліконів на агарозному гелі. 4.4 Аналіз експресії МРНК 2ЕР ТЕ
Експресію мРНК 2ЕР ТЕ кількісно визначали в зразках кДНК, які початково синтезували для
МРНК Д-кетоацил-АСР-синтетази ІІ (описаної в прикладі 4.1). Аналіз ПЛР ТадмМап планували на основі касети 2ЕР з використанням якірних праймерів до послідовності МІ 5 орадие-2 на 5'-кінці і послідовності МР1б6 на 3'-кінці. Аналіз ПЛР складали з використанням: 0,5 мкл 10 мкм маточного розчину прямого праймера "ОР2 МІ/5 ЕТ" (5ЕБО 0 0 МО:33: 5-
ААССПААСАсСаАДАсаАсТсСтТААСАС-3), 0,5 мкл 10 мкМ маточного розчину зворотного праймера "МР16 К1" (5ЕО ІО МО:34: 5-СТСТасСстоТССАССИТА-3), 0,25 мкл 5 мкМ маточного
Зо розчину зонда "МР16 МОВ 185" (ЗЕО ІЮО МО: 45: 5-ТТаАТастаААСАТИТ-3), 1,5 мкл 10 95 (мас/об.) РМР-40, 1,5 мкл 10х буфера для ПЛР з гарячим стартом, 1,0 мкл 25 мМ МОСсі», 1,2 мкл амМтТР (2,5 мм кожного), 0,15 мкл полімерази Ної Зіагі Тад Роїутегазе (Оіадеп, МаІепсіа, СА) і 6,9 мкл води. Суміш ампліфікували з використанням ГІЗНТСМУСІ ЕКО 480 (Коспе Оіадповіїс5, ОА).
Розмічали і маркували 384-ямковий мікропланшет, додавали 13,5 мкл основної суміші на ямку.
До мікропланшета несильно прикріпляли герметизуючу фольгу. Планшет центрифугували протягом 1 хвилини при 3000 об./хв. в центрифузі для мікропланшетів Оіадеп. Герметизуючу фольгу видаляли і додавали 1,5 мкл розморожених розведених синтезованих ланцюгів кКДНК.
До планшета міцно прикріпляли герметизуючу покришку з фольгою і центрифугували, як описано раніше. Програму ПЛР проводили таким чином: і. активація при 95 "С протягом 15 хвилин; ії. денатурація при 95 "С протягом 20 сек. (Ф 4,8 "С/сек.; ій. відпал/елонгація при 60 С протягом 20 сек. (Ф 2,5 "С/сек.; ім. добудування при 72 "С протягом 55 сек. (Ф 4,8 "С/сек.; повторення етапів ії-ім ще 44 разу; мі охолоджування до 38"С протягом 5 сек. ДНК ампліфікували в пристрої для ПЛР з детекцією в реальному часі І С480 або еквівалентному.
Розмір амплікона становив 775 пар основ. Кількість піків КДНК/мРНК 2ЕР ТЕ визначали з використанням ряду стандартів, в яких амплікон-мішень клонували в плазміду і проводили ряд розведення для аналізів ПЛР, як описано для прикладів ВД-кетоацил-АСР-синтетази ІІ і тубуліну, вище. 4.5 Аналіз експресії зразків калюсу
Експресію мРНК 2ЕР ТЕ вимірювали в зразках трансгенного калюсу у віці 8 тижнів приблизно трансформованих 2ЕР ТЕ і вирощуваних на селективному середовищі НЕКЕВІАСЕФ (див. приклад 3). Присутність певної кількості експресованої мРНК 2ЕР ТЕ, як вимірювали за допомогою аналізу КПЛР-РЧУ, детектували в зразках, трансформованих тільки конструкціями, які містять 2ЕР ТЕ, але не в зразках, що містять контрольну конструкцію. Ці дані свідчать, що аналіз був специфічний для експресії 2ЕР ТЕ, і що контрольні калюси не містять трансгена ЕР
ТЕ.
Для виявлення відмінностей в експресії в зразках калюсу на основі результатів КПЛР-РЧ розраховували відношення експресії мРНК р-кетоацил-АСР-синтетази ІІ і тубуліну. Найбільше підвищення експресії МРНК ДВ-кетоацил-АСР-синтетази ІІ спостерігали в зразках калюсу каноли, трансформованих конструкцією ррАВ4695 (таблиця 4). Це 27 95 підвищення експресії було бо статистично значним (р-0,05) відносно контрольних зразків.
Таблиця 4
Експресія мРНК КАФІЇ в зразках калюсу В. пари5, трансформованих різними конструкціями 2ЕР ТЕ
К . Кількість аналізованих Середнє відношення ЗТОЕМ відношення онструкція . і . ш . калюсів експресії КазП/тубуліну експресії КазІИтубуліну 4695 23 3,69 1,20 4696 20 2,81 0,84 4697 24 3,18 0,93 4698 24 3,03 0,68
Контроль 14 2,90 1,12
Приклад 5: Аналіз зразків трансформованих рослин То 5.1 Аналіз експресії мРНК Д-кетоацил-АСР-синтетази ІІ. тубуліну і 7ЕР ТЕ Рослини каноли
То, що містять трансгенну конструкцію ррАВ4695, вирощували до рослини на стадії 6 листків і аналізували на експресію мРНК ендогенного гена рВ-кетоацил-АСР-синтетази ЇЇ, ендогенного гена тубуліну і трансгена 2ЕР ТЕ. Трансгенні рослини порівнювали з контрольними зразками, які трансформували бінарною конструкцією, що містить генну експресійну касету раї (м2 промотору
АШБі10:м3 рагм3 3-ШОТК ОКЕЇ1 АїЩШш). З кожної рослини діркопробивачем для паперу стандартного розміру отримували зразки шести відбитків листя на льоду і по інструкціях виробника виділяли тотальну мРНК з використанням набору для виділення РНК в 96-ямковому форматі Оіадеп 96-жшеїЇ ВМеазу ВМА ехігасійп Кії (Оіадеп, Сагі5райд, СА). Аналізи експресії МРНК
В-кетоацил-АСР-синтетази ІІ, тубуліну і 2ЕР ТЕ проводили з використанням протоколів, описаних вище в прикладі 4.
Експресія мРНК Д-кетоацил-АСР-синтетази І у незалежних трансгенних рослин То варіювала. У 16 аналізованих випадках спостерігали підвищення експресії мРНК більше ніж в З рази (фігура 3). Всі рослини були позитивними по експресії 2ЕР ТЕ. Крім того, для розрахунку експресії мРНК В-кетоацил-АСР-синтетази ІІ на початковому рівні використовували 27 контрольних рослин. Для розрахунку кратності росту експресії середню експресію мРНК р- кетоацил-АСР-синтетази ІІ на основі контролів на початковому рівні порівнювали з експресією
МРНК В-кетоацил-АСР-синтетази ІЇ окремих випадків рослин з 2ЕР ТЕ (фігура 3). Ці рослини вирощували до дозрівання для отримання насіння Ті. Перед цвітінням всі рослини індивідуально закривали мішками для самозапилення для полегшення самозапилення квіток на рослині. Насіння Ті цих рослин збирали приблизно через 4 місяці після їх перенесення в теплицю.
Для подальшого дослідження вибирали випадки 3, 6 і 12.2 (що далі позначається як випадок 12), що представляють різні діапазони експресії.
Приклад 6: Аналіз зразків трансформованих рослин ТТ 6.1 Аналіз жирних кислот насіння Ті
Зо Для дослідження дії 2ЕР ТЕ на зміну вмісту жирних кислот проводили аналіз жирних кислот одиничного насіння в 24 окремих насінинах Ті: на випадок (таблиця 5). Використовували спосіб аналізу метилового ефіру жирних кислот (ГАМЕ) на основі способу АЛОС5 Се2-66(97), і всі значення в таблиці 5 приведені як процент від всіх жирних кислот, присутніх в насінні каноли.
Таблиця 5
Профіль жирних кислот окремих насінин Ті, який вимірюється аналізом ЕАМЕ
Випадки С16:0 С161 сС18:0 С181 сС182 С18:3 Всі С18
З Низький 2,8 0,3 1,6 76,1 12,2 3,7 93,6
З Низький 2,9 0,3 1,4 76,7 11,8 4,0 93,9
З Низький 2,9 0,3 1,4 75,7 13,0 3,6 93,9
З Високий 3,6 0,3 1,4 75,1 15,0 3,5 93,1
З Високий 3,8 0,4 1,4 75,6 12,0 3,8 92,8
З Високий 4,0 0,4 1,5 74,8 12,6 3,7 92,5
Середнє (п--24) 3,3 0,3 1,5 75,7 12,4 3,8 93,3
Ст. відх. (п-:24) 0,5 01 0,1 0,7 0,5 01 0,34 12 Низький 3,1 0,2 1,5 176,4 12,0 3,6 93,6
Таблиця 5
Профіль жирних кислот окремих насінин Ті, який вимірюється аналізом ЕАМЕ 12 Низький 3,2 0,3 1,4 77,0 11,5 3,4 93,3 12 Низький 3,2 0,2 1,8 80,9 7,5 3,2 93,5 12 Високий 3,6 0,3 1,5 76,68 11,7 З 93,2 12 Високий 3,6 0,3 1,6 76,0 11,9 3,5 93,0 12 Високий 3,6 0,3 1,8 77,3 10,8 3,0 92,9
Середнє (п--24) 3,4 0,3 1,6 717,4 10,9 3,3 93,2
Ст. відх. (п-:24) 0,2 0,0 0,2 1,68 1,7 0,3 0,23 6 Низький 3,2 0,5 1,9 81,3 8,1 21 93,3 6 Низький 3,3 0,5 12 79,6 10,1 2,3 93,1 6 Низький 3,5 0,5 2,6 80,6 7,5 1,9 92,6 6 Високий 4,4 0,5 2,4 71,7 10,7 1,5 92,2 6 Високий 4,5 0,6 2,2 77 10,5 1,68 91,6 6 Високий 4,6 0,7 1,3 717,4 11,0 1,7 91,4
Середнє (п--24) 3,9 0,5 1,9 78,9 9,6 1,9 92,4
Ст. відх. (п-:24) 0,6 01 0,6 1,68 1,5 0,3 0,54
Середнє по Мех710 (п-:216) 3,8 0,4 2,3 78,1 9,5 2,5 92,5
Ст. відх. (п-:216) 0,2 0,0 0,6 1,68 1,6 0,7 0,45
Для отримання зразків окреме одиничне насіння вміщували в марковані касетні пробірки на 9б-ямковий планшет для виділення, що містить один стальний шар діаметром 3,175 мм (Зтаї
Рагіх5, Мігатаг, РІ). Пробірки закривали кришками, і насіння піддавали сухому помелу в
СепоСгіпдег (ЗРЕХ СепіРгер Сгоир, Меїшспеп, МУ) протягом 3,0 хвилин при 1300 ударах/хвилину. Кришки видаляли і в кожну ямку додавали 0,6 мл гептану. Ямки повторно закривали кришками і вміщували назад в сепосгіпдег для додаткового дроблення протягом 2,0 хвилин при 1200 уд./хв. Потім зразки виймали і центрифугували при 3700 об./хв. протягом 10,0 хвилин при 6 "С. Використовуючи роботизований пристрій ВесКтап СоцМег МС обої, супернатант переносили в 96-ямковий планшет зі скляними вставками (Місгої! йег, Зумапее,
СА). У зразок додавали 40 мкл 1 95 метоксиду натрію. 30 96 маточний розчин метоксиду натрію розбавляли метанолом (РіиКа/Зідта Аїдгісй, 5 Гоці5, МО). Чашки закривали покритою тефлоном панеллю і перед аналізом С дозволяли інкубуватися при кімнатній температурі протягом 4 годин.
Зразки аналізували на вміст жирних кислот на Адіїепі 6890 ОС-РІО (Адіїепі Тесппоодієв,
Запіа Сіага, СА), обладнаному колонкою УМ Зсіепійіс 08-23, колонкою 15 мх0,25 мм ІО і 0,25 мкм товщини плівки, (У8М/ Зсіепійіс, РоЇїзот, СА). Початкова температура термостата становила 200 7С ії цю температуру підтримували протягом запуску. Вхідний канал встановлювали на коефіцієнт розподілу 1:100 і температуру 280 7С. Протягом перших двох хвилин швидкість змінного потоку гелію підтримували на рівні 0,8 мл/хв. Потім потік збільшували від швидкості 1,0 мл/хв. до 2,5 мл/хв. і втримували протягом 1,5 хвилин. Детектор встановлювали на 300 "С з постійною подачею газу-носія і швидкістю в колонці 30 мл/хв., потоком паливного водню 30 мл/хв. і потоком окисника 400 мл/хв. Використовуваний об'єм для всіх зразків вприскування становив 2 мкл.
Індивідуальні піки метилових ефірів жирних кислот ідентифікували, проводячи порівняння з часом утримування еталонних стандартів метилового ефіру (БІ Ся428, Ми-Снек-Ргер, Іпс.,
ЕІузіап, ММ) з використанням програмного забезпечення УмМаїег5 Согр. Етромжмег Зоймаге.
Залежно від загальних інтегральних площ піків при хроматографії розраховували індивідуальні процентні площі для всіх аналізованих речовин в еталонному стандарті. Також для
Зо ідентифікації будь-яких забруднень при СС проводили аналіз чистого гептану.
Порівняння насіння Ті з трьома найменшими рівнями С16:0 (які з найбільшою імовірністю були позитивними по 2ЕР ТЕ рослинами) і з трьома найвищими рівнями С16:0 (які з найбільшою імовірністю були нуль-рослинами по 2ЕР ТЕ) показало, що зміни вмісту С16:0 можуть відбуватися в результаті сегрегації трансгена 2ЕР ТЕ (таблиця 5). Також у всіх випадках спостерігали відповідну зміну всіх С18 (С18:0-С18:1-С18:21С18:3); насіння з низькими рівнями
С16:0 містило збільшені рівні всіх С18 і навпаки. Це відбувалося, незважаючи на варіабельність індивідуального вмісту жирних кислот С18:0, С18:1,018:2 і С18:3 в результаті сегрегації мутантних генів Тад2 і тааз (Ни, Х., еї а. Тпеог. Аррі. Сепеї. 2006, 113:497-507) в генотипі
Мех710, який піддавали трансформації. Таким чином, робили наступну стадію для ідентифікації позитивних по 2ЕР ТЕ і сестринских нуль-рослин в сегрегуючій популяції Ті в кожному випадку для детекції фактичної зміни профілю жирних кислот при схожому генетичному фоні. 6.2 Аналіз присутності 2ЕР ТЕ в рослинах Т 100-150 сходів Ті всіх трьох випадків перенесення трансгена 3, 6 і 12 піддавали скринінгу для ідентифікації позитивних по 2ЕР ТЕ і сестринских нуль-рослин (таблиця 6). Рослини тестували на присутність щонайменше однієї повнорозмірної касети трансгена 2ЕР ТЕ. З листя цих рослин відповідно до рекомендацій виробників виділяли тотальну геномну ДНК з використанням набору для виділення ОІАСЕМ РІГ АМТ ОМЕА5ЗУ ехігасіоп Кії (Оіадеп, МаіІепсіа,
СА). Протокол модифікували додаванням до буфера Оіадеп АРІ РМР -40 в кінцевій концентрації 195. Очищену гДНК кількісно визначали по протоколу кількісного визначення ДНК
РІСОСКЕЕМО (МоїІесшціаг Ргобевз, Іпс., Еидепе, ОК). Зразки ДНК досліджували на присутність щонайменше однієї повнорозмірної копії трансгена 2ЕР ТЕ за допомогою аналізу ПЛР, що містить наступні реагенти: 5 мкл 10Х буфера ЕХ Тая (ТакКага Віо Іпс., Ої5и, 5іда, дарап), 5 мкл 10 95 полівінілпіролідону-40, 1,0 мкл 10 мкМ маточного розчину прямого праймера цирі10 (ЗЕО 10
МО:35: 5-а4спТСААСапАТСАааАТАТТСТТОИ-3), 1,0 мкл зворотного праймера АШОКЕ23 (ЗЕО
ІО МО:36: 5- ССАТаТТОаССААдАСаСААСО-3, 10 мкМ маточний розчин, 4 мкл аМТтР (2,5 мМ кожні), 0,2 мкл ТаКакКа ЕХ Тад'м Ної аг, 31,8 мкл води і 2 мкл ДНК з концентрацією 10 нг/мкл.
Умови проведення циклів ПЛР були наступними: 94 "С протягом 2 хв., 10 циклів ступінчастої
ПЛР з 98 "С протягом 10 сек..., 65 "С протягом 20 сек., з температурою, що знижується на 0,5 С в кожному циклі до 60 "С з подальшими 72 "С протягом 3:00 хв. За цим слідувало 35 циклів з 98 "С протягом 10 сек..., 60 "С протягом 20 сек., і 72 "С протягом 3:00 хв. і кінцевою елонгацією при 72 "С протягом 10 хв. 5 мкл суміші після кожної реакції запускали на 1 95 агарозному гелі для детекції присутності смуги 2ЕР ТЕ очікуваного розміру 2662 п.н.
Розроблений аналіз кількісної ПЛР з детекцією в реальному часі для гена раї, який молекулярно зчеплений з 2ЕР ТЕ в конструкції рОАВ4695, і його застосовували для ідентифікації позитивних по раї і нуль-рослин для підтвердження його генетичної сегрегації з касетою 2ЕР ТЕ, з який він молекулярно зчеплений.
Таблиця 6
Ідентифікація позитивних по 2ЕР ТЕ і сестринських нуль-рослин в сегрегуючій популяції Ті в трьох випадках
В . . . Рослини Ті з ЕР ТЕ/нуль-
Випадки се посаджене насіння | Ідентифіковані рослини з рослини, які вирощуються до
Ті ЕР ТЕ/нуль-рослини ТТ ' ! отримання насіння Т2
З 150 115/7 12/7 б 100 66/27 5/5 12 150 126/6 8/6
Зо
Реакційна суміш для аналізу ПЛР-РЧ Тадмап раї містила наступне: З мкл основної суміші
Коспе ГІСНТСМУСІ ЕКФ Сусіег 480 ІІ Ргорез 2Х, 0,6 мкл 10 95 РМУР-40, 0,2 мкл 10 мкм маточного розчину прямого праймера раї (5ЕО 10 МО:37:5-АСААайАас ТасАтТТаАТаАТСТАСАСАСИСТ-93), 0,2 мкл 10 мкм маточного розчину зворотного праймера РАТ (5ЕБЕО ІЮ МО:38:5'-
З35 СтТТаАТаССТАТИаТаАСАСССТАААСАСТ-3), 0,2 мкл 5 мкм маточного розчину зонда (5ЕО ІЮ
МО:39:5'-6ЕАМ-ССАаСИаТААаСААТАССАСССАСААСАСС-гасник-3), і її змішували з наступними реагентами для внутрішнього еталонного стандарту НМО (СепВапк: АР127919), як вказано нижче: 0,2 мкл 10 мкм маточного розчину прямого праймера НМО (5ЕО ІЮ МО:40:5'-
ССТСТСТАССАССИТСТСАСАТИ-3, 0,2 мкл 10 мкМ маточного розчину зворотного праймера
НМа (5ЕО ІЮ МО:41:5-САТотасоСапАСТИатТТсСА-3), 0,2 мкл 5 мкм маточного розчину зонда (ЗЕО 10 МО:42:5'-'ЄГЕАМ-СаСТоСТСсАасСТАССАССТОСААССА-гасник-3), 1 мкл ДНК і 0,2 мкл води. Умови проведення циклів ПЛР являли собою: 1 цикл із 95 "С протягом 5 хв., 40 циклів з 95 С протягом 10 сек., 60 "С протягом 40 сек. і 72 "С протягом 1 сек. Усі зразки ампліфікували в трьох екземплярах у 384-ямкових планшетах разом з 1-4 копіями стандартів трансгенної геномної ДНК у пристрої для ПЛР Коспе ГІСНТСУСІ ЕКФ 480.
На основі пропорцій сегрегації позитивних по 2ЕР ТЕ і нуль-рослин у кожному випадку, у випадках 3, 6 і 12 відбувалося приблизно 2, 1 і 2 вставок трансгена 2ЕР ТЕ у геномі В. пари», відповідно (таблиця 6, колонка 3). Ці дані збігаються з даними по сегрегації гена раї у всіх трьох випадках.
6.3 Підвищення експресії мРНК р-кетоацил-АСР-синтетази ІІ у рослинах Т
Потім усі позитивні по 2ЕР ТЕ і сестринські нуль-рослини Ті, представлені в таблиці 6, колонка 3, піддавали аналізу експресії МРНК гена ендогенної В-кетоацил-Аср-синтетази І, трансгена 2ЕР ТЕ і ендогенного гена тубуліну. Останній служив як еталонний ген для нормалізації експресії генів ВД-кетоацил-Аср-синтетази І ї 2ЕР ТЕ. Одержували зразки шести відбитків листя з кожної рослини на стадії б листків на льоду і виділяли тотальну РНК із використанням набору ОІГАСЕМ ЕМАЕАЗУФ) Синтез і розведення ланцюгів кКДНК проводили, як описано в приклад 4.1.
Для всіх трьох генів проводили аналіз КПЛР-РЧ синтезованих кДНК. Аналіз експресії мРНК
В-кетоацил-АСР-синтетази ІІ і тубуліну проводили, як описано в прикладі 4,2 і прикладі 4,3, відповідно. Аналіз ЕР ТЕ модифікували. Реакцію ПЛР складали в такий спосіб: умови реакції були наступними: 7,5 мкл 2Х основного буфера І С480 Ргоре5 Мабхіег Вийег (Коспе Оіадповіїс,
Іпаіапароїїє, ІМ), 0,3 мкл геноспецифічного прямого праймера Мо 1 (5ЕБО ІЮ МО:43:5'- тТовАТСТТОАТАТаТтТтОасаАсСА-3) (10 мкм маточний розчин), 0,3 мкл геноспецифічного зворотного праймера Мо 2 (ЗЕО ІЮ МО:44:5'-АОСТаСАСААТСАТатОаста-3) (10 мкм маточний розчин), 0,15 мкл зонда ОРІ. Мо 85, 1,5 мкл 10 95 (мас/об.) РУР-40 і 3,9 мкл води. Розмічали 384- ямковий мікропланшет і додавали 13,5 мкл описаної вище суміші на ямку. До планшета прикріплювали герметизуючу фольгу, і планшет центрифугували протягом 1 хвилини при 3000 об./хв. Плівку видаляли і додавали 1,5 мкл розморожених розведених перших ланцюгів на ямку.
Крім того, в окремі контрольні ямки додавали стандарти кКДНК. Планшет герметизували герметизуючою кришкою з фольгою і повторювали етап центрифугування. Програму ПЛР проводили в наступних умовах: і. Активація при 95 "С протягом 5 хвилин, ії. Денатурація при 95"С протягом 10 сек. ((Ф 4,8 "С/сек.), ії. Відпал/елонгація при 60 "С протягом 25 сек. ((Ф 2,5 "С/сек.), ім. Добудування при 72 "С протягом 1 сек. (Ф 4,8 "С/сек.), м. Повторення етапів ії-ім ще 39-49 разів, мі. Охолодження до 38 "С протягом 5 сек.
Експресія мРНК 2ЕР ТЕ була найменшою у випадку 6 і найвищою у випадку З з позитивних по 2ЕР ТЕ зразків (фігура 4). Нуль-рослини неекспресували мРНК 2ЕР ТЕ, що означало, що аналіз 7ЕР ТЕ був специфічним для присутності трансгена 2ЕР ТЕ. Рівні мРНК гена р-кетоацил-
АСР-синтетази ІІ, мішені для 2ЕР ТЕ, були підвищені в позитивних по 2ЕР ТЕ рослинах у всіх
Зо випадках (фігура 5). При попарному порівнянні позитивних по ЕР ТЕ і відповідних сестринських нуль-рослин у кожному випадку спостерігали до 3-4-кратного зростання експресії мРНК рд- кетоацил-АСР-синтетази ІІ. Рівні підвищення експресії мРНК р-кетоацил-АСР-синтетази ІІ були зв'язаними з рівнями підвищення експресії мРНК 2ЕР ТЕ у кожному випадку (фігура 4), наприклад, найменшими у випадку 6 і найбільшими у випадку 3. 6.4 Аналіз жирних кислот у листі рослин Ті
Спільно зі збором зразків для аналізу мРНК, описаного в прикладі 6.3, проводили збір другого набору зразків листя Ті для аналізу жирних кислот. Однак на жирні кислоти аналізували тільки підмножину зразків тих рослин, що вирощували, як показано в таблиці б, колонка 4.
