CN105420349A - 确定突变核酸碱基的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供确定突变核酸碱基的方法及试剂盒。本发明涉及核酸扩增技术领域，主要用途为提供一种更准确和灵敏的用于确定样本中靶核酸序列的鉴定区域是否存在突变核苷酸的方法及试剂盒。所述方法包括步骤a：提供第一引物和第二引物，其中第一引物可杂交于含有突变核苷酸的靶核酸序列的鉴定区域；提供包含可检测基团和拥有基于靶核酸序列的扩增区域的序列的标记的寡核苷酸探针；步骤b：通过PCR实施扩增反应；和步骤c：通过扩增曲线确定扩增产物，如果靶核酸序列含有突变核苷酸，第一引物与含有突变核苷酸的靶核酸序列杂交，产生扩增反应；如果靶核酸序列不含有突变核苷酸，第一引物与正常靶核酸序列杂交，不能产生扩增反应。

Description

确定突变核酸碱基的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及核酸扩增技术领域，尤其涉及了一种确定样本中靶核酸序列的鉴定区域是否存在突变核苷酸的方法及试剂盒。

背景技术

单核苷酸多态性(SNPs)是人类基因组中最常见的突变类型。点突变通常也是SNPs，但是这个术语通常指那些低频率发生或者是已知功能，可导致疾病的突变类型(GibsonNJ,2006,ClinChimActa.363(1-2):32-47)。虽然有多种方法，但是还没有一种被广泛接受的简便方法。许多确定基因组DNA低频突变的方法是利用聚合酶链反应(PCR)来扩增突变型和野生型靶序列，PCR产物可用多种方法进行分析，包括测序、寡核苷酸连接、限制性酶切、质谱或者等位基因特异的寡核苷酸杂交等方法均可实现从大量野生型背景基因中鉴定突变型。其它的方法利用等位基因特异性PCR选择性扩增低频率突变的靶核酸序列，利用或者是不利用附加选择。

这些确定稀有突变的PCR方法存在的共同问题是扩增反应时复制并不完全可靠，探针杂交时也会有错误配对情况出现。Newton(NucleicAcidsRes.17:2503-16,1989；U.S.Pat.No.5,595,890)等描述的常规突变检测方法显然都存在这些缺陷。所述的扩增阻碍突变系统(ARMS)利用等位基因特异性突变引物进行PCR反应。该方法利用引物的3'端与突变子的特异序列互补，由此引物得以延伸，而野生型序列因3'端不匹配而不能被延伸。这种方法要求每种突变都有相对应的特异性引物，同时PCR反应需要非常严格的反应条件。扩增中的错配常导致复制不精确或复制错误。

最近，利用PNA(或LNA)钳技术的PCR富集和测定方法已经发展起来了(B.Tabacketal.,2004；A.Senescauetal.,2005；XDavidRenetal.,2009；ToddS.Laughlinetal.,2008；K.Udagawaetal.,2005；HitoshiMiyazawa,etal.,2008)。高亲和力的核酸类似物如肽核酸(PNAs)被用于抑制核酸扩增(U.S.Pat.No.5,891,625和D.B.Demersetal.,1995,H.Orumetal.,1993)。PNA(LNA)-DNA双链体比DNA-DNA双链体更加稳定。因此，PNA(或LNA)能够特异地阻止在一个完全匹配的模板上的引物退火或延伸过程。

美国专利号7,803,543公开了一种检测核酸样本中是否存在靶序列上核苷酸变异的方法，检测步骤包括引物对的应用，PCR扩增这对引物形成的产物包含该靶序列，而肽核酸(PNA)就像一个PCR钳，起到感应探针的作用。该方法使用的第一个引物距离靶序列的5'端至少有30个或更多的核苷酸。PCR过程要求延伸反应的温度低于完全匹配的探针的熔解温度。这个方法也有很多缺点，标记的PNA探针合成比较困难，价格比较昂贵。这个方法要求有个高Tm值的锚定探针，使得反应和设计变得复杂。如果样本只含有正常的靶核酸，PNA能够使反应停止，因此必须设立单独的质控品来测试反应体系是否有效。这种方法重复性和灵敏性低。

美国专利申请公开号2004/0014105A1公开了在一个样本中选择性的富集低丰度多聚核苷酸的方法。这种方法利用酶催化的不能延伸的寡聚核苷酸选择性的阻滞高丰度核酸的聚合酶活性，因此导致低丰度核酸的富集。

