CN106987599B

CN106987599B - 一种抑制人bcr-abl融合基因表达或导致人bcr-abl基因功能丧失的锌指核酸酶及其应用

Info

Publication number: CN106987599B
Application number: CN201710193202.6A
Authority: CN
Inventors: 冯文莉; 高淼; 黄宁姝; 黄峥兰; 袁颖
Original assignee: Chongqing Medical University
Current assignee: International Institute Of In Vitro Diagnostics Chongqing Medical University
Priority date: 2017-03-28
Filing date: 2017-03-28
Publication date: 2021-06-11
Anticipated expiration: 2037-03-28
Also published as: CN106987599A

Abstract

本发明公开了一种DNA分子，其序列如SEQ ID No:2所示，还公开了该DNA分子作为靶点在抑制人bcr‑abl融合基因表达或导致人bcr‑abl基因功能丧失中的应用；抑制人bcr‑abl基因表达或导致人bcr‑abl基因功能丧失是由锌指核酸酶介导的bcr‑abl融合基因同源重组技术带来的。本发明针对bcr‑abl序列中特异的靶序列位点构建的ZFN质粒可高效靶向bcr‑abl基因发生DNA双链断裂，以HDR方式进行修复使bcr‑abl发生移码等突变而被破坏，从而丧失促增殖、抑凋亡等恶性转化潜能，证实ZFNs靶向破坏bcr‑abl基因杀伤和抑制CML细胞的可行性。

Description

一种抑制人bcr-abl融合基因表达或导致人bcr-abl基因功能丧失的锌指核酸酶及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种抑制人bcr-abl融合基因表达或导致人bcr-abl基因功能丧失的锌指核酸酶及其应用。

背景技术

慢性粒细胞白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)的致病根源是由于t(9；22)(q34；q11)平衡易位导致c-abl基因与bcr基因形成bcr-abl融合基因。该融合基因编码的BCR-ABL融合蛋白具有强烈的酪氨酸激酶活性，持续激活下游的RAS/MAPK，PI3K/AKT，STAT5等促增殖抑凋亡信号，导致细胞的恶性转化。临床上的一线治疗药物伊马替尼是一种酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors，TKIs)，可以使近70％的CML慢性期患者达到血液学甚至遗传学的完全缓解，但是，另外30％的患者由于BCR-ABL激酶区突变引发耐药，尤其是T315I突变，即使是新开发的第二代酪氨酸激酶抑制剂，也束手无策；并且，酪氨酸激酶抑制剂只能抑制Abl激酶活性，不能使bcr-abl基因转为阴性，特别是白血病干细胞(leukemia stem cell,LSC)对TKIs不敏感，残留的LSC成为复发的根源。因此，探索新的根治CML的方法迫在眉睫。

细胞本身存在一种DNA损伤-修复机制，当DNA双链的一条链断裂后，以另外一条链为模板进行同源修复；当DNA双链的两条链均断裂后，以同源染色体的DNA双链为模板进行同源修复，从而确保基因组的稳定。当两条染色体的DNA双链均断裂后，以非同源末端连接(nonhomologous end joining,NHEJ)的方式进行修复，这种修复方式极易发生插入、缺失致移码突变。利用细胞的这种损伤-修复原理，诞生了一种可以定点操作基因组的核酸酶修饰技术。它由特异性的DNA识别结合结构域和非特异性剪切DNA的核酸酶组成。该技术可以靶向特定位点的染色体DNA双链断裂(double-stranded breaks,DSB)，以供体DNA为模板，促发同源定向修复(homology directed repair,HDR)，或者以极易出错的NHEJ方式进行修复。其中HDR可对靶基因进行定点插入、缺失、修正等操作，而NHEJ由于极易出错，很容易导致靶基因发生插入、缺失和移码突变，从而实现对靶基因的破坏(gene disruption)。

目前，主要的核酸酶修饰技术包括锌指核酸酶(Zinc finger nucleases,ZFNs)，类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TAL-ENs)和规律成簇间隔短回文重复/Cas核酸酶(clustered regularly interspacedshort palindromic repeats/CRISPR-associated systems,CRISPR/Cas)核酸酶。CRISPR/Ca-s核酸酶技术起步较晚，该技术操作起来最简单，但是，其潜在的完全性问题尚未得到证实。TALENs的主要优势在于不受靶序列特征的限制，但是特异识别靶序列的TALENs片段太长，不利于后续载体的装载和表达，并且在靶细胞内引入大量的重复序列也是未知的安全隐患。相比而言，虽然ZFNs构建过程较复杂，但其是人类基因编辑最确立的技术，技术成熟，免疫原性低，特异性较高，较适用于体内疗法，且已在基因治疗领域显示出良好的前景，是本研究较为理想的工具。

