CN101182585B

CN101182585B - 一种鉴别hbv基因突变类型的方法及其专用芯片与试剂盒

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Publication number: CN101182585B
Application number: CN2007101793299A
Authority: CN
Inventors: 郭永; 赵传赞; 程京; 高华方; 王国青
Original assignee: Tsinghua University; CapitalBio Corp
Current assignee: Tsinghua University; CapitalBio Technology Co Ltd
Priority date: 2007-12-12
Filing date: 2007-12-12
Publication date: 2010-06-09
Anticipated expiration: 2027-12-12
Also published as: CN101182585A

Abstract

本发明公开了鉴别HBV基因突变类型的方法及其专用芯片与试剂盒。该鉴别HBV基因突变类型的方法，是以待检测乙型肝炎病毒的基因组为模板，用如下引物组和没有3′-5′端外切酶活性的DNA聚合酶进行多重PCR扩增，然后将得到的PCR产物与基因芯片进行杂交，根据杂交结果确定HBV基因突变类型；所述引物组包括一种共用引物和一种或一种以上的特异引物；所述特异引物的5′端是条码序列，所述条码序列的长度是5-25nt，所述条码序列与乙型肝炎病毒基因组较低的同源性；所述特异引物的3′端有5-25nt与乙型肝炎病毒的包括一个突变位点的野生型或突变型碱基在内的相应片段完全匹配；所述基因芯片包括若干种探针，所述探针与所述条码序列一一对应，每种探针只含有一种所述条码序列。

Description

一种鉴别HBV基因突变类型的方法及其专用芯片与试剂盒

技术领域

本发明涉及基因分析领域中一种鉴别HBV基因突变类型的方法及其专用芯片与试剂盒。

背景技术

慢性乙型肝炎是目前最严重的健康问题之一，全球约20亿人曾感染过乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)，其中3.5亿人为慢性HBV感染者，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌(HCC)。我国属HBV感染高流行区，中国现有1.3亿乙肝病毒携带者，3000多万乙型肝炎病人。一般人群的HBsAg阳性率为9.09％。HBV是一个高突变的病毒，在它逆转录复制过程中，因RNA聚合酶和逆转录酶缺乏校正功能，可使病毒在复制过程中发生一个或多个核苷酸的突变。HBV突变可以在慢性持续性感染过程中自然突变，也可以受人体免疫应答和疫苗接种，使病毒受免疫压力而导致突变，也可以因各种抗病毒药物治疗诱导病毒突变。发生突变的病毒常可改变其生物学特性，直接导致HBV的免疫逃避、耐药，从而造成治疗的失败和病情的恶化。因此，准确检测HBV突变基因类型将具有重要的生物学、临床和社会意义。

由于HBV自身复制能力很强，每24小时可以复制10²⁴个拷贝，在复制的逆转录过程中，逆转录酶缺乏严格校正机制，自发突变率达10^-5。在HBV感染过程中，会积累大量的HBV突变病毒株，而且与野生病毒株同时存在。在不同病程时期会出现优势种群和劣势种群的转换。