美国专利申请公开号2004/0091905A1公开了一种在突变多聚核苷酸、野生型多聚核苷酸和不相关多聚核苷酸的混合物中检测突变多聚核苷酸的方法。这种方法利用一种延伸引物，它在野生型和突变型多聚核苷酸中都能与第一靶序列互补。还利用一条探针，这条探针只能与野生型多聚核苷酸的第二靶序列互补，不能与突变型互补。引物与第一靶序列的退火延伸使突变型多聚核苷酸产生长的产物。在野生型多聚核苷酸中引物与第一靶序列退火后的延伸被探针与第二靶序列的退火所抑制，因而只产生短的延伸产物或者是没有产物。分离产物后再做PCR，PCR优先的扩增长的产物。

Lay等(Lay,M.J.&Wittwer,CT.(1997),Clin.Chem.,43:2262-2267)报道了利用荧光探针和熔解曲线进行基因分型的方法。杂交探针连同熔解曲线分析被广泛用于突变或SNPs的检测。通常需要一对寡核苷酸探针，称为锚定探针和感应探针(P.S.Bernardetal.(1998),Am.J.Pathol.,153:1055-1061)，锚定探针和感应探针被标记以不同的荧光染料，这样当它们与互补PCR链的邻近位点发生退火时，荧光能量转移发生在这两者之间。最近的研究在PCR时用一个PNA钳和一对杂交探针，证明稀有突变的同源检测可在一个闭合管中实现(C.Y.Chenetal.2004；J.Dabritzetal.2005；K.A.Kreuzeretal.2003；Y.Nagaietal.2005)。然而，在这些研究中，PNA与锚定探针相互竞争地同靶核苷酸结合，因此通过熔解曲线方法检测是非常低效的。另外，如果在一个区域存在多个变异核苷酸需要检测，就不得不设计多个感应探针。

发明内容

本发明的目的是提供一种更准确和灵敏的用于确定样本中靶核酸序列鉴定区域是否存在突变核苷酸的方法及试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：

本发明提供一种确定样本中靶核酸序列鉴定区域是否存在突变核苷酸的方法，所述的方法包括如下步骤：

步骤a：提供能够扩增产物的一对引物：第一引物和第二引物，扩增靶核酸序列包括鉴定区域的一段核酸序列得到扩增产物，其中第一引物可杂交于靶核酸序列的鉴定区域，此鉴定区域含有突变核苷酸，第一引物序列和其相对应的靶核酸序列分为至少三个部分：5'端互补部分，不互补部分，3'端互补部分，其中3'端互补部分含有至少两个核苷酸，并且与包括突变核苷酸的鉴定区域互补；

提供标记的寡核苷酸探针，此标记的寡核苷酸探针包含一个可检测的基团和拥有一段基于靶核酸序列的扩增区域的序列；

步骤b：利用核酸聚合酶对反应混合液通过PCR实施扩增反应，此扩增反应的反应混合液包含核酸聚合酶、标记的寡核苷酸探针和一对引物；

步骤c：通过扩增曲线确定扩增产物，如果靶核酸序列含有突变核苷酸，第一引物与含有突变核苷酸的靶核酸序列的鉴定区域杂交，由于3'端互补部分完全互补，使得第一引物延伸，产生扩增反应；如果靶核酸序列不含有突变核苷酸，第一引物与正常靶核酸序列杂交，由于3'端互补部分不完全互补，使得第一引物不能延伸，不能产生扩增反应。

