CN104498616A - 一种人egfr基因突变荧光pcr检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种人EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包含检测第20号外显子T790M突变的引物探针序列的PCR反应液，其中其上游引物TM-F、下游引物TM-R和探针TM-P的序列分别为：TM-F：5'-CCACCGTGCAGCTCGTTAT-3'，TM-R：5'-AGCAGGTACTGGGAGCCAATA-3'，TM-P：5'-CAGCTCATGCCCTTCGGCTGCC-3'。本发明提供的试剂盒在100ng/反应的野生型人DNA背景下无扩增信号，不出现假阳性情况，说明本发明试剂盒的特异性好、抗干扰能力强。应用该试剂盒，可以对临床石蜡切片等样本中的人EGFR基因突变进行快速检测，为诊断相关肿瘤治疗提供可靠的实验依据。

Description

一种人EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒

技术领域

本发明提供一种人EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒。

背景技术

EGFR(epidermal growth factor receptor)即表皮生长因子受体，是一种跨膜受体酪氨酸激酶，正常情况下包埋在细胞表面的细胞膜中，是一种对肿瘤细胞的繁殖、生长、修复和存活等起重要作用的膜蛋白。一般认为该酪氨酸激酶区域的激活即磷酸化对癌细胞增殖、生长的相关信号传递很重要。基于这个观点，EGFR作为癌症治疗的分子靶标受到普遍关注，并陆续开发出了EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)和抗EGFR抗体等。

异常的EGFR活化能够促进肿瘤细胞的增殖、迁移、分化、血管新生，并且能够抑制肿瘤细胞的凋亡。异常的EGFR活化机制包括受体本身的扩增、受体配体的过表达、活化突变以及负性调节途径的缺乏。EGFR诱导癌症至少通过3种机制：EGFR配体的过表达、EGFR的扩增或EGFR的突变活化。其中以EGFR的突变活化为主要机制。各项研究也表明EGFR在多种肿瘤细胞中存在突变或扩增的情况。已经检测到的突变数量最多的是非小细胞肺癌。

在癌症治疗中，传统的化疗和放疗由于缺乏特异性，取得疗效的同时也往往给患者带来较大的毒副作用。因此，选择特异的分子靶点进行治疗日益受到人们的重视。在取得明显疗效的同时，又可以避免对正常细胞的伤害。EGFR是目前国内外研究者公认的一个肿瘤靶向治疗分子。目前靶向EGFR的药物主要有两类：一类是作用与EGFR胞外区的单克隆抗体，这类抗体能与EGFR胞外配体结合部位结合，阻断了EGFR其与配体的结合，从而阻断下游信号转导途径；一类是作用与胞内酪氨酸激酶活性区域的小分子酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)，如gefitinib和erlotinib。酪氨酸激酶抑制剂主要为小分子喹啉类化合物，能够与细胞内酪氨酸激酶结构域上ATP位点竞争性结合，可逆性、选择性抑制EGFR相关的酪氨酸激酶活性及细胞内磷酸化过程，进而抑制EGFR下游的信号转导，从而阻断EGFR诱导的体外肿瘤细胞的生长，加速细胞凋亡、拮抗血管生成、抑制肿瘤转移、阻断肿瘤生长。

目前FDA已经批准的作用于EGFR的靶向药物包括EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)，例如吉非替尼(易瑞沙，阿斯利康制造)和厄洛替尼(特罗凯，罗氏制造)。临床应用表明，EGFR-TKI仅对部分病人有效，进一步研究发现，EGFR基因外显子18，19，21突变是EGFR-TKI靶向药物起作用的前提条件；而外显子20Ins/T790M突变是造成继发耐药的主要原因。因此，专家推荐在使用EGFR-TKI靶向药物之前进行EGFR基因外显子20的突变检测有助于提高用药的针对性，避免不必要的损失。