Проводили аналіз метилових ефірів жирних кислот (ЄАМЕ), як вказано нижче. Матеріал листя масою 100-100 мг збирали на льоду, а потім перед реакцією трансметилування ліофілізували 0,25М метоксидом натрію в безводному метанолі при 40 "С протягом 20 хвилин. Після реакції трансметилування жирні кислоти три рази екстрагували розчином гептану, що містить як сурогатний стандарт гептадеканоїн. Виділені гексанові фракції висушували і ресуспендували у відомому об'ємі гептану. Отримані метилові ефіри жирних кислот (ГАМЕ) аналізували за допомогою ЗС-РІО з використанням капілярної колонки ВРХ 70 з БОЕ (15 мх0,25 ммх0,25 мкм).
Кожен ЕБАМЕ ідентифікували по його часу утримання і кількісно визначали за допомогою упорскування як калібрований стандарт еталонної суміші олії насіння ріпаку з Маїгеуа ГІ. С.
Завершеність реакції підтверджували, перевіряючи присутність ендогенних ЕАМЕ при четвертій екстракції/одержанні похідних.
Усі три випадки при парних порівняннях позитивних по 2ЕР ТЕ і відповідних сестринських нуль-рослин у кожному випадку продемонстрували зниження загального вмісту С16:0 і одночасне збільшення вмісту всіх С18 (таблиця 7). Наприклад, позитивні по 2ЕР ТЕ рослини у випадку 12 у порівнянні з їх власними сестринськими нуль-рослинами демонстрували зниження вмісту С16:0 на 6,3 95 і збільшення вмісту всіх С18 на 1,44 9.
Таблиця 7
Профіль жирних кислот в листі Т
Назвазраза| Лналаовані С де орд ствдє
Назва зразка - : рослини 12нуль (в 10,98 0,31 69,93 0,91 127ЕР 8 10,29 0,39 70,94 1,02
Знуль 7 10,79 0,56 69,84 1,18
ЗИЕР 12 10,34 0,29 71,25 0,74 бнуль 5 11,94 0,47 70,36 1,91 6/ЕР 5 10,44 0,62 72,16 2,88
Приклад 7: Аналіз трансгенного насіння Т» з ЕР ТЕ
Підмножина позитивних по 2ЕР ТЕ рослин, що демонструє найвищу експресію мРНК р- кетоацил-АСР-синтетази ІІ і сестринських нуль-рослин в кожному випадку, вирощували до дозрівання з отриманням насіння Т» (таблиця 6, колонка 4). Винятком був випадок 3, де також вирощували невелику кількість позитивних по 2ЕР ТЕ рослин з меншими діапазонами експресії.
Вони можуть являти собою іншу сегрегуючу вставку трансгена ррАВ4695. Кожну рослину Ті закривали сітчастим мішком для полегшення самозапилення в даній рослині. Збирали насіння і аналізували рівні жирних кислот.
Аналіз жирних кислот Т2 проводили на сукупності з 24 насінин на рослині, як описано для аналізу насіння Ті в прикладі 6.1. Результати продемонстрували зниження вмісту С 16:0 в позитивних по 2ЕР ТЕ рослинах у всіх трьох випадках при попарному порівнянні з їх відповідними сестринськими нуль-рослинами (таблиці 8А і 888). Це зниження вмісту С 16:0 становило 12,6 95, 11,2 95 ії 22,3 95 для випадків 12, З і б, відповідно. Також спостерігали узгоджене зниження вмісту С16:1. Відповідно до зниження вмісту С16:0 і С16:1 в позитивних по
ДЕР ТЕ рослинах при попарному порівнянні з відповідними сестринськими нуль-рослинами спостерігали одночасне збільшення вмісту всіх СІ 8 (С18:0-С18:14-С18:2-С18:3). Всі три попарних порівняння позитивних по 2ЕР ТЕ і відповідних сестринських нуль-рослин при аналізі з використанням статистичного програмного забезпечення МР були статистично значними (р-«0,001) відносно зростання вмісту всіх С16 (С16:0ж-С16:1) і вмісту всіх С16б/всіх С18 (фігура 6,
А і В). Хоч на основі спостережень сестринських нуль-рослин ці три випадки варіювали за вмістом в них С16:0 (таблиці 8А і 88), 2ЕР ТЕ був ефективним в зниженні вмісту С16:0 до приблизно схожих рівнів приблизно від 2,93 до 3,05. Хоч всі позитивні по 2ЕР ТЕ рослини у випадках З і 12 дають насіння (таблиці 8 і 9), з рослин у випадку 6 насіння дає тільки одна рослина, яка містить 2ЕР ТЕ. Ця конкретна рослина у випадку 6 на основі даних про вміст жирних кислот в листі Ті мала найбільший вміст С 16:0. У таблицях 8А і 88 представлене порівняння профілів жирних кислот Т2 у трьох випадках перенесення траногена В. пари з позитивних по 2ЕР ТЕ рорАВ4695 і відповідних сестринських нуль-рослин. Ці дані отримували із
Зо застосуванням аналізу ЕГАМЕ, і вони описані в розділі 6,1. Проводили аналіз жирних кислот
С12:0-С24:1 і більшість з них представлена в цих таблицях. Всі значення представлені як процент від всіх жирних кислот, присутніх в насінні В. парив.
Таблиця 8А
Аналіз жирних кислот (46:0, (16:11, С18:0, С:18:1, С:18:2 і С:18:3
Зразки С16:0 С161 сС18:0 С181 сС182 С18:3
Середнє для 12Нуль 3,49 0,26 1,29 76,59 11,45 3,73
Ст. відх. (п-б) 0,06 0,01 0,05 0,25 0,21 0,04 122ЕР Середнє 3,05 0,20 1,33 76,53 11,63 3,87 ст. відх. (п-8) 0,11 0,02 0,04 0,39 0,33 0,06
Середнє для ЗНуль 3,30 0,25 1,31 74,34 13,18 3,94
Ст. відх. (п-7) 0,17 0,02 0,10 1,04 0,86 0,25
Середнє для ЗАЕР 2,93 0,18 1,30 74,10 13,62 4,14
Ст. відх. (п-12) 012 0,01 0,08 1,80 1,45 0,25
Середнє для бНуль 3,77 0,38 2,02 73,46 12,42 3,66
Ст. відх. (п-4) 015 0,08 0,14 2,80 2,АА 0,66 67ЕР (п-1 2,93 0,17 1,07 77,89 10,65 3,24
Таблиця 8В
Аналіз жирних кислот С20:0, С20:1, С20:2,022:0, 022:1, С24:0 і 024.1
Зразки с20:0 С20:1 сС202 сС22:0 сб221 С24:0 С241
Середнє для 12Нуль 0,53 1,26 0,05 0,33 0,02 0,14 0,14
Ст. відх. (п-б) 0,03 0,07 0,01 0,04 0,01 0,02 0,02
Середнє для 122ЕР 0,55 1,37 0,06 0,36 0,02 0,15 0,16
Ст. відх. (п-8) 0,02 0,05 0,01 0,02 0,01 0,01 0,02
Середнє для ЗНуль 0,59 1,49 0,06 0,43 0,02 015 0,21
Ст. відх. (п-7) 0,07 0,11 0,01 0,07 0,01 0,03 0,04
Середнє для ЗАЕР 0,57 1,57 0,07 0,42 0,03 015 0,19
Ст. відх. (п-12) 0,04 0,21 0,02 0,07 0,01 0,04 0,04
Середнє для бНуль 0,60 1,49 0,07 0,54 0,03 0,30 0,24
Ст. відх. (п-4) 0,08 013 0,01 0,08 0,01 0,07 0,02 67ЕР (п-1 0,52 1,86 0,07 0,42 0,04 0,20 0,22
В таблиці 9 представлені загальні профілі жирних кислот на основі окремих жирних кислот, представлених в Таблицях 8А і 88.
Таблиця 9
Зразки Всі С18" Всі С Всі насич. хх
Середнє для 12Нуль 93,06 95,52 5,83
Ст. відх. (п-б) 013 0,05 0,09
Середнє для 122ЕР 93,36 96,01 5,48
Ст. відх. (п-8) 0,11 013 0,09
Середнє для ЗНуль 92,78 95,74 5,682
Ст. відх. (п-:7) 0,39 0,17 0,32
Середнє для З2ЕР 93,16 96,14 БА
Ст. відх. (п-12) 0,41 013 0,19
Середнє для бНуль 91,55 95,01 7,47
Ст. відх. (п-:4) 0,36 0,29 0,40 67ЕР(п-1 92,85 96,18 5,17 "Всі С18 являють собою суму наступних ланцюгів атомів вуглецю: С18:0, С18:1, С18:2 і
С18:3. "Всі | С або довголанцюжкові являють собою суму наступних ланцюгів атомів вуглецю: всі
С1вжвсі С20 (С20:0-020:14020:2)нвсі С22(С22:0-022:1) нвсі С24(С24:0-024:1)
Всі насич. являють собою всі насичені жирні кислоти, представлені в Таблицях 8А і 88.
Комбінуючи всі довголанцюжкові жирні кислоти (всі С18, всі С20, всі С22 і всі С24), в позитивних по 2ЕР ТЕ рослинах в різних випадках в порівнянні з сестринськими нуль-рослинами спостерігали зростання від 0,4 95 до 1,296. Серед жирних кислот з більш довгим ланцюгом помітним було збільшення С20:1 на 25 95 в позитивних по 2ЕР ТЕ рослинах у випадку 6. У всіх випадках в рослинах, які містять 2ЕР. ТЕ, також спостерігали зниження вмісту всіх насичених жирних кислот. Воно знаходилося в діапазоні від 6 95 зниження у випадку 12 до 31 95 зниження у випадку 6.
Таким чином, проілюстрована опосередковувана 2ЕР ТЕ активація транскрипції гена рД- кетоацил-АСР-синтетази ІІ в рослинах То і Т; ії одночасному зниженні вмісту всіх жирних кислот
С16 ї збільшенні вмісту всіх жирних кислот С18 в насінні Т». Ці дані демонструють успішне застосування нових технологій 2ЕР ТЕ для спрямування на конкретні гени в шляху біосинтезу жирних кислот і їх модифікації, що приводять до прогнозованих змін профілів олії насіння, які успадковуються в поколіннях потомства.
Приклади 8-15: Підвищення/зниження експресії ГаїВ
Пластиди є головною ділянкою біосинтезу жирних кислот де помо у вищих рослинах (ОпПігодде еї а!., 1979, Ргос. Маї!. Асай. 5сі. ОБА 76:1194-8; ТнеІєп апа ОПігодде, 2002, Меїабоїїс
Епдіпеегіпд 4212-21). Жирні кислоти, що не використовуються в плазмідах, експортуються в цитоплазму за допомогою специфічної активності ацил-АСР-тіоестераз (ЕАТ) при гідролізі ацил- ацилпереносних білків (ацил-АСР) з вивільненням вільних жирних кислот. У рослин існують два класи ферментів ЕАТ, ЕГАТА і ЕАТВ. Для класу ЕАТА іп міго переважні 18:1-АСР, тоді як для класу ЕАТВ переважні субстрат насичених ацил-АСР, такі як 16:0-АСР і 18:0-АСР, але також він демонструє іншу гетерогенну субстратну специфічність (Юоегтапп еї аї., 1995, Агоп. Віоспет.
Віорпувз. 316:612-618; МоевїКег єї а!., 1997, РіІапі Ріпузіоіоду 114:669-677; Заїіаз апа Опігодде, 2002,
АгсНімез ої Віоспетівігу апа Віорпузісв, 403:25-34). Вважають, що ЕАТВ, подібно до РАТА, також присутній у всіх тканинах рослини, але переважно він експресується в насінні, що розвивається (Упа еїа!., 2006, Ріапі Рпузіоірду апа Віоспетівігу 44:645-655).
Ядерний геном Агабрідорзів кодує два гени ГаїА і один ген РаїВ. Пригнічення активності ГаЇВ може істотно знизити вміст насичених жирних кислот в гліцероліпідах. Наприклад, в мутанті
ЕаїВ, отриманому за допомогою вставляння Т-ДНК, вміст пальмітату (16:0) і стеарату (18:0) знижувалося на 42-56 95 і 30-50 905, відповідно, залежно від тканини (Вопамепішнге еї аї., Те Ріапі
Сеїї, 2003 15:1020-1033). Швидкість росту рослин у цього мутанта значною мірою пригнічувалася, приводячи до 50 95 зниження сирої маси на 4 тижні в порівнянні з диким типом.
Це відкриття підтримує точку зору, що служить РаїЇВ як основний фактор, який керує зміною насичених жирних кислот у рослин.
Основна культура олійного насіння Вгаззіса пари являє собою амфідиплоїдний вид, близькоспоріднений з модельним видом Атрбідорзізх, але з розміром генома приблизно у вісім разів більшим, ніж геном Агабідорвзів5. У результаті у цього виду описано шість генів РаїВ (МО 2009/007091) в порівнянні з одним у Агарідорвіз. Ця складність утруднює розуміння функції окремих генів РаїВ при маніпуляціях з ними. | навпаки, присутність більшої кількості генів спрощує маніпуляції з експресією декількох генів відносно необхідних показників бажаних жирних кислот замість їх повного нокауту. Відомо, що фактори транскрипції з цинковими пальцями по суті зв'язуються з будь-якою послідовністю ДНК і модулюють генну функцію генів- мішеней (Мап Еепеппаат еї аїЇ., Меїар. Епо. 2004 6:101-108; бапспе; єї аї., 2006, Ріапі
Віотесппоіоду чоштаї! 4:103-114). Як результат, цей інструмент можна застосовувати до генів
РаїВ для розуміння їх функції в В. пари5. Це знання може допомогти в маніпуляціях з експресією від одного до декількох генів БаїВ відносно бажаної "корисної для здоров'я" олії насіння каноли з меншим вмістом насичених жирних кислот.
Приведені нижче приклади 8-15 демонструють активацію транскрипції генів РаїВ у Вгазвзіса париз Г., що приводить до змін профілів жирних кислот в насінні.
Приклад 8: Ідентифікація послідовностей-мішеней для генів ЕаїВ у Вгазв5іса париз І. 8.1 Ідентифікація послідовностей-мішеней
Для пошуку і характеристики промоторних послідовностей генів РаїВ сорти Мех710 Вгазвзіса пари використовували модифікований протокол "прогулянки по геному". Ці нуклеотидні послідовності виділяли і ідентифікували для складання і отримання 2ЕР ТЕ, які можна використовувати для модифікації експресії гена РаїВ. Конструювали дев'ять бібліотек для "прогулянки по геному" з використанням набору Сіопіесп сепоте УмаїКкіпд Кії (Раю Ано, СА). Ці бібліотеки застосовували для отримання послідовності довжиною -1 т. п. н. вище ділянки старту транскрипції генів БаїВ. На основі послідовностей Е5БТ РаїВ, доступних в загальнодоступних базах даних, складали і синтезували пару прямих вкладених праймерів, бо специфічних до гена РаїВ. Пару зворотних вкладених праймерів складали і синтезували для гібридизації з адаптерними послідовностями. З цих дев'яти бібліотек ампліфікували декілька фрагментів ПЛР. Отримані фрагменти ПЛР клонували у вектори ТОРО (Іпмігодеп, Сагізрай, СА,
БА) і секвенували для ідентифікації промоторних послідовностей РаїВ. На основі цього підходу ідентифікували два гени РаїВ, РаївВА і РаїВ5. Виявили, що хоч кодуючі послідовності цих генів РаїВ були висококонсервативними, послідовності в 5-ШТК і промоторних областях відрізнялись.
Експресія ГРаїВ і кількісне визначення генів РаїВ4 і РаїВ5 за допомогою аналізу кількісної
ПЛР-РЧ в насінні В. парих, що розвивається, дозволяють передбачити, що ці гени високоекспресовані в насінні В. пари5. Тотальну РНК виділяли, кількісно визначали і ділянки ініціації транскрипції картували, як описано вище в прикладі 1. Промоторні послідовності цих двох генів використовували для складання 2ЕР ТЕ для модифікації експресії на рівні транскрипції.
Приклад 9: Конструювання ДНК-зв'язувальних доменів 2ЕР, специфічних до генів РаїВ
Конструювали білки з цинковими пальцями до різних ділянок-мішеней в гені РаїВ. Нижче в таблицях Т0А і 108 представлені ділянки-мішені і розпізнавальні спіралі для характерних складів ЕР.
Таблиця 10А
Ділянки зв'язування-мішені Ра(В для 2ЕР ТЕ 7ЕР Ділянка-мішень РаїВаА (від 5' до 3) Ділянка-мішень Специфічність аассАдАдСсдАсСАТСИ Еа(В5 (від 5 до 3) до РаїВ 13685" АСАСАСідададад (ЗЕО І МО: 47) Відсутність ділянки зв'язування Еаїва
Відсутність ділянки сдАААсаСацпАпАТСаАс дада дсассдса (ЗЕО 10 13714 | зв'язування аазсАСсААсТттТАсса МО:48) гав: гаїва і ааадссАцпААтттАСсСИасТ 13722 | П'ТаСдаадасі (ЗЕО І ТТтасбададасі (ЗЕО ІЮ Еаїв5
МО 49) МО 50) 1374377 СІССОААСАСАТТОО СОТААсаснсді | СОСОлЛАСАСАТТОССО Еаїва і гаїВ5 (5ЕО 10 МО:51) ТАА сснсай (ЗЕО ІЮ МО:52
Таблиця 108
Області розпізнавальних спіралей ЕР 7ЕР 17 2 З 4 5 б
ВБОМІ 5 ОБАНАК вБООІЗК ОЗНАК вБОоНІ 5 ОМАННІ
А(ЗЕО І Т (ЗЕО ІЮ (ЗЕО ІЮ Т (ЗЕО ІВ М(ЗЕОІЮО /Е(ЗЕО І 13685 -МО:75) МО:76) МО:21) МО:77) МО:78) МО:79)
ВБОМІ 5 ОБАНАК вБООІ ЗК ОЗНАК вБОоНІ 5 ОМАМНІ
А(ЗЕО І Т (ЗЕО ІЮ (ЗЕО ІЮ Т (ЗЕО І К(ЗЕСОІОЮО Т(5ЕОЮ 13714. МО:75) МО:76) МО:21) МО:77) МО:80) МО:81) вБОоНІЗ нНОМТАК вБОНІ 50 МЗАЗАК ОБОМА озаніз
Т (ЗЕО ІЮ М(ЗЕО ІЮ (ЗЕО ІЮ М(ЗЕО Ір В(ІЗЕОІО В(ЗЕОЮ 13722 МО:82) МО:83) МО:84) МО:85) МО:16) МО:86)
М5ОБІТ ВВА0І 5 ВАБОБІ БА ОМАНАК вБОоНІ 5 ВАМАОВІТ 13743 Е (ЗЕО ІО В(ІЗЕО І (ЗЕО ІЮ Т (ЗЕО Ір О(ЗЕОІЮ (ЗБОЮ
МО:87 МО:88 МО:89 МО:90 МО:84 МО:91 "Великі букви являють собою зв'язувальну послідовність 2ЕР, тоді як маленькі букви, які розташовуються по боках, являють собою оточення з фланкуючих послідовностей для ділянки зв'язування 2ЕР ТЕ. Маленькі курсивні букви між великими буквами являють собою пропущені основи при зіставленні 2ЕР. як Зв'язувальна послідовність 7ЕР для РаїВА і РаїВ5 є однаковою, але З3'-фланкуючі послідовності для двох генів відрізняються. ях цисла являють цинковий палець (1 представляє палець 1, 2 представляє палець 2 і т. д.)
Приклад 10: Опосередковане 2ЕР ТЕ підвищення експресії природних генів РаїВ у В. пари5
Для ілюстрації опосередкованого 2ЕР ТЕ підвищення експресії РаїВ в клітинах В. парив, отримували конструкції, що містять чотири склади генів 2ЕР ТЕ (таблиці 10 ії 11), ці гени доставляли в клітини В. пари5 для стабільної експресії за допомогою опосередковуваної Адгобасієгцт трансформації. 10.1 Складання конструкцій
Складені і сконструйовані бінарні плазміди з 2ЕР ТЕ перераховані в таблиці 11 нижче.
Експресію генів ЕР ТЕ вміщували під контроль відносно сильного конститутивного промотору, такого як промотор, що походить з промотору вірусу мозаїки жилок маніоки (С5МУММ).
Опосередковувану Адгобасієгішт трансформацію рослин проводили, як описано в прикладі 3.2, зі стабільним вбудовуванням 2ЕР ТЕ в геном В. парив.
Таблиця 11
Описані конструкцій ЕР ТЕ, направлених на гени РаїВ В. пари
З.М. ЕР Мо конструкції Генна касета
МАВ АВ7/С5УММ/МІ 5 Ор-2-2ЕР 13685 1 13685 ррАВА689 МРІ16/3-0ТА АШОВЕ23/АШБІ 10/Рау3-ОТА
АШОВЕ1
МАВ АВ7/С5УММ/МІ 5 Ор-2-2ЕР 13714- 2 13714 ррАвВАб690 МРІ16/3-0ТА АШОВЕ23/АШБІ 10/Рау3-ОТА
АШОВЕ1
МАВ АВ7/С5УММ/МІ 5 Ор-2-2ЕР 13722-
З 13722 ррАВАб91 МРІ16/3-0ТА АШОВЕ23/АШБІ 10/Рау3-ОТА
АШОВЕ1
МАВ АВ7/С5УММ/МІ 5 Ор-2-2ЕР 13743- 4 13743 ррАВвВАб692 МРІ6/3-О0ТААШОВЕ23/АШБІІО/Рауз3'-ОТА
АШшШОВЕ1 рорАВ4689 являє собою бінарну плазміду, яка містить генні експресійні касети послідовності ядерної локалізації або МІ 5 орадне-2 (Ор-2)/13685//Р 16 і раї. Ця конструкція містить наступні генетичні елементи: мх3 МАК КВ?7 (область прикріплення до матриксу (ТПотрзоп та інші., 1997,
МО9727207)):м2 промотору С5МММ (промотор вірусу мозаїки жилок маніоки (Мегдадиег еї аї., 1996, Ріапі Моїєсшіаг Віоіоду 311129-1139)):МІ 5 орадне-2 (Мап Еепеппаат еїа!., 2004, Меїароїїс
Епаіпеегіпу 6:101-108; НоІтев5-Оамі5 еї аїЇ., 2005, Ріапі Моїесшаг Віоюду 57:411-423)у/злиття цинкового пальця 13685//Р16 (датіезоп та інші., Віоспет. Віорпу. Ре. Соттип. 2006, 348:873- 879)м1 3-ОТА АшОВЕг23 (3'-нетрансльована область відкритої рамки зчитування 23
Адгорасієгцт іштеїасіепв (Семіп та інші., 1987, ЕР222493)):м2 промотору АШЬЙО (промотор убіквітину 10 Агабідорвів Наїїапа (Саїїйїй5, та інші., 1990, 9. Віої. Спет. 265-12486-12493))м5 раї (фосфінотрицинацетилтрансфераза (уопІереп еї аї., 1988, Сепе 70:25-37))м4 3-0ОТА АШОВЕ1 (3'-нетрансльована область відкритої рамки зчитування 1 Адгобасіегпцт Кшптеїасієп5 (Ниапд та інші., у. ВасіегіоїЇ. 172:1814-1822)). Бінарну плазміду конструювали за допомогою клонування фрагмента ДНК, який містить злиття МІ. 5 орадие-2/цинковий палець 13685//Р16, в ррАВЗ3912 по ділянках рестрикції МсоІ-Ззасі. Отримана конструкція, яку помічали як ррАВ8215, містила генну експресійну касету м2 промотору С5МММ:злиття МІ/5 орадие-2/цинковий палець
Зо 13685/УР16:м1 3-0ТК АшШОКЕ23. ррадАВ8215 клонували в бінарну плазміду рОАВ4668 шляхом реакції І-А Саїємау Веасійоп (Іпийгодеп, Сагі5рад, СА).В даній реакції отримували ррАВ4689 і підтверджували за допомогою розщеплень рестрикційними ферментами і реакцій секвенування. ррАВ4690 являє собою бінарну плазміду, яка містить генні експресійні касети МІ 5 орадие- 2/13114Л/Л/Р16 і раї. Ця конструкція містить наступні генетичні елементи: м3 МАК КВ7:м2 промотору С5МММ:злиття МІ 5 орадие-2/цинковий палець 13714//Р16:м1 3-ОТА АШОВЕ23 маг промотору АШБІі10:м5раєм4 3-ОТК АШшОКЕї. Бінарну плазміду конструювали шляхом клонування фрагмента ДНК, який містить злиття МІ.5 орадие-2/цинковий палець 13714//Р16, в ррАВЗ912 по ділянках рестрикції МесоІ-засі. Отримана конструкція, яку помічали як ррАВ8216, містила генну експресійну касету м2 промотору С5МММ:злиття МІ.5 орадие-2/цинковий палець 13714//Р16м1 3-ТК АШОКЕ23. ррдВ8216 клонували в бінарну плазміду рОАВ4668 шляхом реакції Г-К Сагемау Кеасійп (Іпмігодеп, Сагізрай, СА). В даній реакції отримували ррАВ4690 і підтверджували за допомогою розщеплень рестрикційними ферментами і реакцій секвенування.