作为优选，第一引物的3'端互补部分的3'末端核苷酸与靶核酸序列的突变核苷酸互补。

作为优选，第一引物的3'端互补部分的3'末端第二个核苷酸与靶核酸序列的突变核苷酸互补。

作为优选，第一引物的3'端互补部分含有两个核苷酸，并且与包括突变核苷酸的靶核酸序列的鉴定区域互补。

作为优选，第一引物的3'端互补部分含有三个核苷酸，并且与包括突变核苷酸的靶核酸序列的鉴定区域互补。

作为优选，不互补部分在第一引物上的核苷酸数目多于不互补部分在靶核酸序列上的核苷酸数目，从而不互补部分在第一引物上形成一个凸起。

作为优选，不互补部分在第一引物上的核苷酸数目是1或2或3，不互补部分在靶核酸序列上的核苷酸数目是0。

作为优选，不互补部分在第一引物上的核苷酸数目是2或3或4，不互补部分在靶核酸序列上的核苷酸数目是1。

作为优选，不互补部分在第一引物上的核苷酸数目少于不互补部分在靶核酸序列上的核苷酸数目，从而不互补部分在靶核酸序列上形成一个凸起。

作为优选，不互补部分在第一引物上的核苷酸数目是0，不互补部分在靶核酸序列上的核苷酸数目是1或2或3。

作为优选，不互补部分在第一引物上的核苷酸数目是1，不互补部分在靶核酸序列上的核苷酸数目是2或3或4。

作为优选，不互补部分在第一引物上的核苷酸数目与不互补部分在靶核酸序列上的核苷酸数目相当，不互补部分在第一引物上的核苷酸数目是2或3或4，不互补部分在靶核酸序列上的核苷酸数目是2或3或4。

作为优选，所述标记的寡核苷酸探针包含一个报告标记和一个淬灭标记，其中淬灭标记在当上述标记的寡核苷酸探针是单链结构且没有与上述靶核酸序列杂交时，能够淬灭报告标记的荧光；其中上述标记的寡核酸探针与靶核酸序列杂交形成双链结构后，报告标记的荧光不能被淬灭，此时报告标记的荧光强度比当上述标记的寡核苷酸探针是单链结构且没有与上述靶核酸序列杂交时的荧光强度更强。

所述的确定样本中靶核酸序列鉴定区域是否存在突变核苷酸的方法，其中步骤a还提供阻遏寡核苷酸，此阻遏寡核苷酸包含拥有一段基于正常靶核酸序列的鉴定区域的序列，此阻遏寡核苷酸上的相应序列与靶核酸序列上的正常序列一致，使得阻遏寡核苷酸与上述的相关靶核酸序列的鉴定区域杂交形成一个双链体，阻遏寡核苷酸与靶核酸序列的杂交区域，和第一引物与靶核酸序列的杂交区域部分重叠，阻遏寡核苷酸含有3'末端标记，使得阻遏寡核苷酸不能延伸。

本发明还提供一种确定样本中靶核酸序列鉴定区域是否存在突变核苷酸的试剂盒，包括：

提供能够扩增产物的一对引物：第一引物和第二引物，扩增靶核酸序列包括鉴定区域的一段核酸序列得到扩增产物，其中第一引物可杂交于靶核酸序列的鉴定区域，此鉴定区域含有突变核苷酸，第一引物序列和其相对应靶核酸序列分为至少三个部分：5'端互补部分，不互补部分，3'端互补部分，其中3'端互补部分含有至少两个核苷酸，并且与包括突变核苷酸的鉴定区域互补；

提供标记的寡核苷酸探针，此标记的寡核苷酸探针包含一个可检测的基团和拥有一段基于靶核酸序列的扩增区域的序列；

核酸聚合酶；

如果靶核酸序列含有突变核苷酸，第一引物与含有突变核苷酸的靶核酸序列杂交，由于3'端互补部分完全互补，使得第一引物延伸，产生扩增反应；如果靶核酸序列不含有突变核苷酸，第一引物与正常靶核酸序列杂交，由于3'端互补部分不完全互补，使得第一引物不能延伸，不能产生扩增反应；

可选的，还提供阻遏寡核苷酸，此阻遏寡核苷酸包含拥有一段基于正常靶核酸序列的鉴定区域的序列，此阻遏寡核苷酸上的相应序列与靶核酸序列上的正常序列一致，使得阻遏寡核苷酸与上述的相关靶核酸序列的鉴定区域杂交形成一个双链体，阻遏寡核苷酸与靶核酸序列的杂交区域，和第一引物与靶核酸序列的杂交区域部分重叠，阻遏寡核苷酸含有3'末端标记，使得阻遏寡核苷酸不能延伸。

第一引物的3'端互补部分的3'末端核苷酸与靶核酸序列的突变核苷酸互补，当第一引物与突变靶核酸序列杂交，由于完全互补，核酸聚合酶能延伸第一引物。当第一引物与正常靶核酸序列杂交时，由于3'末端不匹配，核酸聚合酶不能能延伸第一引物。

也可以3'端互补部分的3'末端第二个核苷酸与靶核酸序列的突变核苷酸互补。当第一引物与突变靶核酸序列杂交，由于完全互补，核酸聚合酶能延伸第一引物。当第一引物与正常靶核酸序列杂交时，由于3'末端第二个核苷酸不匹配，核酸聚合酶也不能能延伸第一引物。