随着人类医学和药物研究水平的提高，药理遗传学(Pharmacogenetics)日渐兴起。研究表明，药物在体内的代谢、药物治疗的有效性以及副反应、甚至患者的预后都存在个体差异，受患者基因背景的影响。因此，应用药理遗传学，在基因水平上研究药物作用的个体差异，使得个性化治疗这一新一代医学概念成为可能。对药物作用相关基因的检测，可指导医生对患者准确施药，规避药物副作用，同时提高病人乃至社会的医疗费用效率。

随着分子生物学的飞速发展，越来越多的分子生物学方法应用于检测人EGFR基因突变，主要包括测序、基因芯片、探针杂交技术等。而随着FQ-PCR技术的发展，其在人EGFR基因突变诊断领域的应用已越来越广泛，也越来越为人所重视，人EGFR基因突变的实验诊断中，实时荧光PCR技术凭借着快速、敏感、特异等优点显示出了其临床诊断的优越性。

而基于荧光PCR技术与等位基因特异性PCR技术(ARMS-PCR)结合检测人EGFR基因突变的方法被越来越多的研发人员尝试使用。实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点(即Ct值)以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果。等位基因特异PCR(ARMS-PCR)的基本原理是，TaqDNA聚合酶缺少3→5外切酶活性，在一定条件下PCR引物3末端的错配导致产物的急剧减少，针对不同的已知突变，设计适当的引物可以通过PCR方法直接达到区分突变型和野生型基因的目的。

国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术与ARMS-PCR技术检测人EGFR基因突变的试剂盒应用于临床检测中，然而此方法有很多不足之处：1)对于野生型背景的耐受能力差，例如仅能耐受10ng野生型核酸的干扰，且经常出现假阳性；2)一般没有设置阳性内对照(即内标)，无法监控假阴性；3)一般没有预防PCR产物污染的措施。

发明内容

本发明的目的在于解决现有人EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒的缺陷，提供一种操作快速、方法简便、检测灵敏度高、检测范围宽的人EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒，应用该试剂盒，可以对临床石蜡切片等样本中的人EGFR基因突变进行快速检测，为诊断相关肿瘤治疗提供可靠的实验依据。

因此，本发明提供一种人EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包含检测第20号外显子T790M突变的引物探针序列的PCR反应液，其中其上游引物TM-F、下游引物TM-R和探针TM-P的序列分别为：

TM-F：5'-CCACCGTGCAGCTCGTTAT-3'，

TM-R：5'-AGCAGGTACTGGGAGCCAATA-3'，

TM-P：5'-CAGCTCATGCCCTTCGGCTGCC-3'。

本发明提供的试剂盒在100ng/反应的野生型人DNA背景下无扩增信号，不出现假阳性情况，说明本发明试剂盒的特异性好、抗干扰能力强。

优选地，所述试剂盒中还包含检测第20号外显子中三种插入突变的引物探针序列的PCR反应液，检测每种插入突变的PCR反应液中均包含上游引物序列、下游引物序列和探针各一条，其中检测三种插入突变insCAC、insGGT和insGCCAGCGTG的上游引物序列分别为Ex20Ins-F1、Ex20Ins-F2和Ex20Ins-F3；检测所述三种插入突变的下游引物序列均为Ex20Ins-R，探针序列均为Ex20Ins-P；

Ex20Ins-F1：5'-GGCCAGCGTGGACGGT-3'，

Ex20Ins-F2：5'-GATGGCCAGCGTGGCCA-3'，

Ex20Ins-F3：5'-AGTGGACAACCCCCACCAC-3'，

Ex20Ins-R：5'-TCCAGGAGGCAGCCGAAG-3'，

Ex20Ins-P：5'-TGGACAACCCCCACGTGTGCC-3'。

在一种具体的实施方式中，所述试剂盒中还包含内标序列，以及在所述PCR反应液中还包含检测内标的引物探针序列，

内标序列为5’-CTGTCATCACTTAGACCTCACCCTGTGGAGCCACACCCTAGGGTTGGCCAATCTACTCCCAGGAGCAGGGAGGGCAGGAGCCAGGGCTGGGCATAAAAGTCAGGGCAGAGCCATCTATTGCTTACATTTGCTTC-3’，