目前，已知的HBV多聚酶(Pol)基因(P基因)与耐药相关的突变类型包括如表1所示的一些类型。

表1、HBV P基因与耐药相关的突变类型

目前国内外HBV突变位点检测主要有以下几种方法：(1)HBV DNA聚合酶基因序列测定：根据HBV基因组保守序列设计引物扩增靶序列，将PCR产物直接测序，直接获得有关耐药突变的序列信息。尽管序列分析是金标准，但此方法只能检测含量大于10％的突变株，且操作复杂，成本较高，需要测序仪，多用于科研，不适用于临床检测中广泛应用；(2)HBV PCR产物限制性片段长度多态性分析(polymerasechain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)：原理为将待测的DNA片段用限制性内切酶酶切，以识别并切割特异的序列，将酶切后的产物进行电泳，根据DNA片段的大小来判断目的基因是否会有特异性序列。用PCR-RFLP方法在HBV耐拉米夫定突变株的检测原理为：将HBV聚合酶基因扩增，在扩增产物中引入特定碱基序列，其与突变株形成内切酶位点，而不能和野生株形成内切酶位点；突变株扩增产物经酶切后则产生短片段，根据电泳结果可以判断是否会有突变序列。但目前方法标准化程度差、混合基因型检测能力差，检测基因突变时，对于1个碱基以上的突变，需要多个检测系统分别检出；(3)PCR-序列特异性引物(PCR-sequence specific primer，PCR-SSP)扩增HBV DNA：位点特异性引物仅与特异突变序列结合，可特异地扩增出突变株。但每对引物1次只能检测1种特异突变，反应条件不易控制，存在非特异扩增的可能和HBV基因异质性较高、个体之间的HBV序列存在差异有可能产生假阴性，在临床检测中已很少应用。(4)肽核苷酸介导序列特异性PCR：PNA是一种核酸类似物，它的骨架为肽键链，碱基连在骨架链上的氮原子上。寡聚PNA可以与单链核酸模板结合，但不能作为引物引导DNA的合成。寡聚PNA结合力较普通寡核苷酸强，退火温度(Tm)比普通寡核苷酸高50％，但如果出现错配，则结合力迅速下降。在扩增时寡聚PNA作为阻轭物放在引物前面，与PCR引物部分重叠，当寡聚PNA与野生模板完全配对时，不能发生聚合反应；当寡聚PNA与突变模板出现错配时，结合力迅速下降，失去阻轭作用，使聚合反应得以进行。但此时扩增产物为突变序列。该方法可用于突变检测，但不能获得序列信息；(5)熔解温度法(melting temperature)。当温度慢慢升高时，由于单个碱基的不匹配也会造成结合能力的降低，因此发生位点突变的DNA模板会较早发生与探针的变性分离而导致荧光信号的降低，最终表现为突变株的Tm值低于野生株的Tm值，通过软件分析可以实现完全的区分而达到对突变的检测。目前有商品试剂供应，需要仪器为Roche Lightcycler，单一反应管，闭管检测，结果直观明确；(6)线性探针分析：将不同序列的探针固定在硝化纤维膜上的不同位置，每个位置用来检测不同的突变序列，然后与HBV聚合酶的基因扩增产物杂交。控制反应条件，使扩增出的突变序列与相应探针结合，再根据结合的不同位置探测出不同部位的突变。现在该方法已经有商品化试剂供应。该方法经扩增后杂交，具有敏感度好，可检测突变株大于10％的低滴度样品。尚有提供信息量大和操作可自动化的优点。但试剂昂贵，同时存在少量由于DNA序列多态性导致的不容易解释结果的问题，因此在临床检测中应用较少；(7)序列特异性探针杂交法(SequenceSpecific Oligonucleotide Probe，SSOP)基因芯片技术：利用基因芯片的高通量、平行检测特性，对引起突变的众多基因设计探针，这些探针结合于同一张芯片上，从血清样本中提取病毒DNA经体外扩增后，与芯片探针杂交，根据杂交信号判断HBV的突变基因型。该技术对于单碱基差异很难准确区分，特异性较差；同时，该方法很难对突变型/野生型共存个体进行准确的区分。

上述技术都存在一个共同的不足，即任何单一方法都不能高通量、准确特异的检出优势种群/劣势种群中的HBV基因突变类型。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴别HBV基因突变类型的方法及其专用芯片与试剂盒。

本发明所提供的鉴别HBV基因突变类型的方法，是以待检测乙型肝炎病毒的基因组为模板，用如下引物组和没有3′-5′端外切酶活性(exonuclease activity)的DNA聚合酶进行多重PCR扩增，然后将得到的PCR产物与基因芯片进行杂交，根据杂交结果确定HBV基因突变类型；

所述引物组包括一种共用引物和一种或一种以上的特异引物；

所述共用引物与所述特异引物组成的每对引物能扩增包括乙型肝炎病毒基因组的一个突变位点的突变型或野生型碱基在内的核苷酸片段；

所述特异引物的5′端是条码序列，所述条码序列的长度是5-25nt，所述条码序列与乙型肝炎病毒基因连续匹配或相同的碱基数小于5个；所述特异引物的3′端有5-25nt与乙型肝炎病毒的包括一个突变位点的野生型或突变型碱基在内的相应片段完全匹配；

当所述引物组包括一种以上的所述特异引物时，一种所述特异引物的5′端是一种条码序列，各种条码序列之间Tm值之差小于等于5℃，相互之间以及与所有的引物之间没有交叉杂交，并且无发夹结构，与含有所述HBV目的基因的物种的基因组连续匹配或相同的碱基数小于10个；

所述基因芯片包括若干种探针，所述探针与所述条码序列一一对应，每种探针只含有一种所述条码序列。

上述方法中，所述多重PCR扩增的模板具体可为从全血、血清、组织、病毒培养物提取的病毒核酸或质粒。

该方法中，因为每种PCR扩增产物只包括一个突变位点的野生型或突变型，并且被一种条码序列标记，当其与所述芯片杂交后，根据杂交结果，即可得知待测样品的突变类型，进而确定HBV的耐药情况。

所述特异引物可与乙型肝炎病毒的包括一个突变位点的野生型或突变型碱基在内的相应片段完全匹配。

为提高检测的特异性，所述特异引物中可以引入人工错配碱基。所述人工错配碱基是天然的A、T、C、G四种碱基或其类似物，该类似物包括尿嘧啶(U)，肽核酸(PNA)，锁定核酸(LNA)等。

所述多重PCR扩增可在一管中进行，或分为多管进行多管多重PCR反应。

所述条码序列可为单链寡核苷酸序列或肽核酸序列。

所述条码序列带有荧光分子或可通过化学发光或固体微粒进行标记检测的分子。

所述HBV基因突变类型可为rtL80V、rtL80I、rtI169T、rtV173G、rtV173L、rtL180M、rtA181T、rtA181V、rtT184G、rtS202I、rtM204I、rtM204V、rtM204S、rtN236T和rtM250I中的至少一种。