发明内容

针对以上问题，本发明一方面提供一种DNA分子，其序列如SEQ ID No:2所示。

本发明的另一方面在于提供如SEQ ID No:2所示的DNA分子作为靶点在抑制人bcr-abl融合基因表达或导致人bcr-abl基因功能丧失中的应用；所述抑制人bcr-abl基因表达或导致人bcr-abl基因功能丧失是由锌指核酸酶介导的bcr-abl融合基因同源重组技术带来的。

在上述技术方案中，所述人bcr-abl基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。

所述的锌指核酸酶的锌指蛋白的核苷酸编码序列如SEQ ID No:3和4所示。

所述的同源重组为同源定向修复，使用到的供体DNA的左臂扩增引物如SEQ IDNo:7和8所示，右臂扩增引物如SEQ ID No:9和10所示。

本发明的有益效果是：本发明定位了bcr-abl基因中一段特异的靶序列位点DNA片段，并针对此特异位点构建ZFN质粒，将此质粒核转染K562细胞可以使bcr-abl基因发生定点断裂,并以供体DNA为模板进行同源修复，使其插入8个碱基最终导致bcr-abl基因的破坏。本发明的显著优势表现在针对bcr-abl序列中特异的靶序列位点构建的ZFN质粒可高效靶向bcr-abl基因发生DNA双链断裂，以HDR方式进行修复使bcr-abl发生移码等突变而被破坏，从而丧失促增殖、抑凋亡等恶性转化潜能，证实ZFNs靶向破坏bcr-abl基因杀伤和抑制CML细胞的可行性。

附图说明

图1是鉴定转染ZFN质粒的K562细胞基因组DNA测序结果峰图。

图2是K562细胞相关蛋白Western Blot检测结果图，Blank：空白对照组；GFP:空载组。

图3是K562细胞、GFP和ZFN-L/R+Donor质粒核转染K562细胞克隆形成镜下图，K562细胞：未处理细胞，GFP：空载质粒，ZFN-L/R+Donor：ZFNs和Donor同时作用于K562细胞。

图4是GFP和ZFN-L/R+Donor质粒核转染K562细胞后细胞克隆形成数柱状图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1、针对人bcr-abl基因特异靶位点序列的ZFN质粒和Donor质粒的设计与构建

一、针对人bcr-abl基因特异靶位点序列的锌指核酸酶的设计合成

根据NCBI的查询和拼接确定了人bcr-abl基因的基因序列(如SEQ ID No:1所示)，通过生物信息学的方法，完成ZFNs设计，确定了该人bcr-abl基因的锌指核酸酶作用的特异靶位点序列为：

GGCGTCGACGGCgactacGAGGACGCCGAG(如SEQ ID No:2所示)；中间部分序列(gactac)为FokI内切核酸酶切割位点，也即ZFN特异敲除的靶位点序列，且本发明中所用的FokI内切核酸酶为专性异二聚化Fok I质粒，购自Addgene公司，可避免同源二聚化导致的非特异切割。

本发明中设计的针对人bcr-abl基因的锌指核酸酶(ZFNs)由锌指蛋白(ZFP)和FokI酶构成

(1)锌指蛋白(ZFP)的左臂(ZFP-L)、右臂(ZFP-R)序列

ZFP-L的DNA序列为(如SEQ ID No:3所示)：

5’-GTCGACCTGGAGCCCGGCGAGAAGCCCTACAAGTGCCCCGAGTGCGGCAAGAGCTTCAGCGACTGCCGCGACCTGGCCCGCCACCAGCGCACCCACACCGGCGAGAAGCCCTACAAGTGCCCCGAGTGCGGCAAGAGCTTCAGCGACCCCGGCAACCTGGTGCGCCACCAGCGCACCCACACCGGCGAGAAGCCCTACAAGTGCCCCGAGTGCGGCAAGAGCTTCAGCGACCCCGGCGCCCTGGTGCGCCACCAGCGCACCCACACCGGCGAGAAGCCCTACAAGTGCCCCGAGTGCGGCAAGAGCTTCAGCGACTGCCGCGACCTGGCCCGCCACCAGCGCACCCACACCGGCAAGAAGACCAGCTGC GGCCGC-3’。

ZFP-R的DNA序列为(如SEQ ID No:4所示)：

5’-GTCGACCTGGAGCCCGGCGAGAAGCCCTACAAGTGCCCCGAGTGCGGCAAGAGCTTCAGCCGCAGCGACAACCTGGTGCGCCACCAGCGCACCCACACCGGCGAGAAGCCCTACAAGTGCCCCGAGTGCGGCAAGAGCTTCAGCGACTGCCGCGACCTGGCCCGCCACCAGCGCACCCACACCGGCGAGAAGCCCTACAAGTGCCCCGAGTGCGGCAAGAGCTTCAGCGACCCCGGCAACCTGGTGCGCCACCAGCGCACCCACACCGGCGAGAAGCCCTACAAGTGCCCCGAGTGCGGCAAGAGCTTCAGCCGCAGCGACAACCTGGTGCGCCACCAGCGCACCCACACCGGCAAGAAGACCAGCTGC GGCCGC-3’。

