CN105177118B - 检测人egfr基因突变的引物和探针体系及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测人EGFR基因29种突变的引物和探针体系，包括如SEQ ID No：1～26所示的核苷酸序列；还涉及一种检测人EGFR基因29种突变的方法，包括合成引物和探针、在引物3’‑末端起第2或第3位置引入脱氧次黄嘌呤核苷、荧光PCR反应以收集荧光信号FAM和HEX、结果判定等步骤；以及包括所述引物和/或探针中至少一种的试剂盒。该引物和探针体系具有很高的灵敏度，可以满足低突变丰度样本的检测，即在野生基因组DNA的背景下，可以完成较低突变基因含量的检测，以高度的敏感性和特异性准确区分样本类型，发挥技术的最大优势。

Description

检测人EGFR基因突变的引物和探针体系及试剂盒
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种检测人EGFR基因突变的引物和探针体系及试剂盒。
背景技术
大量研究表明，在非小细胞肺癌（NSCLC）人群中40%左右的患者携带表皮生长因子受体（EGFR）基因的体细胞突变，这些突变与络氨酸激酶抑制剂（TKIs）疗效有明确的相关性，如易瑞沙（Iressa）和特罗凯（Tarceva）等药物。其中，不含T790M突变，但携带EGFR基因其它位点突变的NSCLC患者在接受易瑞沙和特罗凯治疗时疗效显著，经研究发现EGFR外显子20上的T790M位点为耐药位点，会抑制易瑞沙和特罗凯等药物的疗效。
EGFR基因位于7号染色体上，包含28个外显子，其酪氨酸激酶功能区由18～24外显子编码，经研究发现NSCLC患者的EGFR基因突变主要发生在18～21外显子，其中以19外显子上的缺失突变和21外显子上的点突变居多；主要突变类型包括18外显子上的点突变（G719X）约占5%，19外显子上的缺失突变（主要位于747～750位氨基酸）约占45%，20外显子上的插入突变约占1%，20外显子上的耐药点突变（T790M）约占5%，21外显子上的点突变（L858R和L861Q）约占40～45%。
目前的基因突变检测方法如突变扩增阻滞系统(amplification refractorymutation system，ARMS)、TaqMan技术等，虽然广泛应用在临床检测工作中，但是其聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)引物存在以下缺点：(1)特异性不好，诊断基因突变位点设计引物容易产生非特异性扩增，影响检测效率和准确性；(2)选择性不好，在高浓度野生型背景下，检测低拷贝能力较差；(3)敏感性和分辨率较差，受到引物设计的限制，导致检测的敏感性差，分辨率不高。
随着基因时代的开启，分子诊断技术在临床辅助诊断中扮演越来越重要的角色，如SNP、基因突变等检测逐步应用于临床的辅助诊断和个性化用药。核酸检测技术（nucleicacid amplification testing，NAT）包含两种扩增方式：对靶核酸直接扩增和信号扩增。对靶序列的扩增又可以分为等温扩增（isothermal amplification，IA）和聚合链式反应（polymerase chain reaction，PCR）。等温扩增技术包含：转录介导的扩增方法TMA(transcription mediated amplification)、NASBA（Nucleic acid sequence-basedamplification）、SDA（strand displacement amplification）等。
转录介导扩增（transcription mediated amplification，TMA）由Dr.LarryMimms发明，并且其公司Gen-Probe 2004年因此获得美国国家技术奖（National Medal ofTechnology）。TMA反应体系需要两种酶的共同作用：鼠白血病病毒逆转录酶（Moloneymurine leukemia virus，MMLV）和T7 RNA多聚酶；在42°C恒温条件下来扩增DNA或RNA的反应系统。扩增原理为：在逆转录酶作用下，目标序列以引物为引导来进行逆转录，在杂合链上的RNA通过逆转录酶的RNA酶H活性降解以后，合成双链的DNA；且在T7 RNA多聚酶的作用下，转录出数以万计的目标RNA序列，所转录出的RNA可以作为模板来进行下一个循环，整个反应过程是一个自催化过程。
依赖核酸序列的扩增技术（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）的扩增原理与TMA扩增原理相似，但在提取核酸和产物扩增检测的方法上存在不同，这两种扩增方法的灵敏度较高、特异性强、反应条件相对简单、扩增效率高，均无需专门的扩增仪器。TMA和NASBA，由于其高效的扩增能力，广泛用于血液中乙型肝炎病毒（hepatitisB virus，HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）和艾滋病毒（hepatitis I virus，HIV）的筛查，但是其扩增基因突变和SNP的能力尚未得到验证。
