JP2023505031A - がんの分析のための方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

対応する白血球及び無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の組み合わされた超高感度シーケンシングにより、術前治療及び切除後の臨床転帰を予測する真の腫瘍特異的変化が同定された。【選択図】 図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１１月２５日に出願された米国仮出願第６２／９４０，２１０号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

政府の権利に関する声明
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金ＣＡ１２１１１３及びＣＡ１８０９５０の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

本発明の技術分野
本発明の実施形態は、対象の循環における腫瘍特異的変化を検出及び同定するための非侵襲的方法に関する。一部には、本方法は、治療に対する患者の応答、再発及び／又は生存性の長期評価を提供する。

切除可能な胃がんのための根治的な集学的治療後の主要な課題は、術後再発のリスクが高い顕微鏡的遺残病変を有する患者を同定することである（Ｍａｒｒｅｌｌｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ Ｓｕｒｇ ２４１，２４７－２５５，ｄｏｉ：１０．１０９７／０１．ｓｌａ．００００１５２０１９．１４７４１．９７（２００５）、Ｓｏｎｇｕｎ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ １１，４３９－４４９，ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ１４７０－２０４５（１０）７００７０－Ｘ（２０１０）、Ｂｉｃｋｅｎｂａｃｈ，Ｋ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ ２０，２６６３－２６６８，ｄｏｉ：１０．１２４５／ｓ１０４３４－０１３－２９５０－５（２０１３）、Ｖａｎ Ｃｕｔｓｅｍ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ ３８８，２６５４－２６６４，ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ０１４０－６７３６（１６）３０３５４－３（２０１６））。手術後の微小残存病変（ＭＲＤ）の状態を捕えるための現在利用可能なイメージング技術及び従来の血液バイオマーカーは、感度が低く、臨床診療において役割を果たさない（Ａｕｒｅｌｌｏ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｗｏｒｌｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２３，３３７９－３３８７，ｄｏｉ：１０．３７４８／ｗｊｇ．ｖ２３．ｉ１９．３３７９（２０１７））。切除標本に対するネオアジュバント化学療法の効果の組織病理学的評価は、予後情報を提供するための重要なツールとなっている（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ ９８，１５２１－１５３０，ｄｏｉ：１０．１００２／ｃｎｃｒ．１１６６０（２００３）、Ｓｍｙｔｈ，Ｅ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３４，２７２１－２７２７，ｄｏｉ：１０．１２００／ＪＣＯ．２０１５．６５．７６９２（２０１６）、Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．＆Ｂｅｃｋｅｒ，Ｋ．Ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｇｒａｄｉｎｇ ｏｆ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃａｎｃｅｒｓ ａｆｔｅｒ ｎｅｏａｄｊｕｖａｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ、Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈｉｖ：ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ４７２，１７５－１８６，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００４２８－０１７－２２３２－ｘ（２０１８））。しかしながら、顕微鏡的残存腫瘍、リンパ節浸潤、及び不良な組織病理学的応答では、残存病変のリアルタイムの存在が評価されない。

Ｍａｒｒｅｌｌｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ Ｓｕｒｇ ２４１，２４７－２５５，ｄｏｉ：１０．１０９７／０１．ｓｌａ．００００１５２０１９．１４７４１．９７（２００５） Ｓｏｎｇｕｎ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ １１，４３９－４４９，ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ１４７０－２０４５（１０）７００７０－Ｘ（２０１０） Ｂｉｃｋｅｎｂａｃｈ，Ｋ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ ２０，２６６３－２６６８，ｄｏｉ：１０．１２４５／ｓ１０４３４－０１３－２９５０－５（２０１３） Ｖａｎ Ｃｕｔｓｅｍ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ ３８８，２６５４－２６６４，ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ０１４０－６７３６（１６）３０３５４－３（２０１６） Ａｕｒｅｌｌｏ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｗｏｒｌｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２３，３３７９－３３８７，ｄｏｉ：１０．３７４８／ｗｊｇ．ｖ２３．ｉ１９．３３７９（２０１７） Ｂｅｃｋｅｒ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ ９８，１５２１－１５３０，ｄｏｉ：１０．１００２／ｃｎｃｒ．１１６６０（２００３） Ｓｍｙｔｈ，Ｅ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３４，２７２１－２７２７，ｄｏｉ：１０．１２００／ＪＣＯ．２０１５．６５．７６９２（２０１６） Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．＆Ｂｅｃｋｅｒ，Ｋ．Ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｇｒａｄｉｎｇ ｏｆ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃａｎｃｅｒｓ ａｆｔｅｒ ｎｅｏａｄｊｕｖａｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈｉｖ：ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ４７２，１７５－１８６，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００４２８－０１７－２２３２－ｘ（２０１８）

ここでは、本発明者らは、対象の循環における腫瘍特異的変化を検出及び同定するための新しい非侵襲的方法を提供する。一態様では、本方法は、がんを有する患者の循環腫瘍ＤＮＡ中の変異を検出するための対応する白血球及び無細胞のＤＮＡ分析を含む。腫瘍特異的変化は、治療などに応答して、異なる時点にわたって検出され、モニタリングされ得る。

本発明の方法及びシステムは、胃がんに罹患している又は胃がんに罹患しやすい患者を検出及びモニタリングするのに特に有用である。本発明の方法及びシステムはまた、結腸直腸がんに罹患している又は罹患しやすい患者を検出及びモニタリングするために特に有用である。本発明の方法及びシステムはまた、肺がんに罹患している又は肺がんに罹患しやすい患者を検出及びモニタリングするのに特に有用である。本発明の方法及びシステムはまた、食道がんに罹患している又は罹患しやすい患者を検出及びモニタリングするのに特に有用である。

したがって、特定の実施形態では、対象の循環腫瘍ＤＮＡ中の腫瘍特異的変異を検出する方法が提供され、本方法は、対象から全血を採取し血漿及び細胞成分を分離して各々からＤＮＡを抽出すること、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）及び対象の全血の試料から得られた細胞ＤＮＡを含むゲノムＤＮＡのシーケンシングライブラリーを調製すること、参照ゲノム配列と比較した場合のｃｆＤＮＡ及び細胞ＤＮＡにおける配列変異を同定すること、ｃｆＤＮＡ及び細胞ＤＮＡの配列変異を比較すること、及び、それによって腫瘍特異的変異を同定することを含む。いくつかの実施形態では、配列リードは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）手順から生成される。

特定の実施形態では、がんを有する患者の循環腫瘍ＤＮＡ中の変異を検出するための対応する白血球及び無細胞のＤＮＡ分析に基づく方法は、抗がん剤による全身療法の適格性を決定することができる。

特定の実施形態では、本方法は、外科的切除に適格ながんを有する患者の循環腫瘍ＤＮＡ中の変異の検出を提供する。

ある特定の実施形態では、本方法は、周術期化学療法で処置された患者の循環腫瘍ＤＮＡのレベルの変化の検出を提供する。

ある特定の実施形態では、本方法は、ネオアジュバント抗がん剤で処置された患者の循環腫瘍ＤＮＡのレベルの変化の検出を提供する。

ある特定の実施形態では、好ましい方法は、がんを有する患者の術前化学療法に対する病理学的応答の予測を提供する。このような方法は、胃がんを有する患者に特に有用である。そのような方法はまた、結腸直腸がん、肺がん、及び／又は食道がんを有する患者に特に有用である。

ある特定の実施形態では、好ましい方法は、がんを有する患者の周術期治療後の再発の予測を提供する。

ある特定の実施形態では、好ましい方法は、がんを有する患者の周術期治療後のがん特異的生存の予測を提供する。

ある特定の実施形態では、好ましい方法は、がんを有する患者の周術期治療後の全生存率の予測を提供する。

ある特定の実施形態では、好ましい方法は、がんを有する患者の腫瘍切除後の微小残存病変の検出を提供する。

特定の実施形態では、好ましい方法は、抗がん剤による全身治療に適格ながんを有する患者のクローン造血に関連する変化の検出を提供する。

特定の実施形態では、好ましい方法は、腫瘍切除前にネオアジュバント全身治療を受けることから利益を得る患者の同定を提供する。

特定の実施形態では、腫瘍タイプは胃がんである。さらなる実施形態では、腫瘍タイプは結腸直腸がんである。他の実施形態では、腫瘍タイプは肺がんである。他の実施形態では、腫瘍タイプは食道がんである。

特定の実施形態では、循環腫瘍ＤＮＡは、治療前、手術時、及び手術後２ヶ月以内に分析される。

定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む）は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。一般的に使用される辞書で定義されているものなどの用語は、関連技術の文脈におけるそれらの意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであり、本明細書で明示的にそのように定義されない限り、理想化された又は過度に形式的な意味で解釈されないことがさらに理解されよう。

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数形も含むことが意図される。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」という用語、又はそれらの変形が詳細な説明及び／又は特許請求の範囲のいずれかで使用される限において、かかる用語は、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と同様に包括的であることを意図している。

「約（ａｂｏｕｔ）」又は「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容可能な誤差範囲内にあることを意味し、これはその値がどのように測定又は決定されるか、すなわち測定系の限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野の慣例に従って、標準偏差が１以内であるか又は標準偏差が１を超えることを意味する場合がある。あるいは、「約」は、所与の値又は範囲の最大２０％、最大１０％、最大５％、又は最大１％の範囲を意味する場合がある。あるいは、特に生物学的システム又はプロセスに関して、この用語は、ある値の５倍以内のオーダーの大きさを意味する場合があり、また２倍以内のオーダーの大きさを意味する場合もある。特定の値が本出願及び特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記しない限り、「約」という用語は、特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味するものと見なすべきである。

「アラインメントされた」、「アラインメント」、「マッピングされた」又は「アラインメントする」、「マッピング」という用語は、参照ゲノムからの既知の配列に対するそれらの核酸分子の順序に関して一致として同定される１つ又は複数の配列を指す。そのようなアラインメントは、手動で、又はコンピュータアルゴリズム、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｔｓパイプラインの一部として配布されているＥｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄａｔａ（ＥＬＡＮＤ）コンピュータプログラムによって行うことができる。アラインメントにおける配列リードのマッチングは、１００％の配列一致又は１００％未満（不完全一致）であり得る。

「代替対立遺伝子」又は「ＡＬＴ」という用語は、例えば、既知の遺伝子に対応する、基準対立遺伝子に対して１つ又は複数の変異を有する対立遺伝子を指す。

本明細書で使用される「がん」という用語は、当技術分野で知られているような無秩序な細胞増殖又は複製を特徴とする疾患、状態、形質、遺伝子型又は表現型を意味し、胃がん、結腸直腸がん、肺がん、結腸直腸がん、肺がん、食道がん、並びに、例えば、白血病、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）及び慢性リンパ性白血病、カポジ肉腫などのＡＩＤＳ関連がん、乳がん、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、線維肉腫、巨細胞腫、アダマンチノーマ、及び脊索腫などの骨がん、髄膜腫、神経膠芽腫、低悪性度星細胞腫、乏突起細胞腫、下垂体腫瘍、シュワン細胞腫及び転移性脳がんなどの脳がん、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、腺腫、扁平上皮がん、喉頭がん、胆嚢及び胆管がんなどの様々なリンパ腫を含む頭頸部のがん、網膜芽細胞腫などの網膜のがん、食道のがん、胃がん、多発性骨髄腫、卵巣がん、子宮がん、甲状腺がん、精巣がん、子宮内膜がん、黒色腫、肺がん、膀胱がん、前立腺がん、肺がん（非小細胞肺がんを含む）、膵臓がん、肉腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、頭頸部がん、皮膚がん、鼻咽頭がん、脂肪肉腫、上皮がん、腎細胞がん、胆嚢腺がん、耳下腺がん、子宮内膜肉腫、多剤耐性がん、並びに、腫瘍血管新生に関連する血管新生などの増殖性疾患及び状態、を含む。

「候補バリアント」、「いわゆるバリアント」又は「推定バリアント」という用語は、例えば、変異していると判定されたゲノム内のある位置のヌクレオチド配列から検出された１つ又は複数のヌクレオチドバリアントを指す。一般に、ヌクレオチド塩基は、試料から得られた配列リード上の代替対立遺伝子の存在に基づいて、いわゆるバリアントと見なされ、その場合、配列リードはそれぞれがゲノム内の位置をクロスオーバーする。候補バリアントの供給源は、最初のうちは確認されないか、又は不確かである場合がある。処理の過程で、候補バリアントは、ゲノムＤＮＡ（例えば、血液由来）又はがんに影響される細胞（例えば、腫瘍由来）などの予想される供給源と関連付けられ得る。加えて、候補バリアントは真陽性と呼ばれる場合がある。目的のバリアントは、測定され、認定され、定量され又は検出される遺伝子配列の特定のバリアントである。いくつかの実施形態では、目的のバリアントは、がん、腫瘍、又は遺伝性障害などの状態に関連することが知られている又は疑われるバリアントである。

