CN102010894B - 检测人K-ras基因外显子12、13突变的核苷酸序列、方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及检测人K-ras基因外显子12、13突变的核苷酸序列、检测人K-ras基因外显子12、13突变的方法及试剂盒。所述的检测人K-ras基因外显子12、13突变的核苷酸序列，包含由SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：10所示的任一核苷酸序列。其中，SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列两端标记有JUP荧光集团，SEQ ID NO：4～10所示的核苷酸序列两端标记有MAR荧光集团。本发明的试剂盒可用于指导对爱必妥等EGFR抗体药物临床用药。

Description

检测人K-ras基因外显子12、13突变的核苷酸序列、方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及检测人K-ras基因外显子12、13突变的核苷酸序列、检测人K-ras基因外显子12、13突变的方法及试剂盒。

背景技术

靶向治疗是近年来肿瘤领域的新热点，同以往经典的化疗治疗效果比较，靶向药物显著延长患者的无进展生存期(PFS)和整体生存期(OS)，同时降低药物的不良反应。美国FDA已经成功的将下列药物批准用于上述肿瘤的治疗，如：Trastuzumab(赫塞汀)治疗乳腺癌，Gefitinib(易瑞沙)和Erlotinib(特罗凯)治疗非小细胞肺癌，Cetuximab(爱必妥)治疗结直肠癌，Sunitinib(舒尼替尼)和Sorafenib(索拉非尼)治疗肾细胞癌。

由于在靶向治疗之前需要进行靶向诊断，所以如何准确地进行靶向诊断是决定治疗有效与否的前提。大量临床研究资料证实，Kras基因突变状态与针对EGFR的药物，如Cetuximab(爱必妥)和Panitumumab(帕尼单抗)等的疗效有关，应用抗EGFR的药物治疗肿瘤有必要检测Kras基因的突变。

Kras基因突变检测已被写入最新版的《NCCN结直肠癌临床实践指南》，新指南传递给广大医生和患者两条重要信息：一是所有转移性结直肠癌患者都应检测Kras基因状态；二是只对Kras基因野生型患者推荐介绍抗EGFR药物治疗。

K-ras基因，是人体肿瘤中常见的致癌基因，位于EGFR下游的Ras-Raf-Mek信号途径，该途径的异常也会导致肿瘤细胞的生长和肿瘤的进程。K-ras基因某些关键位点易发生突变，并且主要集中在特定的氨基酸密码子(第12、13、61密码子)上，其中12、13占所有突变的90％，这些突变使KRAS蛋白持续保持活化状态而不再受上游EGFR的调控，导致针对EGFR靶标的药物(Erbitux，Vectibix，Iressa，Tavceva等)失效。这种突变在胰腺癌、结直肠癌和肺癌中发生率较高较为常见。

因此，Kras基因突变检测是目前医生了解结直肠癌患者癌基因状况最直接、最有效的方法，通过检测不仅可以深入了解癌基因的情况，更重要的是筛选出针对抗EGFR靶向药物治疗有效的结直肠癌患者，帮助临床医生选择制定对肿瘤患者最有效的治疗方案。目前在欧美等发达国家，kras基因检测已经成为结直肠癌患者内科治疗前的常规检查。在通常情况下，60％左右的结直肠癌患者的kras基因是野生型的，如果都接受了Kras基因检测后，通过个体化的综合治疗方案，在化疗基础上加靶向药物，有效率可以达到60％左右，所以越早做Kras基因突变检测，患者获益越大。

随着分子生物学的发展，出现了很多检测基因突变的方法：

一、核苷酸序列测定法

核苷酸序列测定法是基因突变经典的检测方法，被誉为公认的金标准，目前国内外报道的发现的新的基因突变，大多采用DNA测序法，该方法虽然可靠直观，并可检测出多位点的变异，但耗时、灵敏度低，尤其在混合模板时，最低检出极限在10％以上。