基于等温扩增开发的SNP或基因突变的检测虽然较少，如Invader和SMARTamplification，但是Invader技术已经推广于临床SNP和基因突变的检测。Invader技术可以认为是一种信号放大技术，该技术不以模板扩增为核心，主要通过信号系统本身的不断放大从而达到基因检测的目的。Invader技术原理：Invader技术设计了一套非常特别的invader和空间结构识别内切酶。当检测有突变存在，酶切下primary probe1的5’-端序列，作为下一个反应的invader，信号持续产生。SMRAT为模板扩增的等温扩增技术，检测基因突变主要依赖于Mut蛋白，当无突变，检测突变的引物与模板结合时3’-端有错配，Mut蛋白结合抑制Bst聚合酶的延伸。上述的两种等温突变检测技术，需要一个95°C变性后降温然后加酶的过程，不易于临床接受和开展。
此外，Junction probes（JP）和Three Way Junction（3WJ）突变检测信号系统，这两项技术不能独自检测基因突变，需要PCR等过程扩增出数以万计的单链DNA，再应用该技术杂交，临床应用价值很低，但该技术引出类似“短片段引物杂交”的雏形。JP和3WJ 技术原理，简述如下：step 1，在特定的反应条件和靶序列存在下，探针PB锚定靶序列；step 2，探针PA识别SNP并于PB和靶序列形成稳定的Y型结构；step 3，限制性内切酶-CviQ(1)识别酶切位点并切割下淬灭基团产生荧光；step 4，位于PB上的酶切位点碱基之间被硫代，所以无法酶切而保留完整，PA切断后，残余片段无法与PB和靶序列形成稳定结构而脱落；剩余PB和靶序列在进入下一步循环放大。
聚合酶链式反应（PCR）发明之后，基于PCR开发的基因突变技术不断衍生出新的检测手段和技术，如：PCR-RFLP，allele-sepecific PCR，TaqMan probe，ARMS，PNA-LNA clamp荧光PCR、Cycleave probe PCR，Nanofluidic Digital PCR Arrays，MassArray和DNA芯片等等。
PCR-RFLP是在早期实验中开发的检测SNP分型技术，主要优点在于可以巧妙地选择出限制性内切酶来切出可用于分辨突变位点的短片段长度多态，不过PCR-RFLP需要电泳分离酶消化后的产物，会严重制约反应的通量和实验操作的自动化。
ARMS技术与allele-sepecific PCR大致相同，利用DNA聚合酶缺失3’～5’端的外切活性，3’端错配的引物低于正常引物的延伸速度，当错配数目达到一定的严谨程度时，3’端则无法延伸，如果PCR有条带，说明有相应的突变。ARMS技术敏感性和特异较高，已经成功应用于临床检测SNP，但是ARMS技术引物和探针的设计受到突变邻近碱基的局限，大大的限制该技术的广泛使用。
TaqMan探针是寡核酸探针，有荧光报告基团连接在探针的3’末端，有荧光淬灭基团连接在探针的5’末端。在探针完整的情况下，淬灭基团可以吸收报告基团发射的荧光信号，在PCR扩增时，结合到靶DNA链上的探针的淬灭基团将被Taq酶的5’外切酶活性切除掉，将探针的荧光报告基团和淬灭基团分离，最终荧光信号将被荧光监测系统接收到。通过应用不一样的荧光报告基团，在同一个PCR反应中可以同时检测不一样的酶切消化的等位基因特异性探针。这样的5’外切酶实验在当今己经可以成功用来区分一些只含有一个碱基不同的等位基因。即管如此，TaqMan探针技术也遇到ARMS技术同样的开发瓶颈。
Cycleave probe PCR，技术原理类似TaqMan探针，只是探针含有一个rNTP碱基于SNP互补，当存在突变时，rNTP与突变配对，RNaseＨ识别并切割rNTP，使探针的荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，荧光产生，此项技术缺点是背景较高，探针容易降解，引物探针设计受限制。
PNA-LNA-clamp技术，采用NestPCR技术和PNA-LNA-clamp探针，PNA-LNA-clamp探针特异性的封闭野生型SNP，阻止野生型模板扩增从而达到扩增突变的目的。虽然这项技术很灵敏，但经历两次PCR容易污染，探针设计也受到限制。
高通量SNP检测技术也有一些自身的优势，但是同时也存在着各自的缺陷。拿核酸杂交反应的芯片技术来说，分辨率不高是由非特异性杂交导致的，容易出现假阳性的结果；而等位基因特异性引物延伸反应和单碱基延伸反应的芯片技术都需要多色荧光系统和对靶标进行的扩增、制备以及纯化等步骤，最终使突变检测工作操作起来费时耗力。