「無細胞核酸」、「無細胞ＤＮＡ」又は「ｃｆＤＮＡ」という用語は、個体の体内（例えば、血流）を循環し、１つ又は複数の健康な細胞及び／又は１つ又は複数のがん細胞に由来する核酸断片を指す。さらに、ｃｆＤＮＡは、ウイルス、胎児などの他の供給源に由来し得る。

「循環腫瘍ＤＮＡ」又は「ｃｔＤＮＡ」という用語は、腫瘍細胞又は他の種類のがん細胞に由来し、死細胞のアポトーシス又は壊死などの生物学的過程の結果として個体の血流に放出され得る、又は生存腫瘍細胞によって能動的に放出され得る核酸断片を指す。

本明細書で使用される場合、「備えている（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「備えられた（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」という用語及びその変形は、項目、組成物、装置、方法、プロセス、システムなどの定義された又は記載された要素に関して、包括的又はオープンエンドであることを意味し、追加の要素を可能にし、それによって、定義された又は記載された項目、組成物、装置、方法、プロセス、システムなどがそれらの指定された要素を含み、又は必要に応じてそれらの均等物を含むこと、及び、他の要素が含まれてもよく、それらが定義された項目、組成物、装置、方法、プロセス、システムなどの範囲／定義内に入ることを示す。

「診断の」又は「診断された」とは、病的状態の存在又は性質を同定することを意味する。診断方法は、感度及び特異性が異なる。診断アッセイの「感度」は、検査陽性の疾患個体のパーセンテージ（「真陽性」のパーセント）である。このアッセイによって検出されない疾患個体は「偽陰性」である。罹患しておらず、アッセイで試験陰性となった対象は、「真陰性」と呼ばれる。診断アッセイの「特異性」は、１から偽陽性率を引いたものであり、「偽陽性」率は、検査で陽性となった疾患を有さない者の割合として定義される。特定の診断方法は、状態の確定診断を提供しない場合があるが、その方法が診断に役立つ肯定的な指標を提供するのであればそれで十分である。

本明細書で使用される「有効量」は、治療上又は予防上の利益を提供する量を意味する。

「ゲノム核酸」又は「ゲノムＤＮＡ」という用語は、１つ又は複数の健康な（例えば、非腫瘍）細胞に由来する染色体ＤＮＡを含む核酸を指す。様々な実施形態では、ゲノムＤＮＡは、白血球（ＷＢＣ）などの血球系統に由来する細胞から抽出することができる。

本明細書における「次世代シーケンシング（ＮＧＳ）」という用語は、クローン増幅分子及び単一核酸分子の超並列シーケンシングを可能にするシーケンシング方法を指す。例えば、参照によりその全体が組み込まれる、Ｐｈａｌｌｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｒｌｙ－ｓｔａｇｅ ｃａｎｃｅｒｓ ｕｓｉｎｇ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ９，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｎ２４１５（２０１７）、Ｌｉ Ｂ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３０：５９７－６０３，２０１９，ｄｏｉ：１０．１０９３／ａｎｎｏｎｃ／ｍｄｚ０４を参照されたい。ＮＧＳの非限定的な例としては、可逆的色素ターミネーターを使用する合成によるシーケンシング及びライゲーションによるシーケンシングが挙げられる。

「任意選択の（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」又は「任意選択で（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は、続いて記載される事象又は状況が発生し得ること又は発生し得ないこと、並びに、その説明が、その事象又は状況が発生する場合及び発生しない場合を含むことを意味する。

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、「又は」という用語は、一般に、その内容が明らかにそうでないことを指示しない限り、「及び／又は」を含む意味で使用される。

免疫原性組成物の「非経口」投与には、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）又は胸骨内の注射又は注入方法が含まれる。

「患者」又は「個体」又は「対象」という用語は、本明細書では互換的に使用され、治療される哺乳動物の対象を指し、ヒト患者が好ましい。場合によっては、本発明の方法は、マウス、ラット及びハムスターを含むげっ歯類、並びに霊長類を含むがこれらに限定されない実験動物において、獣医学的用途や疾患の動物モデルの開発に使用される。

本明細書で使用される「参照ゲノム」という用語は、ある種又は対象の代表的な例として集められた、デジタルの又は事前に同定された核酸配列データベースを指す場合がある。参照ゲノムは、複数の対象、試料又は生物からの核酸配列から集めることができ、必ずしも１人の個体の核酸構成を表すものではない。参照ゲノムは、試料からのシーケンシングリードを染色体位置にマッピングするために使用され得る。例えば、ヒト対象並びに他の多くの生物に使用される参照ゲノムは、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．の全米バイオテクノロジー情報センターで見られる。

「リードセグメント」又は「リード」という用語は、個体から得られた配列リード及び／又は個体から得られた試料から得られた初期配列リードに由来するヌクレオチド配列を含む任意のヌクレオチド配列を指す。

「配列リード」という用語は、個体から得られた試料から読み取られたヌクレオチド配列を指す。配列リードは、当技術分野で公知の様々な方法によって得ることができる。

本明細書で定義される場合、化合物又は薬剤の「治療有効」量（すなわち、有効投与量）は、治療的に（例えば、臨床的に）望ましい結果をもたらすのに十分な量を意味する。組成物は、１日１回以上から１週間に１回以上投与することができ、例えば、１日おきに１回投与することができる。当業者は、疾患又は障害の重症度、以前の治療、対象の一般的な健康状態及び／又は年齢、並びに存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない特定の要因が、対象を効果的に治療するために必要な投与量及びタイミングに影響を及ぼし得ることを理解するであろう。さらに、治療有効量の本発明の化合物による対象の治療は、単回の治療又は一連の治療を含み得る。

本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、「治療」などの用語は、障害及び／又はそれに関連する症状を軽減又は改善することを指す。排除するものではないが、障害又は状態を治療することは、障害又は状態又はそれに関連する症状が完全に解消されることを必要としないことが理解されよう。

遺伝子：本明細書に開示されるすべての遺伝子、遺伝子名及び遺伝子産物は、本明細書に開示される組成物及び方法が適用可能な任意の種に由来するホモログに対応することが意図される。特定の種に由来する遺伝子又は遺伝子産物が開示される場合、その開示は例示のみを意図しており、それが現れる文脈において明確に示されない限り、限定として解釈されるべきではないことが理解される。したがって、例えば、本明細書に開示される遺伝子又は遺伝子産物について、相同遺伝子及び／又はオーソロガス遺伝子及び他の種からの遺伝子産物を包含することが意図される。

範囲：本開示全体を通して、本発明の様々な態様を範囲の形式で提示する場合がある。範囲形式での説明は、単に便宜及び簡潔さのためのものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、その範囲内の個々の数値だけではなく、すべての可能な部分範囲を具体的に開示したものと見なされるべきである。例えば、１から６などの範囲の説明は、その範囲内の個々の数、例えば１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６だけではなく、１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３から６などの部分範囲を具体的に開示していると見なされるべきである。このことは、範囲の広さに関係なく適用される。

本特許又は出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を伴うこの特許又は特許出願公開の写しは、請求し、必要な料金を支払った場合に特許庁によって提供される。