在上述ZFP-L和ZFP-R的DNA序列中，5’端的下划线部分为Sal I酶切位点。3’端的下划线部分为Not I酶切位点，下划线前面的碱基T为防止移码添加的碱基。

(2)FokI酶

Fok I-L质粒(质粒编号37198)和Fok I-R质粒(质粒编号37199)均购自Addgene。

二、质粒pAd-Track-CMV-ZFN-L的构建

按照如下步骤操作：

(1)将上述ZFP-L的编码序列交由北京华大基因公司合成；用Sal I酶和Not I酶(TaKaRa公司)对ZFP-L和pAd-Track-CMV(重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室保存)进行双酶切，37℃，1h；

(2)随后将酶切产物分别进行纯化回收，具体步骤按照天根生化科技有限公司普通DNA产物纯化试剂盒(货号DP204)；

(3)将酶切回收产物用T4连接酶(TaKaRa公司)进行连接，16℃，16h；

(4)连接产物转化入DH5α感受态后在Kana抗性的平板上进行分区划线，随后在37℃孵箱中培养12h；

(5)在上述Kana平板上挑取8-10个单克隆菌落进行扩大培养；

(6)在扩增得到的菌液中提取质粒，具体步骤按照天根生化科技有限公司质粒小提试剂盒(货号DP103)；

(7)提取得到的质粒进行测序验证，其中得到的测序结果正确的质粒就为pAd-Track-CMV-ZFP-L；

(8)以Fok I-L质粒为模板，PCR扩增Fok I-L质粒，以表1所列的引物进行目的片段PCR扩增反应。反应体系为25μl，12.5μl Premix Taq、1μl 10μM引物FokI-Sence primer、1μl 25μM引物FokI-antisence primer、100ng质粒DNA，加超纯水至25μl。PCR扩增程序：94℃5min；94℃30s，退火温度58℃，72℃30s，循环29次，最后72℃延伸5min；PCR扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测；

表1扩增Fok I质粒DNA目的片段引物表

注：FokI-Sence primer中GCGGCCGC为Not I酶切位点，下划线为linker序列，5’端的AAGGAAAAAA为保护碱基。FokI-antisence primer中CTCGAG为Xho I酶切位点，5’端的CCG为保护碱基。

(9)随后将PCR产物进行纯化回收，具体步骤按照天根生化科技有限公司普通DNA产物纯化试剂盒(货号DP204)；

(10)用Xho I酶和Not I酶(TaKaRa公司)对Fok I-L和pAd-Track-CMV-ZFP-L质粒进行双酶切，37℃，1h；

(11)随后将酶切产物分别进行纯化回收，具体步骤按照天根生化科技有限公司普通DNA产物纯化试剂盒(货号DP204)；

(12)将它们的酶切回收产物用T4连接酶(TaKaRa公司)进行连接，16℃，16h；

(13)连接产物转化入DH5α感受态后在Kana抗性的平板上进行分区划线，随后在37℃孵箱中培养12h；

(15)在上述Kana平板上挑取8-10个单克隆菌落进行扩大培养；

(16)在扩增得到的菌液中提取质粒，具体步骤按照天根生化科技有限公司质粒小提试剂盒(货号DP103)；

(17)提取得到的质粒进行测序验证，其中得到的测序结果正确的质粒就为pAd-Track-CMV-ZFN-L。

三、质粒pAd-Track-CMV-ZFN-R质粒的构建

过程与上述“质粒pAd-Track-CMV-ZFN-L的构建”过程类似，不同处是将ZFP-R合成后构建pAd-Track-CMV-ZFP-R质粒，再与Fok I-R质粒相连接构建pAd-Track-CMV-ZFN-R质粒。(扩增Fok I-R质粒所用的PCR引物\程序和产物长度同表1)。

四、同源模板Donor质粒的构建

以K562细胞cDNA为模板，PCR扩增Donor(左臂bcr 217～758，长542bp；右臂：bcr759～1523bp，长765bp)，左臂克隆入Kpn I和Not I酶切位点，右臂克隆入Not I和Xba I酶切位点，将左、右臂同时克隆入质粒pAd-Track-CMV中。

按照如下步骤操作：

(1)以K562细胞(上海细胞所提供)cDNA为模板，PCR扩增Donor左臂(Donor-L)，以表2所列的引物进行目的片段PCR扩增反应。反应体系为25μl，12.5μl Premix Taq、1μl 10μM引物Donor-L-F、1μl 25μM引物Donor-L-R、100ng cDNA，加超纯水至25μl。PCR扩增程序：94℃5min；94℃30s，退火温度56℃，72℃30s，循环29次，最后72℃延伸5min，PCR扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测；

