CN102888466A

CN102888466A - Kras基因突变检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN102888466A
Application number: CN201210422269XA
Authority: CN
Inventors: 蔡从利; 张喆; 周鹏飞
Original assignee: YZY BIOPHARMA CO Ltd
Current assignee: YZY BIOPHARMA CO Ltd
Priority date: 2012-10-30
Filing date: 2012-10-30
Publication date: 2013-01-23

Abstract

本发明适用于生物技术及医学领域，提供了一种KRAS基因突变检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液，7对特异性引物，1对质控引物，特异性探针，锁核酸探针，内标系统，酶溶液和参比染料。本发明还提供了一种人类KRAS基因七种突变检测方法。本发明的检测试剂盒具有以下优点：1.灵敏度高；2.特异性强；3.减少污染，确保结果真实可信；4操作简单快速。

Description

KRAS基因突变检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于生物技术及医学领域，尤其涉及一种人类KRAS基因突变检测试剂盒及检测方法。

背景技术

Ras为一种原癌基因，其参与人类肿瘤的发生发展，最初是从大鼠肉瘤病毒中克隆而得。自1982年Weinberg等人发现人的膀胱癌细胞中有活化的H-Ras基因后，Ras基因引起人们极大关注。Ras基因编码的蛋白质是P21蛋白，分子量为21KD，由188-189个氨基酸组成，也称之为P21高度相关蛋白。

Ras基因家族中，KRAS对人类癌症影响最大。KRAS蛋白是EGFR信号传导通路中的一个关键的下游调节因子，KRAS突变型编码异常的蛋白，刺激促进恶性肿瘤细胞的生长和扩散，且不受EGFR信号影响。在研究EGFR突变与吉非替尼治疗进展期NSCLC患者的疗效间的关系的过程中也发现了KRAS基因点突变，而且研究表明，KRAS基因突变与NSCLC对吉非替尼、厄洛替尼等靶向治疗药物的原发性耐药有关。有研究发现KRAS基因的突变使结直肠癌患者对西妥昔单抗的治疗产生耐药性。因此检测KRAS基因的突变可作为EGFR靶向治疗耐药性产生的重要预测指标。

美国国家癌症综合网络(NCCN)2009年版的临床指南中明确指出：KRAS基因是人体肿瘤中常见的致癌基因。该基因的突变常见于多种恶性肿瘤，在肺癌患者中的突变率为15-30%，在结直肠癌患者中为20-50%。导致KRAS处于激活状态的突变部位主要是位于外显子2的密码子12和13。NCCN指出KRAS基因突变会使肺癌患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂产生耐药；使结直肠癌患者对抗EGFR抗体类药物产生耐药。所以NCCN提出肿瘤患者接受EGFR靶向药物治疗之前，必须进行KRAS基因突变检测，根据检测结果决定是否使用EGFR靶向药物作为临床治疗措施。因此KRAS基因突变检测能提高肿瘤临床治疗的针对性，降低治疗费用，节省宝贵的治疗时间。

KRAS基因突变包括以下七种常见突变类型：1.Gly12Asp(GGT>GAT),2.Gly12Ala(GGT>GCT),3.Gly12Val(GGT>GTT),4.Gly12Ser(GGT>AGT),5.Gly12Arg(GGT>CGT),6.Gly12Cys(GGT>TGT),7.Gly13Asp(GGC>GAC)。KRAS基因突变为体细胞突变，因此其检测方法也不同于一般性遗传突变的检测。其检测主要存在两个方面的难点：一是需要高灵敏度，因为样品模板中突变比例未知，可能突变含量只有1%甚至更低，这就需要较高检测灵敏度以准确检出这些稀有细胞。另一方面是需要高特异性，因为样品中细胞可能绝大多数都是野生型，如何在大量野生型背景中准确检出突变细胞是KRAS基因突变检测的另一个难点。