図１Ａ及び図１Ｂは、切除可能な胃がんを有する患者のｃｆＤＮＡの分析を示す。図１Ａ：試験概略図。ＩＢ－ＩＶＡ期が確認された胃腺がんを有する、全身化学療法による周術期治療に適格な患者を、３サイクルの術前化学療法とそれに続く３サイクルの術後化学療法を受けるか、あるいは同じ術前レジメンとそれに続く化学療法に術後放射線療法を組み合わせて受けるように、事前に無作為化した。試験登録時（ベースライン）、３サイクルの術前化学療法後（術前時点）、及び術後（術後時点）に、各患者の採血を採取した。最初に血液試料を処理して、血漿からのｃｆＤＮＡ、及び白血球（ＷＢＣ）からのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を適切に抽出した。ｃｆＤＮＡ及びＷＢＣ ｇＤＮＡライブラリーの両方を、５８個のがんドライバー遺伝子にまたがる８０９３０個の塩基を包含するカスタムＲＮＡオリゴプールでハイブリッド捕捉した。捕捉ライブラリーを高カバレッジ（３００００倍超）で配列決定した後、配列アラインメント、エラー訂正、及びバリアントコールを行った。ｃｆＤＮＡにおいて、ＷＢＣ中に検出された変異を同定して除去し、ｃｆＤＮＡにおける腫瘍特異的変異を同定した。図１Ｂ：臨床病理学的特徴、外科的治療の種類、病理病期、及びこの翻訳試験で分析された患者のサブセットの術後治療の種類（ｎ＝５０）。ＭＳＩ（マイクロサテライト不安定性）、ＭＳＳ（マイクロサテライト安定性）、ＥＢＶ（エプスタイン・バー・ウイルス）、ＥＣＣ（エピルビシン、シスプラチン、カペシタビン）、ＣＣ（シスプラチン、カペシタビン）。 図２Ａ～図２Ｈは、限局性胃がんを有する患者の白血球及びｃｆＤＮＡにおけるｃｔＤＮＡバリアントの同定を実証する一連のプロット及び概略図である。図２Ａ～図２Ｂ：超高感度ターゲットシーケンシングを使用して、５０人の患者のｃｆＤＮＡにおける変異（図２Ａ）及びＷＢＣにおける変異（図２Ｂ）を検出し、変化を有する症例のみを示した。図２Ｃ：ｃｔＤＮＡにおける腫瘍特異的変異が、ｃｆＤＮＡにおけるＷＢＣ由来バリアントのサブトラクション後に２７人の個体において同定された。図２Ｄ：ｃｆＤＮＡバリアント（上部、黄色）、ＷＢＣバリアント（中、紫）及び得られたｃｔＤＮＡバリアント（底部、青色）の変異対立遺伝子分率の分布を示す密度プロット。図２Ｅ：ＷＢＣにおける変異対立遺伝子分率のレベル（横軸）及びｃｆＤＮＡにおけるそれらの対応するレベル（縦軸）は、ＷＢＣ変化がｃｆＤＮＡにおいて同様のレベルで同定されることを示唆している（ピアソン相関係数＝０．９１、ｐ＜０．００１）。変化がＷＢＣにおいて検出されない場合、同定されたバリアントが腫瘍由来である確率は、青色ドットの陰影によって示している。図２Ｆ：年齢（横軸）と各患者で検出されたＷＢＣバリアントの絶対数（縦軸）との関係は、ＷＢＣ変化の数が年齢と共に増加することを示唆している（ｒ２＝０．３６、指数相関）。図２Ｇ：ｃｆＤＮＡ（上のプロット）及びＷＢＣ（下のプロット）において検出されたＴＰ５３における変異の位置及び頻度は、ｃｆＤＮＡにおけるＴＰ５３変化の大部分がＷＢＣに由来することを実証している。両方のデータセットにおいて検出された１つのＴＰ５３スプライス部位変異は示していない。図２Ｈ：ｃｆＤＮＡ断片長（ｂｐ）に基づくｃｆＤＮＡ断片の累積分率は、ＷＢＣ ＴＰ５３バリアント（赤色）及び野生型ＴＰ５３配列と比較して、腫瘍由来ＴＰ５３変化を有するｃｆＤＮＡ断片について変化した分布（青色）を示している（ｐ＜０．００１、コルモゴロフ・スミルノフ検定）。 図３Ａ～図３Ｉは、胃がんにおける病理学的応答及び臨床転帰のバイオマーカーとしての術前ｃｔＤＮＡを実証する一連のプロット、グラフ、概略図及びＨ＆Ｅ画像である。図３Ａ～図３Ｂ：分子レスポンダー（ＣＧＳＴ３３）（図３Ａ）及びノンレスポンダー（ＣＧＳＴ１１０）（図３Ｂ）におけるベースライン及び術前時点でのｃｔＤＮＡバリアントのレベル。分子レスポンダー中のバリアントＭＡＦはｃｔＤＮＡの排除を示しているが、ｃｔＤＮＡレベルは分子ノンレスポンダーでは比較的変化していない。Ｍａｎｄａｒｄの腫瘍退縮グレードを示す代表的なＨ＆Ｅ画像（倍率２０倍）を各症例について右側に示す。図３Ｃ：外科的切除を受けた４３人の患者のそれぞれについて検出された病理学的特徴（ＴＲＧ及びリンパ節状態）及び最高変異対立遺伝子分率を表すヒートマップ。各事例についてＬａｕｒｅｎの分類は下に示している。図３Ｄ：術前時点での腫瘍退縮の程度とｃｔＤＮＡ状態との間の二分された関係（ｐ＝０．０３、フィッシャーの直接確率検定）、図３Ｅ、腫瘍退縮の程度と疾患再発との間の二分された関係（ｐ＝０．０３、フィッシャーの直接確率検定）、図３Ｆ、病理学的リンパ節状態と疾患再発との間の二分された関係（ｐ＝０．００２、フィッシャーの直接確率検定）、及び図３Ｇ、術前時点でのｃｔＤＮＡ状態と疾患再発との間の二分された関係（ｐ＝０．０２、フィッシャーの直接確率検定）。図３Ｈ～図３Ｉ、術前時点でバリアントが検出された患者とバリアントが検出されなかった患者の無イベント生存率についての、すべてのｃｆＤＮＡ配列変化を使用した場合（ログランクｐ＝０．７６；ＨＲ＝０．９；９５％ＣＩ＝０．４～２．１）（図３Ｈ）、又は、ＷＢＣ除去アプローチから同定されたｃｔＤＮＡ変化のみを使用した場合（ログランクｐ＝０．０１；ＨＲ＝３．０；９５％ＣＩ＝１．３～６．９）（図３Ｉ）のカプラン・マイヤー推定値。 図４Ａ～図４Ｅは、切除可能な胃がんにおける微小残存病変バイオマーカーとしてのｃｔＤＮＡの評価を実証する一連のプロット、グラフ、概略図及びＨ＆Ｅ画像である。図４Ａ～図４Ｂ：分子レスポンダー（ＣＧＳＴ３２）（図４Ａ）及びノンレスポンダー（ＣＧＳＴ６８）（図４Ｂ）におけるベースラインから術後時点までのｃｔＤＮＡバリアントのレベル。分子レスポンダー中のバリアントＭＡＦはｃｔＤＮＡの排除を示しているが、ｃｔＤＮＡレベルは分子ノンレスポンダー中で上昇し続けている。Ｍａｎｄａｒｄの腫瘍退縮グレードを示す代表的なＨ＆Ｅ画像（倍率２０倍）を各症例について右側に示す。図４Ｃ：ｃｔＤＮＡの長手方向の表示は、術後の時点が利用可能な２０人の患者の結果である。黒い縦線は手術の時間を表す。緑色の矢印は、最後の追跡で疾患の証拠がない患者を示す。図４Ｄ～図４Ｅ、術後時点でバリアントが検出された患者とバリアントが検出されなかった患者の全生存率についての、すべてのｃｆＤＮＡ配列変化を使用した場合（ログランクｐ＝０．２８；ＨＲ＝３．３；９５％ＣＩ＝０．４～２９）（図４Ｄ）、又は、ＷＢＣ除去アプローチから同定されたｃｔＤＮＡ変化のみを使用した場合（ログランクｐ＝０．００１；ＨＲ＝２１．８；９５％ＣＩ＝３．９－１２３．１）（図４Ｅ）のカプラン・マイヤー推定値。 図５は、ＣＲＩＴＩＣＳ試験コホートに登録された患者のコンソートダイアグラムを示す概略図である。手術可能なＩＢ－ＩＶＡ期の胃がんを有する患者（ｎ＝７８８）を、最初に、エピルビシン、シスプラチン又はオキサリプラチン及び経口カペシタビンを用いた３サイクルの術前化学療法で治療し、その後、手術を行った。患者を、同じ化学療法レジメンによる術後治療（ｎ＝３９３）又はシスプラチン及び経口カペシタビンによる術後放射線（ｎ＝３９５）を受けるように無作為に割り当てた。ｃｔＤＮＡ分析に使用される血漿試料は、オランダの研究センターによって提供された。 図６は、胃がんにおける超高感度ＮＧＳアプローチの検出の理論的感度を示す概略図である。ＴＣＧＡ Ｐａｎ－Ｃａｎｃｅｒ Ａｔｌａｓ胃腺がんコホートの分析は、この研究で使用した５８遺伝子パネル（８１Ｋｂ）について理論的感度が８８％であり、このアプローチを使用して４３６症例のうち３８５症例が同定される可能性があることが示された。 図７Ａ～図７Ｆは、分析した胃がんの病理学的特徴及びｃｔＤＮＡレベルを示す一連のグラフである。図７Ａ：びまん性サブタイプ及び腸型サブタイプを有する患者のベースラインでのｃｔＤＮＡの変異対立遺伝子分率（ウィルコクソン順位和検定、ｐ＝０．０２）。図７Ｂ：高分化腫瘍、中分化腫瘍及び低分化腫瘍を有する患者のベースラインでのｃｔＤＮＡの変異対立遺伝子分率（クラスカル・ワリス検定、ｐ＝０．０７）。図７Ｃ～図７Ｄ、腸型サブタイプ及びびまん性サブタイプを有する患者の無イベント生存率［ログランクｐ＝０．９０；ＨＲ＝１．０（９５％ＣＩ＝０．４～２．１）］（図７Ｃ）及び全生存率［ログランクｐ＝０．５９；ＨＲ＝０．８（９５％ＣＩ＝０．３～１．９）（図７Ｄ）についてのカプラン・マイヤー推定値。図７Ｅ～図７Ｆ：アジュバント化学療法又は化学放射線療法で治療された患者の無イベント生存率［ログランクｐ＝０．４８；ＨＲ＝１．３（９５％ＣＩ＝０．６～３．０）］（図７Ｅ）及び全生存率［ログランクｐ＝０．８３；ＨＲ＝１．１（９５％ＣＩ＝０．５～２．５）］（図７Ｆ）についてのカプラン・マイヤー推定値。 図８Ａ～図８Ｋは、胃がんを有する患者の白血球（ＷＢＣ）配列の変化の動態を実証する一連のグラフである。ＷＢＣバリアントの変異対立遺伝子分率は、腫瘍特異的変異のない患者のｃｆＤＮＡで同定した。 図９Ａ～図９Ｄは、ベースライン時点でのｃｆＤＮＡ中のＷＢＣバリアント又は腫瘍特異的変化に基づく生存転帰を実証する一連のグラフである。図９Ａ～図９Ｂ：試験登録時にｃｆＤＮＡ中にＷＢＣバリアントを有する患者又は有しない患者の無イベント生存率［ログランクｐ＝０．１８；ＨＲ＝１．７（９５％ＣＩ＝０．８～３．８）］（図９Ａ）及び全生存率［ログランクｐ＝０．４６；ＨＲ＝１．４（９５％ＣＩ＝０．６～３．２）］（図９Ｂ）についてのカプラン・マイヤー推定値。図９Ｃ～図９Ｄ：試験登録時にｃｔＤＮＡが検出された患者又は検出されなかった患者の無イベント生存率［ログランクｐ＝０．４５；ＨＲ＝１．４（９５％ＣＩ＝０．６～３．０）］（図９Ｃ）及び全生存率［ログランクｐ＝０．５５；ＨＲ＝１．３（９５％ＣＩ＝０．６～３．０）］（Ｄ）についてのカプラン・マイヤー推定値。 図１０Ａ～図１０Ｑは、術前化学療法インターバル中のｃｔＤＮＡの動的変化を示すグラフである。各患者のｃｔＤＮＡ変化は、ｃｆＤＮＡで観察されたＷＢＣバリアントを除去した後、術前化学療法インターバル中に検出された。 図１１Ａ～図１１Ｋは、手術前後のｃｔＤＮＡの動的変化を示す一連のグラフである。各患者について観察されたｃｔＤＮＡ変化は、ｃｆＤＮＡで観察されたＷＢＣバリアントを除去した後、ベースラインから術後時点まで検出された。 図１２Ａ～図１２Ｃは、術前の時点おける一連のプロット及びヒートマップ病理学的応答並びに生存転帰である。図１２Ａ：術前時点での変異対立遺伝子分率と手術後の病理学的特徴との間のスピアマンの順位相関係数を示すヒートマップ（ｙｐＮ、病理学的リンパ節評価；ｙｐＴ、病理学的腫瘍評価；ＴＲＧ、腫瘍退縮グレード）。図１２Ｂ：術前化学療法に対して、病理学的応答が軽微か又はない患者（ＴＲＧ３－５）及び病理学的応答が大きい患者（ＴＲＧ１－２）の無イベント生存率についてのカプラン・マイヤー推定値［ログランクｐ＝０．０３；ＨＲ＝３．６（９５％ＣＩ＝１．１～１１．３）］。図１２Ｃ：（ｙｐＮ１－３）リンパ節腫瘍浸潤のある患者及び（ｙｐＮ０）リンパ節腫瘍浸潤のない患者の無イベント生存率についてのカプラン・マイヤー推定値［ログランクｐ＝０．００２；ＨＲ＝４．５（９５％ＣＩ＝１．８～１１．６）］。 図１３Ａ及び図１３Ｂは、術前の時点におけるｃｆＤＮＡ及びｃｔＤＮＡバリアントの検出及び全生存率を実証するプロットである。図１３Ａ～図１３Ｂ、術前時点でバリアントが検出された患者とバリアントが検出されなかった患者の全生存率についての、すべてのｃｆＤＮＡ配列変化を使用した場合［ログランクｐ＝０．７４；ＨＲ＝０．９（９５％ＣＩ＝０．４～２．１）］（図１３Ａ）、又はＷＢＣ除去アプローチから同定されたｃｔＤＮＡ変化のみを使用した場合［ログランクｐ＝０．０３；ＨＲ＝２．７（９５％ＣＩ＝１．１～６．７）］（図１３Ｂ）のカプラン・マイヤー推定値。 図１４Ａ～図１４Ｂは、術後の時点でのｃｆＤＮＡバリアント及びｃｔＤＮＡバリアントの検出及び無イベント生存率を実証するプロットである。図１４Ａ～図１４Ｂ：術後時点でバリアントが検出された患者とバリアントが検出されなかった患者の無イベント生存率についての、すべてのｃｆＤＮＡ配列データ［ログランクｐ＝０．２８；ＨＲ＝３．３（９５％ＣＩ＝０．４～２９．３）］（図１４Ａ）を使用した場合、又はＷＢＣ除去アプローチから同定されたｃｔＤＮＡ変化のみを使用した場合［ログランクｐ＜０．００１；ＨＲ＝２１．８（９５％ＣＩ＝３．９－１２３．１）］（図１４Ｂ）のカプラン・マイヤー推定値。 図１５は、白血球変異対立遺伝子分率と血漿変異対立遺伝子分率との間の相関を示す。このプロットでは、ベースライン（青色）及び切除後（オレンジ色）の時点について、白血球変異対立遺伝子分率をｘ軸にプロットし、血漿変異対立遺伝子分率をｙ軸にプロットしている。 ベースライン及び切除後の血漿における変異の検出。血漿中で検出された変化についての変異対立遺伝子分率を、ベースライン、切除前の採血（左）及び切除後の採血（右）について示す。変異は、血液中でどのように検出されたかに基づいて色付けしている。中央のスパインは、患者の病期及び患者が臨床的再発をしたかどうかを示す。ベースラインにおいて５％を超える変異及び切除後において７％を超える変異は、それらの値で示している。 図１７Ａ～図１７Ｃ。（Ａ）は、免疫療法で治療された肺がん患者から一連の血液及び組織試料の採取を可能にする生物検体及び臨床メタデータ収集プロトコルを示す。血漿及び対応する白血球ＤＮＡ試料をディープシーケンシングし、クローン造血バリアントを除去し、患者の臨床表現型についてｃｔＤＮＡ分子応答を解釈した。（Ｂ～Ｃ）遺伝子内の白血球由来のｃｆＤＮＡ変異はクローン造血と標準的な関係にないことが見出され、ｃｆＤＮＡ変異が腫瘍由来であるかＣＨ由来であるかを決定するために、対応する白血球ＤＮＡのディープシーケンシングが重要であることを示している。 図１８Ａ～図１８Ｄ。（Ａ）液体生検分析は、ｃｆＤＮＡ変化の約５０％が非腫瘍由来（生殖細胞系又はＣＨ由来）であることを明らかにしている。（Ｂ～Ｃ）ＣＨ由来及び腫瘍由来としての血漿変異を適切に分類することにより、分子応答パターンの評価することができ、レスポンダーをノンレスポンダーと区別することができた。（Ｄ）ＣＨ由来バリアントが除去されると、ｃｔＤＮＡ分子応答は進行を反映した（ＰＦＳ）。 ＣＨ由来の変異及び生殖細胞系列の変異を含めると、ｃｔＤＮＡ分子応答を正確に判定することができず、ｃｔＤＮＡ動態は無増悪生存率及び全生存率と関連しなかった（上のパネル）。対照的に、対応する白血球ＤＮＡのディープシーケンシングを採用した場合、バリアントは腫瘍由来及びＣＨ由来のカテゴリーに正確に分類され、これにより、分子ｃｔＤＮＡレスポンダーとノンレスポンダーの区別が可能になった。フィルタリング後、ｃｔＤＮＡレスポンダーは、有意に長い無増悪生存及び全生存を有していた（下のパネル）。 図２０は、生殖細胞由来バリアント及びＴＰ５３ＣＨ由来バリアントが対応する白血球ＤＮＡシーケンシング分析によって除外された場合にのみ、腫瘍由来ＴＰ５３ Ｇ２４５Ｓ変異によって捕捉されたｃｔＤＮＡ動態が、切除時に認められた腫瘍退縮（１０％残存腫瘍）と一致したプロットを示す。