第一引物的3'端互补部分可含有两个核苷酸，也可含有三个核苷酸，也可含有四个核苷酸，并且与包括突变核苷酸的靶核酸序列的鉴定区域互补。

不互补部分指的是当第一引物与靶核酸序列杂交时，除了5'端和3'端互补部分，它们之间还有一个不互补部分。形成不互补部分可以是因为第一引物与靶核酸序列上的核苷酸碱基不匹配造成的，也可以是因为第一引物与靶核酸序列上的核苷酸的数目不相等造成的。当在第一引物上的核苷酸数目多于不互补部分在靶核酸序列上的核苷酸数目，不互补部分在第一引物上形成一个凸起。

不互补部分在第一引物上的核苷酸数目可以是1或2或3，不互补部分在靶核酸序列上的核苷酸数目是0。这样靶核酸序列上的互补部分是连续的，也就是靶核酸序列上的相应核苷酸都有与第一引物匹配的核苷酸。

另外不互补部分在第一引物上的核苷酸数目可以是2或3或4，不互补部分在靶核酸序列上的核苷酸数目可以是1。

不互补部分在第一引物上的核苷酸数目可以少于不互补部分在靶核酸序列上的核苷酸数目，从而不互补部分在靶核酸序列上形成一个凸起。

作为优选，不互补部分在第一引物上的核苷酸数目可以是0，不互补部分在靶核酸序列上的核苷酸数目可以是1或2或3。这样第一引物上的互补部分是连续的，也就是第一引物上的相应核苷酸都有与靶核酸序列匹配的核苷酸。

另外不互补部分在第一引物上的核苷酸数目可以是1，不互补部分在靶核酸序列上的核苷酸数目可以是2或3或4。

不互补部分在第一引物上的核苷酸数目也可与不互补部分在靶核酸序列上的核苷酸数目相当，不互补部分在第一引物上的核苷酸数目可以是2或3或4，不互补部分在靶核酸序列上的核苷酸数目可以是2或3或4。

作为优选，所述标记的寡核苷酸探针包含一个报告标记和一个淬灭标记，其中淬灭标记在当上述标记的寡核苷酸探针是单链结构且没有与上述靶核酸序列杂交时，能够淬灭报告标记的荧光；其中上述标记的寡核酸探针与靶核酸序列杂交形成双链结构后，报告标记的荧光不能被淬灭，此时报告标记的荧光强度比当上述标记的寡核苷酸探针是单链结构且没有与上述靶核酸序列杂交时的荧光强度更强。

第一引物的5'端互补部分是主要杂交部分，它的长度与一般引物的长度类似，可以是9个核苷酸到30个核苷酸。

可选的，PCR反应可以含有阻遏寡核苷酸。

第一引物和阻遏寡核苷酸竞争性的结合到靶核酸序列的同一个区域，当突变核苷酸存在的时候，探针会结合的不牢固，因此第一引物有更高的机会结合和延伸，导致含有突变核苷酸的靶核酸序列的有效扩增。

作为优选，所述的阻遏寡核苷酸可以被分成两部分，第一部分包含与鉴定区域的5'端序列一致的序列，第二部分包含与鉴定区域的3'端序列基本一致的序列，其中阻遏寡核苷酸的第一部分和第二部分可以是连续的，鉴定区域的5'端部分和3'端部分可以是不连续的。

靶核酸序列可能包含突变核苷酸的核酸片段或基因，也可能包含疾病相关SNP或基因、耐药基因和毒力基因。疾病相关基因可能包括但不限于癌症相关基因及与遗传相关的基因。与癌症相关的基因包含但不局限于K-ras、H-ras、N-ras、p53(TP53)、CDKN2A(p16)、PIC3K、PTEN、RB1、表皮生长因子受体基因、BRAF、BRCA1、BRCA2、STK11和VHL、Kit、Jak2。

根据本项发明，靶核酸序列的鉴定区域的突变核苷酸包含一个或多个核苷酸置换、缺失、插入和/或非正常的甲基化。

一般来说，阻遏寡核苷酸或探针的3'末端会被“封闭”以阻止探针和引物结合产生延伸产物，“封闭”可以采用不配对碱基或加入化学部分例如染料、淬灭剂、生物素或磷酸基团到最后一个核苷酸的3'羟基来实现，这些掺入部分可充当检测的标记。封闭也可以通过移除3'-OH或利用缺少3'-OH的核苷酸例如双脱氧核苷酸来实现。