所述HBV基因突变类型具体可为rtL180M、rtA181T、rtA181V、rtM 204I、rtM204V、rtM204S和rtN236T中的至少一种。

检测上述HBV基因突变类型的引物组具体如下：所述共用引物的核苷酸序列是序列表中的序列1；

所述特异引物为下述11种单链核苷酸片段中的一种或任意多种，所述11种单链核苷酸片段的核苷酸序列分别是序列表中的序列2至序列12。

本发明提供了1条PCR上游共用引物以及11组PCR下游特异引物(方框内为HBV检测位点的特异引物，下划线为条码序列，粗斜体字为人工引入的错配碱基)：

共用引物：GCACGCTATCACGTTCTTCGCTGTACCAAACCTTCGGAC(序列1)；

用于扩增HBV P基因的rtL180M突变位点的两个基因特异性引物：

180L-WT：TCGAGTACAGGACCCACATCAG

(序列2),

180M-MU：GTTGGCTAGGAACTGCAAGCAC

(序列3)；

用于扩增HBV P基因的rtA181T突变位点的两个基因特异性引物；

181A-WT：TCGGCACGCGCGAGATCACCATC

(序列4)

181T-MU：GCATAGACGTGGCTCAACTGTC

(序列5)

用于扩增HBV P基因的rtA181V突变位点的两个基因特异性引物；

181A-WT：

TCGGCACGCGCGAGATCACCATC

(序列4)

181V-MU

：AGCTAGACCACTCAGCAGACTG

(序列6)

用于扩增HBV P基因的rtM204I突变位点的两个基因特异性引物；

204M-WT：

TTTTCCCGTCCGTCATCGCTCAAG

(序列7)

204I-MU：

GTTAGGGTCGCGCCAAACTCTCC (序列8)

用于扩增HBV P基因的rtM204V突变位点的两个基因特异性引物；

204M-WT：

TTTTCCCGTCCGTCATCGCTCAAG

(序列7)

204V-MU：

AGTCGAAGTGTGCGTCAGACTC (序列9)

用于扩增HBV P基因的rtM204S突变位点的两个基因特异性引物；

204M-WT：

TTTTCCCGTCCGTCATCGCTCAAG

(序列7)

204S-MU：

CAAGGCACGTCCCAGACGCATCAA

(序列10)

用于扩增HBV P基因的rtN236T突变位点的两个基因特异性引物；

236N-WT：

GAGTGAAGCCAATCGAGTGAGCC

(序列11)

236T-MU：

CTGTTAAACGTCAGAGCGCAGC (序列12)

所述条码序列为下述11种单链核苷酸片段中的一种或任意多种：所述11种单链核苷酸片段的核苷酸序列分别是序列表中的序列2的自5′末端的第1至22位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列3的自5′末端的第1至22位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列4的自5′末端的第1至23位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列5的自5′末端的第1至22位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列6的自5′末端的第1至22位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列7的自5′末端的第1至24位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列8的自5′末端的第1至23位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列9的自5′末端的第1至22位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列10的自5′末端的第1至24位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列11的自5′末端的第1至23位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列12的自5′末端的第1至22位脱氧核糖核苷酸；

所述基因芯片包括下述11种探针中的一种或任意多种：所述11种探针中的每种探针分别含有一种所述条码序列。

本发明所提供的鉴别HBV基因突变类型的基因芯片，它包括下述11种探针中的一种或任意多种，所述11种探针中的每种探针分别含有下述11种条码序列中的任意一种；

所述条码序列为下述11种单链核苷酸片段中的一种或任意多种：所述11种单链核苷酸片段的核苷酸序列分别是序列表中的序列2的自5′末端的第1至22位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列3的自5′末端的第1至22位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列4的自5′末端的第1至23位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列5的自5′末端的第1至22位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列6的自5′末端的第1至22位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列7的自5′末端的第1至24位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列8的自5′末端的第1至23位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列9的自5′末端的第1至22位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列10的自5′末端的第1至24位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列11的自5′末端的第1至23位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列12的自5′末端的第1至22位脱氧核糖核苷酸。

本发明所提供的鉴别HBV基因突变类型的试剂盒，包括一种共用引物和一种或一种以上的特异引物；

所述特异引物的5′端是条码序列，所述条码序列的长度是5-25nt，所述条码序列与乙型肝炎病毒基因组同源性较低(连续匹配或相同的碱基数小于10个)；所述特异引物的3′端有5-25nt与乙型肝炎病毒的包括一个突变位点的野生型或突变型碱基在内的相应片段完全匹配；

当所述引物组包括一种以上的所述特异引物时，一种所述特异引物的5′端是一种条码序列，各种条码序列之间Tm值之差小于等于5℃(有相似的Tm值)，相互之间以及与所有的引物之间没有交叉杂交，并且无发夹结构，与含有所述HBV目的基因的物种的基因组连续匹配或相同的碱基数小于10个；