一態様では、本発明者らはここで、切除可能な胃がんを有する患者の術前化学療法後及び手術後の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）変化を正確に検出し得る、対応するｃｆＤＮＡ及び白血球（ＷＢＣ）のシーケンシングアプローチを提供する。本明細書に具体化される方法は、術前治療完了後のｃｔＤＮＡの検出及び手術後の微小残存病変の検出によって、集学的治療レジメンで治療された切除可能な胃がんを有する患者の再発及び生存を予測することができるようにする。好ましい方法は、ｃｔＤＮＡ変化をクローン造血に関連するｃｆＤＮＡバリアントと区別することができ、手術前又は手術後のｃｔＤＮＡ除去が周術期治療に対する患者転帰の予測バイオマーカーとして機能し得るかどうかを見極めることができた。

したがって、特定の実施形態では、循環腫瘍由来ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）変化を同定する方法は、同じ患者由来の対応するｃｆＤＮＡ及び白血球の超高感度ターゲットシーケンシング分析を含む。得られた結果については、以下の実施例のセクションで詳細に説明する。端的に言えば、切除可能な胃がんを有する７８８人の患者の周術期治療を評価する第ＩＩＩ相試験であるＣＲＩＴＩＣＳ試験の患者からの試料を分析した（図５）。複数の時点（ｎ＝１２０）で入手可能な血液試料を用いた５０人の患者の液体生検分析により、ｃｆＤＮＡの変化の５２％が白血球に由来することが明らかになった。ｃｆＤＮＡから血球の変化をフィルタリングした後、ｃｔＤＮＡの存在によって、術前治療後（中央値１８．４ヶ月対中央値未到達、Ｐ＝０．０１２、ＨＲ＝３．０、９５％ＣＩ＝１．３～６．９）及び手術後（中央値１８．７ヶ月対中央値未到達、Ｐ＜０．００１、ＨＲ＝２１．８、９５％ＣＩ＝３．９～１２３．１）に分析した場合に、集学的治療に適格な患者の再発を予測できることがわかった。これらの分析は、ｃｔＤＮＡを他のｃｆＤＮＡ変化と区別するための容易な方法を提供し、例えば、胃がん、並びに結腸直腸がん、肺がん及び／又は食道がんなどの他のがんを有する患者の周術期治療及び切除に対する患者転帰の予測バイオマーカーとしてのｃｔＤＮＡの有用性を強調する。

以下の実施例のセクションに詳細に記載されるように、点変異、小さな挿入及び欠失からなる、ｃｆＤＮＡ中の候補腫瘍特異的変異を、目的のターゲット領域にわたって同定することができる。端的に言えば、（ｉ）３つの別個のペアリードがｃｆＤＮＡ中に変異を含み、血漿中の特定の変異を含む別個のペアリードの数が全別個のリードペアの少なくとも０．０５％であった場合、又は、（ｉｉ）１つの別個のペアリードがｃｆＤＮＡ中に変異を含み、その変異がまた少なくとも１つのさらなる時点において（ｉ）で指定されるレベルで検出された場合、（ｉｉｉ）ミスマッチ塩基又は小型インデルがベースラインにおいて１つの別個のリードのレベルで採取された試料の対応する白血球のシーケンシングデータにおいて同定されなかった場合（表９）、（ｉｖ）ミスマッチ塩基又は小型インデルがｄｂＳＮＰから誘導される一般的な生殖細胞系列バリアントのカスタムデータベースに存在しなかった場合、（ｖ）変化した塩基がパラロガス配列を含む誤って配置されたゲノムアラインメントから生じなかった場合、及び、（ｖｉ）変異がタンパク質コード領域内に入り、ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト又はスプライス部位の変化として分類された場合、にのみ、変化を候補体細胞変異と見なした。ヌクレオチド変化及びアミノ酸変化が、ＣＯＳＭＩＣデータベースで報告された２０例以上のがん症例で観察された変化と同一である場合、候補変化を体細胞ホットスポットと定義した。

ゲノム及びがん
がんゲノムシーケンシング研究によって、ヒト腫瘍を成長及び進行させる様々な遺伝子変異が集合的に同定されている。親から子に伝えられる遺伝性又は生殖細胞系列変異とは異なり、体細胞変異は、人の一生の間に個々の細胞のＤＮＡにおいて形成されるものであり、親から子には伝えられない。したがって、がんに関連する体細胞ＤＮＡ変異に起因する配列バリアントは、がんを検出し、がんの発症を調べるためのバイオマーカーを提供する。

腫瘍組織自体は、がんバリアント、又は様々ながんに関連することが知られているか若しくは疑われる配列バリアントを検出するために分析され得る大量のＤＮＡ材料を含む。これは、腫瘍組織の生検によって行うことができる。しかしながら、がんの位置及び形態が連続的に変化するため、がん組織及びがん由来ＤＮＡを得るために様々な位置で生検試料を継続的に取得することは困難であることが多い。死滅腫瘍細胞は、それらのＤＮＡの小片を血流及び他の体液に放出する。これらの断片は、無細胞循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）と呼ばれ、非がん細胞由来の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）と共存する。体細胞変異に関連するｃｔＤＮＡのスクリーニングによって、患者の腫瘍の進行が検出され、追跡される。これらの方法は、液体生検とも呼ばれる。

様々な現在の液体生検の方法では、患者から採取したｃｆＤＮＡを分析するためにハイスループットシーケンシングを利用する。しかしながら、腫瘍特異的バリアントを検出する能力は、いくつかの要因によって制限される。ハイスループットシーケンシングを利用する液体生検方法は、シーケンシングエラーレート及びシーケンシングデプスによって制限される。一部のがん患者では、一部の腫瘍バリアントに対して腫瘍量が非常に大きい場合がある。例えば、ｃｔＤＮＡは、いくつかの試料では０．１％未満、又は０．０１％未満であり得る。したがって、腫瘍に由来するｃｆＤＮＡの分率は、シーケンシングパイプラインの誤差範囲を下回る可能性がある。低い腫瘍負荷の患者からコールされる腫瘍特異的バリアントは、推定されるリードにおいて腫瘍バリアントと一致する配列が実際は本当の変異ではなくシーケンシングエラーに起因する可能性が小さいながら存在するため、高い偽陽性率に悩まされる可能性がある。真陽性を増加させて感度を向上させ、偽陽性を減少させて選択性を向上させることが望ましい。

したがって、特定の実施形態では、対象の循環腫瘍ＤＮＡ中の腫瘍特異的変異を検出する方法は、がんのリスクがある又はがんに罹患している対象から試料を取得することを含む。特定の実施形態では、試料は全血である。細胞成分から血漿を分離するために全血を処理、例えば、遠心分離する。次いで、血漿からｃｆＤＮＡを抽出し、例えば白血球からゲノムＤＮＡを抽出する。無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）及び細胞ＤＮＡを含むゲノムＤＮＡのシーケンシングライブラリーを調製し、参照ゲノム配列と比較してｃｆＤＮＡ及び細胞ＤＮＡの配列変異を同定する。ｃｆＤＮＡと細胞ＤＮＡとの間の配列変異を比較して、配列の違いを同定する。ｃｆＤＮＡ及び白血球ＤＮＡの両方で検出された配列特異的変異は、腫瘍特異的変異として除外した。ｃｆＤＮＡにおいて排他的に検出された配列特異的変異は、腫瘍特異的変異として同定した。

特定の実施形態では、がんを有する対象の循環腫瘍ＤＮＡにおける変異の検出が外科的切除の適格性を決定する。

特定の実施形態では、周術期化学療法で治療された患者の循環腫瘍ＤＮＡのレベルの変化の検出によって、患者が治療に反応しているかどうかを決定する。例えば、ネオアジュバント抗がん剤で治療された患者で検出される循環腫瘍ＤＮＡのレベルの低下。

特定の実施形態では、がんを有する患者の術前化学療法に対する病理学的応答の予測によって、治療がその治療効果に対して否定的な反応を示しているかどうかを決定する。例えば、図１２Ａ～図１２Ｃを参照されたい。

特定の実施形態では、循環腫瘍ＤＮＡのレベル又は検出される変異の数及び種類の減少は、がんを有する患者の周術期治療後の再発の予兆である。

特定の実施形態では、循環腫瘍ＤＮＡのレベル又は検出された変異の数及び種類の変化は、がんを有する患者の周術期治療後のがん特異的生存の予兆である。例えば、循環腫瘍ＤＮＡの減少、又はｃｆＤＮＡに排他的な検出された変異の数及び種類の減少は、生存を予測するであろう。例えば、図３Ａ～図３Ｉを参照されたい。

特定の実施形態では、循環腫瘍ＤＮＡのレベル又は検出された変異の数及び種類の変化は、がんを有する患者の周術期治療後の全生存率の予測である。例えば、図９Ａ～図９Ｄを参照されたい。

特定の実施形態では、循環腫瘍ＤＮＡのレベル又は検出された変異の数及び種類の変化によって、がんを有する患者の腫瘍切除後の微小残存病変を決定する。例えば、図４Ａ～図４Ｅを参照されたい。

特定の実施形態では、がんを有する患者のクローン造血に関連する変化の検出によって、対象が抗がん剤による全身治療に適格であるかどうかを決定する。例えば、図２Ａ、図２Ｂ並びに表６及び表７を参照されたい。

特定の実施形態では、循環腫瘍ＤＮＡのレベル又は検出された変異の数及び種類の変化によって、腫瘍切除前にネオアジュバント全身治療を受けることから利益を得る患者の同定が可能になる。

例えば、標準的な技術を使用して生物学的流体からｃｆＤＮＡを精製した後、その断片を１つ又は複数の酵素工程に供してシーケンシングライブラリーを作成する。これらの酵素工程は、５’リン酸化、ポリメラーゼによる末端修復、ポリメラーゼによるＡテーリング、リガーゼによる１つ又は複数のシーケンシングアダプターのライゲーション、及びポリメラーゼによる複数の断片の線形又は指数関数的増幅のうちの１つ又は複数を含み得る。いくつかの実施形態では、その配列組成が予め定義された配列のパネルとマッチする複数のフラグメントは、開始ライブラリーのサブセットがさらなる工程のために繰り越されるように、ハイブリダイゼーション－捕捉によって標的化又は選択することができる。

増幅アダプターは、断片化された核酸に結合され得る。アダプターは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（コーラルビル、アイオワ州）などから商業的に入手することができる。特定の実施形態では、アダプター配列は、酵素を用いて鋳型核酸分子に結合される。酵素は、リガーゼ又はポリメラーゼであり得る。リガーゼは、オリゴヌクレオチド（ＲＮＡ又はＤＮＡ）を鋳型核酸分子にライゲーションすることができる任意の酵素であり得る。適切なリガーゼには、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（イプスウィッチ、マサチューセッツ州）から市販されているＴ４ ＤＮＡリガーゼ及びＴ４ ＲＮＡリガーゼが含まれる。リガーゼを使用する方法は、当技術分野で周知である。ポリメラーゼは、鋳型核酸分子の３’末端及び５’末端にヌクレオチドを付加することができる任意の酵素であり得る。