探针的标记物可以是荧光基团。该探针可以包含相互作用的标记对，例如荧光基团和/或非荧光染料。这种相互作用的标记对的一个实例就是荧光——淬灭基团对。标记可以在探针的任何位置上，只要它与其它的标记或别的实体如寡核苷酸上的G核苷酸相互作用。标记最好是连接在探针的两端，例如，荧光基团连接在探针的5'末端而淬灭基团连接到探针的3'末端。

标记的阻遏寡核苷酸或探针可以包含一个报告基团和一个淬灭基团，当上述的阻遏寡聚核苷酸或探针为单链构象时，也就是说还未跟上述的靶核酸序列杂交时，其中的淬灭基团可以淬灭上述的报告基团的荧光；所述的阻遏寡核苷酸或探针在与靶核酸序列杂交时能够形成双链结构，这时报告基团的荧光不能被淬灭，使得报告基团的荧光强度较单链探针时大大增强。

淬灭标记最好是非荧光染料标记，它连接在阻遏寡聚核苷酸或探针的3'末端或5'末端，或者是连接在阻遏寡聚核酸或探针的内部残基。报告基团可以是荧光染料标记，连接到阻遏寡聚核苷酸或探针的内部残基，或者是连接到阻遏寡聚核苷酸或探针的5'末端或者是3'末端。优选是探针的5'末端标记荧光基团3'末端标记淬灭基团。也可以是探针的中间核苷酸标记荧光基团而3'末端标记淬灭基团。报告标记优选是荧光基团，包括荧光素、荧光素衍生物、花青染料、荧光素—花青结合物及类似的物质。

鉴定区域被分成两部分：5'部分和3'部分，阻遏寡核酸也可以被分成两部分，第一部分包含与鉴定区域的5'端序列基本一致的序列，第二部分包含与鉴定区域3'端基本一致的序列，其中，阻遏寡核苷酸的第一部分和第二部分是连续的，而鉴定区域的5'部分和3'部分可以是连续的也可以是不连续的。在一个实例中，阻遏寡核苷酸的一个序列与靶核酸序列的鉴定区域一致。在一个优化的实例中，阻遏寡核苷酸包含一个与靶核酸序列的鉴定区域不一致的序列。在阻遏寡核苷酸和靶核酸序列的鉴定区域形成的双链体上，靶核苷酸序列的一条链上可以存在1—6个核苷酸的膨出。寡核苷酸探针和靶核酸序列的鉴定区域的双链体上存在的一个膨出或错配有利于降低探针的Tm值。

既然第一引物和阻遏寡核酸含有共同的序列，它们与靶核酸序列的同一区域竞争性的结合。当突变核苷酸存在的时候，探针会结合的不牢固，因此第一引物有更高的机会结合和延伸，导致含有突变核苷酸的靶核酸序列的有效扩增。

所述“多聚核苷酸”和“寡聚核苷酸”是核酸的类型，一般是指引物、探针、被检的寡聚物片段、寡聚物质控和未标记的阻滞物和多聚脱氧核糖核苷酸(包含2-脱氧-D-核糖)、多聚核糖核苷酸(包含D-核糖)和其他任何类型的多聚核苷酸，它的N-糖苷为嘌呤或嘧啶碱基，或者是修饰过的嘌呤或嘧啶碱基。术语“核酸”、“多聚核苷酸”和“寡聚核苷酸”在长度上不加区分，而且这些词可以互换使用。“核酸”、“DNA”及其它的类似术语也包括核酸类似物。寡聚核苷酸并不一定是天然序列或其衍生物，而可能以各种方式产生，包含化学合成、DNA复制、反转录或者是各种组合的方式。

术语“靶序列”、“靶核酸”及“靶核酸序列”可以互换使用，都是指需要被扩增和/或检测的片段，或者是与一个互补的寡聚核苷酸或多聚核苷酸杂交的核酸，例如，一个阻滞的寡聚物或引物延伸的目标片断。靶序列可以是单链或双链的DNA、RNA、结构类似物或杂合体。靶序列可以是单链也可为双链。在引物延伸阶段，靶序列与引物杂交形成双链体，这时的靶序列也称为“模板”。模板在合成互补多聚核苷酸时起样板作用。本发明中涉及的靶序列可以来源于活体或者是死的组织，包含但不限于原核生物、真核生物、植物、动物和病毒，以及合成和/或重组的靶序列。