所述特异引物与乙型肝炎病毒的包括一个突变位点的野生型或突变型碱基在内的相应片段完全匹配。

所述条码序列为单链寡核苷酸序列或肽核酸序列。

所述特异引物引入人工错配碱基；所述人工错配碱基是天然的A、T、C、G四种碱基或其类似物，所述类似物包括尿嘧啶(U)，肽核酸(PNA)，锁定核酸(LNA)等。

所述突变位点为rtL80V、rtL80I、rtI169T、rtV173G、rtV173L、rtL180M、rtA181T、rtA181V、rtT184G、rtS202I、rtM 204I、rtM204V、rtM204S、rtN236T和rtM250I中的至少一个。

所述突变位点为rtL180M、rtA181T、rtA181V、rtM 204I、rtM204V、rtM204S和rtN236T中的至少一个。

所述共用引物的核苷酸序列是序列表中的序列1；

所述试剂盒还包括上述基因芯片。

所述试剂盒还包括没有3′-5′端外切酶活性的DNA聚合酶。

本发明中的多重PCR不同于一般意义上的简单多重PCR。首先，特异性引物的3′末端碱基有两种形式，一种是末端碱基和待检测的基因位点野生型(SNP或突变)匹配，一种是末端碱基和待检测的基因位点突变型(SNP或突变)匹配，二者相互对照，这增加了反应的特异性和准确性；其次，在特异引物的末端连接条码序列用于对待检测的基因位点进行编码；另外，为了增强反应的特异性可以在引物序列中引入人工突变点。

本发明中的通用芯片也不同于一般意义上的固定有序列特异性探针的基因芯片，在普通芯片上固定的探针是针对基因的特定位点进行检测的基因片段，检测不同的目标基因需要设计不同的探针，制备不同的芯片。而本发明中基因芯片是一种用来对预先筛选出的一套序列特异性基因片段(条码序列)进行识别的基因芯片，芯片上固定的探针不是针对特定的基因序列，而是针对特定的条码序列。条码序列可以用来对不同的基因位点、对不同基因的不同位点、对不同物种的不同基因位点进行编码(相当于一个条码)，对于不同的检测目的可以用相同的一套条码序列，这样对于不同检测目的，只要在芯片上固定一套可以识别这套条码序列的基因片段就可完成检测任务。

本发明的方法快速、简便、更具可操作性、易于实现自动化操作。可用于HBV基因突变检测、基因多态性分析等方面，适用于临床HBV耐药和基因型检测、耐药以及肝癌机理研究和流行病学调查等领域，有利于指导临床诊断、个体化医疗、耐药监测和预后分析等。

附图说明

图1为基因芯片点阵排布示意图

图2为用图1所示的基因芯片对克隆质粒进行实际检测的结果

图3为用图1所示的基因芯片对乙型肝炎病人的临床样品1#进行实际检测的结果

图4为用图1所示的基因芯片对乙型肝炎病人的临床样品2#进行实际检测的结果

图5为用图1所示的基因芯片对乙型肝炎病人的临床样品3#进行实际检测的结果

具体实施方式

下述实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、用本发明的基因芯片和方法检测已知HBV突变的克隆质粒样品

1.突变克隆质粒制备

1)HBV P基因的野生型质粒pGEM-T-HBVPWT的制备

以HBV基因组DNA为模板，用上游引物(序列：CAAGGTATGTTGCCCGTTTG)和下游引物(序列：GGAGTTCCGCAGTATGGATCGG)PCR扩增核苷酸序列是GenbankAccession Number AB205123的自5′末端第1448位至2191位脱氧核糖核苷酸，将该PCR产物与pGEM-T Easy载体连接，得到含有核苷酸序列是Genbank AccessionNumber AB205123的自5′末端第1448位至2191位脱氧核糖核苷酸的包括HBV P编码基因在内的片段的重组质粒pGEM-T-HBVPWT，该质粒为包括HBV P基因的野生型质粒。

2)HBV P基因的突变型质粒pGEM-T-HBVPMU180M、pGEM-T-HBVPMU181T、pGEM-T-HBVPMU181V、pGEM-T-HBVPMU204I、pGEM-T-HBVPMU204V、pGEM-T-HBVPMU204S和pGEM-T-HBVPMU236T的制备方法如下：