ライゲーションは、平滑末端であってもよく、又は相補的な突出末端を利用してもよい。特定の実施形態では、断片化後に断片の端部を修復し、（例えば、エキソヌクレアーゼを使用して）トリミングし、又は（例えば、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰを使用して）充填して平滑末端を形成することができる。いくつかの実施形態では、市販のキット、例えば、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（マディソン、ウィスコンシン州）から入手可能なものを使用して末端修復を行って、平滑末端５’リン酸化核酸末端を生成する。平滑末端を生成すると、その末端をポリメラーゼ及びｄＡＴＰで処理して、断片の３’末端及び５’末端に対して鋳型非依存性付加を形成し、これにより単一のＡオーバーハングを生成することができる。この単一のＡは、Ｔ－Ａクローニングと呼ばれる方法において、５’末端から単一のＴがオーバーハングした断片のライゲーションをガイドするために使用される。あるいは、制限酵素によって残されるオーバーハングの可能な組み合わせは、制限消化後に判明するので、末端はそのまま、すなわち不規則な末端のままにしてもよい。特定の実施形態では、相補的なオーバーハング末端を有する二本鎖オリゴヌクレオチドが使用される。

特定の実施形態では、バーコード配列が鋳型核酸に結合される。特定の実施形態では、バーコードが各断片に結合される。他の実施形態では、複数のバーコード、例えば２つのバーコードが各断片に結合される。バーコード配列は、一般に、その配列をシーケンシング反応において有用にする特定の特徴を含む。例えば、バーコード配列は、ホモポリマー領域が最小限であるか、又はホモポリマー領域を有さないように、すなわち、バーコード配列内に、２つ以上の同じ塩基がＡＡ又はＣＣＣのように並ぶように設計される。バーコード配列はまた、塩基ごとのシーケンシングを行うときに塩基の付加順序から少なくとも１編集距離離れて、最初と最後の塩基が配列の予想される塩基と一致しないことを担保にするように設計される。

バーコード配列は、各配列が核酸の特定の部分に相関するように設計されており、配列リードをそれらが由来する部分に相関させることを可能にする。特定の実施形態では、バーコード配列は、約５ヌクレオチドから約１５ヌクレオチドの範囲である。特定の実施形態では、バーコード配列は、約４ヌクレオチドから約７ヌクレオチドの範囲である。バーコード配列は鋳型核酸と共に配列決定されるので、オリゴヌクレオチドの長さは、結合した鋳型核酸からの最長読み取りを可能にするように最小長でなければならない。例えば、複数のＤＮＡバーコードは、様々な数のヌクレオチドの配列を含み得る。特定の実施形態では、バーコード配列は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０又はそれ以上のヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドの一端のみに結合している場合、複数のＤＮＡバーコードは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０又はそれ以上の異なる識別子を生成することができる。あるいは、ポリヌクレオチドの両端に結合している場合、複数のＤＮＡバーコードは、４、９、１６、２５、３６、４９、６４、８１、１００、１２１、１４４、１６９、１９６、２２５、２５６、２８９、３２４、３６１、４００個又はそれ以上の異なる識別子（ＤＮＡバーコードがポリヌクレオチドの１の末端だけに結合している場合の２である）を生成することができる。

一般に、バーコード配列は、鋳型核酸分子から少なくとも１つの塩基分離間している（ホモポリマーの組み合わせを最小限に抑える）。特定の実施形態では、バーコード配列は、例えば酵素を用いて鋳型核酸分子に結合される。酵素は、後述するように、リガーゼ又はポリメラーゼであり得る。

増幅若しくはシーケンシングアダプター又はバーコード、又はそれらの組み合わせは、断片化された核酸に結合され得る。そのような分子は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（コーラルビル、アイオワ州）などから商業的に入手することができる。特定の実施形態では、そのような配列は、リガーゼなどの酵素を用いて鋳型核酸分子に結合される。適切なリガーゼには、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（イプスウィッチ、マサチューセッツ州）から市販されているＴ４ ＤＮＡリガーゼ及びＴ４ ＲＮＡリガーゼが含まれる。ライゲーションは、平滑末端であってもよく、又は相補的な突出末端の使用を介してもよい。特定の実施形態では、断片化後に断片の端部を修復し、（例えば、エキソヌクレアーゼを使用して）トリミングし、又は（例えば、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰを使用して）充填して平滑末端を形成することができる。いくつかの実施形態では、市販のキット、例えば、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（マディソン、ウィスコンシン州）から入手可能なものを使用して末端修復を行って、平滑末端５’リン酸化核酸末端を生成する。平滑末端を生成すると、その末端をポリメラーゼ及びｄＡＴＰで処理して、断片の３’末端及び５’末端に対して鋳型非依存性付加を形成し、これにより単一のＡオーバーハングを生成することができる。この単一のＡは、Ｔ－Ａクローニングと呼ばれる方法において、５’末端から単一のＴがオーバーハングした断片のライゲーションをガイドすることができる。あるいは、制限酵素によって残されるオーバーハングの可能な組み合わせは、制限消化後に判明するので、末端はそのまま、すなわち不規則な末端のままにしてもよい。特定の実施形態では、相補的なオーバーハング末端を有する二本鎖オリゴヌクレオチドが使用される。

任意の処理工程（例えば、取得工程、単離工程、断片化工程、増幅工程、又はバーコード化工程）の後、核酸を配列決定することができる。

シーケンシング：特定の実施形態では、ハイスループットシーケンシング法が用いられる。特定の実施形態では、次世代シーケンシング法が使用される。例えば、それぞれ参照によりその全体が組み込まれる、Ｐｈａｌｌｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｒｌｙ－ｓｔａｇｅ ｃａｎｃｅｒｓ ｕｓｉｎｇ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ９，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｎ２４１５（２０１７）、Ｌｉ Ｂ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３０：５９７？６０３，２０１９，ｄｏｉ：１０．１０９３／ａｎｎｏｎｃ／ｍｄｚ０４を参照されたい。ＮＧＳの非限定的な例としては、可逆的色素ターミネーターを使用する合成によるシーケンシング及びライゲーションによるシーケンシングが挙げられる。この方法では、ＤＮＡ断片のターゲット捕捉及びディープシーケンシング（３００００倍超）に基づいて、８０９３０ｂｐのコード遺伝子領域にわたるｃｆＤＮＡにおける単一塩基置換や小さな挿入又は欠失を、ＰＣＲ増幅及びシーケンシングのアーチファクトと区別しながら同定する。

シーケンシングはまた、当技術分野で公知の任意の方法によるものであり得る。ＤＮＡシーケンシング技術には、標識ターミネーター又はプライマー及びスラブ又はキャピラリーでのゲル分離を使用する古典的なジデオキシシーケンシング反応（サンガー法）、可逆的に終端された標識ヌクレオチドを使用する合成によるシーケンシング、パイロシーケンシング、４５４シーケンシング、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａシーケンシング、標識オリゴヌクレオチドプローブライブラリーへの対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、ライゲーションが続く標識クローンのライブラリーへの対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションを使用する合成によるシーケンシング、重合工程中の標識ヌクレオチドの取り込みのリアルタイムモニタリング、ポロニーシーケンシング、ＳＯＬｉＤシーケンシング、ターゲットシーケンシング、一分子リアルタイムシーケンシング、エクソンシーケンシング、電子顕微鏡ベースのシーケンシング、パネルシーケンシング、トランジスタ媒介シーケンシング、直接シーケンシング、ランダムショットガンシーケンシング、全ゲノムシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、キャピラリー電気泳動、ゲル電気泳動、二本鎖シーケンシング、サイクルシーケンシング、一塩基伸長シーケンシング、固相シーケンシング、ハイスループットシーケンシング、超並列シグネチャーシーケンシング、エマルジョンＰＣＲ、低変性温度での共増幅ＰＣＲ（ＣＯＬＤ－ＰＣＲ）、マルチプレックスＰＣＲ、可逆的色素ターミネーターによるシーケンシング、ペアエンドシーケンシング、短期シーケンシング、エキソヌクレアーゼシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、ショートリードシーケンシング、単一分子シーケンシング、リアルタイムシーケンシング、逆ターミネーターシーケンシング、ナノポアシーケンシング、ＭＳ－ＰＥＴシーケンシング、及びそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態では、シーケンシング方法は超並列シーケンシングであり、すなわち、少なくとも１００、１０００、１００００、１０００００、１００万、１０００万、１億又は１０億個のポリヌクレオチド分子のすべてを同時に（又は迅速に連続して）シーケンシングする。いくつかの実施形態では、シーケンシングは、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ又はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている遺伝子分析装置などの遺伝子分析装置によって行うことができる。分離された分子のシーケンシングは、最近になって、ポリメラーゼ又はリガーゼを用いた連続的又は単一の伸長反応、並びにプローブのライブラリーを用いた単一又は連続的な示差的ハイブリダイゼーションによって実証されている。シーケンシングは、ＤＮＡシーケンサー（例えば、シーケンシング反応を行うように設計された機械）によって行うことができる。

使用することができるシーケンシング技術には、例えば、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓシステムの使用が含まれる。第１の工程では、ＤＮＡを約３００～８００塩基対の断片に剪断し、その断片を平滑末端化する。次いで、オリゴヌクレオチドアダプターを断片の末端にライゲートする。アダプターは、断片の増幅及びシーケンシングのためのプライマーとして機能する。断片は、例えば、５’－ビオチンタグを含むアダプターＢを使用して、ＤＮＡ捕捉ビーズ、例えば、ストレプトアビジン被覆ビーズに結合させることができる。ビーズに結合した断片は、油－水エマルジョンの液滴内でＰＣＲ増幅される。その結果は、各ビーズ上のクローン増幅ＤＮＡ断片の複数のコピーである。第２の工程では、ビーズをウェル（ピコリットルサイズ）に捕捉する。パイロシーケンシングは、各ＤＮＡ断片に対して並行して行われる。１つ又は複数のヌクレオチドの付加は、シーケンシング機器においてＣＣＤカメラによって記録される光信号を生成する。シグナル強度は、組み込まれるヌクレオチドの数に比例する。パイロシーケンシングは、ヌクレオチド付加時に放出されるピロリン酸（ＰＰｉ）を利用する。ＰＰｉは、アデノシン５’ホスホスルフェートの存在下でＡＴＰスルフリラーゼによってＡＴＰに変換される。ルシフェラーゼはＡＴＰを使用してルシフェリンをオキシルシフェリンに変換し、この反応は検出及び分析される光を生成する。

使用することができるＤＮＡシーケンシング技術の別の例は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カールスバッド、カリフォルニア州）製のＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓによるＳＯＬｉＤ（商標）技術である。ＳＯＬｉＤ（商標）シーケンシングでは、ゲノムＤＮＡが断片に剪断され、アダプターが断片の５’及び３’末端に結合して断片ライブラリーを生成する。あるいは、アダプターを断片の５’及び３’末端にライゲートし、断片を環状化し、環状化された断片を消化して内部アダプターを生成し、得られた断片の５’及び３’末端にアダプターを結合させて、マット対ライブラリーを生成することによって、内部アダプターを導入することができる。次に、クローンビーズ集団を、ビーズ、プライマー、鋳型及びＰＣＲ成分を含有するマイクロリアクタ中で調製する。ＰＣＲの後、鋳型を変性させ、ビーズを濃縮して、伸長した鋳型を有するビーズを分離する。選択されたビーズ上の鋳型は、スライドガラスへの結合を可能にする３’修飾を受ける。配列は、部分的にランダムなオリゴヌクレオチドと、特定のフルオロフォアによって同定される中央の決定された塩基（又は塩基対）との連続的なハイブリダイゼーション及びライゲーションによって決定することができる。色を記録した後、ライゲーションしたオリゴヌクレオチドを除去し、次いでプロセスを繰り返す。

使用することができるＤＮＡシーケンシング技術の別の例は、例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州）によってＩｏｎ ＴｏｒｒｅｎｔによりＩＯＮ ＴＯＲＲＥＮＴの商標で販売されているシステムを使用するイオン半導体シーケンシングである。イオン半導体シーケンシングは、例えば、Ｒｏｔｈｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｄｅｖｉｃｅ ｅｎａｂｌｉｎｇ ｎｏｎ－ｏｐｔｉｃａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ ４７５：３４８－３５２（２０１１）、米国特許出願公開第２０１０／０３０４９８２号、米国特許出願公開第２０１０／０３０１３９８号、米国特許出願公開第２０１０／０３００８９５号、米国特許出願公開第２０１０／０３００５５９号、及び米国特許出願公開第２００９／００２６０８２号に記載されており、これらの各々の内容は、参照によりその全体が組み込まれる。

