CN106399462A - 一种bcr-abl融合基因扩增试剂盒和检测试剂盒 - Google Patents

一种bcr-abl融合基因扩增试剂盒和检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN106399462A
CN106399462A CN201510447596.4A CN201510447596A CN106399462A CN 106399462 A CN106399462 A CN 106399462A CN 201510447596 A CN201510447596 A CN 201510447596A CN 106399462 A CN106399462 A CN 106399462A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
bcr
kit
quantitation
reactant liquor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510447596.4A
Other languages
English (en)
Inventor
卿志荣
郑帮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Repodx Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Shanghai Repodx Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Repodx Biotechnology Co Ltd filed Critical Shanghai Repodx Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201510447596.4A priority Critical patent/CN106399462A/zh
Publication of CN106399462A publication Critical patent/CN106399462A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供公开了一种BCR-ABL融合基因扩增试剂盒和检测试剂盒,该扩增试剂盒使用方便，操作快速，灵敏度高。本发明检测试剂盒可以对BCR-ABL融合基因进行分型和定量，因此可以根据BCR-ABL融合基因检测结果，对慢性粒细胞白血病患者进行病情发展和预后的监测。

Description

一种BCR-ABL融合基因扩增试剂盒和检测试剂盒
技术领域
本发明涉及基因扩增领域，具体地涉及一种融合基因的扩增试剂盒和检测试剂盒。
背景技术
慢性粒细胞白血病(CML)是一种起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，临床上分为慢性期、加速期和急变期，急性变是临床引起死亡的主要原因，细胞遗传学特征是具有Ph染色体，即t(9；22)(q34；q11)，其分子水平上形成bcr-abl mRNA。t(9；22)(q34；q11)为CML特征性染色体易位，形成断裂点丛集区-Abelson癌基因(bcr—abl)融合基因，其中bcr—ablp210是CML的分子标志，近年国外在分子水平对BCR-ABL融合蛋白进行研究发现，根据BCR断裂点位置的不同分为3个主要类型：M-bcr，m-bcr，μ-bcr，相应编码p210蛋白、p190蛋白及p230蛋白(de Klein A,van Kessel AG,Grosveld G,et al.A cellular oncogene istranslocated to the Philadelphia chromosome in chronic myelocyticleukaemia[J].Nature,1982,300(5894):765-767；Bartram CR,de Klein A,Hagemeiger A,etal.Translocation of cab1oncogene correlates with the presence of a Philadelphiachromosome in chronic myelocytic leukaemia[J].Nature,1983,306(5940):277-280；)。95％以上的CML患者可表达p210蛋白；5％以下的CML患者表达p190蛋白；在急性前B细胞白血病具有BCR-ABL融合蛋白阳性的患者中2/3表达为p190蛋白，1/3表达为p210蛋白(MeloJV.The diversity of BCR-ABL fusion proteins and their relationship to leukemiaphenotype[J].Blood,1996,88(7):2375-2384；高锦声，匡志超.人类染色体技术的研究进展[J].自然杂志，2003,25(5)，267-271)。p190蛋白及p210蛋白不仅在CML患者中表达，而且也在急性髓系白血病患者中表达(Melo JV.The diversity of BCR-ABL fusion proteinsand their relationship to leukemia phenotype[J].Blood,1996,88(7):2375-2384)。对白血病相关融合基因进行常规检查，不仅可以为白血病诊断、分型、临床治疗选择和预后判断提供重要依据，同时也是白血病微小残留病变(MRD)检测的基础。