其中，所用的引物序列具体如下：

用于制备HBV P基因突变克隆的通用上游引物：

CAAGGTATGTTGCCCGTTTG(突变引物1)；

用于制备HBV P基因突变克隆的通用下游引物：

GGAGTTCCGCAGTATGGATCGG(突变引物2)；

用于制备HBV P基因的rtL180M突变克隆的引物：

突变上游引物：CGTTTCTCATGGCTCAGTTTAC(突变引物3)，

突变下游引物：GTAAACTGAGCCATGAGAAACGG(突变引物4)；

用于制备HBV P基因的rtA181T突变克隆的引物：

突变上游引物：GTTTCTCCTGACTCAGTTTACTAG(突变引物5)，

突变下游引物：CTAGTAAACTGAGTCAGGAGAAACG(突变引物6)；

用于制备HBV P基因的rtA181V突变克隆的引物：

突变上游引物：GTTTCTCCTGGTTCAGTTTACTAG(突变引物7)，

突变下游引物：CTAGTAAACTGAACCAGGAGAAACG(突变引物8)；

用于制备HBV P基因的rtM204I突变克隆的引物：

突变上游引物：CTTTCAGTTATATTGATGATGTGG(突变引物9)，

突变下游引物：ACCACATCATCAATATAACTGAAAG(突变引物10)；

用于制备HBV P基因的rtM204V突变克隆的引物：

突变上游引物：CTTTCAGTTATGTGGATGATGTG(突变引物11)，

突变下游引物：CACATCATCCACATAACTGAAAG(突变引物12)；

用于制备HBV P基因的rtM204S突变克隆的引物：

突变上游引物：CTTTCAGTTATAGTGATGATGTGG(突变引物13)，

突变下游引物：ACCACATCATCACTATAACTGAAAG(突变引物14)；

用于制备HBV P基因的rtN236T突变克隆的引物：

突变上游引物：GGTATACATTTGACCCCTAATAAAAC(突变引物15)，

突变下游引物：GTTTTATTAGGGGTCAAATGTATACC(突变引物16)。

第一轮PCR扩增：所有反应均以野生型质粒pGEM-T-HBVPWT作为模板；分别以突变引物1和突变引物3以及突变引物2和突变引物4进行PCR扩增，扩增产物分别命名为产物1和产物2；分别以突变引物1和突变引物5以及突变引物2和突变引物6进行PCR扩增，扩增产物分别命名为产物3和产物4；分别以突变引物1和突变引物7以及突变引物2和突变引物8进行PCR扩增，扩增产物分别命名为产物5和产物6；分别以突变引物1和突变引物9以及突变引物2和突变引物10进行PCR扩增，扩增产物分别命名为产物7和产物8；分别以突变引物1和突变引物11以及突变引物2和突变引物12进行PCR扩增，扩增产物分别命名为产物9和产物10；分别以突变引物1和突变引物13以及突变引物2和突变引物14进行PCR扩增，扩增产物分别命名为产物11和产物12；分别以突变引物1和突变引物15以及突变引物2和突变引物16进行PCR扩增，扩增产物分别命名为产物13和产物14；

第二轮PCR扩增：所有反应引物均为突变引物1和突变引物2；共扩增7管，模板分别为产物1和产物2的混合物(管1)，产物3和产物4的混合物(管2)，产物5和产物6的混合物(管3)，产物7和产物8的混合物(管4)，产物9和产物10的混合物(管5)，产物11和产物12的混合物(管6)，产物13和产物14的混合物(管7)

将上述PCR产物(管1)与pGEM-T Easy载体连接，得到质粒pGEM-T-HBVPMU180M，该质粒为包括HBV P基因的180M突变型质粒；将上述PCR产物(管2)与pGEM-T Easy载体连接，得到质粒pGEM-T-HBVPMU181T，该质粒为包括HBV P基因的180T突变型质粒；将上述PCR产物(管3)与pGEM-T Easy载体连接，得到质粒pGEM-T-HBVPMU181V，该质粒为包括HBV P基因的180V突变型质粒；将上述PCR产物(管4)与pGEM-T Easy载体连接，得到质粒pGEM-T-HBVPMU204I，该质粒为包括HBV P基因的204I突变型质粒；将上述PCR产物(管5)与pGEM-T Easy载体连接，得到质粒pGEM-T-HBVPMU204V，该质粒为包括HBV P基因的204V突变型质粒；将上述PCR产物(管6)与pGEM-T Easy载体连接，制备质粒pGEM-T-HBVPMU204S，该质粒为包括HBV P基因的204S突变型质粒；将上述PCR产物(管7)与pGEM-T Easy载体连接，得到质粒pGEM-T-HBVPMU236T，该质粒为包括HBV P基因的236T突变型质粒。

2.制备多重PCR引物及基因芯片的探针

(1)引物

引物如表2所示，引物名称中后缀为WT的引物代表扩增野生型基因特异性引物，引物名称中后缀为MU的引物代表扩增突变型基因特异性引物，每个突变位点的两种基因特异性引物分别与共用引物(UF)配对。多重PCR引物序列见序列1～序列12，引物由上海Invitrogen公司(Invitrogen Co.，Shanghai，China)合成与纯化。

为提高检测特异性，部分等位基因特异性引物中引入人工错配碱基。

(2)探针

芯片是由与多重PCR产物杂交的11种条码序列探针、QC(点样的阳性质控)、BC(点样的阴性质控)、NC(杂交的阴性质控)和PC(杂交的阳性质控)组成的阵列。

其中，探针序列具体如下(下划线为条码序列)：

用于检测HBV P基因的rtL180M突变位点扩增产物的探针；

180L：NH2-polyT15-gttggctaggaactgcaagcac(条码序列是序列2的自5′末端的第1至22位脱氧核糖核苷酸)

180M：NH2-polyT15-tcgagtacaggacccacatcag(条码序列是序列3的自5′末端的第1至22位脱氧核糖核苷酸)

用于检测HBV P基因的rtA181T突变位点扩增产物的探针；

181A：NH2-polyT15-tcggcacgcgcgagatcaccatc(条码序列是序列4的自5′末端的第1至23位脱氧核糖核苷酸)