使用することができるシーケンシング技術の別の例は、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングである。Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングは、折り返しＰＣＲ及びアンカープライマーを用いた固体表面上のＤＮＡの増幅に基づく。ゲノムＤＮＡを断片化し、断片の５’及び３’末端にアダプターを付加する。フローセルチャネルの表面に結合したＤＮＡ断片は伸長され、架橋増幅される。断片は二本鎖になり、二本鎖分子は変性する。固相増幅の複数のサイクルとそれに続く変性によって、フローセルの各チャネルに同じ鋳型の一本鎖ＤＮＡ分子の約１０００個のコピーからなるクラスターを数百万個作成することができる。プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及び４つのフルオロフォア標識された可逆的に終端するヌクレオチドを使用して、連続的なシーケンシングを行う。ヌクレオチド取り込み後、レーザーを使用してフルオロフォアを励起し、画像を取り込み、第１の塩基のアイデンティティを記録する。組み込まれた各塩基からの３’ターミネーター及びフルオロフォアを除去し、組み込み工程、検出工程及び同定工程を繰り返す。この技術によるシーケンシングは、米国特許第７，９６０，１２０号、米国特許第７，８３５，８７１号、米国特許第７，２３２，６５６号、米国特許第７，５９８，０３５号、米国特許第６，９１１，３４５号、米国特許第６，８３３，２４６号、米国特許第６，８２８，１００号、米国特許第６，３０６，５９７号、米国特許第６，２１０，８９１号、米国特許出願公開第２０１１／０００９２７８号、米国特許出願公開第２００７／０１１４３６２号、米国特許出願公開第２００６／０２９２６１１号、及び米国特許出願公開第２００６／００２４６８１号に記載され、これらの各々は、参照によりその全体が組み込まれる。

使用することができるシーケンシング技術の別の例としては、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（メンロパーク、カリフォルニア州）の単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）技術が挙げられる。ＳＭＲＴでは、４つのＤＮＡ塩基のそれぞれが、４つの異なる蛍光色素のうちの１つに結合される。これらの染料は、ホスホリンク（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｎｋｅｄ）されている。単一のＤＮＡポリメラーゼは、ゼロモード導波路（ＺＭＷ）の底部に一本鎖の鋳型ＤＮＡの単一分子で固定化される。伸長している鎖にヌクレオチドを組み込むのに数ミリ秒かかる。この間、蛍光標識が励起されて蛍光シグナルが発生し、蛍光タグが切断される。色素の対応する蛍光の検出が、組み込まれた塩基を表示する。このプロセスが繰り返される。

使用することができるシーケンシング技術の別の例は、ナノポアシーケンシング（Ｓｏｎｉ＆Ｍｅｌｌｅｒ，２００７，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｔｏｗａｒｄ ｕｌｔｒａｆａｓｔ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｕｓｉｎｇ ｓｏｌｉｄ－ｓｔａｔｅ ｎａｎｏｐｏｒｅｓ，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５３（１１）：１９９６－２００１）である。ナノポアは、直径１ナノメートル程度の小さな孔である。ナノポアを導電性流体に浸漬し、それを横切る電位を印加すると、ナノポアを通るイオンの伝導に起因してわずかな電流が生じる。流れる電流の量は、ナノポアのサイズの影響を受ける。ＤＮＡ分子がナノポアを通過するとき、ＤＮＡ分子上の各ヌクレオチドは、異なる程度でナノポアを塞ぐ。したがって、ＤＮＡ分子がナノポアを通過するときのナノポアを通過する電流の変化は、ＤＮＡ配列の読み取りを意味する。

使用することができるシーケンシング技術の別の例は、化学感応性電界効果トランジスタ（ｃｈｅｍＦＥＴ）アレイを使用してＤＮＡをシーケンシングすること（例えば、米国特許出願公開第２００９／００２６０８２号に記載されているように）を含む。この技術の一例では、ＤＮＡ分子を反応チャンバ内に配置することができ、鋳型分子をポリメラーゼに結合したシーケンシングプライマーにハイブリダイズさせることができる。１つ又は複数の三リン酸がシーケンシングプライマーの３’末端で新しい核酸鎖へ組み込まれたことを、ｃｈｅｍＦＥＴが電流の変化によって検出することができる。アレイは、複数のｃｈｅｍＦＥＴセンサを有することができる。別の例では、単一の核酸をビーズに結合させることができ、核酸をビーズ上で増幅させることができ、個々のビーズをｃｈｅｍＦＥＴアレイ上の個々の反応チャンバに移すことができ、各チャンバはｃｈｅｍＦＥＴセンサを有し、核酸を配列決定することができる。

使用することができるシーケンシング技術の別の例は、例えば、Ｍｏｕｄｒｉａｎａｋｉｓ，Ｅ．Ｎ．ａｎｄ Ｂｅｅｒ Ｍ．，ｉｎ Ｂａｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ＩＩＩ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ ｇｕａｎｉｎｅ－ｌａｂｅｌｅｄ ＤＮＡ，ＰＮＡＳ ５３：５６４－７１（１９６５）に記載されているように電子顕微鏡の使用を含む。この技術の一例では、個々のＤＮＡ分子は、電子顕微鏡を用いて識別可能な金属標識を用いて標識される。次いで、これらの分子を平らな表面に伸ばし、電子顕微鏡を用いて画像化して配列を測定する。

配列リード：シーケンシングにより複数のリードが得られる。リードは、一般に、約１５０塩基長未満、又は約９０塩基長未満のヌクレオチドデータの配列を含む。特定の実施形態では、リードは、約８０～約９０塩基長、例えば、約８５塩基長である。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、非常に短いリード、すなわち、約５０又は約３０塩基長未満の長さのリードに適用される。配列リードデータは、配列データ及びメタ情報を含み得る。配列リードデータは、当業者に知られているように、例えば、ＶＣＦファイル、ＦＡＳＴＡファイル又はＦＡＳＴＱファイルなどの任意の適切なファイルフォーマットで保存することができる。

ＦＡＳＴＡは、元々、配列データベースを検索するためのコンピュータプログラムであったが、ＦＡＳＴＡという名称が標準ファイルフォーマットも指すようになった。Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，ＰＮＡＳ ８５：２４４４－２４４８を参照されたい。ＦＡＳＴＱフォーマットは、生物学的配列（通常はヌクレオチド配列）及びその対応する品質スコアの両方を記憶するためのテキストベースのフォーマットである。これはＦＡＳＴＡフォーマットに類似しているが、配列データの後に品質スコアを有する。配列字と品質スコアの両方は、簡潔にするために単一のＡＳＣＩＩ文字で符号化される。ＦＡＳＴＱフォーマットは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒなどのハイスループットシーケンシング装置の出力を保存するためのデファクトスタンダードである（Ｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｔｈｅ Ｓａｎｇｅｒ ＦＡＳＴＱ ｆｉｌｅ ｆｏｒｍａｔ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｉｔｈ ｑｕａｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅｓ，ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｏｌｅｘａ／Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＦＡＳＴＱ ｖａｒｉａｎｔｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３８（６）：１７６７－１７７１）。

本発明の特定の実施形態は、配列リードのアセンブリを提供する。アライメントによるアセンブリでは、例えば、リードは互いに又は参照に対してアライメントされる。各リードを、参照ゲノムに対してアライメントすることによって、すべてのリードが、互いに関連して配置されてアセンブリが生成される。加えて、配列リードの参照配列に対するアラインメント又はマッピングを用いて、配列リード内のバリアント配列を同定することもできる。本明細書に記載の方法及びシステムと組み合わせて、バリアント配列を同定することを用いて、さらに疾患又は状態の診断又は予後を支援するか、又は治療決定を導くことができる。

特定の実施形態では、配列リードは、選択領域のさらなる再編成を伴って、ヒト参照ゲノム（ｈｇ１９）に対してアラインメントされる。点変異、小さな挿入及び欠失からなる、ｃｆＤＮＡ中の候補腫瘍特異的変異は、目的のターゲット領域全体を使用して同定される。ヌクレオチド変化及びアミノ酸変化が、ＣＯＳＭＩＣデータベースで報告された２０例以上のがん症例で観察された変化と同一である場合、候補変化を体細胞ホットスポットと定義する。

対応する白血球のシーケンシングによって同定されなかったｃｆＤＮＡで検出された変化については、そのような変化が腫瘍由来である事後確率を、変化した対立遺伝子の頻度並びにｃｆＤＮＡ及びＷＢＣ配列の総カバレッジを使用してベイズ統計モデルから決定した。

コンピュータのプロセッサなどの処理システムは、バリアント計算分析を実行するためのコードを実行するために使用される。変異相関係数の群の分析は、ＷＢＣバリアントとｃｆＤＮＡで同定されたそれらの対応する変化との間の関連、並びにＷＢＣバリアントの数と年齢との間の関連について求められる。

ｃｆＤＮＡのシーケンシングによって同定されるがＷＢＣのシーケンシングによって同定されない変異については、変異が造血性であったモデルの確率に対して、変異が腫瘍由来であるモデルの確率が計算される。ｃｆＤＮＡ及びＷＢＣのシーケンシングにおける変化した変異を有するリードの観察された数のサンプリング分布は、その変異及び未知の確率シータにおける全カバレッジによってパラメータ化された二項分布である。この方法は、以下の実施例のセクションで詳細に説明する。

いくつかの実施形態では、処理システムは、１つ又は複数の異なるタイプのモデルを使用する。例えば、ベイジアン階層モデルは、候補バリアントを生成するために使用され得る多くの可能なモデルアーキテクチャの１つである。さらに、複数の異なるモデルがデータベースに格納されていてもよく、又はアプリケーションの事後訓練のために検索されてもよい。例えば、第１のモデルは、単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）ノイズ率をモデル化するように訓練され、第２のモデルは、挿入欠失ノイズ率をモデル化するように訓練される。さらに、処理システムは、モデルのパラメータを使用して、配列リードにおける１つ又は複数の真陽性の尤度を決定することができる。処理システムは、尤度に基づいて品質スコアを（例えば、対数スケールで）決定することができる。ジョイントモデルなどの他のモデルは、１つ又は複数のベイズ階層モデルの出力を使用して、異なる試料の配列リードにおけるヌクレオチド変異の予想ノイズを決定することができる。

いくつかの実施形態では、本発明のステップのいずれか又はすべてが自動化される。あるいは、本発明の方法は、１つ又は複数の専用プログラムで全体的又は部分的に具体化し得、例えば、それぞれを任意選択でＣ＋＋などのコンパイル言語で記述し、次いでコンパイルし、バイナリとして配布することができる。本発明の方法は、既存の配列分析プラットフォーム内のモジュールとして、又は既存の配列分析プラットフォーム内の機能を呼び出すことによって、全体的又は部分的に実装することができる。特定の実施形態では、本発明の方法は、単一の開始キュー（例えば、人間の活動、別のコンピュータプログラム、又は機械から供給されるトリガイベントのうちの１つ又は組み合わせ）に応答してすべてが自動的に呼び出されるいくつかのステップを含む。すなわち、本発明は、いずれかのステップ又はステップの任意の組み合わせがキューに応答して自動的に行われ得る方法を提供する。自動的とは、一般に、人間の入力、影響、又は相互作用を介在させないこと（すなわち、最初の、又は待ち行列前の人間の活動のみに応答すること）を意味する。

本明細書において提供するシステムのいずれかのいくつかの実施形態では、シーケンサーは次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を行うように構成される。いくつかの実施形態では、シーケンサーは、可逆的色素ターミネーターを用いた合成によるシーケンシングを使用した超並列シーケンシングを行うように構成される。他の実施形態では、シーケンサーは、ライゲーションによるシーケンシングを行うように構成される。さらに他の実施形態では、シーケンサーは、単一分子シーケンシングを行うように構成される。

