CN105567837B - 检测K-ras基因突变的引物和探针体系、方法及试剂盒 - Google Patents

检测K-ras基因突变的引物和探针体系、方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测K‑ras基因突变的引物和探针体系，包括SEQ ID NO：1～13所示的核苷酸序列；还公开了其检测方法，包括配置50μL荧光PCR反应体系、进行荧光PCR扩增程序、结果判定等步骤。本发明可同时检测KRAS基因7种突变；最多可以检测1～10拷贝的基因突变；特异性强，在10～30ng野生型DNA背景下不受干扰；检测性能突出，在10ng DNA背景下，可以检测出1～10拷贝的基因突变。

Description

检测K-ras基因突变的引物和探针体系、方法及试剂盒
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种检测K-ras基因突变的引物和探针体系、方法及试剂盒。
背景技术
K-ras基因是EGFR信号通路中的重要分子之一，是首个影响结直肠癌临床治疗决策的生物标记物，其所编码的K-ras蛋白为EGFR信号通路下游区的一种分子G蛋白，当K-ras基因发生突变后，会导致该信号通路异常活化，从而对EGFR单抗治疗无效。因此，K-ras基因状态与针对EGFR的靶向药物（例如西妥昔单抗和帕尼单抗等）的疗效有关，《09年NCCN非小细胞肺癌临床实践指南》明确指出：如果K-ras基因发生了突变，则不建议病人使用特罗凯(Tarceva/厄洛替尼/Erlotinib)进行分子靶向治疗。
许多肿瘤中K-ras基因的突变率较高，在白血病、肺癌、直肠癌、胰腺癌等癌症中，K-ras突变很常见，尤其是在结直肠癌和非小细胞肺癌中，突变率甚至可达30～60%和21～28%。同时在上述两种肿瘤中约80～90%的K-ras基因突变发生在突变热点2号外显子12、13密码子上，其中的7个突变热点：G12C、G12R、G12S、G12V、G12D、G12A、G13V/D占到了全部突变的90%以上。
因此，检测K-ras基因上述7个突变热点，可准确判断患者对该类治疗的预测疗效，以供临床医师参考，也能尽最大的努力筛选出有效人群，避免错过治疗。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种检测人K-ras基因突变的引物和探针体系，可同时检测KRAS基因7种突变，最多可以检测1～10拷贝的基因突变，特异性强，在10～30ng 野生型DNA背景下不受干扰，检测性能突出，在10ng DNA背景下，可以检测出1～10拷贝的基因突变。
为解决以上技术问题，本发明通过以下技术方案实现：
设计一种检测K-ras基因突变的引物和探针体系，包括SEQ ID NO：1～13所示的核苷酸序列，所述引物或探针具有以下特点：
（1）本发明引进LNA修饰的野生探针封闭野生模板，探针3’-末端用PO4修饰或NH2修饰封闭阻止Taq DNA聚合酶的延伸；
（2）本发明特异性引物3’-末端碱基采用LNA修饰；
（3）本发明特异性引物3’-末端起第二个碱基引入脱氧次黄嘌呤核苷修饰。
设计一种检测K-ras基因突变的方法，包括以下步骤：
（1）合成所述引物和探针；
（2）配置50μL荧光PCR反应体系：Buffer（10×）5μL，Mg2+ 1.0～5mmol/L，dNTP 100～1000nmol/L，上述每个引物100～500nmol/L，上述每个探针100～1000nmol/L，Taq DNA聚合酶1U～3U，DNA模板5～10ng；
（3）进行荧光PCR扩增程序：酶激活，95℃ 10min；突变富集，95℃ 30s，68℃ 30，64℃ 50s，72℃ 25s，16个循环；扩增检测，30个循环，95℃ 30s，58℃ 32s，72℃ 18s，于“58℃32s”该步骤收集荧光信号FAM和HEX；
（4）结果判定：检测体系中，HEX通道15<Ct<22，表明上样在可控范围内，结果有效；以FAM信号通道为阳性判断标准，曲线呈“S”曲线，且Ct<29 为阳性，Ct为0则为阴性。
所述DNA模板包括FFPE组织及外周血游离DNA。
利用上述引物和/或探针中的至少一种，可制成用于检测K-ras基因突变的试剂盒。
本发明具有以下积极有益技术效果：