181T：NH2-polyT15-gcatagacgtggctcaactgtc(条码序列是序列5的自5′末端的第1至22位脱氧核糖核苷酸)

用于检测HBV P基因的rtA181V突变位点扩增产物的探针；

181V：NH2-polyT15-agctagaccactcagcagactg(条码序列是序列6的自5′末端的第1至22位脱氧核糖核苷酸)

用于检测HBV P基因的rtM204I突变位点扩增产物的探针；

204M：NH2-polyT15-ttttcccgtccgtcatcgctcaag(条码序列是序列7的自5′末端的第1至24位脱氧核糖核苷酸)

204I：NH2-polyT15-gttagggtcgcgccaaactctcc(条码序列是序列8的自5′末端的第1至23位脱氧核糖核苷酸)

用于检测HBV P基因的rtM204V突变位点扩增产物的探针；

204V：NH2-polyT15-agtcgaagtgtgcgtcagactc(条码序列是序列9的自5′末端的第1至22位脱氧核糖核苷酸)

用于检测HBV P基因的rtM204S突变位点扩增产物的探针；

2048：NH2-polyT15-caaggcacgtcccagacgcatcaa(条码序列是序列10的自5′末端的第1至24位脱氧核糖核苷酸)

用于检测HBV P基因的rtN236T突变位点扩增产物的探针；

236N：NH2-polyT15-gagtgaagccaatcgagtgagc(条码序列是序列11的自5′末端的第1至23位脱氧核糖核苷酸)

236T：NH2-polyT15-ctgttaaacgtcagagcgcagc(条码序列是序列12的自5′末端的第1至22位脱氧核糖核苷酸)。

探针由上海Invitrogen公司(Invitrogen Co.，Shanghai，China)合成与纯化。

芯片上的条码序列探针序列结构通式为：NH₂-TTTTTTTTTTTTTTT-条码序列。即探针的5′端氨基修饰，氨基旁边连接poly-T15，然后是分别是条码序列。

将探针固定到醛基化修饰的玻片上。所有的条码序列探针用50％DMSO溶解，终浓度为15μM，每个点重复四次点制到玻片上。

QC是一端带有Hex标记，另一端氨基修饰的寡核苷酸探针，用于观察芯片点样和固定的效率，其序列为NH₂-TTTTTTTTTTTTTTTAGAGTGCTTGGTGCCATAAC-HEX；BC为50％的DMSO，用于质控点样过程中有无样品残留污染；NC是一段氨基修饰的寡核苷酸探针，与杂交液中的所有待检测序列不会杂交，用于观察有无非特异杂交，其序列为NH₂-TTTTTTTTTTTTTTTGCAACCACCACCGGAGG；PC是一段氨基修饰的寡核苷酸探针，可以与杂交液中添加的荧光标记的互补序列(c-PC)杂交，用于杂交过程的质控，其序列为NH₂-TTTTTTTTTTTTTTTGGTATCGCGACCGCATCCCAATCT。

表2.检测的突变位点、引物及探针

3.多重PCR

分别以pGEM-T-HBVPWT，pGEM-T-HBVPMU180M，pGEM-T-HBVPMU181T，pGEM-T-HBVPMU204V和pGEM-T-HBVPMU236T 5种质粒等摩尔混合作为模板，进行多重PCR。

多重PCR在2管中进行，2管除了特异引物不同，其余成分完全相同。管1特异引物：180L-WT，181A-WT，204M-WT，236N-WT；管2特异引物：180M-MU，204I-MU，204V-MU，204S-MU，181T-MU，181V-MU，236T-MU。

扩增体系如下，包括0.2mM dNTPs，1×Qiagen PCR buffer，添加MgCl₂至2mM，pH 8.7，1单位HotStarTaq DNA Polymerase(Qiagen，Hilden，Germany)，和0.1ng质粒DNA，共用引物，各检测位点的特异引物。25μl扩增体系中，各引物的浓度如下：180L-WT 0.02μM，181A-WT 0.02μM，204M-WT 0.03μM，236N-WT0.03μM，180M-MU 0.03μM，204I-MU 0.03μM，204V-MU 0.02μM，204S-MU 0.02μM，181T-MU 0.03μM，181V-MU 0.02μM，236T-MU 0.02μM，共用引物0.8μM。

扩增参数为：

先95℃15分钟；

然后94℃30秒，0.5℃/秒降至69℃，56℃30秒，0.2℃/秒升至70℃，70℃45秒，10个循环；

再90℃30秒，0.5℃/秒降至60℃，56℃30秒，0.2℃/秒升至70℃，70℃45秒，22个循环；

最后60℃10分钟；

4℃保存。

4，基因芯片杂交

2管PCR产物混合，取10μl混合物加到20μl杂交缓冲液中(6×SSC，5×Denhardt′s reagent，25％甲酰胺，0.1％SDS，5nM c-PC(与芯片PC互补的序列，5′端TAMRA标记)。98℃变性5分钟，冰浴，杂交混合物加入到两个相邻的点阵中作为重复实验。然后将芯片放置50℃水浴中杂交1小时。取出玻片分别在两种洗液中42℃各洗2min，洗液I：0.3×SSC/0.1％SDS，洗液II：0.06×SSC。最后，玻片稍离心甩干。