実施例１：がんを有する患者の治療応答の予測のための、対応する白血球及び無細胞のＤＮＡ分析
本実験では、対応するｃｆＤＮＡ及びＷＢＣのシーケンシングアプローチを適用して、切除可能な胃がんを有する患者の術前化学療法後及び手術後のｃｔＤＮＡ変化を正確に検出した。術前治療の完了後のｃｔＤＮＡの検出並びに手術後の微小残存病変の検出によって、集学的治療レジメンで治療された切除可能な胃がんを有する患者の再発及び生存を予測することができると仮説を立てた。全体として、これらの分析によって、ｃｔＤＮＡ変化をクローン造血に関連するｃｆＤＮＡバリアントと区別するための新しい戦略を評価し、手術前又は手術後のｃｔＤＮＡ除去が周術期治療に対する患者転帰の予測バイオマーカーとして機能し得るかどうかを調査した。

材料及び方法
実験研究の設計：本実験は、ＣＲＩＴＩＣＳ研究（ＮＣＴ００４０７１８６）からランダムに選択された、少なくとも２つの時点（図１Ａ、図５、表１）からのゲノム分析に利用可能で好適な血漿試料を有していた５０人の患者のｃｆＤＮＡ評価の予測値の計画された探索的分析である。ＣＲＩＴＩＣＳ研究は、切除可能な肺がんを有する患者の周術期化学療法（化学療法群）対術後化学放射線療法を伴う術前化学療法（化学放射線療法群）の研究者主導型非盲検多施設第ＩＩＩ相無作為化比較試験である（Ｃａｔｓ Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ １９，６１６－６２８，ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ１４７０－２０４５（１８）３０１３２－３（２０１８））。オランダ、スウェーデン及びデンマークの５６の病院からの合計７８８人の患者を前もって無作為化し、静脈内エピルビシン、シスプラチン又はオキサリプラチン及び経口カペシタビンの３回の術前２１日間サイクルと、これに続く静脈内エピルビシン、シスプラチン又はオキサリプラチン及び経口カペシタビンの３回の術後サイクルを受ける（化学療法群）か、又は、同じ術前レジメンと、これに続く毎日のカペシタビン及び毎週のシスプラチンと組み合わせた術後放射線療法を受ける（化学放射線療法群）（図１Ａ、図５、表１）ようにした。試験登録時のベースライン血液試料をｃｆＤＮＡと白血球の両方のターゲットディープシーケンシング（３００００倍）に使用し、続いて独立したバリアントコール、さらに、白血球フィルタリングアプローチを使用した腫瘍特異的変異の検出を行った（図１Ａ）。連続する時点からの腫瘍特異的変異を、ベースラインにおける同じ患者からの白血球シーケンシングデータを使用して同定した。

患者及び特徴：食道胃十二指腸内視鏡検査並びに胸部、腹部及び骨盤のＣＴによって評価したときに、患者が、組織学的に証明された胃腺がん（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ，６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎの定義による）のＩＢ－ＩＶＡ期（Ｇｒｅｅｎｅ，Ｆ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ：ＡＪＣＣ ｃａｎｃｅｒ ｓｔａｇｉｎｇ ｍａｎｕａｌ．６ｔｈ Ｅｄ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２））である場合に、それらの患者を試験に適格とした。胃食道接合部の腫瘍を有する患者は、腫瘍の大部分が主に胃の中に位置しており、その結果Ｓｉｅｗｅｒｔ ＩＩ型（真の胃食道接合部）腫瘍及びＩＩＩ型（心臓下胃）腫瘍からなり得るときに登録することを許可した。Ｓｉｅｗｅｒｔ Ｉ型（遠位食道）腫瘍を有する患者は適格としなかった。術前ＣＴスキャンが腹膜がん腫症を示唆した場合、探索的腹腔鏡検査が適応された。患者の登録及びゲノム研究は、ヘルシンキ宣言に従って行われ、施設内審査委員会（ＩＲＢ）によって承認され、すべての患者から、研究目的での試料取得に関する書面によるインフォームドコンセントを得た。

応答、ミスマッチ修復状態及びＥＢＶ状態の判定の病理学的評価：各患者の切除標本から病理スライドを採取し、ＮＣＴｖＧによって集中的に再調査して、Ｌａｕｒｅｎの分類基準（Ｌａｕｒｅｎ，Ｐ．Ｔｈｅ Ｔｗｏ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｉｎ Ｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｇａｓｔｒｉｃ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ：Ｄｉｆｆｕｓｅ ａｎｄ Ｓｏ－Ｃａｌｌｅｄ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ－Ｔｙｐｅ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ａｎ Ａｔｔｅｍｐｔ ａｔ ａ Ｈｉｓｔｏ－Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ａｃｔａ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ ｅｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ ６４，３１－４９（１９６５））に従って組織学的サブタイプを確認した。組織病理学的退縮を、Ｍａｎｄａｒｄの腫瘍退縮グレード（ＴＲＧ）システム、すなわち、ｉ）ＴＲＧ１、残存腫瘍なし（病理学的完全奏効）、ｉｉ）ＴＲＧ２、残った散在した腫瘍細胞、ｉｉｉ）ＴＲＧ３、線維症増殖性腫瘍、ｉｖ）ＴＲＧ４、腫瘍増殖性線維症、及び、ｖ）ＴＲＧ５、退行の組織学的徴候なし（表１）、に従ってＮＣＴｖＧによって決定した。エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）の検出のために、切除標本のＨ＆Ｅスライド上で腫瘍領域を画定した。十分な量の腫瘍組織の場合、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）の構築のために１つの腫瘍当たり３つのコアを採取した。ＴＭＡ切片を切断し、Ｅｐｓｔｅｉｎ－ＢａｒｒウイルスコードＲＮＡ ｉｎ－ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（ＥＢＥＲ－ＩＳＨ）に使用した。化学療法誘発性の病理学的完全奏効（ほぼ）のために切除標本に腫瘍がほとんど又は全く残っていない場合、診断生検標本に対してＥＢＥＲ－ＩＳＨを実施した。ＥＢＥＲ－ＩＳＨは、Ｕ ＩＮＦＯＲＭ ｉＶｉＥＷ Ｂｌｕｅ ＩＳＨ（ｖ１．０２．００２３）及びＩＮＦＯＲＭ ＥＢＥＲプローブを使用して、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ Ｕｌｔｒａ ＩＨＣ／ＩＳＨ染色モジュール（ロシュ・ダイアグノスティックス社、オランダ）で、製造業者のプロトコル（表１）に従って実施した。

診断生検標本からのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織ブロックをＭＳＩ分析に使用した。Ｈ＆Ｅスライド上で腫瘍領域を画定した。画定した腫瘍領域からＤＮＡを単離した。５つのほぼ単形のモノヌクレオチドマーカー（ＢＡＴ－２５、ＢＡＴ－２６、ＮＲ－２１、ＮＲ－２４、ＭＯＮＯ－２７）からなるＭＳＩ分析システム（ＭＳＩ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｓｙｓｔｅｍバージョン１．２、Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者の使用説明書に従って使用してＭＳＩ分析を行った。ＰＣＲ産物を、ＡＢＩ ３５００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国）を用いてキャピラリー電気泳動により分離し、Ｇｅｎｅ Ｍａｐｐｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国）を用いて解析した。対立遺伝子の正確なサイズ決定のために、また、ランツーラン変動を調整するために、ＰＣＲ試料に内部レーンサイズ標準を加えた。すべてのマーカーが安定している場合、腫瘍はマイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）と解釈した。１つのマーカーが不安定である場合、腫瘍をＭＳＩ－ｌｏｗ（ＭＳＩ－Ｌ）と解釈し、２つ以上のマーカーが不安定性を示した場合、ＭＳＩ－ｈｉｇｈ（ＭＳＩ－Ｈ）と解釈した。ＭＳＩ－Ｌ腫瘍をＭＳＳカテゴリーに含めた（表１）。

白血球からのｃｆＤＮＡ及びゲノムＤＮＡの試料調製及び次世代シーケンシング：全血をＫ２ＥＤＴＡチューブに採取し、アムステルダムのＶＵｍｃの中央病理研究室に送り、採取後１日以内に処理した。血漿及び細胞成分を、４℃の１．５ｍｌ微量遠心管中、１３００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって分離し、これをＤＮＡ抽出時まで－２０℃で保存した。Ｑｉａｇｅｎ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ）を使用して血漿からｃｆＤＮＡを単離し、ＬｏＢｉｎｄチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ）に溶出した。Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ）を使用して白血球から高分子量ＤＮＡを抽出し、続いて集束超音波装置（Ｃｏｖａｒｉｓ）を使用して剪断した。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ｃｆＤＮＡの濃度及び品質を評価した。蛍光強度に基づいて高分子量ＤＮＡの飽和濃度を有するｃｆＤＮＡ試料を実験から除外した。

ｃｆＤＮＡからの次世代シーケンシングライブラリー及び白血球からの剪断高分子量ＤＮＡを８．４ｎｇから２５０ｎｇで調製した（表２）。ゲノムライブラリーを以前に説明されているように調製した（Ｐｈａｌｌｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｒｌｙ－ｓｔａｇｅ ｃａｎｃｅｒｓ ｕｓｉｎｇ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ９，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｎ２４１５（２０１７））。端的に言えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ用ＮＥＢＮｅｘｔ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ［Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）］を、製造業者のガイドラインに対して、ｉ）ライブラリー精製工程でオンビーズＡｍｐｕｒｅ ＸＰアプローチを利用する、ｉｉ）オンビーズ戦略に適合するように試薬容量を適宜調整する、ｉｉｉ）８ｂｐバーコードを有する８つのユニークなＩｌｌｕｍｉｎａ二重インデックスアダプターのプールをライゲーション反応に使用する、及び、ｉｖ）ｃｆＤＮＡライブラリーをＨｏｔＳｔａｒｔ Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼで増幅する、といった４つの主要な変更を行った上で使用した。ゲノムライブラリーの調製を以前に説明されているように行った（Ｐｈａｌｌｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ９，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｎ２４１５（２０１７））。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ｃｆＤＮＡゲノムライブラリーの濃度及び品質を評価した。

製造業者のガイドラインに従って、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ試薬及び５８個の遺伝子をターゲットとするハイブリダイゼーションプローブのカスタムセット（表３）を使用して、ターゲット捕捉を行った。捕捉されたライブラリーを、ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いて増幅した。捕捉されたｃｆＤＮＡライブラリーの濃度及び品質をＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で評価した。ライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で１００ｂｐのペアエンドランを使用して配列決定した。

白血球フィルタリングアプローチを使用した次世代シーケンシングデータの一次処理及び推定体細胞変異の同定：ｃｆＤＮＡ及び白血球試料における配列変化の分析のための次世代シーケンシングデータの一次処理を以前に説明されているように行った（Ｐｈａｌｌｅｎ Ｊ．ｅｔ ａｌ．２０１７）。端的に言えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＣＡＳＡＶＡ（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）ソフトウェア（バージョン１．８）を、デュアルインデックスアダプターシーケンスの逆多重化及びマスキングに使用した。配列リードを、ＮｏｖｏＡｌｉｇｎを使用してヒト参照ゲノム（ｈｇ１９）に対してアライメントし、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ法を使用して選択領域をさらに再アライメントした（Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ７，２８３ｒａ２５３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａａ７１６１（２０１５））。

点変異、小さな挿入及び欠失からなる、ｃｆＤＮＡ中の候補腫瘍特異的変異を、前述のように目的のターゲット領域にわたってＶａｒｉａｎｔＤｘ（Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．２０１５）（Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して同定した（Ｐｈａｌｌｅｎ Ｊ．ｅｔ ａｌ．２０１７））。端的に言えば、（ｉ）３つの別個のペアリードがｃｆＤＮＡ中に変異を含み、血漿中の特定の変異を含む別個のペアリードの数が全別個のリードペアの少なくとも０．０５％であった場合、又は、（ｉｉ）１つの別個のペアリードがｃｆＤＮＡ中に変異を含み、その変異がまた少なくとも１つのさらなる時点において（ｉ）で指定されるレベルで検出された場合、（ｉｉｉ）ミスマッチ塩基又は小型インデルがベースラインにおいて１つの別個のリードのレベルで採取された試料の対応する白血球のシーケンシングデータにおいて同定されなかった場合（表９）、（ｉｖ）ミスマッチ塩基又は小型インデルがｄｂＳＮＰから誘導される一般的な生殖細胞系列バリアントのカスタムデータベースに存在しなかった場合、（ｖ）変化した塩基がパラロガス配列を含む誤って配置されたゲノムアラインメントから生じなかった場合、及び、（ｖｉ）変異がタンパク質コード領域内に入り、ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト又はスプライス部位の変化として分類された場合、にのみ、変化を候補体細胞変異と見なした。ヌクレオチド変化及びアミノ酸変化が、ＣＯＳＭＩＣデータベースで報告された２０例以上のがん症例で観察された変化と同一である場合、候補変化を体細胞ホットスポットと定義した。