二、基因芯片技术

基因芯片(genechip)，又称基因微矩阵(microarray)，其原理是将大量特定的基因片段或寡核苷酸片段作为探针有序地和高密度地排列固定于玻璃或硅等载体上，然后与待测的有荧光标记的样品核酸按碱基配对的原则进行杂交，通过激光共聚焦系统检测杂交信号强度，经计算机分析处理数据资料，获取样品分子的数量和序列信息，从而可对核酸序列进行大规模、高通量的研究.基因芯片技术由于其具有大通量、快速、灵敏、平行检测基因的优势，已在生物学的各个领域中得到广泛的应用。但由于目前技术还不够成熟，所以有一定的假阳性和假阴性率，实验数据不容易解释，不可检测出新位点的变异。

三、聚合酶链反应(PCR)-限制性片段长度多态性分析(RFLP)方法

错配PCR结合RFLP分析技术能有效地鉴别不同的基因型，实验简便、快速，无需特殊仪器，适合于一般实验室应用及大规模临床检验使用，但灵敏度不够，且该法操作中需开盖用PCR产物进行酶切，增加了产物污染的风险造成污染。

四、实时荧光定量PCR法：

近年来出现的实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具，实验诊断和操作严格的市场准入制度，基本解决了过去实验过程因污染出现的假阳性，成为临床诊断中首选的核酸诊断技术。

在实时荧光定量PCR技术中，特异性荧光探针的选择和设计是至关重要的。它是把荧光化合物标记到特异性的寡核苷酸上形成荧光标记的DNA探针，通过探针与PCR产物特异性的结合，在PCR过程中可对产物实现均相、实时、定量检测。根据荧光基团标记和实现能量共振转移方式的不同，荧光PCR所用的探针可以分为五大类，分别是：Taqman探针，分子信标(molecular beacon)，光标记引物，杂交探针，DNA-RNA-DNA嵌合探针。Taqman探针是运用最早的，普及率最高的荧光探针，目前国内市场上用的荧光PCR试剂盒几乎都是使用该类探针，但由于此类探针本底较高和不能识别单个核苷酸的差异，不利于用于Kras基因的突变检测。近年来发展起来的AllGlo^TM探针，是最新一代的荧光定量探针，它拥有普通Taqman、Taqman-MGB及分子信标探针所有优点，采用两端同样的荧光集团，在oligo上面互相互为报告及淬灭基团，在杂交水解之后两端标记的染料又全部变为报告基团，大大提高了荧光增量。更重要的是，染料上面含有特殊的可以大大提高TM值的化学基团，可以大大提高探针的特异性，特别适合用于基因单碱基突变检测。

发明内容

本发明要解决的首要技术问题在于提出一种检测人K-ras基因外显子12、13突变的核苷酸序列。

本发明要解决的第二技术问题在于提出一种人检测K-ras基因外显子12、13突变的方法。

本发明要解决的第三技术问题在于提出一种人检测K-ras基因外显子12、13突变的试剂盒。

本发明要解决的第四技术问题在于提出人检测K-ras基因外显子12、13突变的试剂盒的应用。

为了解决本发明的技术问题，本发明采用的技术方案为：

本发明涉及一种检测人K-ras基因外显子12、13突变的核苷酸序列，包含由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10所示的任一核苷酸序列。

本发明的第一优选技术方案为：检测人K-ras基因外显子12、13突变的核苷酸序列中，SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列两端标记有JUP荧光集团，SEQ ID NO：4～10所示的核苷酸序列两端标记有MAR荧光集团。

本发明的第二优选技术方案为：检测人K-ras基因外显子12、13突变的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1所示的上游引物、SEQ ID NO：2所示的下游引物、SEQ ID NO：3所示的野生型探针和SEQ ID NO：4～SEQ IDNO：10所示的突变型探针中的至少一个。

本发明的第三优选技术方案为：检测人K-ras基因外显子12、13突变的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1所示的上游引物、SEQ ID NO：2所示的下游引物、SEQ ID NO：3所示的野生型探针和SEQ ID NO：4～SEQ IDNO：10所示的突变型探针。