目前KRAS基因突变检测的方法很多，如直接测序法，焦磷酸测序法，高分辨率溶解曲线检测法（High Resolution Melting Analysis，HRM），高效液相色谱法，荧光定量PCR法等。其中最常见方法还是直接测序法，该法费用较低，但操作耗时长，并且它有两个明显的缺点：一是灵敏度低，一般需要突变基因丰度达到10%以上才能准确检测。二是由于后续需要对PCR产物进行处理，容易出现污染导致结果不准确。

因此在本领域需要一种可以高效快速准确全面地检测出KRAS基因全部七种突变的产品及方法，以便及时准确地获得KRAS基因突变的信息。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种人类KRAS基因突变检测试剂盒及检测方法，旨在解决现有技术中检测周期长、灵敏度低且检测结果不够准确的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种KRAS基因突变检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液，酶溶液，7对特异性引物，1对质控引物，特异性探针，锁核酸探针，内标系统和参比染料，其中，所述7对特异性引物序列分别为SEQID NO:1和SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5和SEQID NO:6，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，SEQID NO:11和SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14，所述1对质控引物为SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16。

本发明还提供一种KRAS基因突变检测方法，包括以下步骤：

（1）制备本发明的KRAS基因突变检测试剂盒；

（2）取1只质控管和7只突变检测管，分别向其中加入步骤（1）中的PCR缓冲液、酶溶液、参比染料、特异性探针和内标系统，并向该质控管中加入质控引物，向该7只突变检测管中分别加入7对特异性引物，且该7只突变检测管中均加入锁核酸探针；

（3）提取待测样品DNA，分别加入至所述1只质控管和7只突变检测管中，进行PCR反应。

本发明KRAS基因突变检测试剂盒采用TaqMan探针法，建立了针对人类KRAS基因12和13密码子7种常见突变的多重实时PCR检测方法，本发明KRAS基因突变检测试剂盒中采用锁核酸探针用于阻断野生型，大大降低野生型背景，提高特异性，同时引入内标系统和UNG酶防污染系统，能更加准确，稳定的对样品进行分型检测。本发明的检测试剂盒及检测方法具有以下优点：1.灵敏度高，可以在10ng野生型基因组DNA背景下准确检出1%的突变DNA；2.特异性强：针对7种不同突变位点设计引物，同时结合锁核酸探针降低了背景，能特异的识别对应突变；3.使用荧光定量PCR技术进行检测，检测过程均为闭管反应，显著降低污染，并且加入UNG酶防污染系统，确保结果真实可信；4操作简单快速，能在100分钟内完成检测，并且结果判读简单客观，便于分析。

附图说明

图1为本发明的KRAS基因突变检测试剂盒检测KRAS基因野生型样品的扩增曲线图；

图2为本发明的KRAS基因突变检测试剂盒检测KRAS基因第12密码子GGT>TGT突变型样品的扩增曲线图；

图3为本发明的KRAS基因突变检测试剂盒检测KRAS基因第12密码子GGT>AGT突变型样品的扩增曲线图；

图4为本发明的KRAS基因突变检测试剂盒检测KRAS基因第12密码子GGT>CGT突变型样品的扩增曲线图；

图5为本发明的KRAS基因突变检测试剂盒检测KRAS基因第12密码子GGT>GTT突变型样品的扩增曲线图；

图6为本发明的KRAS基因突变检测试剂盒检测KRAS基因第12密码子GGT>GAT突变型样品的扩增曲线图；

图7为本发明的KRAS基因突变检测试剂盒检测KRAS基因第12密码子GGT>GCT突变型样品的扩增曲线图；

图8为本发明的KRAS基因突变检测试剂盒检测KRAS基因第13密码子GGC>GAC突变型样品的扩增曲线图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供一种KRAS基因突变检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液，酶溶液，7对特异性引物，1对质控引物，特异性探针，锁核酸探针，内标系统和参比染料，其中，所述7对特异性引物序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14，所述1对质控引物为SEQID NO:15和SEQ ID NO:16。