ррАВ4691 являє собою бінарну плазміду, яка містить генні експресійні касети МІ 5 орадие- 2/13122//Р 16 і раї. Ця конструкція містить наступні генетичні елементи: м3 МАК КВ7:м2 промотору С5МММ:злиття МІ 5 орадие-2/цинковий палець 13722//Р16:м1 3-ОТА АШОВЕ23 маг промотору АШБІі10:м5 раї (фосфінотрицинацетилтрансфераза):м4 3-ОТК АшОКЕ1. Бінарну плазміду конструювали шляхом клонування фрагмента ДНК, який містить злиття МІ. 5 орадие- 2/Іцинковий палець 13722Л/Р16, в ррАВЗ3912 по ділянках рестрикції МесоІ-Засі. Отримана конструкція, яку помічали як ррАВ8217, містила генну експресійну касету м2 промотору
С5МММ:злиття МІ 5 орадие-2/цинковий палець 13722/Л/Р16:м1 3-О0ТА АшОВЕ23. ррАВ8217 клонували в бінарну плазміду ррАВ4668 шляхом реакції І-й Саїеумау Веасійп (Іпийгодеп,
Сагізрадй, СА). В даній реакції отримували рОАВ4691 і підтверджували за допомогою розщеплень рестрикційними ферментами і реакцій секвенування. ррАВ4692 являє собою бінарну плазміду, яка містить генні експресійні касети МІ 5 орадие- 2/13743/УР 16 и раї. Ця конструкція містить наступні генетичні елементи: у3 МАК КВ7 (область прикріплення до матриксу:см2 промотору С5МММ:злиття МІ 5 орадие-2/цинковии палець 13743/УРІ16:м1 3-ОТК АшОКЕ23:м2 промотору АШБі10 (промотор убіквітину 10 Агарідорзів
ІШаїїапа)м5 рама 3-ОТК АшОКЕ1. Бінарну плазміду конструювали шляхом клонування фрагмента ДНК, який містить злиття МІ. 5 орадие-2/цинковий палець 13743/Л/Р16, в ррАВЗ3912 по ділянках рестрикції МсоІ-Ззасі. Отримана конструкція, яку помічали як ррАВ8218, містила генну експресійну касету м2 промотору СзУМУх злиття МІ/5 орадие-2/цинковий палець 13743//Р1б6міІ 3-0ИТК АшОКЕ23. ррдАВ8218 клонували в бінарну плазміду ррАВ4668 шляхом реакції Г-К Сагемау Кеасійп (Іпмігодеп, Сагізрай, СА). В даній реакції отримували ррАВ4692 і підтверджували за допомогою розщеплень рестрикційними ферментами і реакцій секвенування.
Приклад 11: Аналіз трансформованих зразків калюсів
Лінії трансгенних калюсів В. пари отримували за допомогою трансформації чотирьох конструкції ЕР. ТЕ, ррдв4689-ррАВА4692, і контрольної конструкції, РОАВ8210, за допомогою опосередкованої Адгобасієгішт трансформації рослин, як описано в прикладі 3,2. Контрольна конструкція, РОАВ8210, яка містила генну експресійну касету раї (Промотор АЮБІ1ТО/рау3-ООТА
АШОРКЕ ЇЇ) і касету ненаправленої 2ЕМ (промотор СЗМММ/2ЕМ/3-0ТК АшШОКЕ23). Зі всіх ліній виділяли тотальну РНК і синтезували кДНК, як описано в прикладі 4.1. Єдиною модифікацією
Зо описаного раніше протоколу було використання як праймерів для реакцій отримання кКДНК праймерів оліго-аТ замість випадкових гексамерів і відповідна зміна реакції кДНК, по інструкціях виробника. 11.1 Аналіз експресії мРНК РаїВА і РГаївр 11.1.1 Аналіз РаїіВА за допомогою кількісної ПЛР з детекцією в реальному часі (КПЛР-РЧУЧ) у
В. пари5
Суміш ПЛР для ампліфікації КДНК РаїВ4 складали наступним чином: 1,5 мкл 10Х буфера для ПЛР з гарячим стартом (Оіадеп, МаІепсіа, О5А), 1,2 мкл 10 мМ акмтрР, 1 мкл 25 мМ Мас», 0,15 мкл Оіадеп Ної зіагі Тад (5 Од/мкл), 0,5 мкл 10 мкМ маточного розчину прямого праймера 77143 (З5ЕО ІЮ МОС53: СТІ ТОДАСОСТТАТСТТССТОС) (10 мкМ маточний розчин), 0,5 мкл 10 мкм маточного розчину зворотного праймера ЕАТВ5о К4 (ЗЕ ІО МО:54:
ТТССАСААСАТСТСОСССААдДО), 0,25 мкл 5 мкМ маточного розчину зонда ТадМап МОВ (Се
Тесппоіодієх, Сагізрай, СаїйОогпіа) Раїв4 МОВ Ргобе 4 (5БО 10 МО:55: ГАМ-
СТСАСОСТССАССС), 1,5 мкл 10 95 (мас./об.) РМР-40 і Н2О до 13,5 мкл на одну реакцію.
Розмічали прийнятний квадрант(и) 384-ямкового мікропланшета і заповнювали в об'ємі 13,5 мкл основної суміші на ямку. До планшета несильно прикріплювали герметизуючу фольгу. Планшет центрифугували протягом 1 хвилини при 3000 об./хв. в центрифузі для мікропланшетів Оіадеп.
Потім у відповідні ямки додавали 1,5 мкл розморожених розведених перших ланцюгів кКДНК з наступним додаванням 1,5 мкл стандартів плазмідної кДНК з концентрацією ДНК в контрольних ямках від найменшої до найбільшої. На завершення герметизуючу фольгу міцно прикріплювали до планшета і центрифугували. Програму ПЛР проводили в системі для ПЛР з детекцією в реальному часі ГІЗНТСУСІГЕКФ 480 (Коспе Оіадпобвіїсв, Іпаіапароїї5, ІМ, ОБА) з використанням наступної програми: 1) активація при 95 С протягом 15 хвилин; 2) денатурація при 957 протягом 20-30 сек. ((Ф 4,8 "С/сек.); 3) відпал при 60 "С протягом 20-30 сек. (Ф 2,5 "С/сек.); 4) добудова при 72 "С протягом 45-60 сек. ((Ф 4,8 "С/сек.); повторення етапів 2)-4) ще 39-49 разів; 5) охолодження до 38 "С протягом 5 сек. для зупинки реакції.
Розмір амплікона РаїВА складав 678 п. н. Ця послідовність перекриває інтрон довжиною 79 п.н. на основі геномної послідовності. Крім того, зворотний праймер сконструйований з перекриванням інтрона, таким чином, сприяючи специфічній ампліфікації тільки кКДНК РаїВА, таким чином, усуваючи ампліфікацію геномної ДНК. бо 11.1.2 Аналіз КПЛР-РЧ Гаїв5 у В. пари
Суміш ПЛР для ампліфікації КДНК РаїВв5 складали наступним чином: 1,5 мкл 10Х буфера для ПЛР з гарячим стартом (Оіадеп, МаІепсіа, О5А), 1,2 мкл 10 мМ акмтрР, 1 мкл 25 мМ Мас», 0,15 мкл Оіадеп Ної зіагі Тад (5 Од/мкл), 0,5 мкл 10 мкМ маточного розчину прямого праймера 77145 (5БО І МО:56: СТТІТОДААОСТСАТСТТССТС), 0,5 мкл 10 мкМ маточного розчину зворотного праймера ЕАТВ5 К4 (5ЕО І МО:57: ТТГССАСААСАТСТОСССААС), 0,25 мкл 5 мкм маточного розчину зонда ТадМап МОВ (Ійе Тесппоодіе5, Сагізрай, Саїйотіа)
Раїв5 МОВ Ргобе 1 (ЗЕО ІО МО:58: РАМ-ААССТТСАТССТСССА), 1,5 мкл 10 95 (мас/об.) РУР- 40 ї НО до 13,5 мкл на одну реакцію. Решта характеристик аналізу і циклу ПЛР були такими, як описано для аналізу КПЛР-РЧ РаїВА в прикладі 11.1.1.
Розмір отримуваного амплікона складав 678 п. н. Ця послідовність КДНК перекриває інтрон довжиною 76 п. н. на основі геномної послідовності. Крім того, зворотний праймер конструювали з перекриванням інтрона, таким чином, сприяючи ампліфікації КДНК Раїбв5, таким чином, усуваючи ампліфікацію геномної ДНК. 11.2 Аналіз експресії мРНК тубуліну
Цей аналіз проводили, як описано в прикладі 4.3. 11.3 Аналіз експресії МРНК 2ЕР ТЕ
Аналіз мРНК 2ЕР ТЕ зразків калюсів То проводили відповідно до прикладу 4.4. Розмір ампліконів в цьому аналізі складав менше 1 т. п. н. залежно від розміру 2ЕР в кожній з конструкцій. Кількісний аналіз експресії ЕР ТЕ в рослинах То проводили з використанням аналізу на основі активуючого домену МР16, як описано нижче. Суміш для КПЛР-РЧ МР16 для ампліфікація КДНК 2ЕР ТЕ складали наступним чином: 7,5 мкл 2Х основного буфера
ГІОНТСМУСІ ЕК 480 Ргоре5 Мазіег (Коспе Оіадповііс5, Іпаіапароїї5, ІМ, О5А), 0,3 мкл 10 мкм маточного розчину праймера МР16 ОРІ ЕТ (5ЕО І МО:59: ТССАТСТТОАТАТОТТОООБАБА), 0,3 мкл 10 МКМ маточного розчину МРІб ОРІ К1 (ЗЕ ІО МО:60:
АСИатТасСАСААТСАТОТОСТО), 0,15 мкл зонда ОРІ Мо 85 (Коспе Оіадповіїсв5, Іпаіапароїїв, ІМ,
ЗА), 1,5 мкл 10 95 (мас./о6б.) РМР-40 і Н2О до 13,65 мкл. Розмічали прийнятний квадрант(и) 384- ямкового мікропланшета і заповнювали в об'ємі 13,5 мкл основної суміші на ямку. Потім до планшета несильно прикріплювали герметизуючу фольгу. Планшет центрифугували протягом 1 хвилини при 3000 об./хв. в центрифузі для мікропланшетів Оіадеп. Додавали 1,5 мкл
Зо розморожених розведених перших ланцюгів кКДНК з наступним додаванням 1,5 мкл стандартів плазмідної КДНК з концентрацією ДНК в контрольних ямках від найменшої до найбільшої.
Герметизуючу фольгу міцно прикріплювали до планшета і центрифугували. Програму ПЛР проводили в системі для ПЛР з детекцією в реальному часі ГІЗНТСУСІ ЕК 480 Коспе
ОРіадповійс5, Іпаіапароїї5, ІМ, ЮБА) з використанням наступних умов: 1) активація при 957 протягом 5 хвилин; 2) денатурація при 95"С протягом 10 сек. ((Ф 4,8" С/сек.); 3) відпал/елонгація при 60 "С протягом 25 сек. ((Ф 2,5 "С/сек.); 4) добудова при 72 "С протягом 1 сек. (Фі 4,8 "С/сек.); 5) повторення етапів 2-4 ще 39-49 разів. На закінчення реакційну суміш охолоджували до 38 "С протягом 5 сек. для зупинки реакції.
Розмір амплікона УР16 складав 68 п. н. Цей розмір фрагмента відповідає фрагменту МР16, продукції якого очікували при ПЛР ампліфікації. 11.4 Аналіз експресії зразків калюсів
Трансгенні лінії калюсів, які вирощуються з відбором на НЕКВІАСЕФ, за допомогою кПЛР-
РЧ аналізували на рівні експресії РаїВА, РаїВ5, тубуліну і 2ЕР ТЕ. Ген тубуліну служив як еталонний ген для нормалізації рівнів експресії мРНК РаївВА, РаївВ5 і 2ЕР ТЕ. Для нормалізації експресії мРНК розраховували відношення РаїВ4/тубулін і РаїВ5/губулін. Результати для складів конструкцій РОАВ4691 демонстрували статистично значне підвищення експресії мРНК
РаївА і мРНК Раїв5 (р-0,005; фіг. 9). Лінії калюсів з ррАВ4692 демонстрували тренд до підвищення експресії мРНК РаїВвА і РаїВ5, але цей тренд не був статистично значним. В окремому експерименті також аналізували лінії калюсів з ррАВ4689, які продемонстрували тренд до підвищення експресії, але результати не були статистично значимими (дані не показані). В контрольних лініях специфічний оамплікон 2ЕР ТЕ не ампліфікувався, підтверджуючи, що аналіз 2ЕР ТЕ був специфічний тільки для експресуючих 2 ЕР ТЕ ліній.
Приклад 12: Аналіз експресії зразків трансгенних рослин То 12.1 Аналіз актину у В. пари для застосування як внутрішнього контролю для КПЛР-РЧ
Зі всіх ліній виділяли тотальну РНК і синтезували кДНК, як описано в прикладі 11. Суміш
ПЛР для ампліфікації кКДНК актину складали наступним чином (Во Хапд еї аї., 2007, Ріапі
Зсіепсе 173:156-171; номер доступу гена актину в СепеВапк АЕ111812): 7,5 мкл 2Х основний буфер ГІСНТСУСІ ЕК 480 УВА Огеєп І, 0,3 мкл 10 мкМ маточного розчину праймера
ВМ Асіїп Е (5ЕО ІО МО:61: АССАОСТАССТОАСОСАСААС), 0,3 мкл 10 мкМ маточного розчину (510) ВМ Асійп ЕК (ЗЕО ІЮ МО:62: ОЗАСОСОАСООСТОСААСВАСТА), 1,5 мкл 10 95 (мас/об.) РМР-40 і НгО в достатньому для отримання 13,5 мкл об'ємі. Розмічали прийнятний квадрант(и) 384-ямкового мікропланшета і заповнювали в об'ємі 13,5 мкл основної суміші на ямку. До планшета несильно прикріплювали герметизуючу фольгу. Планшет центрифугували протягом 1 хвилини при 3000 об./хв. в центрифузі для мікропланшетів Оіадеп. Додавали 1,5 мкл розморожених розведених перших ланцюгів кКДНК з наступним додаванням 1,5 мкл стандартів плазмідної КДНК з концентрацією ДНК в контрольних ямках від найменшої до найбільшої. Герметизуючу фольгу міцно прикріплювали до планшета і центрифугували. Програму ПЛР проводили в системі для
ПЛР з детекцією в реальному часі ГІЗНТСУСІЕКФ 480 (Коспе біадповіїфсв5, Іпаіапароїї5, ІМ,
ОБА) з використанням наступних умов: 1) активація при 95"С протягом 10 хвилин; 2) денатурація при 95 "С протягом 10 сек. (Ф 4,8 "С/сек.); 3) відпал/елонгація при 60 "С протягом 20 сек. (Ф 2,5 "С/сек.); 4) добудова при 72 "С протягом 20 сек. ((Ф 4,8 "С/сек.); 5) повторення етапів 2-4 ще 39-49 разіва. На закінчення реакційну суміш охолоджували до 38 "С протягом 5 сек. для зупинки реакції. Розмір отримуваного амплікона складав 80 п. н. 12.2 Аналіз експресії МРНК РаївВА і РГаїв5
Рослини В. пари5, трансформовані ррАВ4689-ррОАВ4691, аналізували на підвищену експресію мРНК РаївА і РаїВ5. Крім того, застосовували два типи контролю. Нетрансгенний контроль складався з рослин Мех710, які служили як негативний контроль. Також аналізували другий трансгенний контроль з рослин В. париз Мех710, трансформованих ррАВ8210. Склад конструкції рРОАВ8210 містив дві генні експресійні касети. Генна експресійна касета раї (промотор АШБІ10:ген раг3-ОТА АШОНВЕТ) і генна експресійна касета ненаправленої нуклеази з цинковими пальцями (2ЕМ) (промотор АШБІ1О:ген 2ЕАг3-ОТК АШОКЕ23). Вважали, що 2ЕМ, яка експресується в рраАВ8210, не буде зв'язуватися с геномом рослин В. пари5 Мех710 і розщеплювати його, і не буде змінювати фенотип цих рослин.
Передбачувані трансгенні калюси, які вирощуються з відбором на НЕКВІАСЕФ, відновлювали в рослини (приклад 3.3). Для аналізу експресії мРНК збирали зразки листя рослин В. пари5, які вирощуються в теплиці, на стадії б листків. Отримували зразки шести відбитків листя з кожної рослини і перед виділенням РНК вміщували на лід. Виділяли тотальну
РНК з використанням набору ОІАСЕМ ЕМЕАЗУ. Синтез кДНК і наступні розведення проводили, як описано в прикладі 11. Протокол аналізу експресії РаївА і Раїв5 за допомогою кПЛР-РЧ
Зо описаний вище. Спільно з аналізом проводили/не проводили аналіз експресії ЕР ТЕ. Аналіз
КПЛР-РЧ еталонного гена актину описаний вище.
Експресія генів БаївА і РаїВ5 листям То з різними конструкціями варіювала (фіг. 10).
Найбільше підвищення експресії мРНК РаїВвА і РаїВ5 спостерігали у випадках трансгенних рослин з рРОАВ4691, що приводило до загального підвищення експресії мРНК в 2,0-2,5 разу в порівнянні з нетрансгенними Мех710 і трансгенними контролями з ррАВ8210. Експресія обох генів в порівнянні з контролями була статистично значною (нижче р-0,05). Таким чином, додаткове визначення характеристик конструкцій продовжували з ррАВ4691.
Приклад 13: Аналіз трансгенних рослин Ті 13.1 Аналіз жирних кислот насіння Ті
У випадку ррАВ4691-003-049.1 ("випадок 49") спостерігали значну відмінність вмісту С18:0 в олійних насінні з "низьким" і "високим" вмістом (Таблиця 12).
Вміст С18:0 насіння категорії з "низьким" вмістом був схожим з вмістом в лініях Мех710 (нетрансгенний контроль) і рОАВ8210 (трансгенний контроль). Вміст С 18:0 в насінні з "високим" вмістом корелював з експресією 2ЕР ТЕ, яка приводить до підвищення експресії гена(ів) Еаїв.
Також спостерігали деякі підвищення С20:0, С22:0 і С24:0 на основі переходу С 18:0 в більш довголанцюжкові жирні кислоти. Вміст С 16:0 в окремих насінинах, ймовірно, не змінювався не залежно від категорій з "низьким" або високим" вмістом. Цей результат вказує на той факт, що 2ЕР ТЕ рорАВ4691 зв'язує і підвищує експресію гена(ів) РаїВ, специфічних для ферментативних реакцій перетворення С18:0-АСР в С18:0, а не реакцій перетворення С16:0-АСР в С16:0 (див. приклад 1, фіг. 1).
Таблиця 12
Профіль жирних кислот окремих насінин Т', який змінюється за допомогою аналізу ЕАМЕ
Зразки" Всього сІв:0 00 сви с18:0 с20:0 С22:0 С24:0 насичених
Випадок 49
Низький 6,35 4,11 0,48 1,45 0,46 0,21 0,07
Випадок 19 6,35 3,70 0,35 1,62 0,58 0,30 02 изьКий
Випадок 19 6,49 3,64 0,36 1,66 0,62 0,32 018 изьКий
Випадок 19 7,50 3,55 0,42 2,59 0,80 0,34 017 исоКий
Випадок 19 7,74 3,63 0,45 2,59 0,88 0,38 0,22 исоКий
Випадок 19 7,93 3,67 0,47 2,82 0,86 0,38 017 исоКий
Випадок 49
Середній 6,90 3,70 0,40 2,03 0,67 0,31 0,15 (п-24)
Випадок 49
Ст. відх. 0,51 0,14 0,05 0,37 010 0,04 0,03 (п-24)
Мех 710
Середній 6,47 3,70 0,45 1,79 0,57 0,26 0,11 (п-24)
Мех 710
Ст. відх. 0,35 0,24 0,06 0,17 0,06 0,04 0,03 (п-24) 8210 Середній 6,27 3,51 0,34 1,63 0,61 0,33 014 (п-150) нн 0,40 0,24 0,07 0,25 0,08 0,05 0,04 "Аналіз жирних кислот проводили на 24 окремих насінинах Ті випадку 49 і Мех710, і 144 насінинах з ррАВ8210, які включали випадки 6. Категорії "низький" і "високий" представляють характерний вміст ЕРА в окремих насінинах при класифікації на основі вмісту С 18:0. 13.2 Аналіз присутності 2ЕР ТЕ в рослинах Т"
У разі 49 сто насінин Т: висаджували в теплицю. Дев'яносто сім рослин дали сходи. Кількість піків ЕР. ТЕ визначали з використанням аналізу кПЛР-РЧ раї, як описано в прикладі 6.2 для рослинного матеріалу, виділеного на стадії 2-4 листка. Випадок 49 містив декілька вставок (53 вставки), і в популяції Т Ісегрегували 0-7 піків гена раї, і таким чином, 2ЕР ТЕ. У популяції Ті ідентифікована тільки одна нуль-рослина. 13.3 Підвищення експресії мРНК Раїва і РаїВ5 в рослинах Ті
Аналіз експресії природного гена ЕРаїВ проводили у всіх 97 рослинах сегрегуючої популяції
Ті. У дослідження як контроль включали нетрансгенні рослини Мех710, саджали в той же самий час. Отримували шість відбитків листя на кожну рослину і до можливості проведення виділення
РНК вміщували на лід. Виділяли тотальну РНК з використанням набору ОІАСЕМ КМЕАЗУ.
Синтез кКДНК і подальше розведення проводили, як описано в прикладі 11. Аналіз експресії
ЕаївВА, РаївВ5, тубуліну і МР16 (7ЕР ТЕ) проводили, як описано вище.
Статистичний аналіз відношень РаїВ4/РаїВ5 і тубуліну продемонстрував значні лінійні тренди з експресією тубуліну (фіг. 11), які вказують на те, що ріст РаїВ4/РаїВ5 не має із ростом ендогенного контролю, тубуліну, залежності 1:1. Тому в цьому аналізі відношення не використовувалися, і тубулін в моделі експресії ГаїВ4/РаїВ5 включали як додаткову змінну. Для виключення будь-якої колінеарності між тубуліном і МР16 (2ЕР ТЕ), ортогоналізували матриці зв'язностей для модельних рівнянь.
До всіх наборів даних в даному дослідженні застосовували приведену нижче модель: де статус і являє собою статус трансгенності ур (трансгенна або нуль/контроль);
Уйк - статуд нтрансгенніть«єМРІб ек трансгенність"УР16 являє собою лінійну регресію від УР16, вкладену в трансгенні лінії; а ер являє собою випадковий залишок. За умови, що для кожного зразка проводили три повторних вимірювання, застосовували структуру корельованих залишків: 19 5
В-оз но 1 ет ; де Іп являє собою одиничну матрицю з рангом, який дорівнює кількості зразків, а ф являє собою кореляцію між залишками повторних вимірювань.
Результати аналізу для випадку 49 з використанням вкладених моделей регресії експресії
Баг(вВА залежно від МРІб виявили значне підвищення експресії РаїВвА, що демонструє високозначні позитивні нахили (фіг. 12, таблиця 13). Для РаїВ5, моделі вкладеної регресії продемонстрували позитивний нахил відносно підвищення експресії, і нахил був статистично значним. Для випадків з підвищенням експресії потрібно зазначити, що трансформовані і контрольні рослини не формують однакову лінію, так що існує деяке зміщення лінії і ефектів трансформації.
Таблиця 13
Результати для випадків з підвищенням експресії
Випадок Ген Ефект" Рішення Значення Р
Ба!швА 5 / Трансформована-контроль 10331,11 -0,00001 4691-3- Трансформована "МР16 09У64Е-05 -0,00001 049.001 Раїв5 / Трансформована-контроль 5084,09 -0,00001
Трансформована "МР16 0,308Е-05 -0,00001
АТрансформована-контроль - різниця середньої експресії у трансформованих ліній і ліній, які не несуть трансгенів, по методу найменших квадратів.