因此开发出一种实用经济型的新型SNP检测方法具有十分重要的意义。目前SNP突变检测技术，金标准还是“DNA测序”，但是DNA测序敏感性比较低，小于20%的核酸突变比较难分辨，并且周期比较长；而ARMS技术，无论是敏感性、特异性还是可操作性均胜于测序，已成功的推向临床，用于SNP突变检测，但是该技术的开发受到了SNP邻近核酸序列限制，极大的限制了ARMS的广泛应用，很难满足临床上日益增多的SNP和基因突变的检测需求。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了检测人EGFR基因突变的引物和探针体系及试剂盒，该引物和探针体系具有很高的灵敏度，可以满足低突变丰度样本的检测，即在野生基因组DNA的背景下，可以完成较低突变基因含量的检测，以高度的敏感性和特异性准确区分样本类型，发挥技术的最大优势：准确判断患者对该类治疗的预测疗效，以供临床医师参考，也尽最大努力筛选出有效人群，避免错过治疗。
为解决上述问题，本发明通过以下技术方案实现：
根据EGFR基因18、19、20和21外显子的野生型和突变序列，经过长期大量的试验研究，设计、筛选出一种检测人EGFR基因突变的引物和探针体系，包括如SEQ ID No：1～12、15～26所示的核苷酸序列。
设计一种检测人EGFR基因突变的方法，包括以下步骤：
（1）合成出上述引物和探针；
（2）检测特异性引物，在引物3’-末端起第2或第3位置引入脱氧次黄嘌呤核苷。
（3）配置荧光PCR反应体系，以FFPE组织或外周血游离DNA为模板，利用所述引物和探针体系扩增人EGFR基因突变序列，收集荧光信号FAM和HEX；
（4）结果判定：检测体系中，HEX通道15<Ct<22，表明上样在可控范围内，结果有效；以FAM信号通道为阳性判断标准，当曲线呈“S”曲线，且Ct<29时为阳性，即存在检测引物所对应突变；Ct为0则为阴性，即不存在检测引物所对应突变。
优选的，所述荧光PCR反应体系为：Buffer 5μL，Mg2+终浓度1.0～5mmol/L，dNTP终浓度100～1000nmol/L，单条引物终浓度100～500nmol/L，单条探针终浓度100～1000nmol/L，Taq DNA聚合酶1～3U，DNA模板5～10ng，补充蒸馏水至50μL；
优选的，所述荧光PCR扩增条件为：酶激活，95℃ 10min；突变富集，95℃ 30s，64℃50s，72℃ 25s，如此16个循环；扩增检测，95℃ 30s，58℃ 32s，72℃ 18s，如此30个循环。
更优选的，于“58℃ 32s”步骤收集荧光信号FAM和HEX。
优选的，所述Buffer为10×Buffer。
本发明还设计一种基于荧光PCR平台检测人EGFR基因突变的试剂盒，包括上述引物和/或探针中的至少一种，对FFPE组织及外周血游离DNA的检测同样有效。
本发明的积极有益效果在于：
本发明改良现有扩增受阻检测体系，其创新点在于摈弃ARMS引物设计中，引入错配的原则；本发明在特异性检测引物3’-末端起第2或第3个碱基，采用脱氧次黄嘌呤核苷代替；脱氧次黄嘌呤核苷（dI）是天然存在的碱基，也称肌苷，与A、G、C、T结合力弱，研究发现当它与其它的碱基结合时，会比其它碱基错配相对更稳定；研究表明，脱氧次黄嘌呤与其它碱基的结合能力为：dI：dC> dI：dA> dI：dG> dI：dT，因此在DNA聚合酶的催化下，脱氧次黄嘌呤优先与dC结合。
基于上述技术构思的本发明具有显著的优点：
（1）可同时检测EGFR基因多种突变；
（2）最多可以检测1～10拷贝的基因突变；
（3）特异性强，在10～30ng野生型DNA背景下不受干扰；
（4）检测性能突出，在10ng DNA背景下，可以检测出1～10拷贝的基因突变。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。以下各实施例中所涉及试验试剂，如无特别说明，均为市售，所涉及的方法步骤，如无特别说明，均为常规方法。
以下实施例中检测人EGFR基因突变的引物和探针体系如下表1所示。
表1 检测人EGFR基因突变的引物和探针
标准品是评价不同引物体系的核心，构建出序列正确、浓度准确的标准品才能公正和公平的评价不同突变检测体系。本发明以EGFR基因突变为研究对象，通过构建EGFR基因外显子18、19、20和21基因突变，具体突变类型见表2，来评价本发明的检测基因突变的能力。
表2 人EGFR基因突变类型
实施例1 一种检测人EGFR基因突变的方法，包括以下步骤：
（1）FFPE组织DNA提取
①将切片置于1.5mL的EP管中，加入1mL二甲苯溶液，充分混匀，脱蜡5min后离心去除二甲苯，重复3次；
②加入1mL无水乙醇充分混匀，离心去除液体，重复三次后，95%乙醇漂洗2 min，离心去上清，90%乙醇1 min，80%乙醇1 min，70%乙醇1 min；置于37℃烘干5～10min，让乙醇尽量挥发；
③使用Qiagen QIAamp FFPE DNA mini kit 提取DNA，详细操作流程参照试剂盒手册；
④消化：加入180μL ATL Buffer和20μL蛋白酶K，56℃过夜直到组织完全被消化为止；