具体地，所述PCR缓冲液中含有1.0~5.0mM的MgCl₂，1.0~5.0mM的dNTP，即dATP、dUTP、dGTP和dCTP各1.0~5.0mM。

具体地，所述7对特异性引物序列及其对应的突变的碱基如表1所示：

表17对特异性引物序列及对应的突变的碱基

具体地，所述1对质控引物序列为：

正向引物F：5’-CTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCT-3’SEQ ID NO:15

反向引物R：5’-TCCACAAAATGATTCTGAATTAGCTG-3’SEQ ID NO:16

优选地，所述7对特异性引物和所述1对质控引物对应的特异性探针相同，该特异性探针为TaqMan MGB(Minor Groove Binder)探针类型，序列为SEQ IDNO:17，修饰后特异性探针为：

FAM-5’-TAGGCAAGAGTGCCTTGA-3’-NFQ-MGB，

该特异性探针的5′端标记有报告基团，除了FAM，还可选用其他报告基团，如VIC，该特异性探针的3′端标记有非荧光淬灭基团NFQ(Non-FluorescentQuencher)，该基团本身不产生荧光，因此可以大大降低本底信号的强度，同时该特异性探针上还连接有MGB修饰基团，可以将探针的Tm值提高10℃左右，因此对于同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。FAM，NFQ和MGB为本领域技术人员熟知的探针修饰基团。

本发明实施例中使用的锁核酸探针为LNA-BLOCK探针，该探针序列为SEQ ID NO:18，在一优选实施例中，该锁核酸探针的结构为

5’-T+AG+T+TGG+AGC+TGGTGGC-3’-PO4,

其中，LNA(Locked Nucleic Acid)是一种核酸类似物，和普通核酸分子的区别在于在其碳环的2’氧原子和4’碳原子位置引入亚甲基桥形成锁状结构，因此也称锁核酸，该结构特征使得LNA不但可与DNA或RNA互补序列形成正常的Watson-Crick键结，且所形成的双股结构比起一般的DNA:DNA、DNA:RNA、RNA:RNA结构更加稳定。通过NMR与X-ray结晶技术检测发现LNA:RNA与LNA:DNA双股结构近似于细胞内原本的双股核酸状态，因此其物理性质与一般核酸非常相似而容易操作。在本发明实施例中，使用锁核酸探针阻断野生型KRAS基因序列，降低了背景，增强了检测的特异性，同时可以使Tm值提高3-8℃，因此可以缩短Taqman探针长度，从而增加探针的灵敏度及稳定性。

本发明实施例中，使用内标系统监测该荧光定量PCR反应是否存在抑制，由于待检测的样品中的某些成分可能含有导致PCR出现部分或完全抑制；此外，扩增仪可能存在高于允许范围的孔间差，导致不同管间扩增效率差异，另外人为加样错误也可能导致假阴性结果的出现，因此本发明实施例中采用内标系统来消除上述隐患，保证了检测结果的准确性。该内标系统优选包含内标引物、内标探针和内标模板，本发明实施例中个可采用本领域技术人员熟知的其它内标系统。

优选地，本发明实施例中的内标系统针对志贺氏菌设计，其中包含的内标引物序列如下所示：

正向引物F:5’-CGCAATACCTCCGGATTCC-3’SEQ ID NO:19

反向引物R:5’-TCCGCAGAGGCACTGAGTT-3’SEQ ID NO:20

本发明实施例中的内标探针5′端标记有报告基团，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团，如TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在DNA链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离荧光淬灭基团，产生荧光信号。因此检测到的信号强度就代表了模板DNA的拷贝数。