本发明还涉及一种检测人K-ras基因外显子12、13突变的方法，包括以下步骤：

(1)提取核酸样本；

(2)以步骤(1)提取的核酸为模板，用权利要求1至4任意一项所述的引物和探针序列，多重荧光PCR扩增病原体的靶核酸序列；

(3)采用荧光检测仪对扩增产物进行分析，并分析结果。

其中，本发明所述的检测方法的技术方案的第一优选技术方案为：

所述的多重荧光PCR的反应体系为：50μL反应体系中含有：40μL反应体系中含有：2.5μL 10×PCR reaction buffer(Mg²⁺free)，3mmol/LMg²⁺，0.125mmol/L dNTP，0.25μmol/L上游引物，0.25μmol/L下游引物，0.125μmol/L野生型探针，0.125μmol/L突变型探针，Taq聚合酶2U，UNG酶0.2U，模板量为3μL，补充水至40μL。

本发明所述的检测方法的技术方案的第二优选技术方案为：PCR扩增条件为40～43℃5～8分钟、94～96℃3分钟预变性；92～94℃5秒、58～60℃30秒，重复30～35个循环；最后37℃保温。

本发明所述的检测方法的技术方案的第三优选技术方案为：PCR扩增条件为42℃5分钟、95℃3分钟预变性；94℃5秒、60℃50秒，重复32个循环；最后37℃保温。

本发明还涉及一种检测人K-ras基因外显子12、13突变的试剂盒，含有本发明所述的引物和探针。

其中，本发明所述试剂盒的组成为：

PCR反应液840μl，国际单位比为10∶1的Taq聚合酶和UNG酶的混合物48μl，阴性对照品20μl，阳性对照品I 20μl，阳性对照品II 20μl；

其中，PCR反应液的组成为：10×PCR缓冲液4ml，25mmol/L dNTP0.2ml，50μmol/L上游引物0.2ml，50μmol/L下游引物0.2ml，50μmol/L野生型探针0.1ml，50μmol/L突变型探针0.1ml，用纯化水定容至35ml，充分混匀；

阳性对照I和阳性对照II分别为Kras野生型和突变型质粒DNA溶液；

阴性对照品为纯化水。

本发明还涉及检测人K-ras基因外显子12、13突变的试剂盒的应用。

下面对本发明的技术方案做进一步的详细说明：

本发明建立了一种运用基于AllGlo^TM探针的双重荧光定量PCR技术，一次性定性检测人类K-ras基因外显子12，13突变的快速检测方法和试剂盒，适用于指导对爱必妥等表皮生长因子受体(EGFR)抗体药物临床用药。

其中，本发明的引物和探针为：

上游引物：SEQ ID NO：1TTAGCTGTATCGTCAAGGCACTC

下游引物：SEQ ID NO：2GCCTGCTGAAAATGACTGAATATA

野生型探针：SEQ ID NO：3JUP-TTGGAGCTGGTGGCGT-JUP

突变型探针：SEQ ID NO：4MAR-TTGGAGCTCGTGGCGT-MAR

            SEQ ID NO：5MAR-AGCTGGTGACGTAGGC-MAR

            SEQ ID NO：6MAR-TGGAGCTAGTGGCGT-MAR

            SEQ ID NO：7MAR-GTTGGAGCTGTTGGCGT-MAR

            SEQ ID NO：8MAR-GTTGGAGCTTGTGGCGT-MAR

            SEQ ID NO：9MAR-TGGAGCTGCTGGCGT-MAR

            SEQ ID NO：10MAR-TGGAGCTGATGGCG-MAR

本发明的引物的合成方法是固相亚磷酸三酯法进行化学DNA合成，纯化方法为聚丙烯酰胺凝胶电泳。引物在使用前经稀释后，使用紫外分光光度计进行检测、重定量，确保其A₂₆₀/A₂₈₀＞1.7。