表2扩增Donor左臂的引物

注：以上2条引物的下划线处碱基分别为Kpn I和Not I酶切位点

(2)用Kpn I酶和Not I酶(TaKaRa公司)对Donor-L的PCR产物和pAd-Track-CMV进行双酶切，37℃，1h；

(3)随后将酶切产物分别进行纯化回收，具体步骤按照天根生化科技有限公司普通DNA产物纯化试剂盒(货号DP204)；

(4)将它们的酶切回收产物用T4连接酶(TaKaRa公司)进行连接，16℃，16h；

(5)连接产物转化入DH5α感受态后在Kana抗性的平板上进行分区划线，随后在37℃孵箱中培养12h；

(6)在上述Kana平板上挑取8-10个单克隆菌落进行扩大培养；

(7)在扩增得到的菌液中提取质粒，具体步骤按照天根生化科技有限公司质粒小提试剂盒(货号DP103)；

(8)提取得到的质粒进行测序验证，其中得到的测序结果正确的质粒就为pAd-Track-CMV-Donor-L；

(9)再以K562细胞cDNA为模板，PCR扩增Donor右臂(Donor-R)，以表3所列的引物进行目的片段PCR扩增反应。反应体系为25μl，12.5μl Premix Taq、1μl 10μM引物Donor-R-F、1μl 25μM引物Donor-R-R、100ng cDNA，加超纯水至25μl。PCR扩增程序：94℃5min；94℃30s，退火温度56℃(见表3)，72℃30s，循环29次，最后72℃延伸5min，PCR扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测；

表3扩增Donor右臂的引物

注：以上2条引物的下划线部分碱基分别为Not I和Xba I酶切位点

(10)随后将PCR产物进行纯化回收，具体步骤按照天根生化科技有限公司普通DNA产物纯化试剂盒(货号DP204)；

(11)用Not I酶和Xba I酶(TaKaRa公司)对Donor-R的PCR产物和pAd-Track-CMV-Donor-L质粒进行双酶切，37℃，1h；

(12)随后将酶切产物分别进行纯化回收，具体步骤按照天根生化科技有限公司普通DNA产物纯化试剂盒(货号DP204)；

(13)将它们的酶切回收产物用T4连接酶(TaKaRa公司)进行连接，16℃，16h；

(14)连接产物转化入DH5α感受态后在Kana抗性的平板上进行分区划线，随后在37℃孵箱中培养12h；

(15)在上述Kana平板上挑取8-10个单克隆菌落进行扩大培养；

(17)提取得到的质粒进行测序验证，其中得到的测序结果正确的质粒就为pAd-Track-CMV-Donor。

实施例2、锌指核酸酶定点切割bcr-abl基因并插入NotI酶切位点促发同源定向修复

1、冻存细胞的复苏与培养

从液氮中取出装有K562细胞的冻存小管，立即投入37℃的温水中快速晃动，直至冻存液完全融解；在2min内完成复温；将细胞悬液移入无菌的离心管，加入5mL培养液，轻轻吹匀；将细胞悬液1000r/min离心5min，弃上清；向含有细胞沉淀的离心管加入1mL完全培养基。

2、细胞培养条件及传代培养：

细胞培养条件

培养基组成成分：1640(Gibco Lot:1737734)

10％FBS(BI Lot:1616756)

传代培养：

(1)K562细胞密度达约80％左右；

(2)用移液器反复吹打数次，至细胞全部均匀重悬在培养基中，将其转移到离心管中；500rpm离心5min；

(3)弃上清，加入2mL培养基重悬细胞，分两份加到有培养基的培养瓶中；

(4)晃动培养瓶使细胞分布均匀后，至37℃、5％CO₂培养箱中培养。

3、核转染方法

使用Lonza公司提供的电转试剂Cell Line Nucleofector Kit V及核转染仪进行转染实验，具体操作按照试剂说明书进行。

4、细胞基因组DNA提取：按照天根生化科技有限血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(货号：DP304)操作步骤说明，提取步骤3得到的培养48小时的细胞基因组DNA。

5、目的片段PCR扩增反应和PCR产物测序验证

以上述步骤4得到的细胞基因组DNA为模板，以下表4所列的引物进行目的片段PCR扩增反应。反应体系为25μl，12.5μl Premix Taq、1μl 10μM引物Sence primer、1μl 25μM引物Anti-sence primer、100ng基因组DNA，加超纯水至25μl。PCR扩增程序：94℃5min；94℃30s，退火温度56℃，72℃30s，循环29次，最后72℃延伸5min。PCR扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。

表4扩增bcr-abl基因组DNA目的片段引物表

将PCR产物直接进行测序，将测序所得的序列结果与bcr-abl基因中的靶位点序列进行同源性比较分析，以鉴定转染ZFN质粒K562细胞基因组DNA中靶位点是否被定点插入NotI酶切位点。测序结果峰图如图1所示，K562细胞基因组DNA的靶位点被定点插入NotI酶切位点。