优选地，所述内标探针为：

VIC-5’-AACAGGTCGCTGCATGGCTGGAA-3’-TAMRA SEQ ID NO:21，其中5’修饰的VIC可替换为FAM；

所述内标模板序列为SEQ ID NO:22：

CGCAATACCTCCGGATTCCGTGAACAGGTCGCTGCATGGCTGGAAAAACTCAGTGCCTCTGCGGA(SEQ ID NO:22)

优选地，本发明实施例中的酶溶液中含有Taq酶，其为PCR反应所必需的且该酶溶液还含有UNG酶，其中UNG（uracil-N-glycosylase）酶为尿嘧啶-N-糖基化酶，其特点是最佳活性温度为50℃，95℃灭活，其作用原理是选择性水解断裂含有dU的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的DNA链。在PCR反应中，使用UNG酶可预防非特异性PCR扩增和污染。

本发明实施例中含有参比染料（Reference Dye），其在580nm左右处有最大吸收，而本身不参与PCR反应，其作用是用于校正定量PCR反应时孔与孔之间产生的荧光信号值误差。

优选地，本发明实施例中的检测试剂盒还包括阳性对照液和空白对照液，设置阳性对照和空白对照可监测实时定量PCR反应的正常进行，所述阳性对照液中含有本发明中涉及的KRAS基因7种不同的突变型质粒DNA混合液，该质粒可为本领域技术人员熟知的质粒，这7种质粒浓度相同，均为200copies/μl；所述空白对照液为Tris-HCl(10mM)缓冲液。

本发明的检测试剂盒可以在10ng野生型基因组DNA背景下准确检出1%的突变DNA；且针对7种不同突变位点设计特异性引物，同时结合锁核酸探针降低了背景，能特异的识别对应突变；使用荧光定量PCR技术进行检测，检测过程均为闭管反应，大大降低污染，并且加入UNG酶防污染系统，确保结果真实可信。

本发明还提供一种KRAS基因突变检测方法，包括以下步骤：

（1）制备本发明的KRAS基因突变检测试剂盒；

（2）取8只反应管，1只用作质控管，另外7只用作突变检测管，分别向其中加入步骤（1）中的PCR缓冲液、含有Taq酶和UNG酶的酶溶液、步骤（1）中的特异性探针和内标系统，其中在该质控管中加入质控引物，向该7只突变检测管中分别加入7对特异性引物，且该7只突变检测管中均加入锁核酸探针；

具体地，上述步骤（2）中的PCR缓冲液中含有1.0~5mM的MgCl₂，1.0~5.0mM的dNTP，即dATP、dUTP、dGTP和dCTP各1.0~5.0mM。

优选地，以25μl反应体系为例，向上述步骤（2）中加入待检测样品后得到的混合物中各组分终浓度及含量如下：

上述体系仅为例证性，在实际应用中可以按照比例扩大或缩小该混合物体积及其中各组分含量。

具体地，在上述25μl反应体系中，所述各对引物包括上述步骤（1）中的7对特异性引物，1对质控引物及内标引物，所述各条探针包括上述步骤（1）中的特异性探针和锁核酸探针，所述样品为基因组DNA。

具体地，在步骤（3）中的荧光定量PCR反应条件为：

37℃处理10分钟，95℃预变性5分钟，

40个循环：95℃15秒，60℃60秒，

之后收集荧光信号。

在上述PCR反应后，对结果进行分析，所得结果可分为以下三种：

质控管扩增结果阳性，且突变检测管结果为阴性或者与质控管扩增曲线Δct≥7，该样品判定为野生型，如图1所示；

质控管和突变检测管扩增结果阳性，且突变检测管与质控管扩增曲线Δct<7，该样品判定为突变型，如图2-8所示；

质控管扩增结果阴性，表明样品质量较差或者使用量过少，需要重新提取，测定质量后进行检测。

上述判定方法中，Δct为突变检测管中得到的ct值与质控管中得到的ct值的差值。

优选地，在上述步骤（2）中，除所述8只反应管外还包含装有阳性对照液的阳性对照管和装有空白对照液的空白对照管，其中所述阳性对照液中含有本发明中涉及的KRAS基因7种不同的突变型质粒DNA混合液，该质粒可为本领域技术人员熟知的质粒，这7种质粒浓度相同，均为200copies/μl；所述空白对照液为Tris-HCl(10mM)缓冲液。