所述“核酸序列的互补序列”是指一段寡聚核苷酸，当与核酸序列比对时，一条序列的5'端与另一条序列的3'端配对，即“反向平行联合”。互补配对不需要完美配对，稳定的双链体也可以包含错配或者是不配对的碱基。

所述“互补”是指两条核酸序列通过氢键发生序列特异性的结合，它们的嘌呤和/或嘧啶碱基依据沃森-克里克法则形成双链核酸复合体。也可以解释为核酸序列及修饰的核酸序列或脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的类似物与另一段序列依据沃森-克里克法则形成核酸双链体的能力。

所述“鉴定区域”，都是指靶序列的一个特异区域，在这个区域可能有碱基突变。

所述“杂交”和“退火”也可以互换使用，是指两个核酸互补配对结合到一起形成双链体的过程。

所述“双链体”和“双链”可以互换使用，是指两个有互补序列的核酸杂交形成的结构。双链体可以由两个互补DNA序列、两个RNA序列或者是DNA序列和RNA序列之间形成，后者形成的是杂合双链体。双链体的一条链或者是两条链都可以含有修饰过的核苷酸和/或核酸类似物。所述双链体也可以是样本序列同一个或多个探针杂交而形成。

所述“野生型序列”、“野生型核酸”、“正常核酸”、“野生型DNA”和“野生型模板”可以互换使用，都是指含有正常的，未发生改变的核苷酸序列。

所述“突变多聚核苷酸”、“突变核酸”、“变异核酸”和“含有变异核苷酸的核酸”是指同野生型核酸相比有核苷酸差异的核酸序列。突变序列与野生型序列之间的差异核苷酸称为核苷酸“突变”、“变异核苷酸”或“变异”。所述“变异核苷酸”是指一个或多个碱基置换、缺失、插入、甲基化和/或修饰变化。

所述“扩增”是指在一个混合的核酸样本中使特异核酸序列的浓度显著提高的过程。

所述“标记”是指对用来提供检测(可定量的)信号的与核酸或蛋白相连的任何原子或分子。标记可以为荧光、放射性、比色、重量分析法、磁性、酶活性等方法提供可检测的信号。

所述“探针”是指一个能与靶序列互补配对形成双链体的寡聚核苷酸，但是无法像引物一样延伸形成产物。

附图说明

图1是本发明具体应用的原理示意图。

图2是根据实施例的扩增曲线。

具体实施方式

下面结合附图1与具体实施例对本发明作进一步详细描述：

图1示出反应主要包括：第一引物、第二引物和阻遏寡核苷酸和标记的寡核苷酸探针。在退火时，阻遏寡核苷酸和第一引物竞争模板上的相同结合位点，实现对突变序列的富集扩增。第一引物序列和其相对应靶核酸序列分为至少三个部分：5'端互补部分，不互补部分，3'端互补部分，其中3'端互补部分含有至少两个核苷酸，并且与包括突变核苷酸的鉴定区域互补。

实施例

引物和探针的设计与合成

近年来发现，Braf基因突变发生于甲状腺癌、恶性黑色素瘤、结直肠癌等多种肿瘤中，其中90％以上的突变为T1799A(V600E)。Braf基因V600E突变在乳头状甲状腺癌中突变率达45％，被作为甲状腺癌的预后分子标记。同时，Braf基因突变在结直肠癌中与EGFR抑制剂类靶向药物的耐药性有关，导致部分Kras野生型患者不能从爱必妥(etuximab)和维克替比(Vectibix)治疗中受益。

本例中以BRAFV600E点突变为例，根据其基因序列设计引物和探针，并确保产生的靶核酸序列扩增产物中含有待检测的突变位点。正向引物的3'末端核苷酸或3'端第二个核苷酸(倒数第二个)与突变点核苷酸互补，其序列可以是序列表中的SEQIDNO.1-NO.11；反向引物序列可以是序列表中的SEQIDNO.12；双标记探针可为序列表中的SEQIDNO.13；阻遏寡核苷酸5'端与正向引物的一部分序列重叠，3'端包含突变点，其序列为序列表中的SEQIDNO.14。