探针的合成方法为，将一个染料通过柔性脂肪酸接头连接到磷酸骨架3’末端，而另一相同的染料通过另一柔性脂肪酸接头连接到磷酸骨架5’末端，柔性接头是C2～30直链或者分支的、饱和或不饱和的烃链，任选由杂原子、芳基、低级烷基、低级羟基烷基和低级烷氧基取代。

探针通过在HitachiD7000 HPLC系统上通过反相HPLC纯化系统进行纯化，对于纯化后产品我们将检验其出峰位置及纯度，再用紫外分光光度计在260nm波长下定量包装。

探针在使用前经稀释后，使用紫外分光光度计进行检测、重定量，确保其A260/A280＞1.7。

阴性对照品为纯化水。替代试验检验合格。

阳性对照品为已知浓度的Kras野生型和突变型质粒DNA溶液。

本发明应用双重PCR荧光原理，在同一反应管内同时检测Kras野生型和突变型，野生型和突变型5’端分别标记不同波长的报告荧光。PCR反应进行时，不同的报告荧光基团释放荧光，荧光测定仪器分别读取两种波长的荧光信号进行分析，使两种基因型的诊断在一次实验中完成。

对反应的条件进行优化，最终确定的反应体系及反应条件如下：

多重荧光PCR反应体系优选采用40μL反应体系：40μL反应体系中含有：2.5μL 10×PCR reaction buffer(Mg²⁺free)，3mmol/L Mg²⁺，0.125mmol/L dNTP，0.25μmol/L上游引物，0.25μmol/L下游引物，0.125μmol/L野生型探针，0.125μmol/L突变型探针，Taq聚合酶2U，UNG酶0.2U，，模板量为3μL，补充水至40μL。

多重荧光PCR扩增条件优选为：PCR扩增条件为42℃5分钟、95℃3分钟预变性；94℃5秒、60℃50秒，重复32个循环；最后37℃保温。采用的PCR仪为ABI PRISMPCR荧光检测仪，选定检测荧光为FAM，VIC通道，并在PCR循环第二步60℃时收集荧光信号。仪器检测通道选择通道1，2，其它为默认值。

根据样品，阳性对照，阴性对照的Ct值确定样品中是否存在Kras基因突变，从而指导临床用药。

附图说明

图1为本发明试剂盒开发流程的示意图。

图2为本发明试剂盒检测Kras突变型或杂合型标本的实验结果：多重荧光PCR检测仪FAM通道检测结果：1为Kras基因突变型标本，2为Kras基因杂合型标本；

图3为本发明试剂盒检测Kras突变型或杂合型标本的实验结果：多重荧光PCR检测仪HEX通道检测结果：3为Kras基因突变型标本，4为Kras基因杂合型标本。

本发明的具体实施方式仅对本发明的内容做进一步的解释和说明，并不对本发明的内容作出限制。

具体实施方式

实施例1

1.本发明所采用的原材料

1.1引物及探针

引物及探针由上海超世生物科技有限公司负责合成。

1.2其他材料

纯化水符合《中国生物制品主要原辅材料质控标准》要求；Taq酶、dNTP(dATP∶dCTP∶dGTP∶dUTP＝25mM∶25mM∶25mM∶25mM)、UNG酶由普洛麦格公司提供。所有化学试剂为分析纯或分析纯以上级别，所有试剂均检验合格。

1.3对照品

1.3.1阴性对照品：纯化水；替代试验检验合格。

1.3.2阳性对照品：已知Kras野生型和突变型质粒DNA溶液。

2.检测方法

2.1标本抽提：用基因组DNA抽提试剂盒进行人结肠癌组织中基因组DNA的抽提。

2.2PCR反应试剂的制备

2.2.1引物及探针的制备

引物、探针均为5OD/管，将装有引物或探针的1.5ml离心管13000rpm离心数秒，使引物干粉聚集于管底，加入500μl纯化水，振荡混匀后静置10分钟，探针需要避光静置，使之充分溶解，13000rpm离心数秒。