本发明的检测方法具有灵敏度高、特异性强、结果真实可信的优点，同时该检测方法操作简单快速，能在100分钟内完成检测，并且结果判读简单客观，便于分析。

以下通过具体实施例对本发明进一步阐述。

实施例1

制备本发明的KRAS基因突变检测试剂盒，包括以下步骤：

1.引物及探针合成：针对人类KRAS基因七种突变情况设计并合成7对特异性引物，序列分别为SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ IDNO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14，该7对特异性引物对应的碱基突变情况如表1所示；设计并合成1对质控引物，该质控引物对的序列为SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16；设计并合成1对特异性探针，并对其进行修饰，修饰后的特异性探针为：

FAM-5’-TAGGCAAGAGTGCCTTGA-3’-NFQ-MGB SEQ ID NO:17；

设计并合成锁核酸探针，该锁核酸探针序列为：

5’-T+AG+T+TGG+AGC+TGGTGGC-3’-PO4 SEQ ID NO:18。

将上述各对引物分别配制成100μM的母液储存，将上述两种探针分别配制成100μM的母液储存。

2.制备内标系统：设计并合成针对志贺氏菌的1对内标引物，该引物对序列为SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20；设计并合成内标探针，该探针为：

VIC-5’-AACAGGTCGCTGCATGGCTGGAA-3’-TAMRA SEQ ID NO:21；

合成来自志贺氏菌的内标模板，该模板序列为SEQ ID NO:22，该序列为现有技术中已知。将该内标引物分别配制成100μM的母液储存，内标探针配制成100μM的母液储存，内标模板配置为2×10⁴copies/ml的母液储存。

3.制备其他试剂：制备PCR缓冲液，其中含有1.0mM的MgCl2，dATP、dUTP、dGTP和dCTP各1.0mM；制备酶混合液，其中含有Taq酶0.5×10³U/ml，UNG酶0.1×10³U/ml，制备参比染料。

4.组装试剂盒：试剂盒中包含7管突变检测PCR反应液和1管质控反应液，其中7管突变检测PCR反应液相同之处在于均分别包含PCR缓冲液，特异性探针，锁核酸探针以及内标引物、内标探针和内标模板，不同之处在于它们分别含有7对特异性引物中的一对。1管质控反应液中包含PCR缓冲液，质控引物及特异性探针，内标引物、内标探针和内标模板。此外试剂盒中还包含1管酶混合液，1管空白对照，1管阳性对照和1管参比染料。根据PCR反应体系各成分使用量，计算12人份和24人份两种规格各成分使用量，配制试剂盒各管中成分并组装。

实施例2

制备本发明的KRAS基因突变检测试剂盒，包括以下步骤：

1.引物及探针合成：合成方法同实施例1，合成后将上述各对引物分别配制成100μM的母液储存，将上述两种探针分别配制成100μM的母液储存。

2.制备内标系统：制备方法同实施例1，合成后将该内标引物分别配制成100μM的母液储存，内标探针配制成100μM的母液储存，内标模板配置为5×10⁴copies/ml的母液储存。。

3.制备阳性对照液和空白对照液，该阳性对照液中含有7种质粒DNA，这些质粒DNA中分别含有本发明试剂盒涉及的KRAS基因7种不同的突变，该质粒的选择及设计为本领域技术人员熟知，这7种质粒浓度相同，均为200copies/μl；该空白对照液为Tris-HCl(10mM)缓冲液。