引物和探针均委托专业公司进行合成，其中引物为PAGE纯化，探针为HPLC纯化。探针在5'末端标记FAM荧光报告基团，3'端标记BHQ1淬灭基团。

表1BRAF基因V600E突变鉴定引物和探针寡核苷酸序列表

序列编号	序列名称	寡核苷酸序列(5'-3')
			SEQ ID NO.1	正向引物1	GTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTA-AGA
SEQ ID NO.2	正向引物2	GTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTAC-GA
			SEQ ID NO.3	正向引物3	GTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTgAGA
SEQ ID NO.4	正向引物4	GTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCagAGA
			SEQ ID NO.5	正向引物5	GTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGtagAGA
SEQ ID NO.6	正向引物6	GTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTtgAGA
			SEQ ID NO.7	正向引物7	GTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCatgAGA
SEQ ID NO.8	正向引物8	GTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGtatgAGA
			SEQ ID NO.9	正向引物9	GTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTAtgGAG
SEQ ID NO.10	正向引物10	GTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTttgGAG
			SEQ ID NO.11	正向引物11	GTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCattgGAG
SEQ ID NO.12	反向引物1	CACAAAATGGATCCAGACAACTGT
			SEQ ID NO.13	双标记探针	Fam AGTGGGTCCCATCAGTTTGA BHQ1
SEQ ID NO.14	阻遏寡核苷酸	TAGCTACAGTGAAATCTCGA-phos

这里正向引物是第一引物，“-”和小写字母是不互补部分，不互补部分的左边是5'端互补部分，右边是3'端互补部分。

DNA模板准备

首先通过分子克隆的方法制备包含BRAF基因序列的质粒，命名为突变质粒。将突变质粒DNA和野生型基因组DNA浓度调整为3000copies/μl，按下述方法配制模拟DNA模板。

10％取10μl3000copies/μl的突变质粒混入90μl同浓度的野生型基因组DNA，振荡混匀；

1％取10μl10％液混入90μl3000copies/μl的野生型基因组DNA，振荡混匀；

0.1％取5μl1％液混入45μl3000copies/μl的野生型基因组DNA，振荡混匀；

野生型对照即为3000copies/μl的野生型基因组DNA。

PCR反应组成

按下表(表2)配制PCR反应液并加入模拟DNA模板(每次实验必须包括野生型对照和空白对照)。配制完成后旋涡振荡混匀，离心后上机。

表2PCR体系各成分组成

反应程序设定

设置收集FAM荧光信号的检测通道，将PCR反应管放入荧光定量PCR仪开始扩增，反应程序如下：

表3PCR程序设定

结果判定

当荧光定量PCR仪运行结束后，用其配套软件对本次试验的结果进行扩增曲线分析。野生型对照模板没有扩增；1％和0.1％模拟模板有扩增(图2)。

总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。

Claims (16)

1.一种确定样本中靶核酸序列的鉴定区域是否存在突变核苷酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤a：提供能够扩增产物的一对引物：第一引物和第二引物，扩增所述靶核酸序列包括所述鉴定区域的一段核酸序列得到扩增产物，其中所述第一引物可杂交于所述靶核酸序列的所述鉴定区域，所述鉴定区域含有突变核苷酸，所述第一引物序列和相对应的所述靶核酸序列分为至少三个部分：5'端互补部分，不互补部分，3'端互补部分，其中所述3'端互补部分含有至少两个核苷酸，并且与所述包括突变核苷酸的鉴定区域互补；