6、Western Blot检测相关蛋白变化

提取细胞总蛋白与浓度测定：

(1)收集前述步骤3得到的培养48小时的细胞到10ml离心管里，1000rpm离心10min，弃尽上清液；

(2)再加入2mlPBS于离心管中将细胞悬液，吹打混匀，1000rpm离心10min，弃尽上清液；

(3)加入1ml PBS重新混匀，将细胞悬液转至新的1.5ml EP管中；

(4)配制裂解液：PMSF：NaF：NaVO4：RIPA＝1:1:1:100，每个dish加60μl裂解液。冰上裂解30分钟，每10分钟振荡一次(5-10s)；

(5)将EP管放入4℃离心机，12000rpm离心40分钟，上清液转移至另一个新的EP管中，记录体积，加上清液1/4体积的5×蛋白上样buffer，沸水煮5分钟，-80℃超低温冰箱保存；

(6)BCA试剂盒测蛋白浓度：配制BCA标准品工作液，终浓度0.5mg/ml。将标准品和待测品加入96孔板，按照说明书向每孔加工作液，振荡混匀后37℃水浴箱孵育35分钟，测定560nm处吸光度值，绘制标准曲线并计算蛋白浓度及上样量(见表5)。

表5蛋白浓度测定

Western Blot：

(1)配制10％分离胶加入安装好的电泳仪中，1ml无水乙醇压线，37℃烤箱静置30min取出，弃去无水乙醇，配制5％浓缩胶，根据实验需求加入适量孔梳，再将配好的浓缩胶加入，37℃烤箱静置20min。待浓缩胶完全凝固后去掉胶条放入电泳槽中，加入内槽液(1×SDS)后拔掉梳子，加入外槽液后排气泡。每孔加入30μg蛋白样品，两步法电泳：80V电泳30分钟，120V电泳90分钟；

(2)提前预冷湿转液并将滤纸浸泡在湿转液中，按目的条带分子量切胶浸润湿转液待用。剪与切胶大小相等的膜，甲醇活化1min，双蒸水2min转入湿转液中。转膜：按照三层滤纸、膜、胶和三层滤纸的顺序放入转膜仪，210mA恒流，小分子蛋白按照分子量大小相同时间转膜，大分子量蛋白按照分子量×0.85时间转膜；

(3)配制5％的封闭奶粉待转膜结束时将PVDF膜放入进行封闭，4℃冰箱4h；

(4)TBST去除膜上封闭液放置于蜡板上，加入一抗(1:1000稀释)后密封，4℃冰箱充分反应14-18h；

(5)取出PVDF膜，TBST洗3次/5min，加入二抗(1:2000稀释)，4℃90分钟后再用TBST洗2次/5min，TBS洗5min；

(6)配制发光液：A液：B液＝1:1，加在膜上避光于发光仪内显像。

Western Blot检测相关蛋白结果如图2所示，与空白组，空载组以及各种质粒单独作用组对比ZFN-L/R和Donor共同作用于CML细胞后能使p-Bcr-Abl蛋白明显下调，且Bcr-Abl蛋白下游的效应分子p-Stat5和p-Erk都明显下调；与空白组，空载组以及各种质粒单独作用组对比ZFN-L/R和Donor共同作用于CML细胞后能激活PARP和Caspase-3蛋白，说明其能促进CML细胞凋亡。

7、克隆形成实验

(1)分别用空载质粒GFP和ZFN-L/R+Donor质粒核转染K562细胞，并且设对照组(无质粒转染)，每组处理设置5个复孔，每孔铺300个细胞于24孔板，调整每孔终培养基至750μl；

(2)在每孔中加入750μl 2.7％甲基纤维素，混匀；

(3)37℃、5％CO₂恒温细胞孵箱内培养7-10天观察结果。结果如图3、4所示：ZFN-L/R和Donor共同作用于K562细胞后能明显抑制K562细胞的克隆大小和克隆数量，即抑制K562细胞的克隆形成能力。