4.制备其他试剂：制备PCR缓冲液，其中含有5.0mM的MgCl₂，dATP、dUTP、dGTP和dCTP各5.0mM；制备酶混合液，其中含有Taq酶0.5×10³U/ml，UNG酶0.1×10³U/ml，制备参比染料。

5.组装试剂盒：试剂盒中包含7管突变检测PCR反应液和1管质控液，其中7管突变检测PCR反应液相同之处在于均分别包含PCR缓冲液，特异性探针，锁核酸探针以及内标引物、内标探针和内标模板，不同之处在于它们分别含有7对特异性引物中的一对。1管质控反应液中包含PCR缓冲液，质控引物及特异性探针，内标引物、内标探针和内标模板。此外试剂盒中还包含1管酶混合液，1管空白对照，1管阳性对照和1管参比染料。根据PCR反应体系各成分使用量，计算12人份和24人份两种规格各成分使用量，配制试剂盒各管中成分并组装。

实施例3

用本发明的试剂盒检测KRAS基因突变，本实施例中收集临床病理诊断为结肠癌的47例患者的结肠癌组织，进行石蜡包埋处理得到组织标本，提取基因组DNA，用实施例1中得到的试剂盒检测KRAS基因7种常见突变，同时采用传统焦磷酸测序的方法进行验证，其步骤具体为：

(1)样品的处理：使用DNA提取试剂盒（QIAamp DNA FFPE Tissue Kit,CatNo.56404）提取结肠癌组织标本的基因组DNA。提取方法参照说明书进行，具体步骤为将临床采集的石蜡包埋组织（≤25mg）放置在1.5ml的离心管中，加入1200μl的二甲苯，剧烈涡旋10s，12000rpm室温离心5min。弃上清，注意不要倒掉沉淀。加入1200μl无水乙醇，以除去残留的二甲苯，轻轻涡旋。12000rpm室温离心5min。弃上清，再次加入1200μl无水乙醇，轻轻涡旋。12000rpm室温离心5min。弃上清，打开离心管，在37℃孵育10-15min，直至乙醇完全蒸发。加入180μl buffer ATL。加入20μl蛋白酶K，彻底涡旋，56℃孵育2h左右，直到该组织完全溶解（在孵育过程中可以偶尔涡旋），之后涡旋15s，加入200μl buffer AL，涡旋后加入200μl无水乙醇，混合后再次彻底涡旋震荡。将最后的混合物加入到离心柱上，8000rpm离心1min，弃废液。加入500μlbuffer AW1，8000rpm离心1min，弃废液。加入500μl buffer AW2，12000rpm离心3min，弃废液后12000rpm离心1min，将离心柱放置在新的1.5ml离心管中，加入50~200μl buffer AE，室温放置1min,12000rmp离心1min。取2μl所得溶液测OD值以确定DNA浓度，然后将样品DNA稀释到10ng/μl，取2μl进行下一步的PCR反应。

(2)配制PCR反应体系：取实施例1制得的检测试剂盒，按照如下加入量配制荧光定量PCR反应体系：

其中47例患者对应的基因组DNA进行检测，每例患者对应3组平行样，每组平行样包括8个反应体系，即8只PCR管，其中1只用作质控管，另外7只用作突变检测管，它们在引物与探针上有所区别，除了都含有内标系统即内标引物和内标探针还有特异性探针，质控管中加入质控引物SEQ ID NO：15和SEQID NO：16，7只突变检测管中分别加入7对特异性引物，即SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2是一对，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4是一对，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6是一对，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8是一对，SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10是一对，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12是一对，SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14是一对，同时这7只突变检测管中均加入锁核酸探针。

