CN1840695A - 一种序列特异性寡核苷酸探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种序列特异的寡核苷酸探针及其应用。本发明所提供的序列特异的寡核苷酸探针，含有与靶基因互补的序列，其中，所述寡核苷酸探针上包括至少一个碱基突变。本发明的发明人通过实验证实，本发明的序列特异的寡核苷酸探针对单核苷酸多态性(SNP)的检测特异性大大提高，可以应用于基因分型检测中。本分明的序列特异的寡核苷酸探针，合成原料来源充分，价格低廉，合成工艺成熟，杂交特异性高，具有广泛的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种序列特异性寡核苷酸探针及其应用。
背景技术
用于基因序列变化分析的方法是基于与基因特定序列互补的一段序列特异性寡核苷酸探针(Sequence specific oligonucleotide probe，SSOP)对基因序列的特异性识别来实现的。当探针和基因完全匹配时所形成的杂合体热稳定性高于含有错配碱基的杂合体，每百分之一的错配率将导致杂交体稳定的温度降低1～1.5℃(金冬雁等，分子克隆实验指南，1992年第二版，P541)，据此通过控制杂交温度和其它杂交条件可以使完全匹配的杂交体与含有错配碱基的杂合体区分开来，从而达到基因分析的目的。
尽管理论上可以利用含有错配碱基的探针和目标基因形成的杂合体稳定性差的现象对基因序列上的碱基变化进行检测，但是往往由于碱基错配形式不同、基因序列不同、基因高级结构的差异等因素造成实际情况比理论情况要复杂的多(Kawase Y.etal.Nucleic Acids Res.，14(19)：7727，1986；Ikuta S.et al.，Nucleic Acids Res.，15(2)：797，1987.；Zhang Y.et al.Biophysical journal，81(2)：1133，2001.；Fang Dong F.et al.NucleicAcids Res.，29(15)：3248，2001.)。为了提高对单个碱基变化的检测准确率，一般倾向于把探针设计的较短(＜15bp)，但是为了保持探针对基因识别的特异性和维持相对较高的杂交信号强度又不能使得探针太短，而且即使是相同长度的探针也会由于其GC含量不同、所检测的可变碱基在探针上的位置和数量不同等原因导致这种基于探针杂交的过程变得非常复杂(Bhaumik SR，Chary KV.J Biomol Struct Dyn.，20(2)：199.2002.；Letowski J，Brousseau R，Masson L.J Microbiol Methods，57(2)：269，2004)。其中，探针与靶序列的杂交特异性是最关键的因素，现有一些方法来提高探针检测基因序列变化、特别是单个碱基变化的特异性，例如：对核酸上的戊糖进行化学修饰以提高探针Tm值的方法(也被称为Locked Nucleic Acid，LNA法)(Jacobsen N.et al.Nucleic Acids Res.，30(19)：e100，2002；Mouritzen P.et al.Expert Rev Mol Diagn.，3(1)：27，2003.)、用肽核酸代替核酸作为探针的方法(也被称为Peptide Nucleic Acid，PNA法)(Igloi GL.Proc Natl Acad Sci USA.95(15)：8562，1998.)。另外，有人用碱基类似物(如：3-硝基吡咯)对寡核酸探针中的某个碱基进行替换从而拉大完全匹配和含单碱基突变探针之间Tm的差异(Guo Z，Liu Q，Smith LM.Nat.Biotechno1.，15：331，1997.；Zhen G.，Smith LM.，Lloyd M.US Patent，5780233.)。