2.2.2 100人份三联检PCR反应液的制备

取4ml 10×buffer，0.2ml 25mmol/L dNTP，0.2ml 50μmol/L上游引物，0.2ml 50μmol/L下游引物，0.1ml 50μmol/L野生型探针，0.1ml 50μmol/L突变型探针，用纯化水定容至35ml，充分混匀。

2.2.3反应液的质控

用待检的反应液检测阴性对照品、阳性对照品，检测结果符合：阴性对照品的C_T值大于32或无C_T值，阳性对照品C_T≤30，则为合格。

其中，CT值的定义为：C代表Cycle，T代表threshold，CT值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

研究表明，每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表CT值。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

2.3Taq聚合酶+UNG酶混合液的制备和质控

Taq聚合酶+UNG酶混合液含0.5U/μl Taq聚合酶和0.05U/μl UNG酶分别取2500U Taq聚合酶、250U UNG酶混合，配备5ml酶溶液。替代试验合格。

2.4对照品的制备

2.4.1阳性对照品的制备和质控

已知Kras野生型和突变型质粒DNA溶液，用TE稀释，测定阳性对照品C_T≤28。

2.4.2阴性对照品的制备

取纯化水，测定阴性对照品C_T大于或等于32。

2.5半成品检定

2.5.1特异性检定

取5份临床确诊Kras野生型的标本作为野生型参考品并进行PCR试验，操作严格按照试剂盒说明书进行—野生型符合率应为100％，为合格。

2.5.2准确性检定

取5份临床确诊Kras突变型的标本作为突变型参考品并进行PCR试验，操作严格按照试剂盒说明书进行—突变型符合率应为100％，为合格。

2.5.3灵敏度检定

用10⁷copies/ml浓度的突变型质粒DNA溶液以10倍的梯度逐级稀释至10³copies/ml，取10³copies/ml、10⁴copies/ml、10⁵copies/ml、10⁶copies/ml的突变型质粒DNA溶液作为灵敏度参考品，检测结果C_T≤30，为合格。

2.6分装、贴签、包装

2.6.1分装

用微量移液器将准备好的试剂分装入清洁的离心管中，盖紧管盖，

装量如下：

成份	标识量(μl)	实际分装量(μl)
			PCR反应液	840	900
Taq聚合酶+UNG酶	48	50
			阴性对照	20	20
阳性对照1	20	20
			阳性对照2	20	20

2.6.2贴签

将检验合格的标签，贴在相应的离心管上。

2.6.3包装

按照试剂盒的组成成份，将相应的离心管插入盒内衬上，装入盒中，放入说明书，封口。试剂盒组装要求如下：

成份	数量(管)
		PCR反应液	1
Taq聚合酶+UNG酶混合液	1
		阴性对照	1
阳性对照1	1
		阳性对照2	1

3.试剂盒成品检定

3.1外观检定

检定方法：目测。

检定标准：试剂盒包装完整无缺，并附有说明书；各试剂组分齐全、试剂分装量符合组成要求。

3.2特异性检定，准确性检定，灵敏度检定，精密度检定

同半成品检定。

4.保存及有效期

在-20℃保存条件下，自检定合格之日起有效期为6个月。

5.试剂盒使用说明

本试剂盒采用核酸扩增技术结合双荧光标记探针杂交方法对人基因组中K-ras基因的12、13密码子进行突变检测，从而指导西妥昔单抗的临床用药。

使用方法：

(1)试剂准备(试剂开管前请完全解冻后充分混匀并短暂离心)配制：按每个反应取PCR反应液35μl、酶2μl计算，乘以所需的反应管数(建议酌情可多配一个反应量)，加于一总的无菌离心管中，振荡混匀。