通过酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗后患者会很快好转，各生理生化指标也会很快恢复，传统的细胞遗传学和FISH已经很难对残留的微小病灶进行检测。因此具有灵敏度高、精确度高且可以对微小病灶进行分子水平检测的聚合酶链式反应(PCR)检测方法，成为对患者初期检测和预后监测检查的重要手段(Hughes T,Deininger M,Hochhaus A et al.Monitoring CML patients respondingto treatment with tyrosine kinase inhibitors:review and recommendations forharmonizing current methodology for detecting BCR–ABL transcripts and kinase domainmutations and for expressing results.Blood[J].2006，108(1),28–37；Kantarjian H,Schiffer C,Jones D et al.Monitoring the response and course of chronic myeloidleukemia in the modern era of BCR–ABL tyrosine kinase inhibitors:practical adviceon the use and interpretation of monitoring methods[J].Blood,2008，111(4):1774–1780.)，因此对BCR-ABL融合基因的分型和定量检测对慢性粒细胞白血病(CML)的临床诊断和愈后检测意义重大。应用实时定量PCR(RQ—PCR)技术检测该基因，能为临床医生提供定量的检测结果，较定性检测有更大的临床应用价值。
市场上已有产品和比较成熟的检测技术：
(1)经典的细胞遗传学技术在白血病患者中的诊断价值早已得到公认，因其检测直观明确，不容易出现污染，可以标明每个患者Ph(+)细胞的百分率，因而可作为临床疗效判断指标之一。但细胞遗传学技术对一些染色体易位的亚显微结构则较难发现，国外一组急性白血病的细胞遗传学研究显示，传统细胞遗传学分析异常检出率仅为33.3％。染色体培养时间较长，一般需要1-2周，使其对白血病诊断及危险度分级带来极大的不便；染色体培养技术要求高，培养有时较易失败，即使培养成功也会出现部分细胞不分裂或细胞分裂象不足，这些均会导致常规的细胞遗传学无法检出阳性结果。Virgili等的研究也认为，常规的细胞遗传学方法难以快速对Ph染色体阳性及BCR-ABL融合基因阳性的CML患者作出诊断和预后判断(Virgili A,Brazma D,Reid AG,et al.FISH mapping of Philadelphia negative BCR/ABL1positiveCML[J].Molecular Cytogenetics,2008,18(1):14.)。此外，细胞遗传学对监测白血病患者的微小残留病变(minimal residual disease，MRD)方面效果也较差，这些都限制了细胞遗传学在白血病患者中的应用。
(2)市场已有产品主要以荧光原位杂交(FISH)方法为主，是利用标记的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)探针直接在染色体、细胞或组织水平定位特定靶核酸序列的分子细胞遗传学技术，可同时分析分裂期和间期的多个细胞，并进行定量；可以检测隐匿或微小的染色体畸变以及复杂核型；还可以使用多种荧光标记，显示片段及基因之间的相对位置与方向，空间定位精确。其具有快速、安全、经济、灵敏度高、特异性强等优点。应用基因特异性探针，可检测大多数染色体重排、易位、倒位等结构改变，对MRD的检测、临床疗效判断的检测、临床疗效的判定及预测预后也具有重要意义。其不受细胞中期分裂相的影响，可对间期细胞进行分析。但由于FISH检测的实验操作较复杂，标本处理不当时较难以检出，易出现假阳性的结果，费用较高，需要一定的设备，使FISH在临床的应用不易推广(LandegentJE,Jansen in de Wal N,Dirks RW,et al.Use of whole cosmid cloned genomic sequence forchromosomal localization by non-radioactive in situ hybridization[J].HumGenet,1987,77(4):366-370；Weissinger EM,Thalmeier K,Dull T,et al.Mosaicicm inbcr-abl protein expression in B cells in chronic myelogenous leukemia[J].Int JCancer,1996,68(5):577-582；吴彬，周淑云，刘晓力，等.联合应用FISH和巢式RT2PCR技术检测慢性髓系白血病bcr/abl融合基因[J].中华血液学杂志，2003,24(5)：235-237.)。