内标上游引物G-F：5’-CTGTCATCACTTAGACCTCACCCTG-3’，

内标下游引物G-R：5’-GAAGCAAATGTAAGCAATAGATGGC-3，

内标探针G-P：5’-HEX-AGCCACACCCTAGGGTTGGCCAATC-BHQ1-3’。

本领域技术人员能理解的，当所述试剂盒中只含检测第20号外显子T790M突变的PCR反应液时，所述PCR反应液中含有内标的引物探针序列；当所述试剂盒中一共含四种不同的PCR反应液时，每种PCR反应液中均含有内标的引物探针序列。

优选地，所述试剂盒中还包括预防PCR产物污染的酶混合液，所述酶混合液中包括耐热DNA聚合酶1U/μl～5U/μl和尿嘧啶DNA糖基化酶0.05U/μl～0.2U/μl；且在所述PCR反应液中还包含dUTP。

在一种具体的实施方式中，所述试剂盒中还包括EGFR阳性对照和EGFR阴性对照。

具体实施方式

本发明通过下述实施例进一步说明本发明，但实施例并不用于限制本发明。

实施例1

本实施例中提供一种具体的人EGFR基因突变核酸检测试剂盒，所述试剂盒中包括如下组分。

①内标(阳性内对照)：本发明所采用的内标为人类基因组DNA中的管家基因β-actin，预防由于样本中可能存在的PCR干扰物质或者样本核酸浓度太低所导致的假阴性；目标序列如下所示：

5’-CTGTCATCACTTAGACCTCACCCTGTGGAGCCACACCCTAGGGTTGGCCAATCTACTCCCAGGAGCAGGGAGGGCAGGAGCCAGGGCTGGGCATAAAAGTCAGGGCAGAGCCATCTATTGCTTACATTTGCTTC-3’。

②PCR反应液：本试剂盒包括4种PCR反应液，分别检测点突变Ex20T790M和另一突变位置的插入突变Ex20insCAC、Ex20insGGT和Ex20insGCCAGCGTG共计4种突变。

Ex20T790M突变检测反应液：10×PCR反应缓冲液5μl，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸扩增的上下游引物TM-F与TM-R，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针TM-P，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于内标片段扩增的上下游引物G-F与G-R，0.1μmol/L～0.2μmol/L的用于检测内标的探针G-P。

Ex20insCAC突变检测反应液：10×PCR反应缓冲液5μl，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸扩增的上下游引物Ex20Ins-F1与Ex20Ins-R，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针Ex20Ins-P，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于内标片段扩增的上下游引物G-F与G-R，0.1μmol/L～0.2μmol/L的用于检测内标的探针G-P。

Ex20insGGT突变检测反应液：10×PCR反应缓冲液5μl，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸扩增的上下游引物Ex20Ins-F2与Ex20Ins-R，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针Ex20Ins-P，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于内标片段扩增的上下游引物G-F与G-R，0.1μmol/L～0.2μmol/L的用于检测内标的探针G-P。

Ex20insGCCAGCGTG突变检测反应液：10×PCR反应缓冲液5μl，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸扩增的上下游引物Ex20Ins-F3与Ex20Ins-R，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针Ex20Ins-P，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于内标片段扩增的上下游引物G-F与G-R，0.1μmol/L～0.2μmol/L的用于检测内标的探针G-P。

所述10×PCR反应缓冲液包括pH7.5的200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、30mmol/L氯化镁溶液、500mmol/L氯化钾溶液、0.2％(体积/体积)曲拉通溶液和10％(体积/体积)甲酰胺溶液；所述脱氧核糖核苷三磷酸选自dATP、dCTP、dUTP、dGTP和dTTP；所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物及用于靶多核苷酸检测的探针是源于人EGFR基因耐药突变区域的引物和探针，其碱基对序列见表1。