⑤转归：消化结束后，90°C孵化1小时，其目的是ATL buffer在90℃可以逆转部分甲醛修饰的核酸；
⑥待温度降至室温，快速离心（14000rpm 离心1min），收取上清；
⑦加入200μL AL混匀，再加入200μL无水乙醇混匀（可能产生白色絮状物），快速离心收取上清（14000rpm离心1min）；
⑧将上清转移到吸附株上，8000rpm 离心1min；
⑨将吸附柱重新置于一个新的2mL收集管中，小心打开吸附柱盖子，加入500μLAW1 Buffer，8000rpm 离心1min；
⑩弃废液，小心加入500μL AW2 Buffer，8000rpm 离心1min；离心柱置于新的1.5mL EP管中，14000rpm 离心2min；
将吸附柱置于1.5EP管中，加入100μL ATE buffer与吸附柱中央，65°C孵浴5min，或常温10min；14000rpm离心3min，备用；
DNA浓度检测：于260/280nm吸光度检测DNA浓度和纯度，一般Qiagen试剂盒的纯度1.7～1.9。
（2）PCR扩增转染获得质粒，克隆到pGEM-T载体中，构建成重组质粒，转化至大肠杆菌DH5a中，提取重组质粒，测序鉴定，稀释备用。
（3）制定标准品
①灵敏度标准品：
将构建好的EGFR基因突变质粒分别稀释为1、3、101、102、103、104和105copies备用，该标准品用于评价各个方法检测的敏感性；
②特异性标准品I：
采用Qiagen DNA Blood kit于健康人全血提取人基因组DNA，DNA浓度测定后，DNA测序后鉴定无突变，依次稀释为300ng、100ng、50ng、30ng、10ng、5ng和2.5ng备用；
③分辨率标准品：
分辨率标准品Ⅰ：用104克隆的EGFR基因野生型质粒，构建分辨标准品I；104分辨率标准品，分别含有50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%的EGFR基因突变质粒；
分辨率标准品Ⅱ，用以模拟真实的FFPE组织中L858R突变情形，更为接近实际情况评价不同突变检测系统的检测性能：10ng野生型人基因组DNA（不含EGFR突变）分别加入102、101、5和3 copy的L858R的突变质粒，模拟FFPE组织中EGFR突变：10%、1%、0.1%和0.05%；
分辨率标准品Ⅲ，又称为外周血标准品。通过采用人为在外周血中加入EGFR基因突变质粒而形成类似外周血盘（panel）；该标准品建立的目的是进一步了解上述引物体系检测外周血少量基因突变的能力：2mL外周血中，分别加入104、103、102和10 copies的基因突变质粒。
（4）配置荧光PCR反应体系，以步骤（1）所提DNA为模板，利用所述引物和探针体系扩增人EGFR基因突变序列，收集荧光信号FAM和HEX；
50μL荧光PCR反应体系：Buffer（10×）5μL，Mg2+ 终浓度1.0mmol/L，dNTP终浓度100nmol/L，引物终浓度100nmol/L，探针终浓度100nmol/L，Taq DNA聚合酶 1U，DNA模板1μL；
荧光PCR扩增条件为：酶激活，95℃ 10min；突变富集，95℃ 30s，64℃50s，72℃25s，16个循环；扩增检测，30循环，95℃ 30s，58℃ 32s，72℃ 18s，于“58℃ 32s”该步骤收集荧光信号FAM和HEX。
（5）结果判定：检测体系中，HEX通道15<Ct<22，表明上样在可控范围内，结果有效；以FAM信号通道为阳性判断标准，曲线呈“S”曲线，且Ct<29 为阳性，Ct为0则为阴性。
（6）结论：本实施例可以检测最低至1拷贝的基因突变，且可以耐受高达30ng的野生型DNA干扰。通过各种分辨率标准品的测试，可以检测出0.1%的突变。
实施例2 人EGFR基因突变的检测方法，包括以下步骤：
（1）FFPE组织DNA提取
①将切片置于1.5mL的EP管中，加入1mL二甲苯溶液，充分混匀，脱蜡5min后离心去除二甲苯，重复3次；
②加入1mL无水乙醇充分混匀，离心去除液体，重复三次后；95%乙醇漂洗2分钟；离心去上清，90%乙醇1分钟，80%乙醇1分钟，70%乙醇1分钟；置于37℃烘干10min，让乙醇尽量挥发；
③使用Qiagen QIAamp FFPE DNA mini kit 提取DNA，详细操作流程参照试剂盒手册；
④消化：加入180μL ATL Buffer和20μL 蛋白酶K，56℃过夜直到组织完全被消化为止；
⑤转归：消化结束后，90°C孵化1小时，其目的是ATL buffer在90℃可以逆转部分甲醛修饰的核酸；
⑥待温度降至室温，快速离心（14000rpm离心1min），收取上清；
⑦加入200μL AL混匀，再加入200μL无水乙醇混匀（可能产生白色絮状物）；快速离心收取上清（14000rpm离心1min）；
⑧将上清转移到吸附株上，8000rpm离心1min；