(3)蛋白质印迹法(Western Blot)可对外周血标本进行检测，阳性检出率高达99％。樊英芳等人的研究认为该方法与骨髓Ph染色体检测方法高度一致，为慢性粒细胞白血病的临床检测提供了新的简便方法，有较高的临床应用价值。但该法操作步骤复杂，处理样品需要合适的温度、pH值和足够的细胞数才可以取得较好的结果(樊英芳.BCR/ABL融合基因产物p210在白血病诊断中的临床意义[J].陕西医学杂志，2005,34(11)：1404-1406；王国蓉，于珍，赵耀中，等.慢性髓系白血病实时定量PCR检测的BCR-ABL水平与临床状态关系的分析[J].中国临床血液学杂志，2009,17(4)：861-865.)。
目前市场上主要销售的产品如下：
表1国内外上市产品情况(仅获取国家批准文号的产品)：
表2美国食品药物管理局(FDA)注册产品
表3欧洲共同体(CE)注册产品
3、随着检测技术不断的发展，对BCR-ABL融合基因的检测方法也在不断的进展，由传统的细胞遗传学方法到荧光原位杂交法，发展到分子水平的聚合酶链式反应，这些方法均可检出BCR-ABL转录本，但各种检测方法在样本处理和检测操作均有其优缺点，为了取得较好的检测结果，常常需要联合使用几种检测方法。但由于针对CML的分子靶向治疗的出现和发展，对CML的治疗效果也有了很大的提高，对微小残留病灶(MRD)的检测也显得愈发重要。
传统方法存在的一些问题：
1.检测灵敏性低，细胞遗传学为5％，FISH为0.5％，而PCR方法可以达到0.001-0.0001％，等同于可以在10000-100000个正常细胞中一个细胞既10-5-10-6个细胞水平所表达出的BCR-ABL融合基因RNA。
2.准确性差的缺点，传统细胞遗传学分析异常检出率仅为33.3％，当Ph+＜10％时易出现误差，其敏感度已经无法对白血病患者的微小残留病变(minimal residual disease，MRD)进行检测，这些都限制了细胞遗传学在白血病患者中的应用。
3.传统的细胞遗传学方法和FISH方法均不能对BCR-ABL融合基因进行基因分型，而本发明采用针对各种BCR-ABL融合基因类型的特异性引物和探针，可以在检测BCR-ABL是否存在的同时分辨出BCR-ABL融合基因的种类即基因型。
4.检测周期长，操作复杂及特殊仪器的使用，传统的细胞遗传学方法仅染色体培养一般就需要1-2周时间，且必须将细胞培养至细胞分裂期中期，大大增加了检测时间，染色体培养技术要求高，培养有时较易失败，即使培养成功也会出现部分细胞不分裂或细胞分裂象不足，这些均会导致常规的细胞遗传学无法检出阳性结果。FISH检测的实验操作较复杂，标本处理不当时较难以检出，易出现假阳性的结果，费用较高，需要一定的设备，使FISH在临床的应用不易推广。
因此，本领域迫切需要开发出能高效扩增BCR-ABL融合基因，且操作简单快速的扩增试剂盒和检测试剂盒，尤其对于MRD检测领域，优势更为明显。
发明内容
因此，本发明提供一种操作简单快速的人BCR-ABL融合基因扩增试剂盒，另一方面，还提供一种人BCR-ABL融合基因检测试剂盒。该试剂盒尤其是在MRD检测领域，优势更为明显。
本发明的第一方面，提供一种人BCR-ABL融合基因扩增试剂盒，所述试剂盒包含人BCR-ABL融合基因的引物序列和探针序列；
所述引物序列为：
b2a2上游引物：SEQ ID NO:3；b2a2下游引物:SEQ ID NO:4；
b3a2上游引物:SEQ ID NO:5；b3a2下游引物:SEQ ID NO:6；
e1a2上游引物:SEQ ID NO:7；e1a2下游引物:SEQ ID NO:8；
e19a2上游引物:SEQ ID NO:9,e19a2；下游引物:SEQ ID NO:10；
所述探针序列为：
b2a2探针序列：SEQ ID NO:11；b3a2探针序列：SEQ ID NO:12；
e1a2探针序列：SEQ ID NO:13；e19a2探针序列：SEQ ID NO:14。
上述试剂盒还包含人BCR-ABL融合基因定量标准品的引物序列和探针序列；
定量标准品上游引物:SEQ ID NO:1；定量标准品下游引物:SEQ ID NO:2；定量标准品探针序列：SEQ ID NO:15。
上述试剂盒组分为PCR反应液A、B、C：
PCR反应液A配方：
PCR反应液B配方：
PCR反应液C配方：
物品名称 最终浓度
核酸酶抑制剂 2.7u/ul
脱氧核糖核酸聚合酶 1.7u/ul
尿嘧啶-N-糖基化酶 1.7u/ul
反转录酶 21.3u/ul
纯化水 余量
本发明第二方面，提供一种人BCR-ABL融合基因检测试剂盒，所述试剂盒包括定量标准品引物序列和探针序列，PCR反应液和阳性对照；
所述阳性对照为分别含有SEQ ID NO:16-19的质粒；
所述PCR反应液包括权利要求1所述人BCR-ABL融合基因引物序列和探针序列；
所述定量标准品引物序列为：定量标准品上游引物:SEQ ID NO:1；定量标准品下游引物:SEQ ID NO:2；
所述定量标准品探针序列为SEQ ID NO:15。
上述阳性对照为分别含有SEQ ID NO:16-19的pMD18T质粒载体；上述PCR反应液包含PCR反应液A、B、C：
PCR反应液A配方：
PCR反应液B配方：
PCR反应液C配方：
物品名称 最终浓度
核酸酶抑制剂 2.7u/ul
脱氧核糖核酸聚合酶 1.7u/ul
尿嘧啶-N-糖基化酶 1.7u/ul
反转录酶 21.3u/ul
纯化水 余量
上述试剂盒还包括阴性对照,所述阴性对照为纯化水。
上述试剂盒组分为：
PCR反应液A配方：
PCR反应液B配方：
PCR反应液C配方：
物品名称 最终浓度
核酸酶抑制剂 2.7u/ul
脱氧核糖核酸聚合酶 1.7u/ul
尿嘧啶-N-糖基化酶 1.7u/ul
反转录酶 21.3u/ul
纯化水 余量
阳性对照：分别含有SEQ ID NO:16-19的pMD18T质粒载体；
阴性对照：纯化水；
定量标准品：含正常人ABL基因序列(SEQ ID NO:20)的质粒。