5.数据分析使用晶芯^TMLuxscan-10K/B(博奥生物有限公司)扫描玻片，扫描图如图3所示。图2显示的是用图1所示的基因芯片对pGEM-T-HBVPWT，pGEM-T-HBVPMU180M，pGEM-T-HBVPMU181T，pGEM-T-HBVPMU204V和pGEM-T-HBVPMU236T混合PCR产物进行实际检测的结果。每种探针2×2连续重复点样四次。杂交结果显示野生型检测探针(180L、181A、204M、236N)全部出现杂交信号(工作正常)；杂交图中相应的突变检测探针(180M、181T、204V、和236T)均杂交出了相应的正确检测信号。而181T、204V和204S突变检测探针均没有出现杂交信号。由图2结果可知，所有位点检测结果都正确无误，特异性很好。

实施例2、用本发明的基因芯片和方法检测已知HBV突变的临床样品

1.临床样品核酸制备

已知HBV基因突变的离体病例样品(HBV阳性血清)由人民医院肝病研究所提供。样品1#为HBV P基因的野生型(WT)、HBV P基因的突变型180M和HBV P基因的突变型204I的混合型；样品2#为HBV P基因的野生型(WT)、HBV P基因的突变型180M和HBV P基因的突变型204S的混合型；样品3#为HBV P基因的野生型(WT)、HBV P基因的突变型181V和HBV P基因的突变型236T的混合型。

使用

DNA Blood Mini Kit(Qiagen，Hilden，Germany)提取HBV阳性血清中的基因组DNA。

2.制备多重PCR引物及基因芯片的探针

(1)引物

引物如表1所示，引物名称中后缀为WT的引物代表扩增野生型基因特异性引物，引物名称中后缀为MU的引物代表扩增突变型基因特异性引物，每个突变位点的两种基因特异性引物分别与共用引物(UF)配对。多重PCR引物序列见序列1～序列13，引物由上海Invitrogen公司(Invitrogen Co.，Shanghai，China)合成与纯化。

(2)探针

芯片与实施例1中的如图1所示的芯片相同。该芯片是由与多重PCR产物杂交的11种条码序列探针(如图1所示，探针序列同实施例1)、QC(点样的阳性质控)、BC(点样的阴性质控)、NC(杂交的阴性质控)和PC(杂交的阳性质控)组成的阵列。

3.多重PCR

分别以从样品1#、样品2#、样品3#中提取的基因组DNA为模板，进行多重PCR。

扩增体系如下，包括0.2mM dNTPs，1×Qiagen PCR buffer，添加MgCl₂至2mM，pH 8.7，1单位HotStarTaq DNA Polymerase(Qiagen，Hilden，Germany)，和0.1ng质粒DNA，共用引物，各检测位点的特异引物。25μl扩增体系中，各引物的浓度如下：180L-WT 0.02μM，181A-WT 0.02μM，204M-WT 0.03μM，236N-WT 0.03μM，180M-MU 0.03μM，204I-MU 0.03μM，204V-MU 0.02μM，204S-MU 0.02μM，181T-MU0.03μM，181V-MU 0.02μM，236T-MU 0.02μM，共用引物0.8μM。

扩增参数为：

先95℃15分钟；

最后60℃10分钟；

4℃保存。

4.基因芯片杂交

5.数据分析

使用晶芯^TMLuxscan-10K/B(博奥生物有限公司)扫描玻片，扫描图如图3-5所示。图3-图5显示的是用图1所示的基因芯片对临床乙肝患者血清样品进行实际检测的结果。每种探针2×2连续重复点样四次。样品1#的检测结果如图3所示，样品2#的检测结果如图4所示，样品3#的检测结果如图5所示。杂交结果显示野生型检测探针(180L、181A、204M、236N)全部出现杂交信号(工作正常)；杂交图中相应的突变检测探针(180M、181V、204I、204S和236T)均杂交出了相应的正确检测信号。而181T和204V突变检测探针均没有出现杂交信号。由图3-图5结果可知，所有位点检测结果都正确无误，特异性很好。

序列表

<160>12

<210>1

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gcacgctatc acgttcttcg ctgtaccaaa ccttcggac 39