（3）PCR反应：所用荧光PCR反应条件为37℃处理10分钟，95℃预变性5分钟，

以下程序40个循环：95℃15秒，60℃退火延伸60秒，

之后收集FAM和VIC荧光信号。检测用ABI7500和MxPro Mx3000P进行。

（4）结果分析：47例样品检测结果，以下所示附图中均去除了内标系统产生的检测结果，判定标准为：质控管扩增结果阳性，且突变检测管结果为阴性或者与质控管扩增曲线Δct≥7，该样品判定为野生型，如图1所示；质控管和突变检测管扩增结果阳性，且突变检测管的ct值与质控管的ct值的差Δct<7，该样品判定为突变型，如图2-8所示；质控管扩增结果阴性，表明样品质量较差或者使用量过少，需要重新提取，测定质量后进行检测。

检测结果如下：

野生型7例，其中一个结果如图1所示，其中突变检测管的ct值与质控管的ct值的差Δct约为10，大于7，因此判断为野生型；

第1对特异性引物对应的突变，即KRAS基因第12密码子GGT>TGT突变型样品2例，其中一个结果如图2所示，Δct<7，因此为突变型；

第2对特异性引物对应的突变，即KRAS基因第12密码子GGT>AGT突变型样品3例，其中一个结果如图3所示，Δct<7，因此为突变型；

第3对特异性引物对应的突变，即KRAS基因第12密码子GGT>CGT突变型样品1例，其中一个结果如图4所示，Δct<7，因此为突变型；

第4对特异性引物对应的突变，即KRAS基因第12密码子GGT>GTT突变型样品7例，其中一个结果如图5所示，Δct<7，因此为突变型；

第5对特异性引物对应的突变，即KRAS基因第12密码子GGT>GAT突变型样品14例，其中一个结果如图6所示，Δct<7，因此为突变型；

第6对特异性引物对应的突变，即KRAS基因第12密码子GGT>GCT突变型样品3例，其中一个结果如图7所示，Δct<7，因此为突变型；

第7对特异性引物对应的突变，即KRAS基因第13密码子GGC>GAC突变型样品9例，其中一个结果如图8所示，Δct<7，因此为突变型；

有1例样品由于质量原因未检出。

其中有1例样品检测为KRAS基因第12密码子GGT>AAT突变型样品，测序显示为GGT>GAT突变型样品。

上述结果中有1例样品用本发明的检测试剂盒检测为野生型，而测序结果为KRAS基因第12密码子GGT>GTT突变，后再次测序结果表明为野生型；

还有1例样品测序为KRAS基因第13密码子GGC>GTC突变，而用本发明的检测试剂盒检测为KRAS基因第12密码子GGT>GAT突变，后重新测序表明为KRAS基因第12密码子GGT>GAT突变；其余样品检测结果与直接测序结果相符。

以上结果表明本发明用于人类KRAS基因7种突变检测试剂盒检测结果可靠，与直接测序的符合率≥95%，并且试剂盒灵敏度高于传统测序方法，另外试剂盒方法操作简单快速，满足临床需求，利于大规模推广。

实施例4

取实施例2中制备的检测试剂盒针对25例患者进行检测。步骤如下：

(1)样品的处理：步骤同实施例3。

(2)配制PCR反应体系：取实施例2制得的检测试剂盒，按照如下加入量配制荧光定量PCR反应体系：

针对25例患者的基因组DNA进行检测，每例患者对应3组平行样，每组平行样包括8个反应体系，即8只PCR管，其中1只用作质控管，另外7只用作突变检测管，其中，这8个反应体系相同点是都含有内标系统。即内标引物和内标探针以及特异性探针，不同点在于其中质控管中加入质控引物SEQ IDNO：15和SEQ ID NO：16，7只突变检测管中分别加入7对特异性引物，即SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2是一对，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4是一对，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6是一对，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8是一对，SEQ ID NO：9和SEQID NO：10是一对，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12是一对，SEQ ID NO：13和SEQ IDNO：14是一对，同时这7只突变检测管中均加入锁核酸探针；同时检测过程中加入阳性对照和空白对照检测。阳性对照检测8管，其中7管分别使用7对特异性引物检测，1管使用质控引物检测，阳性对照中含有实施例2中的阳性对照液并含有特异性探针、锁核酸探针和内标系统，且不加入检测样品；空白对照检测8管，其中7管分别使用7对特异性引物检测，1管使用质控引物检测，空白对照中用实施例2中的空白对照液代替阳性对照中的阳性对照液，且不加入检测样品。