序列表

<110> 重庆医科大学

<120> 采用锌指核酸酶技术破坏人bcr-abl融合基因以抑制CML细胞增殖和促使其凋亡

<130> 1

<160> 12

<210> 1

<211> 6021

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 人bcr-abl基因

<400> 1

atggtggacc cggtgggctt cgcggaggcg tggaaggcgc agttcccgga ctcagagccc 60

ccgcgcatgg agctgcgctc agtgggcgac atcgagcagg agctggagcg ctgcaaggcc 120

tccattcggc gcctggagca ggaggtgaac caggagcgct tccgcatgat ctacctgcag 180

acgttgctgg ccaaggaaaa gaagagctat gaccggcagc gatggggctt ccggcgcgcg 240

gcgcaggccc ccgacggcgc ctccgagccc cgagcgtccg cgtcgcgccc gcagccagcg 300

cccgccgacg gagccgaccc gccgcccgcc gaggagcccg aggcccggcc cgacggcgag 360

ggttctccgg gtaaggccag gcccgggacc gcccgcaggc ccggggcagc cgcgtcgggg 420

gaacgggacg accggggacc ccccgccagc gtggcggcgc tcaggtccaa cttcgagcgg 480

atccgcaagg gccatggcca gcccggggcg gacgccgaga agcccttcta cgtgaacgtc 540

gagtttcacc acgagcgcgg cctggtgaag gtcaacgaca aagaggtgtc ggaccgcatc 600

agctccctgg gcagccaggc catgcagatg gagcgcaaaa agtcccagca cggcgcgggc 660

tcgagcgtgg gggatgcatc caggccccct taccggggac gctcctcgga gagcagctgc 720

ggcgtcgacg gcgactacga ggacgccgag ttgaaccccc gcttcctgaa ggacaacctg 780

atcgacgcca atggcggtag caggccccct tggccgcccc tggagtacca gccctaccag 840

agcatctacg tcgggggcat gatggaaggg gagggcaagg gcccgctcct gcgcagccag 900

agcacctctg agcaggagaa gcgccttacc tggccccgca ggtcctactc cccccggagt 960

tttgaggatt gcggaggcgg ctataccccg gactgcagct ccaatgagaa cctcacctcc 1020

agcgaggagg acttctcctc tggccagtcc agccgcgtgt ccccaagccc caccacctac 1080

cgcatgttcc gggacaaaag ccgctctccc tcgcagaact cgcaacagtc cttcgacagc 1140

agcagtcccc ccacgccgca gtgccataag cggcaccggc actgcccggt tgtcgtgtcc 1200

gaggccacca tcgtgggcgt ccgcaagacc gggcagatct ggcccaacga tggcgagggc 1260

gccttccatg gagacgcaga tggctcgttc ggaacaccac ctggatacgg ctgcgctgca 1320

gaccgggcag aggagcagcg ccggcaccaa gatgggctgc cctacattga tgactcgccc 1380

tcctcatcgc cccacctcag cagcaagggc aggggcagcc gggatgcgct ggtctcggga 1440

gccctggagt ccactaaagc gagtgagctg gacttggaaa agggcttgga gatgagaaaa 1500

tgggtcctgt cgggaatcct ggctagcgag gagacttacc tgagccacct ggaggcactg 1560

ctgctgccca tgaagccttt gaaagccgct gccaccacct ctcagccggt gctgacgagt 1620

cagcagatcg agaccatctt cttcaaagtg cctgagctct acgagatcca caaggagttc 1680

tatgatgggc tcttcccccg cgtgcagcag tggagccacc agcagcgggt gggcgacctc 1740

ttccagaagc tggccagcca gctgggtgtg taccgggcct tcgtggacaa ctacggagtt 1800

gccatggaaa tggctgagaa gtgctgtcag gccaatgctc agtttgcaga aatctccgag 1860

aacctgagag ccagaagcaa caaagatgcc aaggatccaa cgaccaagaa ctctctggaa 1920

actctgctct acaagcctgt ggaccgtgtg acgaggagca cgctggtcct ccatgacttg 1980

ctgaagcaca ctcctgccag ccaccctgac caccccttgc tgcaggacgc cctccgcatc 2040

tcacagaact tcctgtccag catcaatgag gagatcacac cccgacggca gtccatgacg 2100

gtgaagaagg gagagcaccg gcagctgctg aaggacagct tcatggtgga gctggtggag 2160

ggggcccgca agctgcgcca cgtcttcctg ttcaccgagc tgcttctctg caccaagctc 2220

aagaagcaga gcggaggcaa aacgcagcag tatgactgca aatggtacat tccgctcacg 2280

gatctcagct tccagatggt ggatgaactg gaggcagtgc ccaacatccc cctggtgccc 2340

gatgaggagc tggacgcttt gaagatcaag atctcccaga tcaagagtga catccagaga 2400

gagaagaggg cgaacaaggg cagcaaggct acggagaggc tgaagaagaa gctgtcggag 2460

caggagtcac tgctgctgct tatgtctccc agcatggcct tcagggtgca cagccgcaac 2520

ggcaagagtt acacgttcct gatctcctct gactatgagc gtgcagagtg gagggagaac 2580

atccgggagc agcagaagaa gtgtttcaga agcttctccc tgacatccgt ggagctgcag 2640

atgctgacca actcgtgtgt gaaactccag actgtccaca gcattccgct gaccatcaat 2700