表1

所述的用于检测内标的引物探针序列分别为：

上游引物G-F：5’-CTGTCATCACTTAGACCTCACCCTG-3’；

下游引物G-R：5’-GAAGCAAATGTAAGCAATAGATGGC-3；

探针G-P：5’-HEX-AGCCACACCCTAGGGTTGGCCAATC-BHQ1-3’；

③酶混合液：耐热DNA聚合酶(Taq酶)1U/μl～5U/μl，尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)0.05U/μl～0.2U/μl；其中UNG酶具有降解含有dU的PCR产物的功能，利用UNG酶和PCR反应液中的dUTP可以起到预防PCR产物污染的作用；

④EGFR阳性对照：为针对4种突变位点所在区域合成质粒的混合物以及包含内标目的序列片段的质粒，经合格的试剂盒检测，Ct值≤30。

⑤EGFR阴性对照：以灭菌水稀释的内标目的序列片段的质粒为待测样本，经合格的试剂盒检测为阴性后作为阴性对照。

实施例2

本实施例中提供实施例1中所述人EGFR基因突变核酸检测试剂盒用于检测石蜡切片所提取的核酸样本中的EGFR基因突变情况的操作方法。

1.试剂准备(在试剂准备区进行)

取出包装盒中的各组分，室温放置，待其温度平衡至室温后，混匀后备用。

根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，按比例(Ex20T790M突变检测反应液反应液43μl/人份+酶混合液2μl/人份；Ex20insCAC突变检测反应液反应液43μl/人份+酶混合液2μl/人份；Ex20insGGT突变检测反应液反应液43μl/人份+酶混合液2μl/人份；Ex20insGCCAGCGTG突变检测反应液反应液43μl/人份+酶混合液2μl/人份；)取相应量的PCR反应液及酶混合液，充分混匀成PCR-mix，瞬时离心后备用。

将上述准备好的试剂转移至样本处理区，待用。

2.样本处理(在样本处理区进行)

使用商业化的石蜡切片核酸提取试剂盒(推荐使用天根石蜡基因组DNA提取试剂盒，DP330)提取DNA。

根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，每个反应管加入45μlPCR-mix。吸取已处理的样本DNA、阴性对照、阳性对照各5μl加入PCR-mix中，盖好管盖。

3.PCR扩增(在扩增与分析区进行)

将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置阴性对照、阳性对照。

荧光检测通道选择(以ABI 7500仪器为例)：1)选择FAM(Reportere:FAM,Quencher:None)通道检测靶核苷酸；2)内标选择HEX或VIC通道检测(Reporter:VIC,Quencher:None)。参比荧光(Passive Reference)设置为ROX。

循环参数设定：

设置完毕，保存文件，运行反应程序。

4结果分析

反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析)，然后记录样本Ct值。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct(即cycle threshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值)。如果样本扩增曲线呈S型，有Ct值且Ct≤39，可以判为阳性；如果样本扩增曲线平直，无Ct值显示(Undet)显示，可以判为阴性。

本领域技术人员知道的，EGFR基因中的两个突变位点(对应4种突变类型)与临床中EGFR-TKI靶向药物的抗药性有关。且若发生上述4种突变类型中的任一种，都说明病人不适合使用该类药物。在这四种突变类型中，T790M点突变是更为常见的；因此，在本发明提供的人EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒中，也可以只包括检测T790M点突变的PCR反应液，而不包括检测另外三种插入突变的PCR反应液。

本实施例中对Genbank中检索到的人EGFR基因序列，针对4种突变分别设计了多条特异性ARMS引物以及下游引物和探针，经优化，筛选出了扩增效果最好的本发明中的引物和探针，可检测出人EGFR基因的4种突变，并且在100ng/反应的野生型DNA背景下不能检测出野生型人EGFR基因，说明本发明试剂盒具有很好的特异性以及抗干扰能力，大大降低了假阳性率。而现有技术中的人EGFR基因检测试剂盒一般仅能检出10ngDNA样本中1％的人EGFR基因突变，其在例如为20ng(比10ng稍多)时便可能受到野生型核酸的干扰而出现非特异性扩增，造成假阳性。而本发明提供的试剂盒能做到100ngDNA而不出现假阳性情况，说明本发明试剂盒的特异性好、抗干扰能力强。我们通过对人EGFR基因引物探针序列的设计解决了现有技术中试剂盒的假阳性问题，可以耐受更高用量的野生型核酸的干扰。