Трансформована "УР1б-регресія експресії РаїВ4/РаїВ5 залежно від експресії МР16, вкладеної в трансгенні лінії.
Потім рослини Ті у випадку 49 сортували на основі відношень експресії РаїВ4/губулін, а потім РаїВ5/тгубулін для пошуку рослин з найбільшою експресією для отримання покоління Т» в теплиці. Для вирощування до дозрівання вибирали вісім рослин з найбільшою експресією
Еаїв4. Шість цих рослин також мали найбільшу експресію РаїВ5. Кількість піків 2ЕР ТЕ у цих рослин з найбільшою експресією варіювала в діапазоні 2-4 піків, тоді як кількість піків, яка сегрегує у всьому потомстві Ті становила 0-7 піків. У контрольних рослин до стану дозрівання для збору насіння Т» також вирощували одну нуль-рослину випадку 49 і десять контрольних
Зо рослин Мех710. 13.4 Аналіз жирних кислот насіння Т2
Аналіз жирних кислот (БА) проводили в партії з 24 насінин всіх рослин, як описано в прикладі 6.1. Профіль БА однієї нуль-рослини для контролю розрахунку профілів БА об'єднували з десятьма контрольними рослинами Мех710. У середньому, для випадку 49 в порівнянні з Мех7/10 спостерігали 1295 збільшення вмісту С18:0 (таблиці 14А і 148). Це збільшення було статистично значним при р-0,05 (фіг. 13). Також деякий ріст продемонстрували довголанцюжкові ЕРА, такі як С20:0, С22:0 ї С24:0, що приводило до росту загального вмісту всіх насичених ГА на 5 9о. Оскільки фермент РаїВ каталізує перетворення
С18:0-АСР у вільні ЕРА С18:0, в результаті активації транскрипції РаїВвА і Раїв5 накопичується більша кількість С18:0 (фіг. 1). ррАВ4691 (приклад 6, таблиці 1 і 2) специфічна до обох генів
Еаїв А і РаіВ5, що приводить до значних змін профілю ГА (таблиці 14А і 148В).
Таблиця 14А
Профіль жирних кислот (С16:0, С16:1, С18:0, С18:1, С18:2 і С18:3) трансгенних і контрольних зразків Мех710 у випадку 49 5.М. І рослини Всього ос160 сіб сі8:0 с18:00с1822 С183 насичених 1 4691-3-049 (8) 6,42 3,47 0,24 1,61 76,32 11,20 3,52 2 Мехега710 (11 6,11 3,40 0,23 144 (7626 11,25 3,76
Числа в дужках в колонці 2 являють собою кількості аналізованих рослин.
Таблиця 148
Профілі жирних кислот (С20:0, С20:1, С20:2, С22:0, 022:1, С24:0, С2471) трансгенних і контрольних зразків Мех710 у випадку 49 5.М. 10 рослини Всього с20:0с20:11 с20:2 с22:0 с221 Са | Сл насичених 1 4691-3-049 (8) 6,42 0,66 1,39 0,05 0,43 0,02 0,21 0,18 2 Мехега710 (11 6,11 0,61 1,43 0,06 0,41 0,02 0,20 0,17
Числа в дужках в колонці 2 являють собою кількості аналізованих рослин.
Значних змін в загальному вмісті С16 при підвищенні експресії природних ЕаїВА і РаїВЬ не спостерігали. Ймовірно, що каталіз перетворення С16:0-АСР в С 16:0 виробляється іншими генами РаїВ, а не РаїВА і Раїв5, ілюстративними мішенями для підвищення експресії з використанням конструкції РОАВ4А691 з 2ЕР ТЕ (фіг. 1).
Спостерігали, що в насінні Ті категорій з "низьким" і "високим" вмістом вміст С 16:00 окремих насінин не змінюється (таблиця 12), що вказує на той факт, що конструкція РОАВ4А691 з 2ЕР ТЕ більш специфічно зв'язується геном(ами) РаїВ, які опосередковують ферментативну реакцію перетворення С18:0-АСР в С18:0, а не реакцію перетворення С16:0-АСР в С16:0 (фіг. 1).
Потрібно зазначити, що підвищення експресії природних генів ВД-кетоацил-АСР-синтетази ЇЇ (приклади 1-6), що індукується 2ЕР ТЕ, зумовлює різні зміни профілів БА в порівнянні з підвищенням експресії генів РаїВА ії РаїВ5. Наприклад, підвищення експресії гена В-кетоацил-
АСР-синтетази ІЇ спричиняє статистично значне зниження вмісту С 16:0 і С 16:11 ії одночасне збільшення вмісту всіх С18 в порівнянні з їх нуль-сегрегантами (приклад 6, фіг. 6, таблиці 5 і 8).
У порівнянні з цим, опосередковуване 2ЕР-ТЕ підвищення експресії гена РаїВ спричиняє статистично значне збільшення вмісту С 18:0, але не спричиняє видимої зміни вмісту С16:0 (фіг. 14). Крім того, ці зміни профілів ЕА за допомогою опосередковуваного 2ЕР ТЕ підвищення експресії генів ДВ-кетоацил-АСР-синтетаза І і БРаїВ відповідно до шляху біосинтезу ЕА конкурують (фіг. 1).
Приклад 14: Отримання конструкцій 2ЕР ТЕ для трансформації рослин Отримували і конструювали чотири конструкції для пригнічення транскрипції генів РаїВ в В. парт ГІ (таблиця 15). Для демонстрації зниження експресії ГаїВ використовували найкращі конструкції ЕР для підвищення експресії РаїВ, 13722 і 13714 (приклади 9-13). Для конструювання функціональних
ЕР ТЕ ці конструкції ЕР зливали з сигналом ядерної локалізації орадие-2 і репресуючим доменом, що складається з КЕКАВІ1 (Наппа-Козе апа Напзеп, 1996, Тгепаз іп Сепеїїсв5, 12:229- 234) або МЕРЕЗ (Опіа еї а!ї., Те Ріапі Сеїї, 2001, 13:1959-1968). Всі ці 2ЕР ТЕ експресували під контролем специфічних для насіння промоторів; використовували промотор білка транспорту ліпідів 2 Агарідорзіз Іаійапа (промотор АШТРІ170) (Сепрапк І: МС 003076) або промотор
Рпазеоив миїЇдагі В-фазеоліну (промотор РуРПаз) (патент США Мо 5591605).
Таблиця 15
Докладна інформація про конструкції 2ЕР ТЕ для направленого зниження експресії генів гаїв
Склад Мо й
З.М. 7ЕР конструкції Генні касети
АТ ТРІ170/МІ 5 Ор-2"-2ЕР-13722-КВАВ1/3'- ! 13722 РОАЗ5203 ТВ ОВЕ23/АШЬО/РауЗ-ОТВ АЮОВЕ
АТ ТРІ170/МІ 5 Ор-2-2ЕР-13714-КВАВ 1/3-ОТА 2 13 рОАБо204 0 ОВЕ2ЗАЮЬИОРАУЗ-ОТА АЮОВЕ
РуРпаз/Ор-2-МІ 5-2ЕР 13722-КВАВ 1/РНаз 3'-
З 13722 рОАЗБ2Т2 0 ТВуАШЬНО/РауЗ-ОТА АШОВЕ
АТ ТРІ170/МІ 5 Ор-2-2ЕР-13722-МЕНЕЗ/3-ОТА й 13722 рРОАЗ5227 ОВЕ23//ДІЮріТ0/РауЗ-ОТВ АШОВЕ "ор-2 - Сигнал ядерної локалізації Орадие-2 рОрАБЗ5203 являє собою бінарну плазміду, що містить генні експресійні касети МІ 5 орадие- 2/13722/КААВІ і раї. Ця конструкція містить наступні генетичні елементи: Промотор 170
АН ТР:злиття МІ. 5 орадие-2/цинковий палець 13722/ККАВІ1:м1 3-ОТА АшОкКгЕ23:м2 промотору
АїШБВБІі10:м5 раїм4а 3-ТК АшШОКЕ1. Бінарну плазміду конструювали за допомогою клонування фрагмента ДНК, що містить злиття МІ. 5 орадие-2/цинковий палець 13722/ККАВІ, в донорний вектор Сайемжау. Отримана конструкція містила генну експресійну касету промотор 170
АЦП ТР:злиття М/5 орадие-2/цинковий палець 13722/ККАВІ:м! 3-ОТК АШшоОКкЕ23. Цю конструкцію клону клонували в бінарну плазміду за допомогою реакції І-А8 Саїємжау Веасійп (Іпмігодеп, Сагі5райд, СА). У цій реакції отримували рраА55203 і підтверджували за допомогою розщеплень рестрикційними ферментами і реакцій секвенування. ррАБЗ5204 являє собою бінарну плазміду, що містить генні експресійні касети МІ 5 орадие- 2/13114/КААВІ і раї. Ця конструкція містить наступні генетичні елементи: промотор 170
АН ТР:злиття МІ. 5 орадие-2/цинковий палець 13714/ККАВІ1:м1 3-ОТК АшОкКгЕ23:м2 промотору
АїШБВБІі10:м5 раїм4а 3-ТК АшШОКЕ1. Бінарну плазміду конструювали за допомогою клонування фрагмента ДНК, що містить злиття МІ. 5 орадие-2/цинковий палець 13714/ККАВІ, в донорний вектор Сайемжау. Отримана конструкція містила генну експресійну касету промотор 170
АЦП ТР:злиття М/5 орадие-2/цинковий палець 13714/ККАВІ:м! 3-ОТК АШшоОКкЕ23. Цю конструкцію клонували в бінарну плазміду за допомогою реакції Ї-А Саїєжшау Веєасійп (Іпмйгодеп, Сагізрайд, СА). У цій реакції отримували ррА55204 і підтверджували за допомогою розщеплень рестрикційними ферментами і реакцій секвенування. рОрАБЗ5212 являє собою бінарну плазміду, що містить генні експресійні касети МІ 5 орадие- 2/13722/КААВІ і раї Ця конструкція містить наступні генетичні елементи: промотор
РуРпаз:злиття МІ.5 орадие-2/цинковий палець 13722/ККАВІ1:м1 3-0ТК АшШОкКгЕ23:м2 промотору
АїШБВБІі10:м5 раїм4а 3-ТК АшШОКЕ1. Бінарну плазміду конструювали за допомогою клонування фрагмента ДНК, що містить злиття МІ.5 орадие-2/цинковий палець 13722/ККАВІ, в донорний вектор Саієеужау. Отримана конструкція містила генну експресійну касету промотор
РмуРпаз:злиття МІ 5 орадие-2/цинковий палець 13722/ККАВІ:м! 3-ТК АшОКЕ23. Цю
Зо конструкцію клонували в бінарну плазміду за допомогою реакції /-А Саїємжшау Веєасійп (Іпмігодеп, Сагізрай, С А). У цій реакції отримували ррА55212 і підтверджували за допомогою розщеплень рестрикційними ферментами і реакцій секвенування. ррАБЗ5227 являє собою бінарну плазміду, що містить генні експресійні касети МІ 5 орадие- 2/13122/МІЕНЕЗ і раї. Ця конструкція містить наступні генетичні елементи: м3 МАК
КВ7:промотор 170 Ай ТР:злиття МІ/5 орадие-2/цинковий палець 13722/МЩЕКЕЗ:м1 3-ОТА
АїШшОКЕ23:м2 промотору АШБІ10:м5 рама 3-ТК АШшШОКН 1. Бінарну плазміду конструювали за допомогою клонування фрагмента ДНК, що містить злиття МІ/5 орадие-2/цинковпй палець 13722/ЖЩЕКЕЗ, в донорний вектор Саїеул"ау. Отримана конструкція містила генну експресійну касету промотор 170 АЄШ ТР:лиття МІ 5 орадие-2/цинковий палець 13722/МЖЕКЕЗ:м1 3-ОТА
АїШОКЕ23. Цю конструкцію клонували в бінарну плазміду за допомогою реакції І -А Саїемжау
Кеасійп (Іпмігодеп, Сагізраа, СА). У цій реакції отримували рраА55227 і підтверджували за допомогою розщеплень рестрикційними ферментами і реакцій секвенування.
Конструкції застосовували для стабільної трансформації сорту Мех/10 В. париб5 за допомогою опосередковуваної Адгобасієгішт трансформації гіпокотильних тканин (приклад 3.2- 5О0
3.3). Рослини То, що вирощуються в теплиці, піддавали самозапиленню і через чотири місяці після висадження збирали насіння ТТ.
Приклад 15: Аналіз насіння Ті трансгенних по 4 конструкціях ЕР ТЕ
Насіння Т: отримували у випадках перенесення трансгена (лінії) 8, 20, 37 і 15 конструкціями рорАБ5203, ррд55204, ррадб55212 і рРрА55227, відповідно. Як контроль використовували насіння п'яти рослин Мех710. Аналіз ГА проводили на 24 окремих насінинах у кожному випадку перенесення трансгена з Ті як описано раніше в прикладі 6,1, з ідентифікацією спочатку конструкції ЕР ТЕ, яка найбільш ефективно змінює профіль БА. 15.1 Аналіз жирних кислот (ЕА) в насінні Ті
За допомогою конструкцій рОрАБ5203, рраАБ5О212 і рОрАБ5Ь227 отримували випадки перенесення трансгена з профілями з найменшим рівнем всіх насичених ГА в порівнянні з контролем Мех710 (таблиця 16). Парні відмінності між кожним з двох випадків конструкцій ррАБЗ5203 і рра55212 і контролем Мех710 були значними (р-«0,005)3. При цьому парна відмінність ррАБ5Ь227 продемонструвала тенденцію до підвищення (р-0,06). У одному з випадків застосування ррА55203 виявляли найменший вміст всіх насичених БА 5,3 95 (не представлено) в порівнянні із середніми 6,38 95 в контролі Мех710. Це являє собою 17 95 зниження всіх насичених БА.
Таблиця 16А
Профіль РЕА в насінні Ті в випадках перенесення трансгена декількома конструкціями
Ме 00 типаналізу ВСЬОГО с140 с160 сів с18:0 с181 с182 С183 конструкції насичених рорАбБг212 нен 6,00 0,05 360 024 1,38 75,88 12,24 ЗА рОАБ5212 Ст. відх. (п--37) 0,21 0,01 0,20 0,02 0,14 1,36 1,03 0,41 рОрАБ5212 значення р"" 0,01 0,07 0,89 0,47 -0,0001 0,39 0,37 0,94 рОАБЗ5204 Середнє (п-20) 6,26 0,05 3,52 0,25 1,65 76,33 11,52 3,58 рОАБ5204 Ст. відх. (п-20) 0,29 0,01 0,15 0,02 0,16 0,78 0,66 0,30 рОрАБЗ5204 Значення Р 0,43 0,72 0,52 0,69 0,32 0,16 0,04 0,34 рОАБ5203 Середнє (п-8) 5,98 0,05 3,68 0,26 1,33 75,32 12,74 3,55 рОАБ5203 Ст. відх. (п-8) 0,36 0,01 0,25 0,05 013 1,76 1,31 0,47 рОрАБ5Ь203 значення Р 0,02 0,06 0,45 0,96 0,0001 0,96 0,98 0,49 рОАБ5227 Середнє (п-15) 6,09 0,03 3,63 0,32 1,32 7543 12,32 3,73 рОАБ5227 Ст. відх. (п-15) 0,35 0,00 0,29 0,09 012 1,69 1,36 0,37 рорАБ5227 значення Р 0,07 0,002 0,69 0,012 «0,0001 0,84 0,48 01
Мех 710 Середнє (п:5) 6,38 0,04 3,59 0,26 1,73 7528 12,76 340
Мех 710 Ст. відх. (п:5) 0,61 0,01 0,15 0,03 0,49 3,00 2,16 0,43 х Числа в дужках демонструють кількість випадків, які включені в аналіз "значення р, яке дорівнює або менше 0,05, вважали статистично значним і розраховували з використанням програмного забезпечення ОМР
Таблиця 168
Профіль РЕА в насінні Ті у випадках перенесення трансгена декількома конструкціями
Ме 00 типаналізу Всього ос20:10 сС20й с20:22 с22:0 са с конструкції насичених рОАБ5212 Середнє (п-37)" 6,00 0,54 1,33 0,06 0,30 013 0,08 рОАБ5212 Ст. відх. (п--37) 0,21 0,04 0,11 0,01 0,03 0,05 0,04 рОрАБ5212 Значення р" 0,01 0,03 0,003 0,14 0,76 0,26 0,23 рОАБЗ5204 Середнє (п-20) 6,26 0,59 1,20 0,05 0,32 013 0,11 рОАБ5204 Ст. відх. (п-20) 0,29 0,06 0,17 0,01 0,05 0,05 0,03 рОрАБЗ5204 Значення Р 0,43 0,79 0,20 0,87 0,68 0,29 0,63 рОАБЗ5203 Середнє (п-8) 5,98 0,51 1,28 0,05 0,29 012 0,11 рОАБ5203 Ст. відх. (п-8) 0,36 0,03 0,15 0,01 0,02 0,01 0,05 рОрАБ5Ь203 Значення Р 0,02 0,006 0,048 0,42 0,56 0,55 0,84 ррАбо227 Середнє (п-15) 6,09 0,56 1,39 0,06 0,39 0,15 0,16
Таблиця 168
Профіль РЕА в насінні Ті у випадках перенесення трансгена декількома конструкціями конструкції насичених рОАБ5227 Ст. відх. (п-15) 0,35 0,07 0,23 0,01 010 0,08 0,05 рОрАБ5227 Значення Р 0,07 0,21 0,0005 0,066 0,008 0,081 0,004
Мех 710 Середнє (п:5) 6,38 0,60 1110 0,05 0,31 0,11 010
Мех 710 Ст. відх. (пІ:5 0,61 013 0,09 0,01 0,07 0,05 0,08 х Числа в дужках демонструють кількість випадків, які включені в аналіз. ""значення р, яке дорівнює або менше 0,05, вважали статистично значним і розраховували з використанням програмного забезпечення ОМР.
Конкретні профілі РА у випадках ррАБ55203, рра55212 і ррА55227 приводили до 21-25 95 зниження вмісту С18:0 в порівнянні з Мех710 (фіг. 15А). Всі ці відмінності були статистично значними при р-0,001 або менше (таблиця 16). Інші довголанцюжкові БА, С20:0, С22:0 і С24:0, також продемонстрували зниження концентрації. Однак змін у вмісті С 16:0 не спостерігали, що в результаті приводило до значного збільшення вмісту С16:0/С18:0 у всіх випадках перенесення трансгена конструкціями (фіг. 168).
Профіль БА трансгенних насіння при використанні ррАБ5227 продемонстрував явні відмінності в порівнянні з ррАБ5203 і ррАБ5212. При використанні ррА55227 в насінні спостерігали 23 95 зниження вмісту С 14:0 (р-0,002) і 19 95 збільшення вмісту С16:1 (р-0,01) в порівнянні з Мех710 (фіг. 16А 4. В, таблиця 16). Склад 2ЕР ТЕ ррад55227 ідентичний складу ррАБЗ5Ь203 і рраі55212 за винятком присутності переважного транскрипцією домену ЕКЕЗ, злитому з 2ЕР замість домену ККАВІ (таблиця 15).
Інший склад 2ЕР, 13714, присутній в ррА55204, був не таким ефективним в зниженні вмісту
С18:0 в порівнянні зі складом 13722 (таблиця 16). На відміну від складу 13722, що зв'язується з обома генами ГРаїВА і РаїВ5, склад 13714 зв'язується тільки з геном РаїВ5 (приклад 9, таблиця 108). 15.2 Ідентифікація рослин для аналізу МРНК
Для аналізу пригнічення транскрипції ГаїВ5 вибирали два випадки перенесення трансгена, 5212І111-004 ї 5227|4|-012, отримані за допомогою трансформації конструкціями ррАБ5212 і ррАБЗ5227, відповідно. У теплиці висаджували від п'ятдесяти до ста насінин Ті: і вирощували рослини. У рослин на стадії 2-3 листків отримували чотири відбитки листя. Цей рослинний матеріал аналізували на кількість піків ЕР ТЕ з використанням аналізу раї кПЛР-РЧ (приклад 6.2). Потім для вирощування до дозрівання для збору насіння Т2 випадковим чином вибирали нуль-рослини по 2ЕР і позитивні по 2ЕР рослини (таблиця 17). У цих рослин для аналізу мРНК
ЕаїіВ через 25 діб після цвітіння збирали незрілі стручки. Обидва випадки сегрегували як при наявності однієї копії. Ці випадки означали як 5212-4 і 5227-12.
Таблиця 17
Скринінг випадків перенесення трансгена на ідентифікацію позитивних по 2ЕР і нуль-рослин
Висаджені насінини 50
Пророслі насінини 43 17 Нуль 5 5212-004 Скринінг на кількість копій 26 1 копія З раї 5 2 копія 4 1 нти
Критерій хХ2 0,04 5227-12 Висаджені насінини 100
Пророслі насінини 96 19 Нуль 4
Скринінг на кількість копій 32 1 копія З раї 27 2 копія 4
Таблиця 17
Скринінг випадків перенесення трансгена на ідентифікацію позитивних по 2ЕР і нуль-рослин
Критерій Х" 0,034 "н.т. 5 Не тестували. 15.3 Проведення виділення РНК і аналізу КПЛР-РЧ
РНК виділяли з незрілого насіння Вгаззіса з використанням набору КМАЕАЗУФ для рослин, отриманого з Оіадеп (Маіепсіа, СА). Насіння вміщували в касетні пробірки, що містять буфер
ВІТ (ОіадепуУР-меркаптоетанол (ВМЕ) і намистину з нержавіючої сталі. Зразки вміщували в штатив для касетних пробірок і гомогенізували при 500 ударах на хвилину протягом 5 хвилин в кульовому млині (Кіесо, Мізайа, СА). Штатив для пробірок перевертали на 180 градусів і гомогенізували додаткові 5 хвилин. Потім зразки переносили в 1,5 мл пробірки Еррепоог! і центрифугували протягом 5 хвилин при 20000х9, і супернатант переносили в чисті пробірки.
РНК виділяли, як описано в протоколі виробника (Оіадеп; Маіепсіа, СА). РНК елюювали з колонок 50 мкл води, яка не містить РНКа»з, і в зразках РНК визначали кількість з використанням
МапоОгор 8000 з Тпепто Зсіепійіс (М/Ітіпоюп, ОЕ).
Від десяти до дванадцяти мікрограм РНК обробляли ДНКазою ТШОКВО ОМА-їтее (каталожний номер АМ1907; Арріїей Віозузіет»5, Ровіег Сйу, СА) в 1,5-мл пробірках, що не містять РНКаз/ДНКаз, для видалення геномної ДНК. Для кожного зразка РНК отримували п'ятдесят мікролітрів реакційної суміші, яка містить РНК, 1Х буфер для ДНКази і 2 Одиниці
ДНКази ТОКВО. Реакційні суміші інкубували при 37 "С протягом 30 хвилин. У кожну пробірку додавали п'ять мікролітрів (5 мкл) реагенту для інактивації ДНКази і перемішували. Зразки інкубували при кімнатній температурі протягом трьох хвилин, знов перемішували і інкубували при кімнатній температурі протягом додаткових двох хвилин. Зразки центрифугували при 20000х9 протягом п'яти хвилин. Сорок мікролітрів (40 мкл) супернатанту видаляли, залишаючи нижче завис для інактивації ДНКази. У кожному обробленому ДНКазою зразка визначали кількість з використанням Маподгор з тим, щоб для синтезу ДНК можна було б використати еквівалентні кількості РНК.
Для кожного зразка РНК отримували комплементарну ДНК (кДНК) з використанням набору
СсОМА Нідп Сарасійу (Арріїєй Віозубієетв5, Бо5іег СпПу, СА). У короткому викладі, 1,5 мкг РНК використовували як матрицю в п'ятдесяти мікролітрах реакційної суміші, що містить ЇХ буфер для зворотної транскрипції, 1Х аМТР, 1Х випадкові олігомери і 125 одиниць зворотної транскриптази Мийізсгіре. Крім того, для кожного використання 1,5 мкг обробленої ДНКазою
Зо РНК отримували реакційні суміші без КТ в тих же умовах, як указано вище, але без зворотної транскриптази Мийізсгібе. Всі зразки інкубували при 25 "С протягом 10 хвилин, 37 "С протягом 2 годин, 85 "С протягом 5 хвилин і протягом ночі при 4 "С.