（3）PCR反应，条件与实施例（3）相同。

（4）结果分析，选取阳性对照检测结果为阳性且空白对照检测结果为阴性的组进行分析，判断标准同实施例3，即突变检测管的ct值与质控管的ct值的差Δct≥7，样品判定为野生型；

Δct<7,样品判定为突变型，且特异性引物检测到的突变型为该特异性引物对应的突变型。

结果如下：在该25例患者中，有2例野生型；23例突变型，在这些突变型中，第1对特异性引物对应的突变，即KRAS基因第12密码子GGT>TGT突变型样品1例；

第2对特异性引物对应的突变，即KRAS基因第12密码子GGT>AGT突变型样品1例；

第3对特异性引物对应的突变，即KRAS基因第12密码子GGT>CGT突变型样品1例；

第4对特异性引物对应的突变，即KRAS基因第12密码子GGT>GTT突变型样品4例；

第5对特异性引物对应的突变，即KRAS基因第12密码子GGT>GAT突变型样品10例；

第6对特异性引物对应的突变，即KRAS基因第12密码子GGT>GCT突变型样品2例；

第7对特异性引物对应的突变，即KRAS基因第13密码子GGC>GAC突变型样品4例。以上结果未有图示。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种KRAS基因突变检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液，酶溶液，7对特异性引物，1对质控引物，特异性探针，锁核酸探针，内标系统和参比染料，其中，所述7对特异性引物序列分别为SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2、SEQID NO:3与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7与SEQID NO:8、SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13与SEQ ID NO:14，所述1对质控引物为SEQ ID NO:15和SEQ IDNO:16。

2.如权利要求1所述的KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述酶溶液含有Taq酶和UNG酶。

3.如权利要求1所述的KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述锁核酸探针结构为:

5’-T+AG+T+TGG+AGC+TGGTGGC-3’-PO4。

4.如权利要求1所述的KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述特异性探针序列为SEQ ID NO:17，且所述特异性探针5’端修饰有FAM或VIC，3’端修饰有NFQ-MGB。

5.如权利要求1所述的KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述内标系统包含内标引物、内标探针和内标模板，且所述内标引物序列为SEQ IDNO:19和SEQ ID NO:20，所述内标探针序列为SEQ ID NO:21，所述内标模板序列为SEQ ID NO:22。

6.如权利要求5所述的KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述内标探针5’端修饰有VIC或FAM，3’端修饰有TAMRA。

7.如权利要求1所述的KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还含有阳性对照液和空白对照液，所述阳性对照液含有7种质粒DNA混合液，所述7种质粒DNA分别含有7种不同的KRAS突变基因，所述空白对照液为Tris-HCl缓冲液。

8.一种KRAS基因突变检测方法，包括以下步骤：

（1）制备如权利要求1-7中任一项所述的KRAS基因突变检测试剂盒；

（2）取1只质控管和7只突变检测管，分别向其中加入步骤（1）中的PCR缓冲液、酶溶液、参比染料、特异性探针和内标系统，并向所述1只质控管中加入步骤（1）中的质控引物，向所述7只突变检测管中分别加入步骤（1）中的7对特异性引物，且所述7只突变检测管中均加入锁核酸探针；

9.如权利要求8所述的KRAS基因突变检测方法，其特征在于，所述步骤（3）的PCR反应体系中各组分终浓度及含量如下：

10.如权利要求8所述的KRAS基因突变检测方法，其特征在于，所述步骤（3）中PCR反应条件为：

37℃10分钟，95℃5分钟，

40个循环：95℃15秒，60℃60秒。