另外，本发明对PCR反应体系进行了优化组合，利用UNG酶可以降解含dU的DNA链的特点，在PCR体系中添加了UNG酶和dUTP，可以预防前次PCR产物的污染，防止样本检测假阳性。在样本提取过程中增加了内标，利用内标监控DNA提取和PCR反应过程，监控反应体系是否有效，防止样本检测假阴性。荧光定量PCR扩增结束后，通过曲线形状及Ct值判断阴阳性，检测结果可作为临床对爱必妥(Erbitux，西妥昔单抗)、帕尼单抗(Panitumumab)、吉非替尼和厄洛替尼等用药情况检测的参考，用做临床辅助诊断。

本发明提供的试剂盒用于检测企业工作参考品，阴阳性参考品符合率为100％，灵敏度参考品的检测结果符合质量标准。

本发明提供的试剂盒的精密度试验表明：批内和批间重复性好，检测结果Ct值的变异系数<10％，浓度变异系数<50％。

如上所述，本发明提供的试剂盒的特异性试验表明：本试剂盒在100ng/反应的野生型人DNA背景下无扩增信号。此外，临床样本的检测试验表明：本试剂盒可对100ngDNA样本中低至1％(1％产生突变、99％为未突变的野生型)的人EGFR基因突变检出。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种人EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含检测第20号外显子T790M突变的引物探针序列的PCR反应液，其中其上游引物TM-F、下游引物TM-R和探针TM-P的序列分别为：

TM-F：5'-CCACCGTGCAGCTCGTTAT-3'，

TM-R：5'-AGCAGGTACTGGGAGCCAATA-3'，

TM-P：5'-CAGCTCATGCCCTTCGGCTGCC-3'。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含检测第20号外显子中三种插入突变的引物探针序列的PCR反应液，检测每种插入突变的PCR反应液中均包含上游引物序列、下游引物序列和探针各一条，其中检测三种插入突变insCAC、insGGT和insGCCAGCGTG的上游引物序列分别为Ex20Ins-F1、Ex20Ins-F2和Ex20Ins-F3；检测所述三种插入突变的下游引物序列均为Ex20Ins-R，探针序列均为Ex20Ins-P；

Ex20Ins-F1：5'-GGCCAGCGTGGACGGT-3'，

Ex20Ins-F2：5'-GATGGCCAGCGTGGCCA-3'，

Ex20Ins-F3：5'-AGTGGACAACCCCCACCAC-3'，

Ex20Ins-R：5'-TCCAGGAGGCAGCCGAAG-3'，

Ex20Ins-P：5'-TGGACAACCCCCACGTGTGCC-3'。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含内标序列，以及在所述PCR反应液中还包含检测内标的引物探针序列，

内标序列为5’-CTGTCATCACTTAGACCTCACCCTGTGGAGCCACACCCTAGGGTTGGCCAATCTACTCCCAGGAGCAGGGAGGGCAGGAGCCAGGGCTGGGCATAAAAGTCAGGGCAGAGCCATCTATTGCTTACATTTGCTTC-3’，

内标上游引物G-F：5’-CTGTCATCACTTAGACCTCACCCTG-3’，

内标下游引物G-R：5’-GAAGCAAATGTAAGCAATAGATGGC-3，

内标探针G-P：5’-HEX-AGCCACACCCTAGGGTTGGCCAATC-BHQ1-3’。

4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括预防PCR产物污染的酶混合液，所述酶混合液中包括耐热DNA聚合酶1U/μl～5U/μl和尿嘧啶DNA糖基化酶0.05U/μl～0.2U/μl；且在所述PCR反应液中还包含dUTP。

5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括EGFR阳性对照和EGFR阴性对照。