Праймери і зонди для ГАТВ, КАБІЇ, ЕКЕЗ, ККАВІ і тубуліну конструювали з використанням програмного забезпечення Ргітег Ехрге55 З з Арріїєд Віозуєіет»5 (Розіег Спу, СА). Праймери синтезували за допомогою Іпіедгаїей ОМА Тесппоіодіез (СогаїміШе, ІА). Нижче приведені послідовності праймерів:
ЗЕО ІЮО МО:63: ЕАТВ5 пма--тоасСстасСссСАТААСААССАТТТ-3";
ЗЕО ІЮО МО:64: ЕАТВ5 геух-5-СОССЮСТаИ,аТт т оСАаТтсА-З";
ЗЕО ІЮ МО:65: КВАВІ пма-5-ААассАтататтСсатацАТТТСА-3";
ЗЕО ІЮ МО:66: КВАВІ гех-5-САСААТСОТИаСТА ТАСАСТАТСААДИ-3";
ЗЕО ІЮ МО:67: ЕВЕЗ пма-5-асассаассасвАаттаттА-з;
ЗЕО ІЮО МО:68: ЕВЕЗ гех-5-ССССАТСОСаСОТТАСАТОИ-3";
ЗЕО ІЮ МО:69: ТУБУЛІН пма-5-сАдасСстаАсаААСсАасСаАТТас-з";
ЗЕО ІЮ МО:70: ТУБУЛІН гем-5-ТТОСТОСТОССААСОААТа-3.
Зонди бЕАМ/МОВ синтезували в Арріїєа Віозуз(етвз (РБозіег СПУ, СА):
ЗЕО ІЮ МО:71: зонд 6РАМ для ЕАТВ5о ТТТСстодасСсассА;
ЗЕО ІЮ МО:72: зонд 6ЕАМ для ККАВІ ТАСССААСАСТОСААСОСТ;
ЗЕО ІЮ МО:73: зонд 6ЕАМ для ЕКЕЗ САСОССТСАСОССТТ, і
ЗЕО ІЮ МО:74: зонд б6ЕАМ для тубуліну ТАСААДОСТТТССААСТІТ.
Експресію генів РаївВ, ЕВЕЗ, КВАВІ і тубуліну оцінювали за допомогою ПЛР з детекцією в реальному часі з використанням Арріїєа Віозубзіет 7900ОНТ (Розіег Спу, СА). Для встановлення динамічної рівноваги і для ефективності аналізу отримували стандартну криву з використанням аліквот декількох зразків КДНК з різних груп. Потім з вихідного розведення робили серійне розведення 1:5 і 1:4. Кожний зразок кКДНК розбавляли 1:50 10 мМ Ттгі5, рН 7,5. Реакційні суміші
ПЛР отримували в об'ємі двадцяти мікролітрів, що містить 1Х основну суміш для експресії генів (Арріїей Віозузієт»е5; БЕозіег Сйу, СА), 0,8 мкМ прямих і зворотних праймерів, 0,2 мкм геноспецифічного зонда бЕАМ/МОВ і 4 мікролітра розбавленої кКДНК. Всі реакції проводили в пристрої Арріїей Віозухіет 7900НТ з використанням програмного забезпечення 505 2.4 в наступних умовах: Етап 1) 50 "С протягом 2 хвилин; Етап 2) 95 "С протягом 10 хвилин; Етап 3) 95С протягом 15 секунд; і Етап 4) 60 "С протягом 1 хвилини. Етап З і 4 повторювали 39 додаткових циклів. Експресію гена тубуліну оцінювали в кожному планшеті, тоді як реакції для
ЕаївВ, ЕВЕЗ ї КВАВІ проводили окремо. Всі реакції проводили в трьох повтореннях.
Стандартні криві оцінювали на регресію і нахил і у міру необхідності регулювали порогові значення. Зразки без КТ (контролі без зворотної транскриптази, що містять РНК зі всіма компонентами для реакції отримання кДНК за винятком зворотної транскриптази) порівнювали з відповідними зразками з підтвердженням наявності відмінності Сі від 5 до 7. Дані імпортували в
Ехсеї для аналізу. Середні значення кількостей РаїІВ, ЕНЕЗ ії КВАВІ нормалізували по середній кількості тубуліну і реєстрували як відношення експресії РаїВ і тубуліну. 15.4 Аналіз зниження експресії мРНК специфічного для насіння ЕРаїВ5 в недозрілому насінні
Результати продемонстрували, що зниження експресії мРНК РаїВ через 25 діб після цвітіння (БАР) в недозрілому насінні залежало від стану зиготності рослини Ті. Наприклад, в незрілому насінні гетерозиготних рослин (1 копія) 5227-12 видимого зниження експресії мРНК Раїв5 не спостерігали (фіг. 17). Однак коли експресія 2ЕР ТЕ в гомозиготних рослинах (2 копії) зростала в 2 рази, спостерігали 21 95 зниження експресії мРНК РаїВ5 (р-0,025). Подібні результати отримували в іншому випадку, 5212-4, з іншою конструкцією, ррА55212. У цьому випадку знов не спостерігали видимого зниження експресії РаїВЬ в гетерозиготних рослинах (фіг. 18). Однак в гомозиготних рослинах при зростанні експресії ЕР ТЕ спостерігали 15 95 зменшення кількості транскриптів РаївВ5.
Зо Нуль-рослини, гетерозиготні і гомозиготні рослини для двох випадків вирощували до дозрівання і визначали профілі БА в сукупності з 24 насінин кожної рослини. Цей процес сегрегації нуль-ліній з ліній, які містили 2ЕР. ТЕ, забезпечував відмінності в профілях БА, які більш точно відображали присутність 2ЕР ТЕ. 15.4 Аналіз профілів ЕРА в дозрілому насінні Т2
Для випадку 5227-12 профілі БА в дозрілому насінні Т2 варіювали залежно від зиготності
ЕР ТЕ батьківської рослини Ті (таблиці 18А і 188). Хоч гетерозиготні рослини Ті не демонстрували ніякого видимого зниження експресії мРНК РаїВ в незрілому насінні на 25 БАК, профіль ЕА їх насіння демонстрував 8 956 зниження вмісту С18:0. Значного зниження вмісту
С16:0 не спостерігали. Крім того, спостерігали невелике збільшення С 18:1 (олеїнової кислоти) і
ЕА, які йдуть далі, що приводить до загального 5,5 95 зниження всіх насичених ЕА (таблиці 184А і 188, фіг. 19). Коли рослини Ті 5227-12 були гомозиготними по 2ЕР ТЕ, виявляли значне зниження експресії мРНК Раїв. Профілі БА цього насіння Те відрізнялися. Спостерігали 11 95 збільшення вмісту С16:1, що приводить до 2,7 95 зниження всіх насичених ГА (таблиці 18А і 188). Однак додаткового зниження вмісту С18:0 в порівнянні з гетерозиготними рослинами не спостерігали. Ці зміни співпадають з профілем РЕА дозрілого насіння Ті: (приклад 15.1).
Таблиця 18А
Змінений профіль РЕА зрілого насіння Тег у випадку 5227-12
Кіль- Всього С18:1 С18:1 Всі
Мо рослини кість наси- С14:0 С16:0 С16:1 С18:0 (олеї- (вакце- С18 С18:2 С18:3 копій чених нова) нова) " зга 12 0721 005 400 028 2,06 7147 527 76,74 1092 322
Середнє (п--4) ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' 5221-12 Ст. 0 021 001 009 002 0ло 05Б 029 062 029 034 відх. (п-4) 5227-12
Середнє (п-3) 1 6,84 0,05 3,2 025 1,8 71,99 488 7687 11,03 3,33 5227-12 Ст 1 0,33 0,01 033 003 004 050 019 0,32 0,05. 10,31
Таблиця 18А
Змінений профіль РЕА зрілого насіння Тег у випадку 5227-12
Кіль- Всього С18:1 С18:1 Всі
Мо рослини кість наси- С14:0 С16:0 С16:1 С18:0 (олеї- (вакце- С18 С18:2 С18:3 копій чених нова) нова) " 5227-42
Середнє (п-4) 2 7,00 0,05 .3,96 0,30 1,91 70,99 5,9 76,08 11,62 3,30 5221-12 Ст. 2 029 000 047 003 040 150 025 144 121. 026 відх. (п-4)
Таблиця 188
Профіль РА зрілого насіння Те» у випадку 5227-12
Мерослини Сількість Всього С20:0с20:1 с20:2 С22:0 с240 с копій насичених 5227-42
Середнє (п-4) 0 7,21 0,64 1,01 0,04 0,27 013 0,09 5227-12 Ст. о 0,21 0,03 002001 001 003 01 відх. (п-4) 5227-42
Середнє (п-3) 1 6,84 0,62 1,07 0,04 0,28 олег 0,09 5227-12 Ст. 1 0,33 0,02 01 000003 002 001 відх. (п--3) 5227-42
Середнє (п-4) 2 7,00 0,62 1,06 0,04 0,27 012 0,08 5227-12 Ст. 2 0,29 0,09 003001 003 003 001 відх. (п-4)
Подібні результати отримували для профілів БА дозрілого насіння Т2 випадку 5212-4. У насінні гетерозиготних рослин спостерігали 5,5 96 зниження вмісту С18:О0, що приводить до зниження вмісту всіх РА на 3,2 95 (таблиця 18, фіг. 20). Також спостерігали невелике зростання
С18:1; інші концентрації БА, що залишилися, продемонстрували незначне зниження.
Гомозиготні рослини, незважаючи на значне зниження експресії мРНК РаїВ, не продемонстрували більшого зниження вмісту С 18:0 в порівнянні зі зниженням вмісту С18:0 у гетерозиготних рослин.
Таким чином, в цих прикладах продемонстровано пригнічення транскрипції гена Гаїв5, специфічною для насіння експресією 2ЕР ТЕ. 2ЕР ТЕ були ефективними в здійсненні пригнічення транскрипції гена-мішені БаїВ5 у гомозиготних рослин ТТ». Однак зниження вмісту
С18:0 в гомозиготних насіннях Т2 було не більшим, ніж зниження вмісту С18:0 в сегрегуючому насінні Т». Ці результати свідчать, що гомозиготні копії ЕР ТЕ можуть запускати механізм зворотного зв'язку з регуляцією профілів БА, оскільки гени РаїВ є необхідними для росту і розвитку рослин (Вопамепіиге еї аїЇ., Те Ріапі СеїІЇ, 2003 15:1020-1033). Заслуговує уваги, що опосередковуване 2ЕР ТЕ зниження експресії мРНК РаїВ в незрілому насінні зворотно пропорційне підвищенню експресії РаїВ відносно змін вмісту С18:0.
Ці приклади демонструють, що направлена на природні гени РаїВ дія ЕР ТЕ специфічно змінює кількість МРНК РаїВ, таким чином, приводячи до специфічних і успадкованих змін профілів РЕА у В. парив.
Таблиця 19А
Профілі РА насіння Т»2 випадку 5212-4 при різних умовах зиготності
Ме рослини Кількість Всього Сс149 с16:0 с16:1 С18:0 Сс18и С18:2 С183 копій насичених 5212-4 Середнє (п:5) 0 7,02 0,05 3,4 0,2 1,8 7603 11,17 3,50 5212-4 Ст. відх. (п-:5) 0 0,29 0,01 018 002 012 144 171,06 0,56 5212-4 Середнє (п:5) 1 6,79 0,04 3,83 0,32 1,1 7686 10,74 3,36 5212-4 Ст. відх. (п-:5) 1 0,19 000 007 0,01 017 026 Щ 0,1 БР011 5212-4 Середнє (п:5) 2 6,96 0,04 3,9 0,32 1,9 7638 11,00 3,38 5212-4 Ст. відх. (п:5) 2 0,24 0,00 008 0,01 016 081 0,78 0,30
Всі патенти, патентні заявки і публікації, вказані в цьому документі, таким чином, повністю включені за допомогою посилання для всіх цілей.
Хоч як ілюстрація і приклад з метою ясності розуміння наданий докладний опис, фахівцям в даній галузі очевидно, що можна здійснювати різні зміни і модифікації без відхилення від суті або об'єму опису. Таким чином, вказані вище описи і приклади не треба розглядати як обмежувальні.
Перелік послідовностей -11050ОМ АЯВО5СІЕМСЕЗІЇ С еї а). «120»КОНСТРУЙОВАНІ БІЛКИ З ЦИНКОВИМИ ПАЛЬЦЯМИ, НАПРАВЛЕНІ НА ГЕНИ
РОСЛИН, ЗАЛУЧЕНІ ДО БІОСИНТЕЗУ ЖИРНИХ КИСЛОТ -13058325-4006.40 «1405РСТ/О52010/002817 -14152010-10-22 -150561/279,528«15152009-10-22 160596 «170»5Раїепінп мегвіоп 3.5 «21051 «211538 «2122 ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер «40051 птфежвассоЗ ззивсЗосе Божого СЗВеоа з8 «21052 «211535 «2122 ДНК -213»Штучна послідовність «220»«223»Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер «40052 зкозачектоас пасезосвеЗе сосеагоєа со ЗУ 21053 «2115736 «2122 ДНК «213»Вгазвіса пари 40053
- с си С о т я ху ом Ху. ЗВО им ух ям ж узи Мах КО зчзасвовссо сісорачаєс сзаасалте ческшскЗас сова а Зоб сюрмо ЩО поли нич В и и НН мкм у Укус сом щ чу цих хх
Ел киев астзачеекас ссакосссава сЗосисшетлу рас Вчи МАК щук би фо пики и тус шани и НН и «3 викстассЕки досссоссьвв виш осоос скоссчоЗая ссБсаксус Фест. МВ
Зеиксою ВХ фу накид зв ик ик в р пекан в НН о КН Кв в НН о о се шчабкстокс посох ЕтЕсоссс пшКЕтеКсео сСсепаеастЕе СКС ве
У чн нач п ни НН НН Я У кісти вот пексесЕшЕС ВОЗИ рес ОК Ех ше сих Ку ї У п НН НН А НК р и пи ня зму касцсавкото сеанс сопе се евщса асо спасе я еВ сцені ЕН ІЕЕ ВИТОЧКИ НМ КА Й КЕ ООН ие сацессвссвз звакчесесза зеесоЗосвоає азсвобновв соска со сКуаавове зай с тк тути вічі ву ин ук си К имя МУ у сек пу емо ай «Ввисзватшнити што сриосацаиу ЯКУ к зу Осика а вахИоаца Я перлами ких туди емечіссутт очи цик в сих жи соусу и Урі ех о мое м М рек я
У іч ЕК кро и Квас їх Я І мироонаниат созеоикщЕ Коля счче У суфле щі пря призу ьсвІчичі Мер пуз пори тутух хм уча уж ких пихи емуч че Уч пуф ну в их до вКкоччлникі заасиВаЄ сСфссоаасаввя сема зоасваиня КІС КОК вк чевччсеся завад аам впсяссВвоє саше кЯя есвосикЕв Єр е то сич сСечосоас чав так «21054 «2115732 «212»5ДНК «213»Вгазвіса пари «40054 кс уж кети Кф осзгустиуєтивіх у сс кт расу ги СКМ Комоужех і ух Ком кажу фе м можу сх б им М дя чававесщесе сеозсваєс сзавзсвосвко зол скио сеча зе в вУЖОВОМ осуду кіх межонуя мвиемх Ка и НН НН в НН Со ая сс воЕ ссосВозеас са своУ асшосвоазос сс ваа возах шо засос зчазабецаца СозасусеКе сосок виХ осоки ао оз клеоо Ах продук иччіюиу ик ііі як медики ій и фе ахавех ха і уми фею і ие ож р дк дея туд т скзоссскта асСоКекишкеЕ со ККх СозЗиссиКИ Сосна СаБЕкЕЕКСЗ кожи ху веАх кю дю хм ік м ху их ак сім уч пр чи І НН р НИ НИК прут козковтлещ сжококовсх Фо сжккваєсе се заече зскоеки со жив, и уж дж фе ня а а я З а У НН че Ср п у ОН п и р Ки ЧК т стос скщЕсв сесія спе ившек ЗззЕосщше човни НУО КК щини песо сезщСик сосок пасе чи Как жи них ік ит кою ми а нн АН в и ни о и ОН а о КАЧКУ
Фивстесвие червона паска с пбскомае се св чие ки пихи юю Я ун СВОЮ и я ее ру жид р стих пр схо фор п ферит М сте ат прчссвижни срсссесеч сова єс зссзовавЕчое сосок ско сое Се спазвсюоеЕ роко ксвак соззазасожнь заазесчав века паче бом тушки ох й ожУчІ ВИМ сжемухІв У Щи т хо жих у СТИКИ суч ивеж уж щу що д ОТ : зе чани са Кк. ще ї «З ТЕ ре А МАК Кок тав ние я що раси их яке вом У Ко кА ку кед НА о НН НЕ ху
Чисто иа ща сачасное в шсеничи шия М
З пи бух тус хх зацшещочави ви ТЯ «-21055 «21157 «212»2БІЛОК «213»Штучна послідовність «220» 223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «4005 5 ою и З бухе ТІ тТоамх КІ же. ок. хоч шШекх Вер дао іє шех щі ї г х Ж
«212»БІЛОК «213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «4005» 6
ЗіБ цу Її Ава їм ЗМ ві «-21057 «-21157 «212» БІЛОК «213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «40057 вхо ВЗех джр ТВ ем дек Шіц «21058 «-21157 «212»БІЛОК «213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «40058 тмнж дк дек век ЕКО сіє Дав «21059 «-21157 «212»БІЛОК «213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «40059 дк Беж двровів беб Аа Му -210510 «-21157 «212»БІЛОК «213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «400510 вх Шах Авро Вів рес пах ла «-210511 «-21157 «212»БІЛОК «213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «400511 твВх бек беж ех дою Те Ди «-210512 «-21157 «212»БІЛОК
«213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «400512 ока Беж зщЮ АВп оби ів АЕщ «-210513 «-21157 «212»БІЛОК «213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид -400513 І аа дкЗз жевЕ нНіз Беа дія ле «-210514 «-21157 «212»2БІЛОК «213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «400514
Ак аж АЕБ АвО їм Ех ЯМ «-210515 «-21157 «212»БІЛОК «213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «400515 вже дав одіва Мі АДіус Бук Те «-210516 «-21157 «212»БІЛОК «213»Штучна послідовність «220»«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «400516 пів щек бує Ве ев іа Без ії 5 «-210517 -21157 «212»2БІЛОК -213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «400517 дк ск Бар Мі іа ВЕЖ ОСИ «-210518 -21157 «212»2БІЛОК -213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «400518
Зір БУ Вів вводу жк Був -21157 «212»2БІЛОК -213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид 400519 дкЕщ о щеж ео АЮ о бебо СР ОА «210520 -21157 «212»2БІЛОК -213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «400520 їНЕ дек дів Ашю ев обеж ху «210521 -21157 «212»2БІЛОК -213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «400521 ку ес Авр ода Бец о Зех бе
Й й «210522 «-21157 «212»БІЛОК «213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «400522 дж бек Дів бах леза б Аку «210523 «-21157 «212»БІЛОК «213»Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «400523 двюв о їжЕ пек Вам Вк йпув МмУВ «210524 -211518 «2122 ДНК «213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400524 скоса асо тод ее «210525 «-211520 «212» ДНК
«213»Штучна послідовність «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400525 завасзааочсс дедааавщ ки «210526 «211517 «212» ДНК «213»Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 26 зузвизкшщена «(ОО ЕН «210527 «211517 «2122 ДНК -213»Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400527 сиівсесесчо аск я «210528 «211520 «2122 ДНК -213»Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер «400528 шко сода се Ксе ке
Зо «210529 «211520 «2122 ДНК -213»Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер «400529. шевосЗів пабозЗоваша ве -210530 «2115447 «2122 ДНК «213»Вгазвіса пари «400530 аостчиВи спісщеениу щас пос поча св осо си 5 зчивесезчих оспесоовосс зскасоова Єсссзсвасоо соцчоЗоах ес Ек пидесокжск сзазессаоо Фрерозававо зссзаазчен всажоеуско шосе во кас капсовозсе асЕсссКсЗ зи озоза бсасевоеваєЄ ЗовслжєєЕ ша пЕсстуксЗО зкслааскок З ссссова звссозавалоссв заз асо Зоо «кас ес Ес оа чав скщчеочосак ща акоан ас 350 арк аз савасосвосЕ ев сале зоесщазекою безсомиммває асо Зо дадсассзее вазон серия З
«212»5ДНК «213»Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер -400531 всесоЗвіш соссасвВоЗ та «210532 «211522 «212»5ДНК «213»Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер -400532 вчасочоеіа щапсовоссева т а 210533 «211524 «212»5ДНК «213»Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер «400533 н часова есте у КЕ «210534 «211518 «212»5ДНК «213»Штучна послідовність «220»
Зо «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер «400534 пек дааОомок сала вя: 210535 «211524 «212»5ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер «400535 щексвасс пово заиВ осі ке - З ща х 210536 «211520 «2122ДНК -213»Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер -4005 36. свсвкеєвозЗзс вва хо «210537 «211529 «2122ДНК -213»Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер «400537 авсвшнвиоЗ ВсссакзвКи ша В -210538
«2122ДНК «-213»Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер «400538 сЕкозаєко Бапшеечово спас хз 2105» 39 «211529 «2122 ДНК -213»Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний зонд «400539 осачсесаваа павсвзссВває созоввовео ща і 210540 «211523 «2122ДНК -213»Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер 400540 пшкстссасо восчсковВо аз па «210541 «211520 «2122ДНК -213»Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер
Зо «400541 цакскшчесо «Все во «210542 «211525 «212»5ДНК «213»Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний зонд «400542 перссссаз севоспассво аашлшв а «210543 «211522 «2122ДНК «213»Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер -400543 сш сткоавВ асо за кН «210544 «211520 «2122 ДНК «213»Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер «400544 вичечовоак еВ дО «210545 «211516
«2122ДНК «213»Штучна послідовність «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний зонд «400545
ІЗ си КВ ЗЕ 15 «210546 «2115718 «2122ДНК «213»Вгазвіса пари «400546 чаакксоссє сс соавовиоє ЗессОєсах осв оч еаке БО зЕчкакоКеЕ сласчКекос зочевоспаох Ссзсдовс зззвещесооя сбазазадаа ія чеадитеачекс зЗваасссчяа сво ЕТтСсоКесви сЕсвсЕсоо пзавссокевЕ що
Есе ЕВОо суєтбачеєко есе стос ооо сосоаса се ди
КЕКВ соки ЕВеКОоК стсюоВксво шохковОоБо СпосУВеЄ часа Зо. чоЧиссвоКе сссоЕсвозчо земства Коса са соечоозсуєс УБЗсЗ со за жену чЧесчосоВа КЕсссуаоаа соки БсвааКсеає сопе ха шасссчеахЗеЗ засада своск сасозавсє ссроцасссЗ зЗсовасвзево асо з ща зевВ зосвскасВа ЗоссяКОоВ Кссссосоз заслано Сет ща завкссатласс засос Зашпесощех счсЕосомЕВ чую масової Б чес чезча бозасвеечов зазччазаос аеччвовса возаввисесо ар овх ВО посі оч за овосожве сао чеаек Час све азс поча тка «210547 «211528 «2122ДНК «213»Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400547 азвосцесанатччя звис а ср а 210548 «211528 «212»5ДНК «213»Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 48 сао а авпеоцаве зушвесое й
Зо «210549 «211528 «212»5ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400549 сехщррааанив ев ююк ФеВоих ях 210550 «211528 «212»5ДНК
«213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид 400550 звазвавасє пово єю зощащео ка
«210551 «-211528 «2122 ДНК -213»Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид -400551 зле весну шок да «210552 «-211528 «2122 ДНК -213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400552 скссчазазо зе оцеттав секесаве В -210553 «211521 «2122 ДНК -213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер 400553 шила асоо ев осБЕсмК Є ух «210554 «-211520 «2122 ДНК -213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер «400554 ккссвтальна Коен сЕеу о -210555 «-211514 «2122 ДНК -213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний зонд -400555 стсазчевоо вВшсо їй
-210556 «211521 «212» ДНК «213»Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер «4005» 56 зЕКкоьс ВсеаЗорех і «210557 «-211520 «2122 ДНК «213»Штучна послідовність
«223»Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер «4005 57 посевсавсв СоБОосесву ване -210558 «211516 «212»5ДНК «213»Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний зонд «400558 вавстсосковко сЕесов їх 210559 «211522 «212»5ДНК «213»Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер «400559 чсзнискЕЕзча Сас аж -210560 «211520 «212»5ДНК -213»Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер «4005» 60
Зомакиняа Мена мч -210561
Зо «211521 «212»5ДНК «213»Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер «400» 61 вМвожаечссасо муасзовсова тії -210562 «211520 «212»5ДНК «213»Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер -400562 сазан ЄЗЧВОвиии КВ 210563 «211521 «212»5ДНК «213»Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер «400563 меж засваФсоВв х «210564 «211518 «212»5ДНК «213»Штучна послідовність «220»
«223»Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер счоссацекК Коса я -210565 «211522 «2122ДНК «213»Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер -400565 аж КЕЧчОНавкК ов ша 210566 «211524 «212»5ДНК «213»Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер «400566 шашвассочо Бе єак ке вч «210567 «211517 «212»5ДНК -213»Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер «400567 посусея Бі ї? -210568 «211518
Зо «212»5ДНК «213»Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер -400568 чисвсвЕске зеивеа їз 210569 «211521 «212»5ДНК -213»Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер «400569 зазвоскаера спа ЖАХ «210570 «211520 «2122ДНК «213»Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний праймер 400570 кс Фев о «210571 «211514 «212»5ДНК -213»Штучна послідовність «220» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний зонд сказ ссвчос осо ї14 «-210572 -211518 «212» ДНК -213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний зонд «400572 каучук КОВО МО «210573 «-211514 «212» ДНК «213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний зонд «400573 . пащиссвиов КЕ ї5 «210574 -211518 «212» ДНК «213»Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний зонд «400» 74 сао сова ЗВ «-210575 «-21157 «212»БІЛОК «213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «400575 «-210576 -21157 «212»БІЛОК «213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «400576 «У чех ів МіВв Аж був ТЕ «-210577 «-21157 «212»БІЛОК «213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «400577 зів баг дек Кіш КЗ цу ТИХ «-210578 «-21157 «212»БІЛОК «213»Штучна послідовність «020»
«223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид дко Шекх З нів Бач йевк зві «-210579 «-21157 «212»БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид 400579
Зі дай Дів Ні дже бів М -210580 «-21157 «212»БІЛОК «213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид 400580
Зк щек Вшю Мів їм бек Бе «-210581 «-21157 «212»БІЛОК «213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «400581 ців дви із во ОЗ їі тн «-210582 «-21157
Зо «212»2БІЛОК «213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «400582
Вхщ щпаеж дв Ме їн; Бек ОТНЕ -210583 -21157 «212»БІЛОК «213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «400583
Мі деж ба ЖНЕ Ах їм Ба «-210584 «-21157 «212»БІЛОК «213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «400584 дЕз йдех АЮ Пів меш бек сам -210585
«212»БІЛОК «213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид 400585
Бат Бек дів Бест ля БУЄ ВВ -210586 «-21157 «212»БІЛОК «213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид -400586. .Ф.