aaggaagaag cccttcagcg gccagtagca tctgactttg agcctcaggg tctgagtgaa 2760

gccgctcgtt ggaactccaa ggaaaacctt ctcgctggac ccagtgaaaa tgaccccaac 2820

cttttcgttg cactgtatga ttttgtggcc agtggagata acactctaag cataactaaa 2880

ggtgaaaagc tccgggtctt aggctataat cacaatgggg aatggtgtga agcccaaacc 2940

aaaaatggcc aaggctgggt cccaagcaac tacatcacgc cagtcaacag tctggagaaa 3000

cactcctggt accatgggcc tgtgtcccgc aatgccgctg agtatctgct gagcagcggg 3060

atcaatggca gcttcttggt gcgtgagagt gagagcagtc ctggccagag gtccatctcg 3120

ctgagatacg aagggagggt gtaccattac aggatcaaca ctgcttctga tggcaagctc 3180

tacgtctcct ccgagagccg cttcaacacc ctggccgagt tggttcatca tcattcaacg 3240

gtggccgacg ggctcatcac cacgctccat tatccagccc caaagcgcaa caagcccact 3300

gtctatggtg tgtcccccaa ctacgacaag tgggagatgg aacgcacgga catcaccatg 3360

aagcacaagc tgggcggggg ccagtacggg gaggtgtacg agggcgtgtg gaagaaatac 3420

agcctgacgg tggccgtgaa gaccttgaag gaggacacca tggaggtgga agagttcttg 3480

aaagaagctg cagtcatgaa agagatcaaa caccctaacc tggtgcagct ccttggggtc 3540

tgcacccggg agcccccgtt ctatatcatc actgagttca tgacctacgg gaacctcctg 3600

gactacctga gggagtgcaa ccggcaggag gtgaacgccg tggtgctgct gtacatggcc 3660

actcagatct cgtcagccat ggagtacctg gagaagaaaa acttcatcca cagagatctt 3720

gctgcccgaa actgcctggt aggggagaac cacttggtga aggtagctga ttttggcctg 3780

agcaggttga tgacagggga cacctacaca gcccatgctg gagccaagtt ccccatcaaa 3840

tggactgcac ccgagagcct ggcctacaac aagttctcca tcaagtccga cgtctgggca 3900

tttggagtat tgctttggga aattgctacc tatggcatgt ccccttaccc gggaattgac 3960

ctgtcccagg tgtatgagct gctagagaag gactaccgca tggagcgccc agaaggctgc 4020

ccagagaagg tctatgaact catgcgagca tgttggcagt ggaatccctc tgaccggccc 4080

tcctttgctg aaatccacca agcctttgaa acaatgttcc aggaatccag tatctcagac 4140

gaagtggaaa aggagctggg gaaacaaggc gtccgtgggg ctgtgagtac cttgctgcag 4200

gccccagagc tgcccaccaa gacgaggacc tccaggagag ctgcagagca cagagacacc 4260

actgacgtgc ctgagatgcc tcactccaag ggccagggag agagcgatcc tctggaccat 4320

gagcctgccg tgtctccatt gctccctcga aaagagcgag gtcccccgga gggcggcctg 4380

aatgaagatg agcgccttct ccccaaagac aaaaagacca acttgttcag cgccttgatc 4440

aagaagaaga agaagacagc cccaacccct cccaaacgca gcagctcctt ccgggagatg 4500

gacggccagc cggagcgcag aggggccggc gaggaagagg gccgagacat cagcaacggg 4560

gcactggctt tcaccccctt ggacacagct gacccagcca agtccccaaa gcccagcaat 4620

ggggctgggg tccccaatgg agccctccgg gagtccgggg gctcaggctt ccggtctccc 4680

cacctgtgga agaagtccag cacgctgacc agcagccgcc tagccaccgg cgaggaggag 4740

ggcggtggca gctccagcaa gcgcttcctg cgctcttgct ccgcctcctg cgttccccat 4800

ggggccaagg acacggagtg gaggtcagtc acgctgcctc gggacttgca gtccacggga 4860

agacagtttg actcgtccac atttggaggg cacaaaagtg agaagccggc tctgcctcgg 4920

aagagggcag gggagaacag gtctgaccag gtgacccgag gcacagtaac gcctcccccc 4980

aggctggtga aaaagaatga ggaagctgct gatgaggtct tcaaagacat catggagtcc 5040

agcccgggct ccagcccgcc caacctgact ccaaaacccc tccggcggca ggtcaccgtg 5100

gcccctgcct cgggcctccc ccacaaggaa gaagctggaa agggcagtgc cttagggacc 5160

cctgctgcag ctgagccagt gacccccacc agcaaagcag gctcaggtgc accagggggc 5220

accagcaagg gccccgccga ggagtccaga gtgaggaggc acaagcactc ctctgagtcg 5280

ccagggaggg acaaggggaa attgtccagg ctcaaacctg ccccgccgcc cccaccagca 5340

gcctctgcag ggaaggctgg aggaaagccc tcgcagagcc cgagccagga ggcggccggg 5400

gaggcagtcc tgggcgcaaa gacaaaagcc acgagtctgg ttgatgctgt gaacagtgac 5460

gctgccaagc ccagccagcc gggagagggc ctcaaaaagc ccgtgctccc ggccactcca 5520