⑨将吸附柱重新置于一个新的2mL收集管中，小心打开吸附柱盖子，加入500μLAW1 Buffer，8000rpm 离心1min；
⑩弃废液，小心加入500μL AW2 Buffer，8000rpm 离心1min；离心柱置于新的1.5mL EP管中，14000rpm 离心2min；
将吸附柱置于1.5EP管中，加入100μL ATE buffer与吸附柱中央，65°C孵浴5min，或常温10min；14000rpm 离心3min 备用；
DNA浓度检测：于260/280nm吸光度检测DNA浓度和纯度，一般Qiagen试剂盒的纯度1.7～1.9。
（2）配置荧光PCR反应体系，以步骤（1）所提DNA为模板，利用所述引物和探针体系扩增人EGFR基因突变序列，收集荧光信号FAM和HEX；
50μL荧光PCR反应体系：Buffer（10×）5μL，Mg2+ 5mmol/L，dNTP 1000nmol/L，引物500nmol/L，探针1000nmol/L，Taq DNA聚合酶3U，DNA 模板1μL；
荧光PCR扩增条件为：酶激活，95°C10min；突变富集，95°C 30s，64°C 50s，72°C25s，16个循环；扩增检测，30个循环，95°C 30s，58°C 32s，72°C 18s，于“58°C 32s”该步骤收集荧光信号FAM和HEX。
（3）结果判定：检测体系中，HEX通道15<Ct<22，表明上样在可控范围内，结果有效；以FAM信号通道为阳性判断标准，曲线呈“S”曲线，且Ct<29 为阳性，Ct为0则为阴性。
（4）结论：本实施例与DxS检测结果完全一致，见表3。
表3 采用多种方法对47例临床样本EGFR基因突变的检测结果
表3续
SEQUENCE LISTING
<110> 陈, 晓琦
<120> 检测人EGFR基因29种突变的引物和探针体系、方法及试剂盒
<130> /
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (19)..(19)
<223> I，n为i肌苷修饰碱基
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
caaaaagatc aaagtgctna 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (19)..(19)
<223> I，n为i肌苷修饰碱基
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 2
caaaaagatc aaagtgctnt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (19)..(19)
<223> I，n为i肌苷修饰碱基
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 3
aaaaagatca aagtgctgnc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gatggaaata tacagcttgc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccaccagacc atgagaggcc 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (14)..(16)
<223> I，n为i肌苷修饰碱基
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 6
ccgtcgctat caannnatct ccg 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (15)..(17)
<223> I，n为i肌苷修饰碱基
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(17)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 7
cgtcgctatc aaggnnncaa cat 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (15)..(17)
<223> I，n为i肌苷修饰碱基
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(17)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 8
cgtcgctatc aaggnnnaga aag 23
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (14)..(16)
<223> I，n为i肌苷修饰碱基
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 9