Фів щШех ЗУ Ні цем Зах дю
КЗ й «-210587 «-21157 «212»БІЛОК «213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «400587 мих Бах Авю дек фа Тл са -210588 -21157 «212»БІЛОК -213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид 0) -400588 « дкч АХ Бій дво їн Бех АЖ -210589 «-21157 «212»БІЛОК «213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «400» 89 вка дек Аюро бек ої век Аме -210590 «-21157 «212»2БІЛОК «213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид 400590 ша юю доз нів ка МУ ХХ «210591 -21157 «212»2БІЛОК -213»Штучна послідовність
«020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид дич ви віз дев Ак бе Бе я ж «210592 -2115200 «212»2БІЛОК -213»Штучна послідовність «020» «223»Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «020» «Р21»тівс їваште «2222(1) ... (200)
Н Н Н " щ «223»Ця область може містити від 5 до 200 залишків "Су «400592
Пі біУу У щіу Піт бі піт піУу б пі бі пі пі бі біт 0іу
У шу пі щіу пт ЧУ Зі 1 У СКУ пі їі СБУ Зі Зі щу зи У т хо Му ке пік щіуУ ПТУ ТУ УК су сх У БУ Сі ЗУ Су БаЖ ЧЬу іт щу де ки КУ
Ме БУ щк аву іт бін сіУ біуУу Бі Шу свж ту і ЗужЖ і біу ОДУ Су Фу що БЕ щИ
Зі пі піу бі біб се БУ сту Зієч бу сі КУ 1 У ск шу ЛУ та зв во щіУу Піт діє іє бі пі У сі У бе су Пре Є У і ше Фу Ку 5 За З с «м жу Ка їі жх Уфа ТУ хк гол тіж в як хм ви Є хх али пух ЗА Тіхх шіу се В: ЗУ СОУ с Ж НК ТІ Кк пах Б; ї р С УЖ с и с МУ КІ У їж КЗ Ж АжМУ що ї05 МІ
УЖ й ху Ми КАМ юк яті жю мі м кс хм хх о єму га су сих тую и ух чу Ер
ЩЕУ СУ су Пух ПАК ше ФюУ У КУ су ПКУ ду БЖ шаж АЖ ЛУ 15 ЕЗО 115 шу ші зу ЯКО СІК шу ЗРЕеЖ зву ОБ су ЗВУ ше ЗВУ п БУ СУ їх ї55 145 ря Б Ж Як я к А ак: ох як в -к й. ак вошшм гі
ТУ Її Її їв
ЗБу і Бі бу Зі зі Чі Зі бі ЗіЄ сіу біт пі Зі зу біт
Інк 179 їз5
Оу шт ку ЗУ ПКУ ЗЗе у Зі бі біт 3 ів пі іх і біУ чі Бр пьж ЗУ й ре БУ сут ї-5 ОО «210593 «21151693 «21225 ДНК «213»Вгазвіса пари «400593 сЕсцацсчо сзскаосазе осо зЗачосовкозкх бзрезени часова Ки зчазазесах Зукедаєсвне заасесшжска сера сода «а свцех в. Мо
Казала чзасексовисв зепсовезчасо ставок Сара сом аслно ко чевасвоїою сишсвоенат ебзавае гас с осо зЄоВвуваєКУу аа «качани пвазеовек Соц соч поета ов. М счааовасек сасзсесках оббесгоВвстеЗ сефрродлаа ск ча ЯК. ащоесчззсв ачоозкоа зачинив можли сеча Вико ща штвевцчосчво «воза сЕБовазчеацоя совет Єва ами васо БЖНи ацасшзазвсеєс ВЕ оОссмеМмІ особове ча сввсдчааево ще ОК Ай жабо воччас сова севесссВас Ботокс оєна поза оє ЗНО сгсосясксв савсЕсвВпов вассвсассВ босвавсеоав ачссоВвкасе якастЗе я во
Ззсосскецев сс кахк зепссосвасо сЧчосекнни ССС Соуси о а
Есе сзаая зЗавсзаєцчеає сорсзованау сша оссеєи сторо асо вах тво зКЕссогаВЕ зозаовоея остова Бест оюва воазеесгстан ВЕ жновоВ ве зажим: засвавссає зозчазкос кочзеуЗооВва сеозеакає загар що ммЕзасвов зсесксЗосої св зчско ЗАКО ЗЕ сЕлаЗ асо Зв теза свя зас соааа ЗаасвЗзасаа асан басвевеаю ох ЕІ сазчосовмала соспаазчоаое сзссвазосо БочосовВсВ ссср свя ваше ОО саваавокая песо оса Фа ек пев несе о звижиозЕсчс завсесзезова чосвсвжеа сосок ксВсссвааЕ восзЗасеиеЄЗ ке мис ссазв савечеаа зчасзосваВет Состчя КоФезаЗа Фацвае ту ТиБо звоезккавазс засос Езков звасесВвекоях зо ек: соводастосо апозсвике ах пече етстскаЇ савасзЗааеая садово сс восссв зазоччекя ЗК: їз счиваччЕЄ Каса сосбовечека сбзекакеЗзос сзавсовасв секс ка
«вссассввт аЗссаваска азЗсесслоссвВ ЗазсовазвЕ ссзекчас озвувдаасее МІпа щзастаназаз сававозсаоє вач кесзча сесазоссесо чоічезавасо СесрдВаєче МК закстЕстоКаЖ зососКоК сен Бексвежесе везе аве себбасваве їв падазазеозс сааасшвасс сессассава вЕсазенасє стіасвочааа вадааавааа 158 папа дав за «210594 «21151767 «2122ДНК «213» Агарідорвів ІНаіІапа «400594
МК спос овісв с«ссаККоКс сссвксЕос соЗзКсрот асо оцЕве Ве
Сервісввавчх сеососкик сечо соч сЕсессОовка счеаешсо їх ссвезКахмє чері ох човка косспусекеве зсозаея аа хво сазлесаекУ ссссвсваєт єззоюцо водервова фзеазовеване баовавсюви я стече скцоЗКсо СазосЗскова есе ссов оре зас За сестосасЕо зсгазсааова содасаакоєВ кКасоЕосКе СОКЕКосрВЕс ЧаВо ЗЕ зи песо Зазио Заазссвтая Фчаавевенмак сечова За сочеом звесавецохь ря часа бомиааващеа заоросоаве фасавзааас сасосевесоа сновоч ес що щиаичкиц свезеакчч запа аваєае сао зако збевассоюов как Еж ен пЯсо часа цс свтавофзса сек зе сзавеся ааавзшекав соч оЄц а ОО шиссспасзо зав чкочЯ ваза воКавВаА фас роода мине ОТ. Ей вавстЕКста аа єчов озвався соски Ссасецоиие але жи поЧекуаКа щезає кова кя зош Скоро шиком тае зиск зоессззоаЗ знана зЗочЕсв зоззецеаї очах Зо воскрес йасовачаачви Чат зак ансКє Кг кавова Зо поБєваєе бішесвіаща Сосна восвуєероюта зок сесвеє близавсеює Зо как есева зе сЕЕКкУ сасуосова коеасосасс всвшасЕче зоцавасє 1055 часа перо сссзЗааса чаю савеачеві дека зо ч«етчовксвоо чис зіва ето вимов меєжацчовко асо 3148 чаксассвас чес х спасе паза есс за Кс 1500 скосзачосвея сеззвоавава чес ашесасчово Зк соц іо чсизкасзана сесабсвосчо спвспавее сепссовох же ки кас ссЗЕ їх зккоЗцасма асо оссву КопсхжачасЕ Єсрзаолаво алабазаавека сова: ЗИ «ее слвасле савчозозвес фра кав: ззоздзасасє зорово оасЧКех і340
Фсстаеаванес стцацовова чав кос зоваваакика пес екс иа 50 зо чоессквК; сеппщНюю чес поль оо сало ЕК 1550 сазвтвксв ясогоесаа КсовувояУє зЗоааЄвнся сбсвавзчекоєо Ве зоачесо 1550
Вова аскеоровх бере Кінах сакесоуєє сезон ове ке вссосяУусв сабо СссссвсВМм сувазовцав поса чеє свЕасЕсова Ел сессбзасеає всвастКОое ча Є «210595 «2115893 «2122ДНК «213»Вгазвзіса гара «400595 чесвроузчаєа тес оповее ссср сеча вежа ве СВ що осстще вс ескЕх совок оКос вепсаочаче Балі ще їж ксасасозова сасчачасаес зЗазчеродавос ссровсеке заавапловов еко ссоцх їв ваксксвии сослЄокснооа зва еки жобеозсет БеВСБочовОо БОЖКО я списки свеЕа спек ЕстеКОо ЗЕ сКЗсх шесКОоКеКИК сзсосзваовео КесеКЕК а зп само боса оноЗ сошОоскосе возоаксбоє чекав евос озеро ЗкО скщесскно «зкоОлсою садово свазакуиом вози еє ще еває жа стзасеччоЗ зач оза вбсвочасвоа засесзесва акзскссосв репер асо ЯН зочиксачов зчскесоЗЕо зссвоскосх Кузачоскк сазксвекас зако чо секс сЗззсоцадо сб ссосо Ксодасозвая ссавця гато ІЙ ссозсЕвосис капесссовЗК зесставове кесассовзеЕо оо зеЕсесуке що ветЗеЕозев зазстчвова зоссЕсаКек кокс аза чЕстЕсксвК сезотя зна зЕзЗеЕаЕКтїх зЗКоззачАЄ ссзаожЕсме ЗасслекМє ані ЄВУ тя скрракоссоа зсссавВЕсаЄ сеавщусеозе Коб асс зе вася. бороваютх 4 висока ов зав ста КЗ Не стачакзаза ази пас ах «210596 «2115812 «2122ДНК «213»Вгазвіса оіегасєа «400596 вхо КЕЕ зпсовхсває зеакассвка Сезсачосва скаже семмавоваКе що
БесссвеЕво боса зиск ссвах КососаааВЕе ЄвеобЗОУКо елевакао їй петеассеска сасзеасоа совок атої сеороКокою шЕВесеОсва КК ї85 шеогавеас дев КН СКЗ кеВ КЕ ВЗ. а сиза спос особа вошерацчадаст зозвсернави япокеватх и амаехМминоМми: зозаавешече зон секс вссК Бех соски ЗО
ЩщІсвКикНЕ ток сесоКсККсх Кокс е Вест сооею сор юо СЯ екшен ща сочоЯ помили совоссишЕем Фе огаюв пев се ща шісссвшое сссоокнвака сосзксавоє сс ссце засос дела савов 380 екс сааай состсрнах созесвЗсає обоз ов песо заказ со а кЕцесВассяс сасСазсваза дончозааоюх сдасЗсоКеЕ собокоскеа давеозаа єв во сосок осз засос вчазЗосазвоек зЗазчссоаосв ВосЕсЕеКк ссссоЗЕ. о зваовсїсоїЕ сесссаввавї сссзаЗКОсЕ ззКскосму сассозесеов засасупасва 78о щи СЗЗ ав азс све КЕ ЩІ

Claims (16)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Неприродний білок з цинковими пальцями, що модулює експресію ендогенного гена тіоестерази жирних кислот В (Раїб) рослин, де білок з цинковими пальцями містить області розпізнавальних спіралей, як показано в кожному рядку наступної Таблиці: ЕР Її 712. 137 14777 15 16 (К 13685 | В5ОМІ ЗА ОБАНАКТ вБООІЗК О5ЗНАКТ вБоНІ БУ ОМАННІЕ (ЗЕО ІЮ (ЗЕО І (ЗЕО І (ЗЕО І (ЗЕО І (ЗЕО ІЮ МО:75 МО:76 МО 21 МО:77 МО:78 МО:79 13714 | В5БОМІ ЗА ОБАНАКТ вБООІЗК О5ЗНАКТ вБОНІЗК ОМАМНАІТ (ЗЕО ІЮ (ЗЕО І (ЗЕО І (ЗЕО І (ЗЕО І (ЗЕО ІЮ МО:75 МО:76 МО 21 МО:77 МО:80 МО:81 13722 | ВБОНІ 5Т НОМ АКМ вБоНІ5О МЗАБЗАКМ ОБОаМІ АВ озанІЗА (ЗЕО ІЮ (ЗЕО І (ЗЕО І (ЗЕО І (ЗЕО І (ЗЕО ІЮ МО:82 МО:83 МО:84 МО:85 МО:16 МО:86 13743 | М5ОБІ ТЕ ВВАбІЗА ВАБОБІ ЗА ОМАНАКТ вБоНІ5О АМАОНІТ (ЗЕО ІЮ (ЗЕО І (ЗЕО І (ЗЕО І (ЗЕО І (ЗЕО ІЮ МО:87 МО:88 МО:89 МО:90 МО:84 МО:91
2. Злитий білок, що містить білок з цинковими пальцями за п. 1 ії функціональний домен.
3. Злитий білок за п. 2, де функціональний домен являє собою домен регуляції транскрипції або домен розщеплення.
4. Білок з цинковими пальцями або злитий білок за будь-яким з пп. 1-3, де ген рослини міститься в рослині Вгаввіса.
5. Білок з цинковими пальцями за п. 4, де білок з цинковими пальцями зв'язується з ділянкою- мішенню, як представлено в таблиці 10А.
6. Полінуклеотид, що кодує один або більше білків з цинковими пальцями або злитих білків за будь-яким з пп. 1-5.
7. Спосіб модифікації одного або більше генів РаїВ у рослинній клітині, де спосіб включає: введення в рослинну клітину одного або більше експресуючих векторів, що містять щонайменше один полінуклеотид за п. б, так, що експресуються один або більше білків з цинковими пальцями і модифікують один або більше генів РаїВ.
8. Спосіб за п. 7, де активована експресія щонайменше одного гена РаївВ.
9. Спосіб за п. 7, де репресована експресія щонайменше одного гена Раїв.
10. Спосіб за п. 7, де полінуклеотид кодує нуклеази з цинковими пальцями і розщеплюється щонайменше один ген.
11. Спосіб за п. 10, який додатково включає етап введення донорної нуклеїнової кислоти так, що донорний вектор за допомогою гомологічної рекомбінації вбудовується у ділянку розщеплення.
12. Рослинна клітина, яка містить щонайменше один ген РаїВ, модифікований будь-яким зі способів за будь-яким з пп. 7-11.
13. Рослинна клітина за п. 12, де клітина знаходиться в насінні, і вміст жирних кислот в насінні модифікований.
14. Рослина, яка містить щонайменше одну клітину за п. 12 або 13.
15. Насіння рослини за п. 14.
16. Потомство рослини за п. 14.
КЕ В мими т Ви ин ні Ша к м но ен х / МН Пластида Шо І ра : Еде з Я ! КА гав і тк ВБІ) | шк і жа ев ЕАЕї че ШИ Дкеаттраня Є і Я ух каві ж мае / К 4: ЗАСЕ 1 АВАСЕ у ко - Ї Я ВА б кі ет і Я нн ж ДЕ ЕАЕЇ ; чай 43853 ЗВІД сен ЗК ТАЙ нене ВВА у зва » ян і:завазмв я навиків Міднх енер жирмнкх ккомит
Фіг. 1 Гени я ВОгВдК ре тИ Прожотор і склали ЯКЕ аа Явав 4557 ява Й 400 вра ЕГЕЕ А Я, В орннононавиноюоюлалолакаогопапоодоагогогогоеснолологадонео горою т і ше и ще Я сх ЩО зх за шЕ ШЕ ШЕ ШІ ШЕ ші ше ші ж ше ше ше Ши і 7 5 | нининнинии І ші Ж сві ОВ Ново вон нн 5 Фо ОКО ве ож В Ен ож она: ЗЕ: ПИВ НН ЕНН ННЯ яеоо0оже ко же НВокоровапалне «Фіг. З в й . їво0о - - шк ! ях ШЕ Е р -. Е а В водо - ї до Ж З ж ЕК.