<210>2

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

tcgagtacag gacccacatc agcactagta aactgagccg g 41

<210>3

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

gttggctagg aactgcaagc acgggcacta gtaaactgac ccat 44

<210>4

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

tcggcacgcg cgagatcacc atcacaaatg gcactagaaa actgtgc 47

<210>5

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

gcatagacgt ggctcaactg tcaatggcac tagtaaactg tgt 43

<210>6

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

agctagacca ctcagcagac tggaacaaat ggcactagta aactcaa 47

<210>7

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

ttttcccgtc cgtcatcgct caagccccca ataccacatc aacc 44

<210>8

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

gttagggtcg cgccaaactc tcccccccaa taccacatca tgaa 44

<210>9

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

agtcgaagtg tgcgtcagac tccccccaat accacatcat gaa 43

<210>10

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

caaggcacgt cccagacgca tcaaccccca ataccacatc attac 45

<210>11

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>11

gagtgaagcc aatcgagtga gccaacgttt ggttttatta gggt 44

<210>12

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>12

ctgttaaacg tcagagcgca gccaacgttt ggttttatta gggg 44

Claims

1.一种鉴别HBV基因突变类型的方法，是以待检测乙型肝炎病毒的基因组为模板，用如下引物组和没有3′-5′端外切酶活性的DNA聚合酶进行多重PCR扩增，然后将得到的PCR产物与基因芯片进行杂交，根据杂交结果确定HBV基因突变类型；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述特异引物与乙型肝炎病毒的包括一个突变位点的野生型或突变型碱基在内的相应片段完全匹配。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述多重PCR扩增在一管中进行，或分为多管进行多管多重PCR反应。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述条码序列为单链寡核苷酸序列或肽核酸序列。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述特异引物引入人工错配碱基；所述人工错配碱基是天然的A、T、C、G四种碱基或其类似物；所述类似物包括尿嘧啶，肽核酸和锁定核酸。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述条码序列带有荧光分子或可通过化学发光或固体微粒进行标记检测的分子。

7.根据权利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于：所述HBV基因突变类型为rtL80V、rtL80I、rtI169T、rtV173G、rtV173L、rtL180M、rtA181T、rtA181V、rtT184G、rtS202I、rtM204I、rtM204V、rtM204S、rtN236T和rtM250I中的至少一种。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述HBV基因突变类型为rtL180M、rtA181T、rtA181V、rtM204I、rtM204V、rtM204S和rtN236T中的至少一种。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述共用引物的核苷酸序列是序列表中的序列1；

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述条码序列为下述11种单链核苷酸片段中的一种或任意多种：所述11种单链核苷酸片段的核苷酸序列分别是序列表中的序列2的自5′末端的第1至22位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列3的自5′末端的第1至22位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列4的自5′末端的第1至23位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列5的自5′末端的第1至22位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列6的自5′末端的第1至22位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列7的自5′末端的第1至24位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列8的自5′末端的第1至23位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列9的自5′末端的第1至22位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列10的自5′末端的第1至24位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列11的自5′末端的第1至23位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列12的自5′末端的第1至22位脱氧核糖核苷酸；

11.一种基因芯片，它包括下述11种探针中的一种或任意多种，所述11种探针中的每种探针分别含有下述11种条码序列中的任意一种；

所述条码序列为下述11种单链核苷酸片段中的一种或任意多种：所述11种单链核苷酸片段的核苷酸序列分别是序列表中的序列2的自5′末端的第1至22位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列3的自5′末端的第1至22位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列4的自5′末端的第1至23位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列5的自5′末端的第1至22位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列6的自5′末端的第1至22位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列7的自5′末端的第1至24位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列8的自5′末端的第1至23位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列9的自5′末端的第1至22位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列10的自5′末端的第1至24位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列11的自5′末端的第1至23位脱氧核糖核苷酸、序列表中的序列12的自5′末端的第1至22位脱氧核糖核苷酸.

12.一种试剂盒，包括一种共用引物和一种或一种以上的特异引物；

当所述引物组包括一种以上的所述特异引物时，一种所述特异引物的5′端是一种条码序列，各种条码序列之间Tm值之差小于等于5℃，相互之间以及与所有的引物之间没有交叉杂交，并且无发夹结构，与含有所述HBV目的基因的物种的基因组连续匹配或相同的碱基数小于10个。

13.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于：所述特异引物与乙型肝炎病毒的包括一个突变位点的野生型或突变型碱基在内的相应片段完全匹配。

14.根据权利要求12或13所述的试剂盒，其特征在于：所述条码序列为单链寡核苷酸序列或肽核酸序列。

15.根据权利要求12或13所述的试剂盒，其特征在于：所述特异引物引入人工错配碱基；所述人工错配碱基是天然的A、T、C、G四种碱基或其类似物；所述类似物包括尿嘧啶，肽核酸和锁定核酸。

16.根据权利要求12或13所述的试剂盒，其特征在于：所述条码序列带有荧光分子或可通过化学发光或固体微粒进行标记检测的分子。

17.根据权利要求12或13所述的试剂盒，其特征在于：所述突变位点为rtL80V、rtL80I、rtI169T、rtV173G、rtV173L、rtL180M、rtA181T、rtA181V、rtT184G、rtS202I、rtM204I、rtM204V、rtM204S、rtN236T和rtM250I中的至少一个。

18.根据权利要求17所述的试剂盒，其特征在于：所述突变位点为rtL180M、rtA181T、rtA181V、rtM204I、rtM204V、rtM204S和rtN236T中的至少一个。

19.根据权利要求12或13所述的试剂盒，其特征在于：所述共用引物的核苷酸序列是序列表中的序列1；

20.根据权利要求19所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括权利要求11所述的基因芯片。

21.根据权利要求20所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括没有3′-5′端外切酶活性的DNA聚合酶。