上述方法中，LNA法由于寡核苷酸探针序列的多变性使得在探针中掺入LNA碱基的个数和位置都很难把握，因此实际操作难度很大。而且，由于LNA法尚未被广泛应用，所以其探针合成成本和价格都较高，这也在某种程度上限制了其实用性；PNA法则由于其化学合成难度较大、成本较高(http：//www.metabion.com)，使得在过去十多年的时间里该技术仍没有得到较好的推广应用；采用碱基类似物代替探针中某个碱基的方法较上述方法有所改进，但具体替代哪个碱基能达到最佳效果尚很难把握，关于替代的规律尚需要做很多研究工作，而且该类碱基类似物的使用量较小，探针合成成本较高，从而在某种程度上限制了该技术的推广和应用。因此，需要建立一种操作方便、价格便宜、实用性强的方法来提高探针杂交的特异性，使SSOP(Sequence specificoligonucleotide probe，序列特异性寡核苷酸探针)方法在基因序列分析中发挥更大的作用。
发明内容
本发明的目的是序列特异性寡核苷酸探针及其应用。
本发明所提供的序列特异性寡核苷酸探针，含有与靶基因互补的序列，其中，所述寡核苷酸探针上包括至少一个碱基突变。
在该寡核苷酸探针中，碱基突变可以是一个，也可以是一个以上，其是否能和靶序列很好杂交取决于突变的位置和碱基形式，优选的是一个碱基突变。
这里，碱基突变的方式包括碱基的替换、碱基的缺失或碱基的插入等。碱基突变的位置为所述寡核苷酸探针的近末端。寡核苷酸探针的近末端是指3’或5’末端；突变的位置优选是靠近3’或5’末端。寡核苷酸探针的长度为11-70个碱基，优选为15-25个碱基。
本发明中，可以用于进行碱基突变的碱基是A、T、C、G、U五种碱基中的一种或几种，或者是稀有碱基(次黄嘌呤、黄嘌呤、次黄苷)等，也可以是除1-(2′-Deoxy-beta-D-ribofuranosyl)-3-nitropyrrole以外的碱基类似物或衍生物中的一种或几种。
发明的发明人通过实验证实，本发明的序列特异的寡核苷酸探针对单核苷酸多态性(SNP)的检测特异性大大提高，可以应用于基因分型检测中，特别是用于HLA基因分型检测中。
本发明在与靶基因具有互补序列的探针的基础上，利用碱基替换、碱基缺失或碱基插入等碱基突变的方式对其进行改造，使得探针中产生一个或几个新的人工引入的碱基突变，这种探针只与靶基因能杂交结合，与其他基因因结合稳定性差而难于杂交，明显提高寡核苷酸探针杂交的特异性，使得通常杂交反应中遇到的假阳性和假阴性的问题基本得以解决。本分明的序列特异的寡核苷酸探针，合成原料来源充分，价格低廉，合成工艺成熟，杂交特异性高，具有广泛的应用价值。
附图说明
图1为探针上各个位点的标号定义；
图2为实施例1芯片点样模式图；
图3为实施例1探针与芯片杂交的理论模式图；
图4为实施例1普通探针与芯片的杂交结果图；
图5为实施例1突变探针与芯片的杂交结果图；
图6为实施例2芯片点样模式图；
图7为实施例2探针与芯片杂交的理论模式图；
图8为实施例2普通探针与芯片的杂交结果图；
图9为实施例2突变探针与芯片的杂交结果图。
具体实施方式
针对每个具体的SNP位点靶基因和与该位点相关的寡核苷酸探针上的碱基变化形式各有四种(A、T、C、G)，其中一种组合是匹配的情况，其他十二种形式均为错配(A/A，A/C，A/G；T/T，T/C，T/G；C/C，C/A，C/T；G/G，G/A，G/T)。探针上各个位点的标号如图1所示，0号为该靶基因的SNP位点，这些位点都可以作为碱基突变的位置，可以采用的突变形式有插入、删除、替换等。
实施例1、+5位插入碱基的探针检测三种HLA基因序列
实验方法：
按Tm值从高到低的形式选择三段长69bp的HLA基因序列
序列1：
5′-GGCATCAGGCCGCCCCAGCTCCGTCACCGCCCGGa/t/c/gACTCCCCCACGTCGCTGTCGAAGCGCACGGACTC-3’；
序列2：
5′-TAGGTGTCCACCGCGGCCCGCCTCTGCTCCAGGAa/t/c/gGTCCTTCTGGCTGTTCCAGTACTCGGCATCAGGC-3’：
序列3：
5′-AGTATCTGTCCAGGAACCGCACCCGCTCCGTCCCa/t/c/gTTGAAGAAATGACACTCCCTCTTAGGCTGCCACA-3’。
其中斜体小写碱基代表各个序列的SNP位点。