上述试剂盒还包括核酸抽提试剂。
上述核酸抽提试剂包括蛋白酶K、裂解液、洗涤液A、洗涤液B和洗脱液。
本发明的有益效果：本发明检测试剂盒由一步法反转录荧光探针定量PCR扩增试剂盒以及定量标准品和阴性、阳性对照组成。RNA抽提试剂可以采取市场上已有的产品，也可以按照本发明的配方提取，本发明RNA抽提试剂由裂解液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液组成，储存于4-8℃，扩增试剂由PCR反应液A、PCR反应液B、PCR反应液C组成。阳性对照包括BCR-ABL融合基因四种基因型序列的质粒的阳性对照，包括b2a2、b3a2、e1a2、e19a2四种，阴性对照为纯化水，定量标准品为含正常人ABL基因序列的质粒。
1.操作简单、快速，本发明RNA抽提部分采用柱抽法进行RNA抽提，操作简单，仅需要一般实验室所使用的离心机即可，在30分钟内便可完成样本RNA的抽提处理全过程，且扩增部分可一次进行最多96个样本的测试(含1个阴性对照样本)。
2.降低耗材的使用以便降低检测成本，采用本专利的方法在操作的全过程中需要的耗材只有RNA抽提所使用的2ml离心管、RNA纯化柱、扩增使用的八连管或96孔板以及移液器吸头。
3.检测结果准确，降低假阳性结果的出现，在扩增步骤加入阴性对照和阳性对照，内参，以此可以有效提高对假阳性和假阴性出现的判断。
4.对实验污染的有效减少：a.本专利采用一步法反转录荧光定量方法，既将信使核糖核酸(mRNA)的反转录以及互补脱氧核糖核酸(cDNA)的PCR扩增所用试剂组分一次性加入反应管中并采用荧光定量PCR仪进行扩增反应，避免中途打开反应管加入新的反应试剂组分而导致实验受到污染，进而造成实验数据不准确；b.加入尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG)并以dUTP替代dNTP等PCR污染控制措施可有效防止PCR的污染；c.采用TaqMan MGB探针(美国AppliedBiosystems公司生产)以避免传统TaqMan(美国Applied Biosystems公司生产)探针产生的本底荧光对检测结果的影响；
5.更高的检测限和更高的检测精密度，采用柱抽法可尽量减少在RNA抽提过程中RNA的损失和各样本抽提之间效率的差异，且PCR方法可对目的基因片段进行指数增长式的扩增，因此本专利具有更高的检测精密度和检测限。
本发明的其他方面由于本文的公开内容，对本领域技术人员而言是显而易见的。
以下结合实施例对本发明进行详细说明。
附图说明
图1浓度呈十倍梯度定量标准品扩增结果
Amplification plot：扩增图谱
△Rn：在给定的一组PCR条件下所生成信号的量值
Cycle：循环
图2十倍梯度定量标准品扩增结果标准曲线
Stand curve：标准曲线
Target：检测目标
Slope：斜率
R2：相关系数
Eff％：扩增效率
图3精密度扩增结果
图4检测限扩增结果
图5b2a2基因型样本检测结果
圆圈圈定部分为FAM通道检测曲线；方框圈定部分为CY5通道检测曲线。
图6b3a2基因型样本检测结果
圆圈圈定部分为JOE通道检测曲线；方框圈定部分为CY5通道检测曲线。
图7e1a2基因型样本检测结果
圆圈圈定部分为ROX通道检测曲线；方框圈定部分为CY5通道检测曲线。
图8e19a2基因型样本检测结果
圆圈圈定部分为CY3通道检测曲线；方框圈定部分为CY5通道检测曲线。
图9定量标准品序列(位于ABL基因上，SEQ ID NO:20)
图10阳性对照1序列(b2a2：SEQ ID NO:16)
图11阳性对照2序列(b3a2：SEQ ID NO:17)
图12阳性对照3序列(e1a2：SEQ ID NO:18)
图13阳性对照4序列(e19a2：SEQ ID NO:19)
图9-图13中单下划线为引物序列位置，双下划线为探针序列位置
具体实施方式
本专利检测方法主要包括样本处理即样本核酸的提取和核酸扩增、检测三部分，在核酸扩增检测部分，考虑到引物探针为核酸序列以及反转录酶、Taq脱氧核糖核酸聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶的稳定性，因此将PCR反应液分为A、B、C三组，便于保证扩增试剂盒和检测试剂盒中各反应液的稳定性，在使用时再按照比例混合使用。本发明经过发明人大量实验，确定出以下序列和试剂盒配方，以快速高效地进行样品PCR扩增和检测，操作方便，节约了大量时间。对设备要求也低。具体试剂盒包含试剂和检测步骤如下所示：
实施例1试剂盒组分及使用方法
表4核酸扩增试剂盒1
表5核酸检测试剂盒1
表6核酸检测试剂盒2
具体检测步骤如下所示：
1. RNA抽提步骤(RNA抽提试剂也可选用市场上已有的产品，如：a、宝生物工程有限公司产品RNAiso Blood，b、天根生化科技(北京)有限公司产品血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒等)：
将裂解液置70℃加热5分钟，使试剂瓶内的结晶全部溶解。实验前在洗涤液A中加入9ml无水乙醇(自备)、洗涤液B中加入16ml无水乙醇并颠倒混匀备用,将定量标准品10倍梯度稀释成4个梯度。
计算测试总数(N)(N＝待测标本数N+阴性对照数1支+阳性对照数4支+定量标准品4支)。
1.1取N个1.5mL离心管(N＝待测标本数量N+阴性对照1支+阳性对照4支+定量标准品4支)，作好标记后分别加入40μL蛋白酶K；
1.2分别加入200μL待测样本(血液：血液样本来源于上海市第七人民医院)、阴性对照、阳性对照，并反复吹打5次混匀或振荡5～10秒，充分混匀；