Ек . «ре ! КТ В аа і ї я | ! ШИЕР бнузь ЗЖРВ зни ЗЖЖКК 1 нухь Вжмічхи ФЧНг. й х х КУ вч - й СЯ й гу о. » Й ж Е, - ща Н У ! . З : г: 1587 я ово ва з. з їй дО ПВ як ї ш х І я ж СВО ї І нь. 3 в в х шо 5 5 СО я 55 го яв В ооо ще М Я ЗЕ Б я ПО СО я Ба я Ж по Конні шт снення М умуннянй ОВО осн случия ит ее Ж ФЖЕР обнов ЗВЕР о їнуль МЕР 3 вель Вимк
Фіг. 5 М В «Е Тра пт с КНТ тя РРО КР КАК кт ккккююююкннї нн и пожіан і є ск с . ШЕ ш й : ні «свою . ее Й к.ІКООх Оу тки неохее ! й я . КУ ко ГБ Х рн Кене й сбвкж ЗМ ВЕН я" о Кк «І ще й м ши п шшШ ш с: Ше ІЗ І: КО х Ще і Ї оитнннатртттнн ядра ревннтнненсрентененентренвнн : зах Я дднняниунятнк орто яресковнюоеоретнскоте БіміхУ ВЖК дику» ЗеЖЕ -нЕ ЩІК Ї Ї хіх ТАКЕ Лихо ЗЕ Мих: ВЖЕ Ї Зехх ЕЕ дижх ! нн НН НН НН М НК КН НК КК КН НМ МН НТК ТК В НИМИ МИ МКК М В НО
НЕ. 5
Ж з аМезчавІв ЙДЕ схе юю долю янв юю х юю т т ж хх хх лк кох хтю т з ххх тютюн ве ТО ЖРТЄТСТСТТСТТСТСТТСАСОСАТТТСТСОсТрТсТостттОгесТс соноенеке ї1у ЗУ У ЕК ка и а а а п п а и п м а а о о се же а Я п Уа ик ее с коле хе ккклукУюки оч Км учи АРІЗБ3О (Б АТС ТТСТТСТСААВОССТСТТССТТТТ т ТОсСктТотоВТОС Коен ІІ) Що з3ої їхо АЕжчаБиВ ТЕ ке в В С ОК ОО м ж ж м т КВ С КК а КО ОК ОК СО ЕК Я ЗЕЗ)ИНУ; аб Р СКТОСТСТТАСССАТОТСОСТТАРЕТАССТОВ ЕТО ТТОСТОСТТ САТ коневноге КО А вай агави ї м а м а м а м и м и в и п в и ке їахо? їіБ)ЬЬ ТОСОТСТОТСВСОСТООАНОАЧАТАьЄССТСЛООСТОТТИСТСТІСЬАТе КОНОМНеуЄ ЕЕ и о кв 35а щЕ244525 й) сяяжжжяяат т тт яю жу тт тт таж тю хх мою юю тю вм уз вЕЗ1ВЗ0? (301) тостоООосщУ осв АосвосвОстТІВосАВАТОСТОТОТОВСТЕ Києвнує 3) ах ав аКЕЗ1аЗ бІ51і ста тТеСоствОса Ас тетотоАе т етРТ т ТОАТТют Коновнкгих: ч51і з За вка авай фр стю тт м хто ох тю ж жюю юю мож ж ж кожною тт АРІ; ї302) ОСТТОТАСРСАСТАСАЛСАЛСААСВАТОСАТТОРОРТСТСТОТТ ТОВАР Хансен а) звх по аРІЗВ3О? ЗВ) ШААТАОТОТІТСТЕТОААТССАКАССАСАТО ОА ОА ТОВ ВУ ТУ Кенккноу ТЗ та оф ЕМ «в че Е : хи о ниж ни В и КК В дЕзчанло Киві РО ООТОВАВОВС Є КТС ТЯ КОСМОС АказВ3о? їм ІВОСтеоОвтоюм» - "ПОСАТООСВЬОВ- - "КУКОВО Мо салют Конезненс зоз) ве РУССО бОСАТОНС аг ЗАТВ КТОСАЛАЛОСЮАМК ТЗ ав ДЕзНаАжаЮ (ЕВ) с о ОВ ТУ КСКЯ жорж т к фКЕ ЕКЕ М Я оо ох ВУ хх кивок хи ик кару ую пу в о ск рожі АРМ яєх ТОСТІВ о с А ВОК АТАК Жовиовноує ч3533 ОП АСВА АВС СОКАМИ СО МК ОТО АЯ Ба ва Ежен зв КОМУ КИ Й В Ви Ех актах я НЯ се Кк иКиу кож кох боже к сюив вр ум ж кох ку руч соски; ж Ж ото нникя Уфа ее АКЗІ8307 1984) ІСКТОСОВОТТЗАаМКТ А Корова Кововнеро Ї501) ОСАТОСОВеТТОВААСАТСА Ж ОТМАТИАОЄС в ОАССТТ ТАТОЛЕ
5. Ка : дви жк ХК тка фс КО ОТТО КО Ко ти ми хв и ЕХ АЕзЯаЯІо 0 сн КЕЖНОСТАЄТ М АКОТ ТТ АОС КОВАНА ВНККНЕЕЄ ЇЗБЕК вт т СТАЛА СААСАСТ АКА АЮАТТОМ ДАТТЕТОАТТЄ вкзаавао гаїв» ПАКУКОТОЧ ОВК КО МК ве КО дЕЗаЕЗО? 0 (В94) ПЕСОТОААТЕКОСТАССТЬАСТВОСЮЄО ВО АТО ВВА ТОВ Коневнеже (01: ОттсотО ОТРОСТАЄО ВАТНОЮ ООАСАСАТСАХ ТС «і ТО Янг ТА вЕзЯЯ БЕЗ (ЗЕ КЕ ВЕ ЯКЕ ві ВАМ ЕК ЕК МВ сх атозо? ве Том п шен Консанея: у НМ НА МНК АК росія і М с ув В ки А ре ; мовне е5і: ААНО ОК Кне ПТО ААА А ОА АКОТ ММ; УК я и щи ХЕ ВАТА ке дяк сек о: ФМ ИМЯ ЖЖ КЕКВ КОЖ фе А як ТОК пнів вт КСТУСААААСЮ Бе АК шаг оч: а з3в оту подо зкеч аа ТОВ ух: Жир «тих хх З А дж ик с сі не МКУ ух. ее Ка сх Те Микжене бе; ТАТСТІСТСАСТОСТОСТЬАОАя ми пе гугл х ТАТА ЕХ АСВ тато Уго Кк АСИОА і а АСК За тост Ка : Уух ЗК МА МКК ТА ПО ЕС СПО вик дк : Ще : МА ОК ЕЕМЕ У ен КЕ а НК жи нка дююкеннний с диф ші ефе фе зва 0 КЕКВ тя ри жк ит хх З З ЗУ ОКО песо ла лат МИ "ває Акжіваат ні вав ВО он її КК Я Коневажиє сте: Ен ТОАСААЛАССААА т пен Нш я ЕеБОКНІВ КО З жив МЕН Зк хртеах а А пана дкгчаата ен ко нн шк ВЕійаот сер УЖ ши КАК М З Бр вед М ЕФ ухху вана о В тет танк км Я еВ. яри ще Ка МІ ОК Я у У ие ч че Ве лю ОТ уч Кі ке УК Ме Б ж ее о Мт ОТ Ас тАНТВАСЮ ОА ЖЕК СОВА в пАСОА КОСТА сна ме в ТОК АТАК В шо М у Межа ЕХО зов ВЕК ЕК вООАТО ТАКИ У их З как ЕХ Я скккккидиди, ке В З У В ма : 5 за гав: прЕеЕ КК Кк Ккк про опр кока ТЕСТАХ. В. акзівоот Ве; АТСТСТТЬСЯ и ще ЦЕХ г. й Ох. ім; Ук ря КІ у, КС ке у рено хх як тире хе е я ; Консенеме: (851, Бек петАЄ кока Кк АТОТОТТВСАНОВМОАТАНЯ че ан чена к Яй Змі ІАЕ ХХ сен УДК КЕ КаСЕКНя ЕВ, ВОЛЬ с вата ння ОК КЕ КК КВ се КА х аааеао СБ ен Кв що п ВВ керівна Н ЖЕО дк ПЕК, пом 358 Між сно дока ек кН ке сновняяє ОО з01) СТОСОТІСТО СТАТ Ост оосАт пня корка кі ля пе жа ЗК, "БО б Ко рук дл зе ще щу ПОСТИ СМ пе а ВАВ мов Елі Й пане БУ ле их ож і Сежх ех зх кн я шу ми х КУ сшая на син тт МИ ДеВІнаВУ Но ВТС, ОКО ТТО КЕКСИ т о; би шо ях ло тр ві о в о ЕН у ВЕ, іа МІАКСЯВ Ое дО хо ВА те Енн ния ВАМ ЕТО Е се вико ЕНН САДСТОКТТИТОЄ псмосьаст тс МИе Ач гех8 пу те З У АН з зав що ї її х сх гНВ о К с- і ше о й | 5о ших Ре їв ОО АК КІ КВ го5 дкзіазоз ВВ самотня ен ще Хонсю (обІ ПЕМАССА АК МИМО МЕМост вдо тет о сто ТОК Чо ААКСАКА УК кК ков сота то тет тою зе ек ши апп УКВ с тиж ДДМА, хм . НН Жим й ум Кук, це НЕ УКВ аль у ща й о Авітаза сідав о ве панам С о КА ЕН тжкдяжи ВРЕХ НИ ЗЕ ВЗА ен КУ во вч: ; свя я тАе ма і йя КН з ЧХ руно І ТЕ ОК у: й ко КУМ ЗК, У кхмо ко ухух м М є щі х КН ее ср ней Миженсує (5055, ПАТ АТТАТТ КІТ ТА т ТОВ т шен м ен Ан пт тоттосАтоСов АгзяяЗаа ІВ) ТА пкт Ан Ве дкзіа3а? ОА о екфеккх ва вс кох ; стрий вза ов; СТСТоТОАСАДАЄ а а повних ЗК іа МемкунеКК з ЗЕВСА Кеш мя МК ТВОЮ тн м в пСАСТК СТО ЗЕ Кз ТИНИ У Ат осАсь АСК Ю ск З пев ше пон ш-Я Ме зва нав МОНО ОО ссттттьньнКоо казав (Я рН й РУРЖИИЗАЛХ. пр оф о З Сом дежівжат (міяяі Же КОТОВ ЕТ ОКА ОтАСАеВОКЕ МАКИ о ее НН УТА АТО ВЕ есе ве пе кети (рії Кк КА НВ УНАТОКИМЕ НОМ АК МОДеККОх 5 Хо ТЕПАСТК іі в ах соАсАТКН т ост АоотасАв с СТАСТТЕ вона кої 1251 пн в левова ТЕБЕ Ко ТВ: ОН МКК а АХ ее ТерЧее. хежіва КІВ и ков че оо МОЯ 1259 тзівот (вн) Покрокове сне кА КОН НЕ КВ осо о о ЗВ тва АВКАЄ Мей кажи НИ КОМ з ВИК КАК ет вх КОХ МОКАЛАСИОЄ ІСІ ВТСТАСНОВ То то щу ОА КАЗОК Ан ВАСЯ ТАКЕ дея 5о гак ЕЕ : АЗОСТЕКОВАЛАЛОКЯЄ а Не КЗ Я ВЕ І ак ОМС ис шк що і о Шк т дез дез УК КЕ КР КЕ ВК 1300 Кансвееях Білая ГОСТЮ ВАК ОО КК ще Киневеерю: божа З зосАОТТТСАСАТОтоАТОС я іспити В ТО ооутевеАВСЯ пато Ас осот ц я з ТИСА НН. йо ЗА ТОВКАТИАЮТА 2 ване що ВУЖ
Фіг. В
Е жк фишок ов ооо КЕ оо Зо е оо І Вк венавів о ОАЕ ВК ВЕК КЕКС Ветоя жЕЗІНЯОт ад) ЮСТЗАТО РОСТОВ тТ рута то олова ювт остА о Кукенує ЗОБІ сесСтОдАтТОв ОСТ ЕТ Бак АТ МО о ек КО 1355 1409
. а М : ж ч В ох гм ВКМ ХО УЖ ких я ОО у МЕ о вказав (ЗВ) а а ява ре в ев М ПАКТ ВААС В АРУІВ3О? ЛЯ) ТОООАТТТОСВА ОА Ат кт, ХТАКАТОСАСАТОСЬКОСТ В, Консенеує о г1З5ІЮ СОМОАТУТОСАА ДАКОВ АТАВА ТА АКТА ХК Мах я с чи г су Вени В У ке На и КЕ и Кен Актяаявоо (3018 К КАЄ АВ АФС Ен п прзаващт пе БЕК то слав ОСС АС ТОМВИСЬТООСЇ Монеанеяв зей ою є СБК ТАКОМЬ Тхосввюее От РЕБОЄ зак тав ЯК АКА ла "ква гав ЕК ВИМОВА ВА МКК КК В дЕЗіаєло гьоєві ДАК СЄТОКОМА ОСС Е КООКЕе аеяіВЗОт 1649» СВБААТОСТОДОС В АВ ОСІ А АХТОСАСАОАВТСТАТО АТ ОАСЬСТІІ Кожен аБІр суму Мт В АК ЯК ВАТ КСКАСАТАТА ТОК АСАЮТ сквктох дове тк "ев ІБОМАИШКИМІ КК В КК Х МК нижня деЗаЯа8о 13518 пк ан ен ен акзівзот (489) Стос тєтовас ок рю т есАВСТОТОС АОС КАТАС Конснемо сії) ЧОМ ОСС ОА ВОМ СУАКСКМСМИЄ ва ї55 і і50о кад ва інв СОМ ВК КК Ми: М Ко Ко В дрояевто зіва) ПОХОВАНО а ЯКО ем ВвЗВанаУ а54Я) ДОАСООСАТОЮОТТСАВОСААКТА С ААССТ ОА ОСА ОО Коновноує іх Ю КОН КООО СК ЕЕКААВТАЗАКОВОСВ СО ТОСАОАЄВ ТК 1503. іа «уко о т їй ж ооо ек ск В у о оо Кк о сн о Я арРОогаВлО (ЗВ пок п се сов ЕХ оо дн и ва ов С КИ ве Кономеує ті стос касьа 0 ТОК ВУ КИ МИЛА ОСТ КТ шин а Й В й с и од жикнк кн рову М ЕВ «ж Жкзі8307 (ї544) ВОСМЮСТТОТСАВАТТЄ ВТО вО ТТ тсОТОост САТ ЬАСТОСВОСЯТеВ Конезнеє (1653 АОСАЧЕСТТОТСАААТТАТ КОТОВ Св ААКТОСАССКТСХ 17 1750 В й Я К ЕХ і. ї як рек. ЕВ я у ви вкя вка Езо пан; ПОНОВИТИ ОН лЕЗіВ3о? зе ЕЛ єтСтовасваво с о ва св ЕООТтве оса Комсвнемє Із РЕ ОСТОСКІАСААСТЬАНК йо СА УТА ТОТАСТОСАВАЄЮ Ії 1599 нео ке СЕК Ам, М КАК в Ви В рати кл прав ВУ дЕЗаанІВ ізв БЕТОН АЕН КВ ПВА АВОВАСТОСОСАТИТТАТОТУ аЕЗІВОУ гіт7Я4; ПОМ ТОККТЬОСТО С О В хнннняняня жита кня Каноеневи са СВК КАСТРУЛЯ вах їв АРІЯа:ІО чібі ЗБООСОААВОХАСАСМТ РОТ ТАЛАСТАСОВАОАССТААОСТАЛОТІ вЕзіащу ТЕ уж нн и и ЕЕ Кене (ЗВ аа. | о 1900 вРОва5ОоО сі965І ТОСТТЛОСАТСЗАОВУСООТТ ОТО САОАОААСТТООАСАЛВАВАЮВСВАХ везяЗе ЕВ п и а а и м в ни КЕ я сепжелтеви (ЗБ зас 15353 АБФЯаБОНІ ТІ БЕБЕ ОБТАВШОСЛОКТК ТТ КУТ ТАМСТТОС КОТ АТАССТОСТТОМУТОААТЄ БЕЗЕ ЗЕ ховаю юю тюх м юю тю ж ж вою ютт м мова ж юю ж мо Коненю ОСЗЕЮХ ів зок м
АгІЯЯяІо С1яяя) ТРА АОЄСТТТУЄСТТТТТТСТАСТОТТТСАТТТСТАТРТОТТВАТСАКХ ЕКЗ Х т Ку ІЗ Х се ча и м нки м п и и и м и и и о 2055 058 АКаЯЯБОИ СЬБІ5І АСБЕТСТОВАААТТЄСВАВОСА ТЕСТ СО КТААВТТТВОТАВСТСТАС ВРЗ1Б30 ОК УЕД) селення тт яння яти Коновнує із 3853 ща АРІЯЕОО (1665: АСУМАХАААЛВАХААВАААЛАААВАААВЯ АЕЗІ1В30 грі; яехихоеюхасююхвюхаттт вити Конениує о схоб813 фіг. 7 ще 5 вес Її З 13ї поні ев В В В в в в С З СК ОК КО С и СК А а дез їб а йфрояюняняяяюювтввттюжттстихиютхюхююи тт ттктютюттттттт 8ез ІВ 45 (рр яянежевваништутичютютюхкх м тт ють тттх тт се ха Т1Е и и ж и ка а а в а о Мета її В озожожох ож ж омех ох се дрхю лк хо дхоля пом поля здодя зол мо моде Але, п яд пд обо се ст с ост сі здо до зе тричі что внтаЗО 11 АСООСАСТРТАОСАОССВАТАТАТАССАТА МОТО ВСТАВ ОосОТАЄ Коновнеке тії і 100 Бах То ЇЩК сюлжхоюжжютмжю тт юю тот т тю мот т хх хх лк хх хх хх хоч хх хх хх ля хо хх ххх моло мм ще ІВ Кс ЕЕ вно п о о в в в п в С В В КО КВ КВ А ОА СМ КНА ОА А С К с НК М О ККО Ж І 2 ї її з льно о по о ла В о о в Й В В В п о в п о м в п нн о в В во 451ї ффрожюляжжжхжх тя тя жи жит т у тю тт ж ю тт тя знтУ3х0а (55 ПАУЗА ТТТ ССС ТТГ ТАТВСАСАСТССВАТТОСССВААТТ Консенеує 5 зе їв а йїрфр янеятянтя жити тини тт тт ж пААттоосост Яви ВВ 3 ЙДЕ ся м уж тт м ж тв мо лксюю хто еВ Вр зей її? їі схежжжкчухтутетитннунютютиу тити ВСЕВзакі ЖЖ для ж тю ю жю мож хх хож охо жо вою мою ж же свое «ВА ще ВЕ ТАН внтзазояє (18 ТАСТСТОСТСА ТАКТ АТА СТАН НК ТА Коневноує МК ОБАТТООСОСТТ Б я йеФ КВ З ТЕЗ ОДСМИАЬ я КАК СКС СОСОК АК юю ня» Беч КВ 8 ТАЗ СОС. я ТОСПААСАСТОСО ТОСТІВ ТВ я тю Веч їб Я (33 КОСОЮ МОСОАЛСАСТОСО ЕТО СТО ОСТ ТОК ТЦадА ню асівз4ї (Б) І а не ее вита ав пе фо ст АН ТОл ПОМ ТМ КА доАюю Коневнеє із СОС 0 ТОСТІВ АВА Бе Щ5 З Ї53К селен ій яким ВКМ АТОМА, Меч ХВ 8 і пдооАте ТАТОТАТСТЛТОВОСТ Стос АСОАОТТТЬОЕСАТОСИ Шез ПО ЯЕ (БО ТТОТАТОТАТОТА СТЕ ТО Воо Стос ВО ТТ АСВСАТеСА бе ТО 47 о подо мн асівніої 3 те А ТОВ Р СС КОЗС АС КОТ ТАСОСАТОСЯ» виз235о8 01356) «ТЕО етос осо АС Консенкуєе 20 ОТАМАН ВОАС ССО ТІТАСОКАТИСА ЗБ що оо без ТО бво3 МАСОК ТАОАО ВО АНА АКОТ ОК ОА НО ще хр а 155 ОАСОССТООТТАОВОАОААОВОВОАПАТООАОАТОО АТО НОСА зач 2 я пої: КАСПОСТОТ ТА АПААСА АСВ АТО ФАО и Їй) сехнкннттнттннняннн нен пнн нти пяти кня ня ння хсіваеві Бах ФСК АКВА КАСКО ВАК ВВА ТТ пев 12452 тарою в ос пов чаваоа нваоя ба мот йон Кезовнеро іі САСОЄС ТУ ТТ иАВОВОВОовОАтОсОвтсОоАоатОа КО Є ЗЕ зве
Фіг. д зе їв 3 0 би» ПКЕЕ АК ЕТНО НААЯ Заз ЇВ Я 0 (45) тео; СТОТСТОТСТОЧТОААТСТСВТ ТВОЮ ВАТ, Беч ЇВ ЯК 555) ШКО КТСТС ОСС ТО ТоААТСТСВ СТРОК ТАССОСЦАЬНКХ зе г є ЇХ сонники тенет вно никненя візаві 158) й нн ВиктВ Взяла Ж пад тя « ААССТО СТО ТОД Кк СОСТЬАВАТЕ КЖонженеє 0 бЄНКО РСАВНОЄ СТБ ТНООТО А АТСТСАТ ТС СТАЄ ВОК зі зва Зер 10 3 085) сот потемяМ тт Зез 10 4 бї94Р СТСГОБЕСАОССТТТТОТОЧСССТ ОСТ ее ТОСТСАТТАТТТЕСТ Зет І Я зобі СТСТСТЕСМСТЕ СТО ОСТ САТТАТТТТТІ Зещ ТВ У ЇЇ) пен нниннанннннвен тики петель всівзекі свові ЕЕ ВВЕВЕКЕС КВК Коти ТЕКА КЕТІ Хонсенсуе (їзБЬР СТСТОРТСАСССЕТТИСТО ото стте 00 ТОСРеАТТАВТКТХ Я сотки Ше перен ременя поч кос ек хор оз газ РОБОЧЕ КОКС САВА я КОКО йдеш Кб а 004240) ОТОВТСТЕСТЮТСТСТО САС ВО М яння ТА ЗАТ Яза ЇВ я5 (346) ОгООТСТІСТОСТСтот МАКС ТО КСЕНЯ я ТКА Жеф ЩО Я? Ї3К ххх ххх хо» хв» » АОС КОЮ» я хх ТОК ЮК асівеяаєї сао СКК ТВ ОТО ВЕО вок ТЕ оо ОС тто внтазої (3тль Ве НСТТСПСОТСТН ССО ння ст ВС хто Консвнене мі: ето С ТосСтеоти в Бе ст восАСТЄ ЕЕ АНЯ зва їв 3 0 (37? ПМ ОО А КОКО ОНА Ява Її 4 00 (За стовото сте тТотСтигАСОСАТСТОС АТО сВОС Фе ХО Яй їзаз што САСОСАТСТСС С ТАТОСАССТО Хез ї0 47 и КИМЖЖММОК ГОСТОСОТСТІО М ГАСОСАТО ВСТА ТОСАССТ ВсіняяяІ і305) пТОЗООТТОостОСетютт КИ АСОСАТСТ ОК АТО сАСС ВНТ23504 410) СТО гаСТОСО Те СТО АСОСУ СТО ТАТОСАССТЕ Коневнею їЯ5іР: КОТ ОЄТИ ОН 0 СТЕР ОСВ ОС ЄТАТОСЬСТО Шеф ЖО З ее) КИЧОВННВО ОО КЕКВ ВВ КОМИКС зва 30 4 Я: сттов СОС ЧСАТИ ТОВ ТСТС САСВОСООСООМО ВТК хе Шк ЇВ «й 33 РРО ї з ТОСАТОТЕСТ СТ сАООЮС СТО ЗК КСО Ще 10 47 іввк ото цес к ТОСАМС Тетерраоасоссовав сх пос і: мівзевь 353 ЕСОЧЕ ВС СС ГОсАТОТОЮЮ СТО ССАСОВОВЮССОВ, ТАК СФАЄ Ваза їаяті ЕТО ОК аа Та овен БЕК ЖЕ Коновноує івозїі стТОтОеютТисєтєвА ОСТ но А ТС еф ЕВОЗ (ЧИ ААВССЕТ ОСТ ТСТАВЕСТАСК КВ КМ КК АН ОВК АКА Шез ЇВ о 3 В3і я КОгСЗАВОЇ САС АСАВ Ява їб я5 13йз; дАасосСуОТСАААТСТАССЮВОСОВАК ТС ОТО ВАС АСААСАВ Хе 50 оя? 0 138Р ЗАОССЦТОССТСтТСАВАТСТАСОСКОСОВАСТЮЮТОВА АСК АСВ с всзазяаєї 403 МОСС ССТСТОЬААТеСТА В вососАСТСОТОЮвАЯ АоКснАСА ВНТОЗБОЯ 50? дАОСОПЦе юн нх н ДОДСВО МКС СОАЛОД ОВО Конзвнеде ізжї: АВОССОТОЗСТСТСВАНВСТАЮСВО ВОВК САС ВО 583 во
Фіг. 28
Бе ЇВ 5 Б СТСАС АЛАТОСТІООСТСТТВСТОВАТССВЮТ г» «олвносві Заа Ж 48 00439 сс пАвАн ен хи ие вжи т нем Б-еч 3 47 зві СТОАССАВАТНСЕ» ях» КРОВ АТОООТАО о хх свиня ВОЗІ іа; СТОАСКАААТОСТ дет жчкття том «КТОСАТССОСТВоЄ лист тея саоаг БИТЕЗ5ОЄ 522) СТОООСВАЯАТОСТ ен СТОК СООТАОС А ТСТОВТО Те Коновнує аз) стсассАЛА ОС КТоАТОСООТВОЄ з їх Є Же Ж ОЗ 0 (Я53РЮ хе САСТАСТТСС ТТ КОСТА ТСАЄТАСАД их бБвеа Ї0 4 (479,5 ТСТООТОК У ВСТТОС ТТ ТОЦСОСТТОСАКТСАСТАСВА Де няння без Її 45 (468) пиши шах ТРЕОССОСРСААССКСТАСАК яти хеа ж 47 (ЕІ як «ВАС АСТТОС ЕТ КІ ОстТтОСврісАЄТАСАХ, шк хх ххю всівзяаь 049 тет састАсттсо КТС ТТОСВАТСАСТАСВАТЬ ххх ВИТИЗ5ОК 0583) яння» Ше. Ії ГАК МЕТ ТОСВО АС ТАСАВОАЛОАВОСАВОХ Хомевнеує 5 и сени в ос ши Ки ! Хец ЇВ я (487 «СНОМ КОСТОЛО ОЦК КО СВКОВ Бе ЩОЯ 53: ее ОСС СТСТО І ТООВАТССАНСТСТОТТТСТОВ С ААТООА Жеч ЇВ 35 1502) --- ДСС СТЕ. СТСТОІ ТОСОАТООААСТОТО ТС АЛ ВООА дев ЩІ 47 (233 -- ОМ ОТЮ СТОБСОТТОСОАТОЗВАСТСТОТ ТТ СТО ОВС всїваані 134) «ДОСІ ТСЮТТ» СтТОРСТТОЗОАТОААСТО ТТ СТО ВАТСОВ ТТ ОЮ (537) дАФОСКАТО ТВ ОТ СТ ТОВ оВА КСО тот Ст Ук гО В, Коннов Газ ОеСТІЯТСТІ ОСТСТСТТОААТСаААСТСИВІУКТСТСТСАКТОМА ЯЗ ст у ет сере не кв Зааз Ї05 3 0 (533 ПДФО ВК КСО ЕК БЕ іш ее вив Ен Без 20 4 00 (554) ААКСВОВООАОСК МИ ОС я ще КтССООТИОЛОосАОЄ Ябетх ЇО 4 8547; ВАЮСАВАЄКОХ товнтсі Зо хост чи тссостюовосває їеа Ї5 47 0236» БАССВОВОСАЗО т ТОАОТОВАВЄ гостА стр стасттеовотовлОСАВС всійяябІ (573 ААССЛОВОВАВО ТОАСТООВАОСТОСТАЄТЬ СТА ТОСТІВ ВНІМОБОЄ ре? АВ СЛОДОСАНАС ОА КОАОЧАЄТИСТИ С КОС ООКМВАТЯААСЯЕ Коневноує (781) ААССВОДЕОМОУЄ ТИС ТКС ТОСТАСТОСІ ЕТ ТСКи ОО Ве ШОЮ (ВВЕ Р ее АТО ТКОЮЮАКОВА КІ А ще Те ж (БВ хе ВТО СТОТТООЗАТОЮАНЬЯ СААВАСК ВКА В. всі8а453 623) ВТТТОДо» ех оВАТТНТТТТОАТОГО ОТАК нт вНІІ35аЯ ра ВККС Аевіт о и Козовноре іа) ЄС АВС аАТОВАТАа ТООБАЛьООЬ СС АВОМЕ Якою поттонно - пут В, бец Ж З 1558 ЮАСВАСТАВОСТОЄ ОО. «ОПО ТЗ ТОТСАСВОЮЮВ, де М Я (651 ПАСАКСААВОСССОТ СЯ пара кеш ее ОТО КОАСАОСЯ Зеа ТО ЗБ (633) ВАСАНСАААИСОСОТНЮЬКИМУ я й «КК ЧАСАССВ Ме ЩО 45 00 БНО ПАСААСААЛССТЯ ТКС АОС зе сх, асі1вяа5і БОЖІ БАСАКЕСТРВТТ ТО вих МАКІВ ТО СТАТОЕ ВНІ2аОЯ 0 зі ЮАСБАЮСТРІО пис песен НН Комоенере іа5з, БАСЗАСААВОСТСТЬСО Слеєвосо бООтестотОтовсво зах вка чні. В
Беф ІВ З (868 ПОООЛЮТТОАЛАСКТСАСТАНО В АННА СТОАСАОСТТТТАТОВКАХТ Без ЇВ 4 (ват ТОООАТТОАЛАСАТСАСТАОЮ ВСЬО ВОК кяжж жк аа ТВ 46 (Б ОБОВ ТОМАСА ТСАСТ АВС ВВС СОТ ТО кю Бей ЩО 47 0 Ї4Щ3Р ТОЗОАСТУОАААСАТСАСТВООТ СВО ОСА ТТ ект ких всійзаєї 03 ВИК ва КРИ КОСТЕНКО КОВО пАСООСАААСТЬТО ВЕтаака ії 53 схожою юю юю тт с сх ххх т т жи ти хи хх мМ Ох хе хх ик ж дж кмуж хм ххх Консвиоує їЗ0Р)Е ТООСсАСТТОАААСКТСАСТАОНТСАВОСОССААКТ І че ЇХ З (ТАБЕ СТОСТАСАВНОСОЮаАТІС няню жк ххх ххх Бе її КЗ їх и п п р и м м и п и п и м р и п и п и и и и и БЕК хв 46 Еш Жов вх хх ххх дже ххх юю ж ок ххх Же є юю оЄ ех ж жк тео тю вх дет ХЕ 4? ЯМИ осяонснжюотвюю мом м моде ххх юю жожж з зв ою м мож ооо мож мех ко хх ох дк жує тя чу екю сів ТТ СТОКТТ РОСА ТСТСАЧСТЕААТ ТТ СААСТКСА ТК СТКАТТКО ВХ витиЗ ЕК у НК в Консонсує ее У МИ що Зез5 ЗІ 8 Ж юю тютюн юю тю т тю тт т ж ж ж ж м мож мою мовожоюок Вей ІВ Я ТТУВЗУ схе юю юю ох юю юю жожю ую т тю босу ТВ а кн и В еф її 53 184 дк т як юожю жк - - Асіз8481 Ївж5Р ОТАК ТАТОСАВАОКАСА КТС ТАТ ТТОАКТСАКТАТТОВЮСЄТСЮ ВУ вит:заа4 ГВЗЗЮ сяють т тт тт тях тт де хо Я СЯ яХОХА Ж ОЖЮ ХА ХА М. МКОО МОМ АЖ В ям КО хАОЧАОМ. вза їв 45 (ЖАВ жяжжжжжж жетежютюх еф 5 7 а В Її сш жу се єю бе же же Ж Є є сЖ бе жк ож жк ж хо воза сачї5) АТААСОАСТАТОКТОАТАЄ вниз БЯЖЗ ї Я ж ка и я й Коневнеує СЮ «ріг. З яке Я й У У се НИ В.