合成得到SNP碱基分别为A、T、C、G四种形式的序列(Oligo)，其中Tm值从高到底的顺序为：序列1＞序列2＞序列3。将这些长69mer的Oligo固定在芯片上制备成如图2所示的芯片点阵，图2中A1、T1、C1、G1分别代表序列1中SNP位点碱基分别为A、T、C、G的四条靶序列；A2、T2、C2、G2分别代表序列2中SNP位点碱基分别为A、T、C、G的四条靶序列；A3、T3、C3、G3分别代表序列3中SNP位点碱基分别为A、T、C、G的四条靶序列，这十二条序列代表纯合型的靶基因；A1C1代表由A1、C1两条靶序列两两组合构成的杂合型序列，其他如A1G1等的表示与此类似，代表杂合型的靶序列；其他，如Hex(QC)、PC、NC、BC分别代表芯片质控对照、阳性对照、阴性对照、空白对照等质控探针。
以一条普通探针(5′-TAMRA-TGGGGGAGTtCCGGGCGGT)和一条在+5位进行了碱基插入型的碱基突变探针(5′-TAMRA-TGGGGGAGTtCCGGcGCGGT)对上述芯片按常规方法进行杂交，探针与芯片的理论杂交结果如图3所示，由于所选取的探针序列的SNP位点的碱基为T，因此理论上只有含有A1的靶序列能够和探针杂交，其他均为SNP错配形示。普通探针与芯片的实际杂交结果如图4所示，碱基突变探针与芯片的实际杂交结果如图5所示。杂交结果显示，普通探针和10条靶序列都产生了较强的杂交，而碱基突变探针只与含有A1的靶序列产生了杂交，非常清晰的把含有单碱基变化的靶序列检测出来，进行碱基突变的寡核苷酸探针的杂交特异性得到了明显提高。
实施例2、碱基替换的探针用于HLA样品分型检测
已知HLA基因型的DNA样品购于国际组织相容性协作组(InternationalHistocompatibility Working Group，IHWG)，这些样品共52个，其信息见http：//www.ihwg.org/shared/cbankservices.htm#ssopref，将这些样品制备PCR产物后点在氨基修饰的玻片上制成HLA分型芯片，芯片的点样模式如图6所示，图中，1-52表示所用的样品，QC、PC、BC、NC分别表示芯片质控对照、阳性对照、阴性对照、空白对照等质控探针。
然后用荧光标记的普通探针(K83551：5’-TAMRA-GGAACACACGGAAAGTGAA-3’)和在-7位进行碱基替换的碱基突变探针(5’-TAMRA-GGcACACACGGAAAGTGAA-3’)按常规方法与上述芯片进行杂交，探针与芯片的理论杂交结果如图7所示，理论上只有52号样品能够和探针杂交，其他样品都和探针存在至少一个碱基的差异。普通探针与芯片的实际杂交结果如图8所示，碱基突变探针与芯片的实际杂交结果如图9所示。杂交结果显示，普通探针不能有效地将完全匹配序列和不匹配序列分开，而人工改造后的碱基突变探针可以非常好的把各种形式的不匹配序列和完全匹配序列区分开，从而达到HLA基因分型检测的目的。
Claims (9)
1、一种序列特异性寡核苷酸探针，含有与靶基因互补的序列，其特征在于：所述寡核苷酸探针上包括至少一个碱基突变。
2、根据权利要求1所述的寡核苷酸探针，其特征在于：所述寡核苷酸探针上包括一个碱基突变。
3、根据权利要求1所述的寡核苷酸探针，其特征在于：所述碱基突变的方式为碱基的替换、碱基的缺失或碱基的插入。
4、根据权利要求3所述的寡核苷酸探针，其特征在于：所述碱基突变的位置为所述寡核苷酸探针的近末端。
5、根据权利要求1-4任一所述的寡核苷酸探针，其特征在于：所述寡核苷酸探针的长度为11-70个碱基。
6、根据权利要求5所述的寡核苷酸探针，其特征在于：所述寡核苷酸探针的长度为15-25个碱基。
7、根据权利要求1-4任一所述的寡核苷酸探针，其特征在于：碱基突变的碱基是A、T、C、G、U五种碱基中的一种或几种，或者次黄嘌呤、黄嘌呤、次黄苷。
8、权利要求1-7任一所述的寡核苷酸探针在基因分型检测中应用。
9、根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述基因为HLA基因。
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2007
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