分装：用微量加样器在每一PCR反应管内加入37μl上述混匀的反应液，存于4℃。

注意：最好在DNA提取结束后配制反应液。

(2)加样：在上述准备的装有混合反应液的PCR反应管中加入标本、阴性对照、阳性对照1、阳性对照2的DNA 3μl。

(3)PCR反应：在ABI系列PCR荧光检测仪上设定如下程序：

选定检测荧光为FAM，VIC通道，并在PCR循环第二步60℃时收集荧光信号。仪器检测通道选择通道1，2；其它为默认值。

(4)反应完毕，存储结果以便进行数据处理。

(5)实验结果计算

5.1基线设定：选3～15个循环的平均荧光信号为基线再分析CT。

5.2阈值设定：

FAM通道：以刚好高于阳性对照品1的扩增曲线最高点，调整起始阈值。

HEX通道：以刚好高于阳性对照品2的扩增曲线最高点，调整起始阈值。

6.检验结果的解释

6.1结果分析

选择“FAM”对K-ras基因突变型进行分析，选择“VIC”对K-ras基因野生型进行分析。实验结果见附图2和3。

6.2结果判定

(1)当标本检测中的C_T值小于或等于30，则判为阳性。

(2)当标本检测中，没有出现扩增曲线或C_T值大于或等于32，则判为低于最低检出极限或阴性。

(3)当标本检测中的C_T值在30～32之间，可能是被检标本的DNA滴度较低，或由于荧光的不稳定，易造成漏检，因此需重新测定以获得可靠结果。重新测定后，若结果小于32，则判为阳性，大于或等于32，则判为低于最低检出极限或阴性。

检测通道	阴阳性情况	阴阳性情况	阴阳性情况	阴阳性情况
					FAM	+	-	+	-
VIC	-	+	+	-
					判定结果	K-ras基因突变型	K-ras基因野生型	K-ras基因杂合型	PCR失败，重做

6.3实验有效条件

a.阴性对照的扩增曲线为一平直基线；

b.阳性对照1的VIC通道显示扩增曲线且Ct值≤30；

c.阳性对照2的FAM显示扩增曲线且Ct值≤30；

6.4保存条件

于-20℃保存，在有效期内使用。

核苷酸电子序列表

<110>上海源奇生物医药科技有限公司

<120>检测人K-ras基因外显子12、13突变的核苷酸序列、方法及试剂盒

<160>10

<170>patent version 2.1

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>1

TTAGCTGTATCGTCAAGGCACTC

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>2

GCCTGCTGAAAATGACTGAATATA

<210>3

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>3

TTGGAGCTGGTGGCGT

<210>4

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>4

TTGGAGCTCGTGGCGT

<210>5

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>5

AGCTGGTGACGTAGGC

<210>6

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>6

TGGAGCTAGTGGCGT

<210>7

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>7

GTTGGAGCTGTTGGCGT

<210>8

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>8

GTTGGAGCTTGTGGCGT

<210>9

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>9

TGGAGCTGCTGGCGT

<210>10

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>10

TGGAGCTGATGGCG

Claims (4)

1.一种检测人K-ras基因外显子12、13突变的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:1所示的上游引物、SEQ ID NO:2所示的下游引物、SEQ ID NO:3所示的野生型探针和SEQ ID NO:4～SEQ ID NO:10所示的突变型探针。

2.根据权利要求1所述的检测人K-ras基因外显子12、13突变的核苷酸序列，其特征在于，SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列两端标记有JUP荧光集团，SEQ ID NO:4～10所示的核苷酸序列两端标记有MAR荧光集团。

3.一种检测人K-ras基因外显子12、13突变的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物和探针。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的组成为：

PCR反应液840μl，国际单位比为10：1的Taq聚合酶和UNG酶的混合物48μl，阴性对照品20μl，阳性对照品I20μl，阳性对照品II20μl；

其中，PCR反应液的组成为：10×PCR缓冲液4ml，25mmol/L dNTP0.2ml，50μmol/L上游引物0.2ml，50μmol/L下游引物0.2ml，50μmol/L野生型探针0.1ml，50μmol/L突变型探针0.1ml，用纯化水定容至35ml，充分混匀；

阳性对照I和阳性对照II分别为K-ras野生型和突变型质粒DNA溶液；

阴性对照品为纯化水。

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