提供标记的寡核苷酸探针，所述标记的寡核苷酸探针包含一个可检测的基团和拥有一段基于所述靶核酸序列的扩增区域的序列；

步骤b：利用核酸聚合酶对反应混合液通过PCR实施扩增反应，所述扩增反应的反应混合液包含所述核酸聚合酶、所述标记的寡核苷酸探针和所述一对引物；

步骤c：通过扩增曲线确定扩增产物，如果所述靶核酸序列含有突变核苷酸，所述第一引物与所述含有突变核苷酸的靶核酸序列的所述鉴定区域杂交，由于所述3'端互补部分完全互补，使得所述第一引物延伸，产生扩增反应；如果所述靶核酸序列不含有突变核苷酸，所述第一引物与正常靶核酸序列杂交，由于所述3'端互补部分不完全互补，使得所述第一引物不能延伸，不能产生扩增反应。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第一引物的所述3'端互补部分的3'末端核苷酸与所述靶核酸序列的所述突变核苷酸互补。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第一引物的所述3'端互补部分的3'末端第二个核苷酸与所述靶核酸序列的所述突变核苷酸互补。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第一引物的所述3'端互补部分含有两个核苷酸，并且与所述包括突变核苷酸的靶核酸序列的所述鉴定区域互补。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第一引物的所述3'端互补部分含有三个核苷酸，并且与所述包括突变核苷酸的靶核酸序列的所述鉴定区域互补。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述不互补部分在所述第一引物上的核苷酸数目多于所述不互补部分在所述靶核酸序列上的核苷酸数目，从而所述不互补部分在所述第一引物上形成一个凸起。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述不互补部分在所述第一引物上的核苷酸数目是1或2或3，所述不互补部分在所述靶核酸序列上的核苷酸数目是0。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述不互补部分在所述第一引物上的核苷酸数目是2或3或4，所述不互补部分在所述靶核酸序列上的核苷酸数目是1。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述不互补部分在所述第一引物上的核苷酸数目少于所述不互补部分在所述靶核酸序列上的核苷酸数目，从而所述不互补部分在所述靶核酸序列上形成一个凸起。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述不互补部分在所述第一引物上的核苷酸数目是0，所述不互补部分在所述靶核酸序列上的核苷酸数目是1或2或3。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述不互补部分在所述第一引物上的核苷酸数目是1，所述不互补部分在所述靶核酸序列上的核苷酸数目是2或3或4。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述不互补部分在所述第一引物上的核苷酸数目与所述不互补部分在所述靶核酸序列上的核苷酸数目相当，所述不互补部分在所述第一引物上的核苷酸数目是2或3或4，所述不互补部分在所述靶核酸序列上的核苷酸数目是2或3或4。

13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述标记的寡核苷酸探针包含一个报告标记和一个淬灭标记，其中所述淬灭标记在当所述标记的寡核苷酸探针是单链结构且没有与所述靶核酸序列杂交时，能够淬灭所述报告标记的荧光；其中所述标记的寡核酸探针与所述靶核酸序列杂交形成双链结构后，所述报告标记的荧光不能被淬灭，此时所述报告标记的荧光强度比当所述标记的寡核苷酸探针是单链结构且没有与所述靶核酸序列杂交时的荧光强度更强。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤a还提供阻遏寡核苷酸，所述阻遏寡核苷酸包含拥有一段基于正常靶核酸序列的鉴定区域的序列，所述阻遏寡核苷酸上的相应序列与所述靶核酸序列上的正常序列一致，使得所述阻遏寡核苷酸与上述的相关靶核酸序列的鉴定区域杂交形成一个双链体，所述阻遏寡核苷酸与所述靶核酸序列的杂交区域，和所述第一引物与所述靶核酸序列的杂交区域部分重叠，所述阻遏寡核苷酸含有3'末端标记，使得所述阻遏寡核苷酸不能延伸。

15.一种确定样本中靶核酸序列的鉴定区域是否存在突变核苷酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

提供能够扩增产物的一对引物：第一引物和第二引物，扩增所述靶核酸序列包括所述鉴定区域的一段核酸序列得到扩增产物，其中所述第一引物可杂交于所述靶核酸序列的所述鉴定区域，所述鉴定区域含有突变核苷酸，所述第一引物序列和相对应的所述靶核酸序列分为至少三个部分：5'端互补部分，不互补部分，3'端互补部分，其中所述3'端互补部分含有至少两个核苷酸，并且与所述包括突变核苷酸的鉴定区域互补；

提供标记的寡核苷酸探针，所述标记的寡核苷酸探针包含一个可检测的基团和拥有一段基于所述靶核酸序列的扩增区域的序列；

核酸聚合酶；

如果所述靶核酸序列含有突变核苷酸，所述第一引物与所述含有突变核苷酸的靶核酸序列杂交，由于所述3'端互补部分完全互补，使得所述第一引物延伸，产生扩增反应；如果所述靶核酸序列不含有突变核苷酸，所述第一引物与正常靶核酸序列杂交，由于所述3'端互补部分不完全互补，使得所述第一引物不能延伸，不能产生扩增反应。

16.根据权利要求15所述的试剂盒，其中所述试剂盒还提供阻遏寡核苷酸，所述阻遏寡核苷酸包含拥有一段基于正常靶核酸序列的鉴定区域的序列，所述阻遏寡核苷酸上的相应序列与所述靶核酸序列上的正常序列一致，使得所述阻遏寡核苷酸与上述的相关靶核酸序列的鉴定区域杂交形成一个双链体，所述阻遏寡核苷酸与所述靶核酸序列的杂交区域，和所述第一引物与所述靶核酸序列的杂交区域部分重叠，所述阻遏寡核苷酸含有3'末端标记，使得所述阻遏寡核苷酸不能延伸。