（1）本发明改良现有扩增受阻检测体系，摈弃ARMS引物设计中引入错配的原则，将特异性检测突变引物3’-末端起第2碱基采用脱氧次黄嘌呤核苷代替。脱氧次黄嘌呤核苷（dI）是天然存在的碱基，与A、G、C、T结合力弱，当与其它碱基结合时，会比其它碱基错配相对更稳定。脱氧次黄嘌呤与其它碱基的结合能力为：dI：dC> dI：dA> dI：dG> dI：dT，在DNA聚合酶的催化下，脱氧次黄嘌呤优先与dC结合。
（2）本发明在特异性检测突变引物的3’-末端碱基采用LNA修饰，提高了检测的特异性和敏感性。
（3）本发明引入了LNA修饰的封闭野生型的LNA探针，使得可以在高背景下检测低拷贝。
因此，本发明可同时检测KRAS基因7种突变；最多可以检测1～10拷贝的基因突变；特异性强，在10～30ng 野生型DNA背景下不受干扰；检测性能突出，在10ng DNA背景下，可以检测出1～10拷贝的基因突变。
附图说明
图1 为本发明阳性结果判定标准对照示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。以下实施例中所涉及的原料，如无特别说明均为市售，所涉及检测方法如无特别说明，则均为常规方法。
实施例1
一种检测KRAS基因 7种突变的试剂盒，包括SEQ ID NO：1～13所示的核苷酸序列，见表1。
表1引物和探针
。
实施例2
一种检测K-ras基因7种突变的方法，包括以下步骤：
（1）配置50μL荧光PCR反应体系：Buffer（10×）5μL，Mg2+ 2.0mmol/L，dNTP300nmol/L，实施例1每个引物200nmol/L，实施例1每个探针300nmol/L，Taq DNA聚合酶2U，DNA模板10ng，余量为ddH2O；
（2）进行荧光PCR扩增程序：酶激活，95℃ 10min；突变富集，95℃ 30s，68℃ 30，64℃ 50s，72℃ 25s，16个循环；扩增检测，30个循环，95℃ 30s，58℃ 32s，72℃ 18s，于“58℃32s”该步骤收集荧光信号FAM和HEX；
（3）结果判定：检测体系中，HEX通道15<Ct<22，表明上样在可控范围内，结果有效；以FAM信号通道为阳性判断标准，曲线呈“S”曲线，且Ct<29 为阳性，Ct为0则为阴性。
实施例3
一、K-ras突变检测体系和阈值的确定
（1）突变检测体系：通过长期的反复测试研究，本发明确定K-ras检测的上样量为10ng，将K-ras基因7种突变分别装入八排管的7个孔，第8个为外控；
（2）阳性判定：阳性判定需要满足以下要求：
首先，PCR阴性对照没有扩增曲线，有标明有污染，结果不可靠；
其次，检测103 copies阳性突变，Ct<23，否则性能不稳定；
第三，外控的Ct值为：17～25，确保上样量的准确性；
最后，检测样品，曲线成“S”，且Ct<30。
满足上述条件，待检测样品K-ras基因突变为阳性。
结果无论有无突变，内参HEX通路都有曲线可以观察到，如果没有，则表明实验存在错误，需要重新实验，见图1。
二、检测结肠癌K-ras基因突变
62例结肠癌样本，已经采用厦门艾德ADX-ARMS 试剂盒标定，来评价本发明实施例2检测临床样本的准确性。检测有出入或阳性的样本采用COLD-PCR后，亚克隆测序鉴定。
表2本发明检测与ADX-ARMS结果对比
通过与对62例临床样本的检测，结果与厦门艾德完全一致，且主要为Gly12Ser（GGT>AGT）、Gly12Val（GGT>GTT）、Gly12Asp（GGT>GAT）、Gly12Ala（GGT>GCT）和Gly13Asp（GGC>GAC），具体的结果参加表2。对两种方法检测判定为阳性的样本采用COLD-PCR测序，结果完成正确。在结肠癌中，K-ras的突变率约为32.8%左右。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南中医学院第一附属医院
<120> 检测K-ras基因突变的引物和探针体系、方法及试剂盒
<130> /
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Claims (2)

1.一种检测K-ras基因突变的引物和探针体系，其特征在于：由SEQ ID NO：1～13所示的核苷酸序列组成。
2.一种检测K-ras基因突变的试剂盒，包括权利要求1所述引物和探针。
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