aagccacagt ccgccaagcc gtcggggacc cccatcagcc cagcccccgt tccctccacg 5580

ttgccatcag catcctcggc cctggcaggg gaccagccgt cttccaccgc cttcatccct 5640

ctcatatcaa cccgagtgtc tcttcggaaa acccgccagc ctccagagcg gatcgccagc 5700

ggcgccatca ccaagggcgt ggtcctggac agcaccgagg cgctgtgcct cgccatctct 5760

aggaactccg agcagatggc cagccacagc gcagtgctgg aggccggcaa aaacctctac 5820

acgttctgcg tgagctatgt ggattccatc cagcaaatga ggaacaagtt tgccttccga 5880

gaggccatca acaaactgga gaataatctc cgggagcttc agatctgccc ggcgacagca 5940

ggcagtggtc cggcggccac tcaggacttc agcaagctcc tcagttcggt gaaggaaatc 6000

agtgacatag tgcagaggta g 6021

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 人bcr-abl基因的锌指核酸酶作用的特异靶位点

<400> 2

ggcgtcgacg gcgactacga ggacgccgag 30

<210> 3

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> ZFP-L

<400> 3

gtcgacctgg agcccggcga gaagccctac aagtgccccg agtgcggcaa gagcttcagc 60

gactgccgcg acctggcccg ccaccagcgc acccacaccg gcgagaagcc ctacaagtgc 120

cccgagtgcg gcaagagctt cagcgacccc ggcaacctgg tgcgccacca gcgcacccac 180

accggcgaga agccctacaa gtgccccgag tgcggcaaga gcttcagcga ccccggcgcc 240

ctggtgcgcc accagcgcac ccacaccggc gagaagccct acaagtgccc cgagtgcggc 300

aagagcttca gcgactgccg cgacctggcc cgccaccagc gcacccacac cggcaagaag 360

accagctgcg gccgc 375

<210> 4

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> ZFP-R

<400> 4

gtcgacctgg agcccggcga gaagccctac aagtgccccg agtgcggcaa gagcttcagc 60

cgcagcgaca acctggtgcg ccaccagcgc acccacaccg gcgagaagcc ctacaagtgc 120

cccgagtgcg gcaagagctt cagcgactgc cgcgacctgg cccgccacca gcgcacccac 180

accggcgaga agccctacaa gtgccccgag tgcggcaaga gcttcagcga ccccggcaac 240

ctggtgcgcc accagcgcac ccacaccggc gagaagccct acaagtgccc cgagtgcggc 300

aagagcttca gccgcagcga caacctggtg cgccaccagc gcacccacac cggcaagaag 360

accagctgcg gccgc 375

<210> 5

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> FokI-Sence primer

<400> 5

aaggaaaaaa gcggccgcgg cggcggcggc agcggcggcg gcggcagcgc cctggtgaag 60

agcgagctgg aggagaag 78

<210> 6

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> FokI-antisence primer

<400> 6

ccgctcgagt cagaagttga tctcgccgtt gttgaacttg cgccgc 46

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> Donor-L-F

<400> 7

cggggtaccc agcgatgggg cttccggcg 29

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> Donor-L-R

<400> 8

aaggaaaaaa gcggccgcgg gttcaactcg gcgtcctcgt agtcg 45

<210> 9

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> Donor-R-F

<400> 9

aaggaaaaaa gcggccgccc gcttcctgaa ggacaacctg atcg 44

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> Donor-R-R

<400> 10

gctctagagc caggattccc gacaggaccc attttc 36

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> Sence primer

<400> 11

gacgccgaga agcccttc 18

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> Anti-sence primer

<400> 12

aatcctcaaa actccggggg 20

Claims

1.一种锌指核酸酶，其特征在于，所述锌指核酸酶能抑制人bcr-abl融合基因表达或导致人bcr-abl基因功能丧失，是针对人bcr-abl融合基因序列的特异性靶位点设计的，所述特异性靶位点的DNA序列如SEQ ID No: 2所示；所述锌指核酸酶由锌指蛋白和FokI内切核酸酶构成，其中所述锌指蛋白的左臂和右臂DNA序列分别如SEQ ID No: 3和SEQ ID No: 4所示，所述锌指核酸酶的切割域为FokI内切核酸酶切割位点。

2.一种多核苷酸，其编码的蛋白质是权利要求1所述的锌指核酸酶。

3.一种如权利要求1所述的锌指核酸酶在制备抑制人bcr-abl融合基因表达或敲除人bcr-abl 基因的药物中的应用，其特征在于：是采用由权利要求1所述的锌指核酸酶介导的bcr-abl融合基因进行同源重组。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的同源重组为同源定向修复，使用到的供体DNA的左臂扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No: 7和SEQ ID No: 8所示，右臂扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No: 9和SEQ ID No: 10所示。