1.3分别加入200μL裂解液，盖上管盖，振荡5～10秒，充分混匀，瞬时离心后置70℃孵育10分钟；
1.4瞬时离心后加入220μL无水乙醇，振荡5～10秒，充分混匀。瞬时离心，将管盖和管壁上的液体离心下来；
1.5将作好标记的核酸提取柱插入2mL离心管中，盖上管盖，10000×g离心1分钟；
1.6将作好标记的核酸提取柱插入新的2mL离心管中并加入700μL洗涤液A，盖上管盖，10000×g离心1分钟；
1.7将作好标记的核酸提取柱插入新的2mL离心管中并加入700μL洗涤液B，盖上管盖，10000×g离心1分钟；
1.8将作好标记的核酸提取柱插入新的2mL离心管中，盖上管盖，20000×g离心3分钟，将残液去除干净；
1.9将核酸提取柱取出，放入新的2mL离心管中，小心加入50μL洗脱液至膜面的中央位置，盖上管盖，静置1分钟，同时做好标记；
1.10 13000×g离心1分钟，离心管中收集的液体即为PCR反应模板。
2. PCR试剂准备
2.1取出PCR反应液A、PCR反应液B和PCR反应液C，置室温下融化后，振荡5～10秒，瞬时离心后备用；
2.2计算测试总数(N)(N＝待测标本数N+阴性对照数1支+阳性对照数4支+定量标准品4支)，按10：8：2(PCR反应液A：PCR反应液B：PCR反应液C)的比例配制PCR反应液，依次加入各组份后，振荡5～10秒，瞬时离心，以每个测试20μL的量将PCR反应液分装至PCR反应管中。
3.加样
在装有PCR反应液的反应管中分别加入20μL待测模板(样本处理步骤1.10离心管中收集的液体)，盖上管盖，离心数秒后进行PCR扩增检测。
4.扩增程序：
扩增可使用的仪器：ABI7500,LightCycler480。
表7 PCR扩增参数
表8 PCR扩增所使用的引物序列：
表9 PCR扩增所使用的探针序列
以上序列依次为SEQ ID NO:11-15。
表10 PCR反应液A配方：
表11 PCR反应液B配方：
表12 PCR反应液C配方：
物品名称 最终浓度
核酸酶抑制剂 2.7u/ul
脱氧核糖核酸聚合酶 1.7u/ul
尿嘧啶-N-糖基化酶 1.7u/ul
反转录酶 21.3u/ul
纯化水 至0.1ml
表13蛋白酶K配方：
物品名称 300ml加入量
蛋白酶K 2g
超纯水 300mL
表14裂解液配方：
物品名称 1L加入量
硫氰酸胍 467.5g
2M氯化钾 240ml
2M三羟甲基氨基甲烷 5ml
0.5M乙二胺四乙酸 2ml
1M盐酸 调节pH值至6.2
聚乙二醇辛基苯基醚 10ml
纯化水 定容至1000ml
表15洗涤液A配方：
表16洗涤液B配制
表17洗脱液配方：
物品名称 1L加入量
氯化钠 1.7g
纯化水 定容至1000ml
待检测样本的定量检测：
浓度本专利中定量参考品为含有定量标准品序列的质粒，其浓度可用分光光度计测试获得，再将其十倍浓度梯度进行稀释成4个浓度便可获得本专利测试时使用的定量标准品，在与待测样本同时进行扩增检测后，对定量参考品进行浓度赋值便可由扩增仪器自动计算出定量标准品的荧光信号强度与的线性关系，根据其线性关系的可靠性判断实验结果的可信度。定量标准品扩增结果如图1，其浓度与检测获得的CT值的线性关系如图2，其斜率为3.394，R2为1，显示出非常良好的线性关系，因此对样本的相对定量结果具有很好的可信度。
精密度：
在测试精密度时，将同一样本进行十次重复抽提并同时进行扩增，扩增结果如图3，扩增结果CT值如表1所示，经计算其CT值变异系数(CV)值为2.48％，表现出良好的精密度。
表18精密度扩增结果CT值
检测限：
将定量标准品十倍梯度稀释至4×107、4×106、4×105、4×104拷贝进行扩增，结果如图4所示，检测结果良好，再将定量标准品十倍梯度稀释至400拷贝和100拷贝两个浓度梯度进行扩增，各扩增46个复孔，扩增结果如图5所示，在400拷贝时有46个复孔均为阳性，检出率为100％，在100拷贝时有44个复孔均为阳性，2个复孔为阴性，检出率为(44/46)×100％＝95.65％，显示出极高的检出率以及良好的检测限。
样本检测结果：
根据扩增结果选择各检测目的基因型的探针检测通道，并对各通道设置不同的显示颜色便可直观的通过扩增结果图看出样本的基因型，结果如图5(b2a2)、6(b3a2)、7(e1a2)、8(e19a2)所示。
样本检测结果的相对定量分析：
样本的相对定量分析采用2-△△Ct法进行分析。
x(相对表达倍数)＝2-△△CT
△△Ct＝△E–△C
△E＝Ct实验组目的基因–Ct(ABL基因)
△C＝Ct对照组目的基因–Ct(ABL基因)
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种人BCR-ABL融合基因扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含人BCR-ABL融合基因的引物序列和探针序列；
所述引物序列为：
b2a2上游引物：SEQ ID NO:3；b2a2下游引物:SEQ ID NO:4；
b3a2上游引物:SEQ ID NO:5；b3a2下游引物:SEQ ID NO:6；
e1a2上游引物:SEQ ID NO:7；e1a2下游引物:SEQ ID NO:8；
e19a2上游引物:SEQ ID NO:9,e19a2；下游引物:SEQ ID NO:10；
所述探针序列为：
b2a2探针序列：SEQ ID NO:11；b3a2探针序列：SEQ ID NO:12；
e1a2探针序列：SEQ ID NO:13；e19a2探针序列：SEQ ID NO:14。