5. Б т 5 вит Б... пов ! о вах Ж Ж і їх Ки ве с ЖЕН І ШИ гео шк М М В, 5 що Вас ос вв ВМ: КС Я ех КС: ІНН я БК и о о 0 я Що я м ШЕ щі хе ВО о В ща М ПО У в Оу с ШЕ ШЕ 5. Ко ІЗ КОНЯ ЕЕ х СОЯ ВО: ї - б й у ППП МИТ. ТИПИ Я ..........- МНН ік: ДИНИ ї в.п ОВ аа ВВ. горесес ВВ почерчнни ВВЕ ДВ, --к я й 4 х о) Контропь а ще Ява Нвмер коневі А
Фі. Я па нн х во Б та зве ХЕ ОО ! Б 5 ! й ЖоОЖ ї Е Хо мій І ! ще я : о ЯдВЯ кт Ів Ж ОТ ж ії і вх й; МоОке зу 3 зве: В 3 В КЕ З ке ща В ши и Якя Щомх : ПИЙ дош шо Я МК : ПИВ ЗУ 1 В ВО С в ВО г. 2 5 Ії З ше ши шНЕ В «1 В 5 З в їв. ОВ а с: Й КЕ | в За о 5 | в й НК Е ее Я нення ПИШИ, Косдине сх: ІВ дор ссстх г: ВДЕ же ав88 а а 8-о махи Брунер ке УкВН СТЕ щі: т. «нг В
Ж. ЖЕ іх и пд нн З ЕК ин НН НК НН НО НН НН В НК ш- МЕЖЕЮ : ге ї д НИ ж 5. ї Сн кн кН НК ж ск КА сх, ї Е | в їх З ВОВК дк» я В син кН що зе о и за -- МОВ око 28 ЗИ КЯ Со г Я пе нн в 5 Б ь, а а Е Я ще ще я НН я г нн нині, Ш-н НИ ще х - й Я ї Й ПДЖУІВВ. «б оооосоохотроююютоох росою росою сорок орососос сосок оссюессосс тири ЗлЮБНЮ КМ КЕ М БЕН ВАКЕ НО Б кОБ ЛОЕ НК ЕЕ об З КЕН Я В ьОВ ТУубун . фік, 11 век ДАТА А А АКА кн тттт танні іі ЖЖ кю ссв З З ІЗ я З -Е МЕ: с КК овикех і ! Ме 3 гу хо : я АК пт др др дннння ж 5 сво як ск Е Шон кс ши шк у нн х. ї з В. - М 5 В . і : с ще с в 5 жа. в !
х. ї ве пу онов КЗ я Й З с ння ре шов ши шк в ши її в ї -- ВОЗ их Зо ЗОВ ЗВУК З От Е й Н Я ее Кос ех ; З - ее: Ве Жак Кун конання НН ШЕ и В ТО КЕО УМ ВОб ОНиНжжКЕ ТО зеюою ак КО ТеБудін (-к кі
Фіг. 13
ДИ дик КАК КАМ М м тео овес З ско. | Я рої Е ІЗ ій : й Кк 2 1 Шан й а йо зх но ПИ ШИ: Й -Є ! вс ши, Б : звати Контроть Зник Фіг, 13 СК МАЛА ОН « а Б ся Х х у сно ши - я - ти о Е: - ом «тт» В шеф Жкоя Бо и ме Ше най нні З Я 5 Й хОнди ай я СОКМоо зе як чай Я 7 вав. 5 Е оду в . аво1-3ааЯЕ Канфюль І Зюок :
Фіг. 14 жк В 7 тт щ. в сл кн? ня х їі Що я ! І й ! ! і в ! я ї ик и о ефе і
8. ; «Ше Пав рс, в НЕ й хм я ки дк М Її 5 ще і й Е кр Ко од і сля й я ж : ГК 15 З їх : ЕД ; : Що шк ее ння нн нн ши нн 4 Мао зоноо дного фон» ЗМ БЖ Бета Бе? Мех 71 БА Оце БОТИ че мех 71О зе рах Яржх
Фк. 15
UAA201503228A 2009-10-22 2010-10-22 Конструйований білок з цинковими пальцями, направлений на гени рослин, залучені до біосинтезу жирних кислот UA120742C2 (uk)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US27952809P 2009-10-22 2009-10-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA120742C2 true UA120742C2 (uk) 2020-02-10

Family

ID=43900600

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201503228A UA120742C2 (uk) 2009-10-22 2010-10-22 Конструйований білок з цинковими пальцями, направлений на гени рослин, залучені до біосинтезу жирних кислот
UAA201206147A UA109418C2 (uk) 2009-10-22 2010-10-22 Конструйований білок з цинковими пальцями, направлений на гени рослин, залучені до біосинтезу жирних кислот

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201206147A UA109418C2 (uk) 2009-10-22 2010-10-22 Конструйований білок з цинковими пальцями, направлений на гени рослин, залучені до біосинтезу жирних кислот

Country Status (18)

Country Link
US (3) US8592645B2 (uk)
EP (2) EP2491127B1 (uk)
JP (1) JP5827233B2 (uk)
KR (1) KR101813981B1 (uk)
CN (2) CN102782140B (uk)
AR (1) AR078740A1 (uk)
AU (1) AU2010308569B2 (uk)
BR (2) BR122019025207B1 (uk)
CA (1) CA2777753C (uk)
DK (2) DK2722392T3 (uk)
ES (2) ES2646138T3 (uk)
IL (1) IL219137A (uk)
MY (2) MY174390A (uk)
NZ (2) NZ599351A (uk)
RU (2) RU2712833C2 (uk)
UA (2) UA120742C2 (uk)
WO (1) WO2011049627A1 (uk)
ZA (1) ZA201202814B (uk)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
US20110239315A1 (en) 2009-01-12 2011-09-29 Ulla Bonas Modular dna-binding domains and methods of use
US8586363B2 (en) 2009-12-10 2013-11-19 Regents Of The University Of Minnesota TAL effector-mediated DNA modification
EP3156062A1 (en) 2010-05-17 2017-04-19 Sangamo BioSciences, Inc. Novel dna-binding proteins and uses thereof
WO2012015938A2 (en) * 2010-07-27 2012-02-02 The Johns Hopkins University Obligate heterodimer variants of foki cleavage domain
CN107556389B (zh) 2012-02-02 2021-10-26 陶氏益农公司 植物反式激活互作基序及其用途
AU2013256240B2 (en) 2012-05-02 2018-09-20 Corteva Agriscience Llc Targeted modification of malate dehydrogenase
BR112014031891A2 (pt) 2012-06-19 2017-08-01 Univ Minnesota direcionamento genético nas plantas utilizando vírus de dna
UA119135C2 (uk) * 2012-09-07 2019-05-10 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб отримання трансгенної рослини
UA118090C2 (uk) * 2012-09-07 2018-11-26 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб інтегрування послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у ген fad2 у клітині сої та специфічний для локусу fad2 білок, що зв'язується, здатний індукувати спрямований розрив
JP6775953B2 (ja) 2012-09-07 2020-10-28 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー Ｆａｄ３性能座および標的化切断を誘導可能である対応する標的部位特異的結合タンパク質
BR112015009967B1 (pt) 2012-11-01 2022-07-12 Medicago Inc. Método para a produção de um polipeptídeo terapêutico
ES2673864T3 (es) 2012-12-21 2018-06-26 Cellectis Patatas con endulzamiento inducido en frío reducido
US10351867B2 (en) * 2013-03-01 2019-07-16 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for targeting RNA polymerases and non-coding RNA biogenesis to specific loci
US10113162B2 (en) 2013-03-15 2018-10-30 Cellectis Modifying soybean oil composition through targeted knockout of the FAD2-1A/1B genes
CN105246324B (zh) * 2013-03-15 2018-08-28 塞尔克蒂斯股份有限公司 通过靶向敲除fad2-1a/1b基因来改良大豆油成分
KR102192599B1 (ko) 2013-04-05 2020-12-18 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 식물의 게놈 내의 외인성 서열의 통합을 위한 방법 및 조성물
CN116083487A (zh) 2013-05-15 2023-05-09 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于治疗遗传病状的方法和组合物
EP3004370B1 (en) * 2013-06-05 2024-08-21 Duke University Rna-guided gene editing and gene regulation
KR102269769B1 (ko) 2013-11-04 2021-06-28 코르테바 애그리사이언스 엘엘씨 최적 메이즈 유전자좌
NZ746567A (en) 2013-11-04 2019-09-27 Dow Agrosciences Llc Optimal soybean loci
EP3066109A4 (en) 2013-11-04 2017-11-29 Dow AgroSciences LLC Optimal soybean loci
CA2928855A1 (en) 2013-11-04 2015-05-07 Dow Agrosciences Llc Optimal maize loci
US10774338B2 (en) 2014-01-16 2020-09-15 The Regents Of The University Of California Generation of heritable chimeric plant traits
WO2015190922A1 (en) 2014-06-10 2015-12-17 Erasmus University Medical Center Rotterdam Antisense oligonucleotides useful in treatment of pompe disease
WO2015193858A1 (en) 2014-06-20 2015-12-23 Cellectis Potatoes with reduced granule-bound starch synthase
US10837024B2 (en) 2015-09-17 2020-11-17 Cellectis Modifying messenger RNA stability in plant transformations
UY37108A (es) 2016-02-02 2017-08-31 Cellectis Modificación de la composición de aceites de soja mediante el knockout dirigido de los genes fad3a/b/c
SG10202006261YA (en) 2016-03-11 2020-08-28 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof
CN109415737A (zh) * 2016-05-25 2019-03-01 嘉吉公司 用于在植物中产生突变的工程化核酸酶
WO2018092072A1 (en) 2016-11-16 2018-05-24 Cellectis Methods for altering amino acid content in plants through frameshift mutations
WO2018136594A1 (en) 2017-01-19 2018-07-26 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof
CN106987599B (zh) * 2017-03-28 2021-06-11 重庆医科大学 一种抑制人bcr-abl融合基因表达或导致人bcr-abl基因功能丧失的锌指核酸酶及其应用
ES2977620T3 (es) 2017-04-25 2024-08-27 Cellectis Alfalfa con composición reducida de lignina
WO2019104056A1 (en) * 2017-11-21 2019-05-31 Cargill, Incorporated Engineered nucleases in plant generation
WO2020244759A1 (en) 2019-06-05 2020-12-10 Klemm & Sohn Gmbh & Co. Kg New plants having a white foliage phenotype
CN111518220A (zh) * 2020-05-14 2020-08-11 重庆英茂盛业生物科技有限公司 一种融合蛋白及其设计方法
CN112662670B (zh) * 2020-12-25 2024-04-02 河南省农业科学院 花生脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因启动子及其制备方法和应用
WO2024161358A1 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Dlf Seeds A/S Beet yellows virus resistance

Family Cites Families (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5102796A (en) 1983-04-15 1992-04-07 Lubrizol Genetics, Inc. Plant structural gene expression
EP0222493A1 (en) 1985-10-04 1987-05-20 Lubrizol Genetics Inc. TR-based sub-TI plasmids
US5422251A (en) 1986-11-26 1995-06-06 Princeton University Triple-stranded nucleic acids
US5176996A (en) 1988-12-20 1993-01-05 Baylor College Of Medicine Method for making synthetic oligonucleotides which bind specifically to target sites on duplex DNA molecules, by forming a colinear triplex, the synthetic oligonucleotides and methods of use
US5861187A (en) 1990-08-30 1999-01-19 Cargill, Incorporated Oil from canola seed with altered fatty acid profiles and a method of producing oil
EP0667906A1 (en) 1991-11-15 1995-08-23 E.I. Du Pont De Nemours And Company $g(b)-KETOACYL-ACP SYNTHETASE II GENES FROM PLANTS
DE69233118T2 (de) 1991-12-04 2004-04-15 E.I. Du Pont De Nemours And Co., Wilmington Fettsäure-desaturase gene aus pflanzen
US5420032A (en) 1991-12-23 1995-05-30 Universitge Laval Homing endonuclease which originates from chlamydomonas eugametos and recognizes and cleaves a 15, 17 or 19 degenerate double stranded nucleotide sequence
US5356802A (en) 1992-04-03 1994-10-18 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoites (FokI) restriction endonuclease
US5487994A (en) 1992-04-03 1996-01-30 The Johns Hopkins University Insertion and deletion mutants of FokI restriction endonuclease
US5436150A (en) 1992-04-03 1995-07-25 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease
US5792632A (en) 1992-05-05 1998-08-11 Institut Pasteur Nucleotide sequence encoding the enzyme I-SceI and the uses thereof
EP0604662B1 (en) 1992-07-07 2008-06-18 Japan Tobacco Inc. Method of transforming monocotyledon
EP0728212A1 (en) * 1993-11-10 1996-08-28 Calgene, Inc. Plant acyl acp thioesterase sequences
US6242568B1 (en) 1994-01-18 2001-06-05 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
DE69534629D1 (de) 1994-01-18 2005-12-29 Scripps Research Inst Derivate von zinkfingerproteinen und methoden
US6140466A (en) 1994-01-18 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
US5585245A (en) 1994-04-22 1996-12-17 California Institute Of Technology Ubiquitin-based split protein sensor
USRE39229E1 (en) 1994-08-20 2006-08-08 Gendaq Limited Binding proteins for recognition of DNA
GB9824544D0 (en) 1998-11-09 1999-01-06 Medical Res Council Screening system
US5789538A (en) * 1995-02-03 1998-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Zinc finger proteins with high affinity new DNA binding specificities
US5773695A (en) 1996-01-26 1998-06-30 North Carolina State University Plant nuclear scaffold attachment region and method for increasing gene expression in transgenic cells
US5925523A (en) * 1996-08-23 1999-07-20 President & Fellows Of Harvard College Intraction trap assay, reagents and uses thereof
DE19635568C1 (de) * 1996-09-02 1998-03-26 Gsf Forschungszentrum Umwelt Vektorsysteme zur konditionalen Genexpression
GB9703369D0 (en) 1997-02-18 1997-04-09 Lindqvist Bjorn H Process
GB2338237B (en) 1997-02-18 2001-02-28 Actinova Ltd In vitro peptide or protein expression library
US6342345B1 (en) 1997-04-02 2002-01-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Detection of molecular interactions by reporter subunit complementation
GB9710807D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
US6323395B1 (en) * 1997-12-24 2001-11-27 Dow Agrosciences Llc Nucleotide sequences of maize and soybean β-Ketoacyl-Acyl Carrier Protein Synthase II and their use in the regulation of fatty acid content of oil
AR014491A1 (es) 1998-01-29 2001-02-28 Dow Agrosciences Llc Metodo para obtener plantas transgenicas fertiles de gossypium hirsutum.
US6410248B1 (en) 1998-01-30 2002-06-25 Massachusetts Institute Of Technology General strategy for selecting high-affinity zinc finger proteins for diverse DNA target sites
WO1999045132A1 (en) 1998-03-02 1999-09-10 Massachusetts Institute Of Technology Poly zinc finger proteins with improved linkers
US6365802B2 (en) * 1998-08-14 2002-04-02 Calgene Llc Methods for increasing stearate content in soybean oil
DE19842276A1 (de) * 1998-09-16 2000-03-30 Bosch Gmbh Robert Paste zum Verschweißen von Keramiken mit Metallen und Verfahren zur Herstellung einer Schweißverbindung
US6140081A (en) 1998-10-16 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for GNN
US6453242B1 (en) 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
US6599692B1 (en) * 1999-09-14 2003-07-29 Sangamo Bioscience, Inc. Functional genomics using zinc finger proteins
US6534261B1 (en) * 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US7030215B2 (en) * 1999-03-24 2006-04-18 Sangamo Biosciences, Inc. Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
US6794136B1 (en) 2000-11-20 2004-09-21 Sangamo Biosciences, Inc. Iterative optimization in the design of binding proteins
JP3107304B1 (ja) * 1999-08-10 2000-11-06 株式会社オハラ 光フィルター用ガラスセラミックス及び光フィルター
US7151201B2 (en) * 2000-01-21 2006-12-19 The Scripps Research Institute Methods and compositions to modulate expression in plants
AU2001226935B2 (en) 2000-01-24 2006-06-22 Gendaq Limited Nucleic acid binding polypeptides characterized by flexible linkers connected nucleic acid binding modules
US20020061512A1 (en) 2000-02-18 2002-05-23 Kim Jin-Soo Zinc finger domains and methods of identifying same
AU2001253914B2 (en) 2000-04-28 2006-06-08 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted modification of chromatin structure
US20020178467A1 (en) * 2000-05-12 2002-11-28 Katayoon Dehesh Plastid transit peptide sequences for efficient plastid targeting
WO2001088197A2 (en) 2000-05-16 2001-11-22 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for interaction trap assays
JP2002060786A (ja) 2000-08-23 2002-02-26 Kao Corp 硬質表面用殺菌防汚剤
US9234187B2 (en) 2001-01-22 2016-01-12 Sangamo Biosciences, Inc. Modified zinc finger binding proteins
GB0108491D0 (en) 2001-04-04 2001-05-23 Gendaq Ltd Engineering zinc fingers
JP2005500061A (ja) 2001-08-20 2005-01-06 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート Ｃｎｎについての亜鉛フィンガー結合ドメイン
US7262054B2 (en) * 2002-01-22 2007-08-28 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants
EP2368982A3 (en) 2002-03-21 2011-10-12 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
DE10220894A1 (de) * 2002-05-10 2003-11-27 Rhein Biotech Proz & Prod Gmbh Promotoren mit veränderter Transkriptionseffizienz
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US20070134796A1 (en) 2005-07-26 2007-06-14 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted integration and expression of exogenous nucleic acid sequences
US8409861B2 (en) 2003-08-08 2013-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted deletion of cellular DNA sequences
CA2534296C (en) 2003-08-08 2013-03-26 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
ATE518960T1 (de) * 2003-09-19 2011-08-15 Sangamo Biosciences Inc Gentechnisch hergestellte zinkfingerproteine zur regulation der genexpression
KR100535326B1 (ko) * 2004-01-20 2005-12-09 한국생명공학연구원 줄기 세포로부터 자연살해 세포로의 분화 조절용 유전자를유효성분으로 포함하는 분화 조절제
US20080131962A1 (en) * 2006-05-25 2008-06-05 Sangamo Biosciences, Inc. Engineered cleavage half-domains
US8021867B2 (en) 2005-10-18 2011-09-20 Duke University Rationally-designed meganucleases with altered sequence specificity and DNA-binding affinity
AU2007334468B2 (en) 2006-12-14 2013-02-07 Corteva Agriscience Llc Optimized non-canonical zinc finger proteins
CN101688220B (zh) 2007-07-09 2017-04-05 拜尔作物科学公司 包含突变酰基‑acp硫酯酶等位基因的芸苔属植物
CN101878307B (zh) * 2007-09-27 2017-07-28 陶氏益农公司 以5‑烯醇式丙酮酰莽草酸‑3‑磷酸合酶基因为靶的改造锌指蛋白
JP2011521643A (ja) * 2008-05-28 2011-07-28 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド Ｄｎａ結合ドメインおよび切断ドメインを連結するための組成物
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
EP2596011B1 (en) 2010-07-21 2018-10-03 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modification of a hla locus
US9401201B1 (en) 2015-05-22 2016-07-26 Qualcomm Incorporated Write driver for memory

Also Published As

Publication number Publication date
EP2491127A4 (en) 2013-04-03
WO2011049627A1 (en) 2011-04-28
BR112012009668B1 (pt) 2022-08-16
CA2777753C (en) 2020-02-04
BR112012009668A2 (pt) 2017-05-09
AR078740A1 (es) 2011-11-30
RU2712833C2 (ru) 2020-01-31
US20140157458A1 (en) 2014-06-05
UA109418C2 (uk) 2015-08-25
US10017775B2 (en) 2018-07-10
US8592645B2 (en) 2013-11-26
NZ599351A (en) 2014-02-28
CN102782140B (zh) 2016-04-13
MY176922A (en) 2020-08-26
CN104277100B (zh) 2018-02-02
JP2013507960A (ja) 2013-03-07
EP2491127B1 (en) 2017-09-20
CA2777753A1 (en) 2011-04-28
AU2010308569A1 (en) 2012-05-03
KR20120123249A (ko) 2012-11-08
JP5827233B2 (ja) 2015-12-02
DK2491127T3 (en) 2018-01-08
ZA201202814B (en) 2012-12-27
US20170204425A1 (en) 2017-07-20
ES2657067T3 (es) 2018-03-01
EP2722392A3 (en) 2014-08-13
US20110167521A1 (en) 2011-07-07
KR101813981B1 (ko) 2018-01-04
RU2568056C2 (ru) 2015-11-10
IL219137A (en) 2017-09-28
ES2646138T3 (es) 2017-12-12
AU2010308569B2 (en) 2015-07-16
EP2722392A2 (en) 2014-04-23
RU2015111840A3 (uk) 2018-11-26
IL219137A0 (en) 2012-06-28
US9631201B2 (en) 2017-04-25
RU2015111840A (ru) 2015-07-20
CN102782140A (zh) 2012-11-14
EP2491127A1 (en) 2012-08-29
EP2722392B1 (en) 2017-11-22
DK2722392T3 (en) 2018-02-19
BR122019025207B1 (pt) 2022-10-04
CN104277100A (zh) 2015-01-14
NZ619018A (en) 2014-06-27
RU2012120854A (ru) 2013-11-27
MY174390A (en) 2020-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA120742C2 (uk) Конструйований білок з цинковими пальцями, направлений на гени рослин, залучені до біосинтезу жирних кислот
CA2926536C (en) Optimal soybean loci for targeted transgene integration
JP7057786B2 (ja) 光合成アンテナの減少を有する高生産性藻類突然変異体
CN104830894B (zh) 靶向修饰的纯合生物体
Chen et al. Three homologous genes encoding sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase 4 exhibit different expression patterns and functional divergence in Brassica napus
KR20150043539A (ko) Fad2 성능 유전자좌 및 표적화 파단을 유도할 수 있는 상응하는 표적 부위 특이적 결합 단백질
UA121197C2 (uk) Нуклеаза "цинкові пальці" для модифікацїї гена ahas та спосіб її використання
EA029904B1 (ru) Уменьшение содержания насыщенных жирных кислот в семенах растений
CA2362897A1 (en) Plant centromeres
Rhoads et al. Altered gene expression in plants with constitutive expression of a mitochondrial small heat shock protein suggests the involvement of retrograde regulation in the heat stress response
KR102308873B1 (ko) 단위결과 제어 유전자 및 그 이용
CN113412332A (zh) 用于在植物中产生高水平pufa的改进方法
AU2015203725B2 (en) Engineered zinc finger proteins targeting plant genes involved in fatty acid biosynthesis
Neubauer et al. The Arabidopsis N-terminal acetyltransferase NAA50 regulates plant growth and defense