cgtcgctatc aagnnnccga aa 22
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (15)..(18)
<223> I，n为i肌苷修饰碱基
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(18)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 10
cgtcgctatc aaggnnnnat ctccg 25
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
acagcaaagc agaaactcac atcg 24
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gaggttcaga gccatg 16
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gatggccagc gtggctag 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gatggccagc gtggaagg 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gtggacaacc cccaccac 18
<210> 16
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (15)..(15)
<223> I，n为i肌苷修饰碱基
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 16
cctacgtgat ggccnt 16
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (16)..(16)
<223> I，n为i肌苷修饰碱基
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 17
caccgtgcag ctcatnat 18
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cacaccagtt gagcaggtac t 21
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
cctgattacc tttgcgatc 19
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (22)..(22)
<223> I，n为i肌苷修饰碱基
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 20
cgcaagatca cagattttgg gng 23
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (17)..(17)
<223> I，n为i肌苷修饰碱基
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 21
ttttgggctg gccaaana 18
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
acctccttac tttgcctcct tctgc 25
<210> 23
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
tgctggctga cctaaag 17
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gaccttgaaa gcctgtta 18
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
ggagttcaag agctagtg 18
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
attcatacgg tagagccatt cacagat 27

Claims (2)

1.检测人EGFR基因突变的引物和探针，由SEQ ID No：1～12、15～26所示的核苷酸序列所组成。
2.一种检测人EGFR基因突变的试剂盒，由权利要求1所述引物和探针所组成。
CN201510422291.8A 2015-07-17 2015-07-17 检测人egfr基因突变的引物和探针体系及试剂盒 Active CN105177118B (zh)

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