2.一种人BCR-ABL融合基因扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含人BCR-ABL融合基因定量标准品的引物序列和探针序列；
定量标准品上游引物:SEQ ID NO:1；定量标准品下游引物:SEQ ID NO:2；定量标准品探针序列：SEQ ID NO:15。
3.如权利要求2所述人BCR-ABL融合基因扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒组分为PCR反应液A、B、C：
PCR反应液A配方：
PCR反应液B配方：
PCR反应液C配方：
物品名称 最终浓度 核酸酶抑制剂 2.7u/ul 脱氧核糖核酸聚合酶 1.7u/ul 尿嘧啶-N-糖基化酶 1.7u/ul 反转录酶 21.3u/ul 纯化水 余量
4.一种人BCR-ABL融合基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括定量标准品引物序列和探针序列，PCR反应液和阳性对照；
所述阳性对照为分别含有SEQ ID NO:16-19的质粒；
所述PCR反应液包括权利要求1所述人BCR-ABL融合基因引物序列和探针序列；
所述定量标准品引物序列为：定量标准品上游引物:SEQ ID NO:1；定量标准品下游引物:SEQID NO:2；
所述定量标准品探针序列为SEQ ID NO:15。
5.一种人BCR-ABL融合基因检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为分别含有SEQ IDNO:16-19的pMD18T质粒载体；所述PCR反应液包含PCR反应液A、B、C：
PCR反应液A配方：
PCR反应液B配方：
PCR反应液C配方：
物品名称 最终浓度 核酸酶抑制剂 2.7u/ul 脱氧核糖核酸聚合酶 1.7u/ul 尿嘧啶-N-糖基化酶 1.7u/ul 反转录酶 21.3u/ul 纯化水 余量
6.如权利要求5所述检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照,所述阴性对照为纯化水。
7.如权利要求5所述检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒组包含以下组分：
PCR反应液A配方：
PCR反应液B配方：
PCR反应液C配方：
物品名称 最终浓度
核酸酶抑制剂 2.7u/ul 脱氧核糖核酸聚合酶 1.7u/ul 尿嘧啶-N-糖基化酶 1.7u/ul 反转录酶 21.3u/ul 纯化水 余量
阳性对照：分别含有SEQ ID NO:16-19的pMD18T质粒载体；
阴性对照：纯化水；
定量标准品：含正常人ABL基因序列(SEQ ID NO:20)的质粒。
8.如权利要求4-7任一权利要求所述检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸抽提试剂。
9.如权利要求8所述检测试剂盒，其特征在于，所述核酸抽提试剂包括蛋白酶K、裂解液、洗涤液A、洗涤液B和洗脱液。
CN201510447596.4A 2015-07-27 2015-07-27 一种bcr-abl融合基因扩增试剂盒和检测试剂盒 Pending CN106399462A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510447596.4A CN106399462A (zh) 2015-07-27 2015-07-27 一种bcr-abl融合基因扩增试剂盒和检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510447596.4A CN106399462A (zh) 2015-07-27 2015-07-27 一种bcr-abl融合基因扩增试剂盒和检测试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106399462A true CN106399462A (zh) 2017-02-15

Family

ID=58008506

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510447596.4A Pending CN106399462A (zh) 2015-07-27 2015-07-27 一种bcr-abl融合基因扩增试剂盒和检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106399462A (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106978489A (zh) * 2017-04-05 2017-07-25 上海睿玻生物科技有限公司 一种新型恒温pcr‑反向斑点杂交基因检测方法
CN106987599A (zh) * 2017-03-28 2017-07-28 重庆医科大学 采用锌指核酸酶技术破坏人bcr‑abl融合基因以抑制CML细胞增殖和促使其凋亡
CN108103155A (zh) * 2018-01-16 2018-06-01 良培基因生物科技（武汉）有限公司 ddPCR技术检测BCR/ABL融合基因的引物及其检测方法
CN110358825A (zh) * 2018-04-09 2019-10-22 苏州云泰生物医药科技有限公司 检测人bcr-abl融合基因的试剂盒及其使用方法
CN111876486A (zh) * 2020-08-13 2020-11-03 领航基因科技（杭州）有限公司 一种bcr-abl1融合基因三种亚型分型检测试剂盒
CN113403392A (zh) * 2021-02-20 2021-09-17 北京金则医学检验实验室有限公司 一种用于检测微小残留病灶的组合物及试剂盒
CN114774525A (zh) * 2022-04-01 2022-07-22 孙家和 一种检测bcr-abl融合基因的era引物和探针及试剂盒
CN115044675A (zh) * 2022-06-09 2022-09-13 广州血康陆道培生物技术有限公司 一种检测bcr-abl1融合基因亚型p190型的引物组及试剂盒

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1454994A1 (en) * 2003-03-07 2004-09-08 Université de la Méditerranée Standardized and optimized real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction method for detection of MRD in leukemia
CN1995386A (zh) * 2006-08-22 2007-07-11 上海复星医药（集团）股份有限公司 Bcr－abl基因荧光定量rt－pcr引物和探针及试剂盒
CN101624621A (zh) * 2008-07-11 2010-01-13 北京大学人民医院 一种定量检测BCR/ABL mRNA水平的试剂盒
CN102251031A (zh) * 2011-06-30 2011-11-23 北京思尔成生物技术有限公司 白血病融合基因的TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测方法及其专用引物、探针与试剂盒
CN102925556A (zh) * 2012-09-29 2013-02-13 童永清 一种检测m BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒
CN103571945A (zh) * 2013-09-27 2014-02-12 沈阳艾迪康医学检验所有限公司 筛查和鉴定bcr-abl非常见融合型别的方法、引物、探针和试剂盒

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1454994A1 (en) * 2003-03-07 2004-09-08 Université de la Méditerranée Standardized and optimized real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction method for detection of MRD in leukemia
CN1995386A (zh) * 2006-08-22 2007-07-11 上海复星医药（集团）股份有限公司 Bcr－abl基因荧光定量rt－pcr引物和探针及试剂盒
CN101624621A (zh) * 2008-07-11 2010-01-13 北京大学人民医院 一种定量检测BCR/ABL mRNA水平的试剂盒
CN102251031A (zh) * 2011-06-30 2011-11-23 北京思尔成生物技术有限公司 白血病融合基因的TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测方法及其专用引物、探针与试剂盒
CN102925556A (zh) * 2012-09-29 2013-02-13 童永清 一种检测m BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒
CN103571945A (zh) * 2013-09-27 2014-02-12 沈阳艾迪康医学检验所有限公司 筛查和鉴定bcr-abl非常见融合型别的方法、引物、探针和试剂盒

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BURMEISTER,T等: "GenBank: AF113911.1", 《NCBI-GENBANK》 *
BURMEISTER,T等: "GenBank: AJ131466.1", 《NCBI-GENBANK》 *
BURMEISTER,T等: "GenBank: AM491363.1", 《NCBI-GENBANK》 *
DE KLEIN等: "GenBank: M25946.1", 《NCBI-GENBANK》 *
EMAD-ALDIN I.等: "Frequencies of BCR-ABL1 fusion transcripts among Sudanese chronic myeloid leukaemia patients", 《GENETICS AND MOLECULAR BIOLOGY》 *
GROFFEN,J等: "GenBank: AH005332.2", 《NCBI-GENBANK》 *
MARJAN YAGHMAIE MSC等: "Frequency of BCR-ABL Fusion Transcripts in Iranian Patients with Chronic Myeloid Leukemia", 《ARCHIVES OF IRANIAN MEDICINE,》 *
NEUMANN F等: "Quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction for diagnosis of BCR-ABL positive leukemias and molecular monitoring following allogeneic stem cell transplantation", 《EUROPEAN JOURNAL OF HAEMATOLOGY 》 *
R.M. ARANA-TREJO等: "BCR/ABL p210, p190 and p230 fusion genes in 250 Mexican patients with chronic myeloid leukaemia (CML)", 《CLIN LAB HAEMATOL》 *
桂晓敏等: "伴不典型BCR．ABL融合基因的慢性髓性白血病的临床和实验研究", 《中华血液学杂志》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106987599A (zh) * 2017-03-28 2017-07-28 重庆医科大学 采用锌指核酸酶技术破坏人bcr‑abl融合基因以抑制CML细胞增殖和促使其凋亡
CN106978489A (zh) * 2017-04-05 2017-07-25 上海睿玻生物科技有限公司 一种新型恒温pcr‑反向斑点杂交基因检测方法
CN108103155A (zh) * 2018-01-16 2018-06-01 良培基因生物科技（武汉）有限公司 ddPCR技术检测BCR/ABL融合基因的引物及其检测方法
CN110358825A (zh) * 2018-04-09 2019-10-22 苏州云泰生物医药科技有限公司 检测人bcr-abl融合基因的试剂盒及其使用方法
CN111876486A (zh) * 2020-08-13 2020-11-03 领航基因科技（杭州）有限公司 一种bcr-abl1融合基因三种亚型分型检测试剂盒
CN113403392A (zh) * 2021-02-20 2021-09-17 北京金则医学检验实验室有限公司 一种用于检测微小残留病灶的组合物及试剂盒
CN114774525A (zh) * 2022-04-01 2022-07-22 孙家和 一种检测bcr-abl融合基因的era引物和探针及试剂盒
CN115044675A (zh) * 2022-06-09 2022-09-13 广州血康陆道培生物技术有限公司 一种检测bcr-abl1融合基因亚型p190型的引物组及试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106399462A (zh) 一种bcr-abl融合基因扩增试剂盒和检测试剂盒
CN105483218B (zh) 检测和/或预测男性生殖功能障碍的精浆piRNA标志物或其组合及其应用
CN107660234A (zh) 使用二代测序预测器官移植排斥的方法
CN104561331B (zh) 一种检测白血病相关融合基因的引物和探针、及其试剂盒
CN108504742A (zh) 一种基于数字pcr技术检测her-2基因拷贝数变异的试剂盒及方法
CN105274190A (zh) 一种检测cyp3a4*1g和mdr1c1236t的基因多态性的hrm方法
CN107988369A (zh) 一种同时检测人egfr基因45个突变位点的试剂盒
CN113718021A (zh) 一种定量检测bcr-abl1融合基因的引物、探针及其试剂盒
CN104673891A (zh) 一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变的检测方法及试剂盒
CN108642156A (zh) 一种t790m基因突变的数字pcr检测试剂盒及其检测方法
CN106498029B (zh) 提高egfr的t790m突变的诊断效率的方法
CN107513577A (zh) 一种高效检测egfrt790m突变体的方法以及用于检测的探针和试剂盒
CN106498028B (zh) Egfr的t790m突变的诊断方法及试剂盒
CN104531881A (zh) 一种人k-ras基因突变荧光pcr检测试剂盒
CN108728538B (zh) Alk基因融合检测引物、方法及试剂盒
CN105950766A (zh) 一种用于检测hla-b*5801等位基因的引物组及试剂盒
CN103725787B (zh) 一种白血病融合基因荧光pcr检测试剂盒
CN103060315B (zh) 一种预测前列腺癌易感性的检测试剂盒和方法
CN110438226B (zh) 一种检测顺反式突变的试剂盒、样品处理方法及判定方法
CN107164510A (zh) 一种辅助诊断脑卒中的检测试剂盒及其检测方法
CN106811537A (zh) 一种检测表皮生长因子受体基因t790m低频突变引物及其应用
CN104498616A (zh) 一种人egfr基因突变荧光pcr检测试剂盒
CN103740835B (zh) 一种白血病融合基因荧光pcr检测试剂盒
CN111206099A (zh) 一种检测egfr基因l858r位点突变的试剂盒
CN109880904A (zh) 外周血浆中egfr基因外显子19缺失突变的检测方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20170215