統計分析：様々な方法を用いて有意性を判定した。ウィルコクソン順位和検定又はクラスカル・ワリス検定を連続変数について行い、フィッシャーの直接確率検定をカテゴリー変数について行った。変異群の分析は、パッケージのｍａｆｔｏｏｌｓ（Ｍａｙａｋｏｎｄａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｍａｆｔｏｏｌｓ：ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ２８，１７４７－１７５６，ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇｒ．２３９２４４．１１８（２０１８））を使用してＲで実施した。ＷＢＣバリアントとｃｆＤＮＡで同定されたそれらの対応する変化との間の関係、並びにＷＢＣバリアントの数と年齢との間の関係について相関係数を求めた。単変量生存分析及び多変量コックス比例ハザードモデルを、パッケージのｓｕｒｖｉｖａｌ及びｃｏｘｐｈｆ（ｃｒａｎ．ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）を使用してＲで行った。

ｃｆＤＮＡシーケンシングによって同定されたがＷＢＣシーケンシングによっては同定されなかった変異については、その変異が腫瘍由来であるというモデルの確率を、その変異が造血性であるというモデルの確率と比較して計算した。ｃｆＤＮＡ及びＷＢＣのシーケンシングにおける変化した変異を有するリードの観察された数のサンプリング分布は、その変異及び未知の確率シータにおける全カバレッジによってパラメータ化された二項分布である。腫瘍由来モデルの下では、ｔｈｅｔａ＿ＷＢＣは０であり、ｔｈｅｔａ＿ｐｌａｓｍａのみが未知である。造血モデルについては、ｔｈｅｔａ＿ＷＢＣとｔｈｅｔａ＿ｐｌａｓｍａは同じであると仮定する。ｔｈｅｔａ＿ｐｌａｓｍａの事前として、形状パラメータ２．４及び３４０のベータ分布を使用して、ｃｆＤＮＡシーケンシング及びＷＢＣシーケンシングの両方で変異が同定された試料において観察された変異対立遺伝子頻度の質量の大部分を大まかに中心に置いた。この事前は、３４０個の異なる分子当たり２．４個の変化したリードを有する試料に相当する。事前から多数のｔｈｅｔａをシミュレートして、シミュレートされた各ｔｈｅｔａの観測データの確率を計算した。これらの確率のエルゴード平均は、モデルを条件とするがｔｈｅｔａを条件としない観測データの尤度に近似する。事前オッズを１と仮定すると、事後オッズ（ＰＯ）はベイズ因子と同じであり、変異がＰＯ／（１＋ＰＯ）によって誘導される腫瘍である確率が得られた。この分析を、ｃｆＤＮＡシーケンシングによってのみ同定された各変異について実施した。

結果
本実験は、ＣＲＩＴＩＣＳ研究（ＮＣＴ００４０７１８６）、すなわち、切除可能な胃がんを有する患者の周術期化学療法（化学療法群）対術後化学放射線療法を伴う術前化学療法（化学放射線療法群）の研究者主導型非盲検多施設第ＩＩＩ相無作為化比較試験（Ｃａｔｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ １９，６１６－６２８，ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ１４７０－２０４５（１８）３０１３２－３（２０１８））からの患者のサブセットにおけるｃｔＤＮＡ評価の予測値の探索的分析であった。２００７年１月１１日～２０１５年４月１７日に、オランダ、スウェーデン及びデンマークの５６の病院からの合計７８８人の患者を前もって無作為化し、静脈内エピルビシン、シスプラチン又はオキサリプラチン及び経口カペシタビンの３回の術前２１日間サイクルと、これに続く静脈内エピルビシン、シスプラチン又はオキサリプラチン及び経口カペシタビンの３回の術後サイクルを受ける（化学療法群）か、又は、同じ術前レジメンと、これに続く毎日のカペシタビン及び毎週のシスプラチンと組み合わせて放射線を受ける（化学放射線療法群）ようにした（図１Ａ、図５、表１）。

原理証明研究として、ゲノム分析に利用可能な血漿試料を複数の時点で有していたオランダの５０人の治療経験のない患者から得た対応するｃｆＤＮＡ及びＷＢＣの試料を配列決定して分析し、ｃｔＤＮＡの腫瘍特異的変異を検出した（図１Ａ、図５、表１）。目標は、術前療法後のｃｔＤＮＡ評価及び治癒を目的とした手術後の微小残存病変分析に基づいて生存転帰を予測することであった。解析した患者のうち、２４人はＬａｕｒｅｎ分類によるびまん性サブタイプを有し、２４人はＬａｕｒｅｎ分類による腸型サブタイプを有し、１人は腺扁平上皮がん（図１Ｂ、表１）と診断された。２１人の患者を遠位胃切除術で、１７人を全胃切除術で、４人を食道心筋切除術で、１人を近位胃切除術で外科治療を行った（図１Ｂ、表１）。治療登録時の当初の適格性にもかかわらず、６人の患者が試験開腹中に進行疾患の証拠を示し、外科的切除を受けなかった。さらなる１人の患者は、理由は不明であるが外科治療を受けなかった。術前療法後の組織病理学的退縮を、Ｍａｎｄａｒｄの腫瘍退縮グレード（ＴＲＧ）に従って決定した。３人の患者が手術時の３サイクルの術前化学療法後に完全な退縮を達成し（ＴＲＧ１）、一方、１０人、１５人、１３人、及び２人の患者がそれぞれ病理病期Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶを示した（図１Ｂ、表１）。３サイクルの術前化学療法後の切除標本の病理学的評価を中心に検討すると、２０人の患者がリンパ節転移の証拠を有しておらず（ｙｐＮ０）、一方で、ｙｐＮ１の１０人の患者（３人のｙｐＮ１ｍｉを含む）、ｙｐＮ２の７人の患者及びｙｐＮ３の６人の患者を含む２３人の患者がリンパ節浸潤を有していることがわかった（表１）。２６人の患者がシスプラチン及びカペシタビンと組み合わせた放射線による術後治療を受け、２４人の患者が手術後に放射線なしで３サイクルのエピルビシン、シスプラチン及びカペシタビンによる術後治療を受けた（図１Ｂ、表１）。

各患者について、試験登録時（ベースライン時点）、患者が３サイクルの術前化学療法を受けた後（術前時点）、及び手術後であるがアジュバント治療の開始前（術後時点）に血漿及びバフィーコートを採取した（図１Ａ、表１及び表２）。ｃｆＤＮＡ及びＷＢＣの並行ディープシーケンシングによる組織分析とは無関係の循環中の腫瘍特異的変化を同定し、続いてｃｆＤＮＡ変化を同定し、ＷＢＣで検出された造血関連変化を除去するアプローチを開発した（図１Ａ）。ｃｆＤＮＡ及びＷＢＣのシーケンシング分析のために、次世代ディープシーケンシングアプローチを使用して、５８個のがんドライバー遺伝子を評価した（図１Ａ、表３、表４、表５）。この方法では、ＤＮＡ断片のターゲット捕捉及びディープシーケンシング（３０，０００倍超）に基づいて、８０，９３０ｂｐのコード遺伝子領域にわたるｃｆＤＮＡにおける単一塩基置換や小さな挿入又は欠失を、ＰＣＲ増幅及びシーケンシングのアーチファクトと区別しながら同定する（Ｐｈａｌｌｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．ＳｃｉＴｒａｎｓｌＭｅｄ９，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｎ２４１５（２０１７））。対応する白血球のシーケンシングによって同定されなかったｃｆＤＮＡで検出された変化については、そのような変化がベイズ統計モデルに由来する腫瘍である事後確率を、変化した対立遺伝子の頻度並びにｃｆＤＮＡ及びＷＢＣ配列の総カバレッジを使用して決定した。

胃がんにおけるシーケンシングアプローチの検出の理論的感度を推定するために、５８個の分析された遺伝子のうちの１つ又は複数に変化を有するＴＣＧＡ Ｐａｎ－Ｃａｎｃｅｒ Ａｔｌａｓ（Ｈｏａｄｌｅｙ，Ｋ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ－ｏｆ－Ｏｒｉｇｉｎ Ｐａｔｔｅｒｎｓ Ｄｏｍｉｎａｔｅ ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ １０，０００ Ｔｕｍｏｒｓ ｆｒｏｍ ３３ Ｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ １７３，２９１－３０４ ｅ２９６，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１８．０３．０２２（２０１８））における胃腺がんの割合を求めた。これらの分析から、４３６人の胃がん症例のうち３８４人がこれらの遺伝子の少なくとも１つの変化を有したことから、本発明者らのターゲットパネルが約８８％の感度を有することがわかった（図６）。全体として、ベースラインでの変異対立遺伝子分率の中央値レベルは、びまん性サブタイプと比較した場合に、腸型サブタイプを有する患者で有意に高いことが観察された（０．２９５％対０％、ｐ＝０．０１５、ウィルコクソン順位和検定）（図７Ａ）。高分化腫瘍、中分化腫瘍又は低分化腫瘍の間で変異対立遺伝子分率のレベルの間に統計学的に有意な差はなかった（ｐ＝０．０７、クラスカル・ワリス検定）（図７Ｂ）。この実験では、腸腺がん及びびまん性胃腺がんを有する患者は、同様の無イベント生存率（表１、図７Ｃ）及び全生存率（表１、図７Ｄ）を示した。元の試験の所見（Ｃａｔｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ １９，６１６－６２８，ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ１４７０－２０４５（１８）３０１３２－３（２０１８））と一致して、患者を無作為化した術後治療群に関連する生存転帰に有意差は観察されなかった（表１、図７Ｅ及び図７Ｆ）。

クローン造血の検出及び腫瘍特異的変化の同定：ベースラインで、また３サイクルの術前化学療法後に、５０人の患者全員のｃｆＤＮＡを評価した。ベースラインで、４０人の患者（８０％）から得られたｃｆＤＮＡにおいて配列変化が検出され（図２Ａ、表６）、３１人の患者（６２％）から得られたＷＢＣにおいて配列変化が検出された（図２Ｂ、表７）。ｃｆＤＮＡデータからＷＢＣ由来の変化を除去した後、２７人の患者（５４％）において腫瘍特異的である可能性が高い５４の変化が検出された（図２Ｃ、表８）。ＷＢＣで検出された最も頻繁に変化した遺伝子は、ＤＮＭＴ３Ａ（４５％）、ＴＰ５３（２９％）、ＥＧＦＲ（１０％）、ＡＰＣ（６％）、ＡＲ（６％）、ＡＴＭ（６％）、及びＭＬＨ１（６％）であったが、ｃｔＤＮＡで検出された最も頻繁に変化した遺伝子は、ＴＰ５３（２２％）、ＭＹＣ（１５％）、ＰＩＫ３ＣＡ（１５％）、ＫＲＡＳ（１１％）、ＨＲＡＳ（１１％）、ＢＲＡＦ（１１％）、ＡＬＫ（１１％）、ＡＴＭ（１１％）、ＫＩＴ（１１％）、及びＣＤＨ１（７％）であった（図２Ｂ及び図２Ｃ、表８）。ＴＣＧＡによって提案された胃腺がんの分子分類（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｎ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｓｔｒｉｃ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｎａｔｕｒｅ ５１３，２０２－２０９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３４８０（２０１４））に従って、ＥＢＶ陰性（ｎ＝３６）及びＭＳＳ腫瘍（ｎ＝３７）における頻度（３％）と比較して、ＥＢＶ陽性（ｎ＝３）又はＭＳＩ高腫瘍（ｎ＝２）を有する患者の血液においてＰＩＫ３ＣＡ変異の頻度がより高いこと（６０％）が見出された。４３個のＷＢＣ由来バリアントの中の変異対立遺伝子分率の中央値は０．３１％（ＩＱＲ０．１８％～０．６３％）であり、これはｃｆＤＮＡで同定された５３個の腫瘍特異的バリアントの中の変異対立遺伝子分率の中央値（０．３１％、ＩＱＲ０．２０％～０．５５％、ｐ＝０．９６、ウィルコクソン順位和検定）と同様であった（図２Ｄ）。ＷＢＣにおける変異対立遺伝子分率のレベルとｃｆＤＮＡにおける対応する変化のレベルとの間に高い相関が観察された（ピアソン相関係数＝０．９１）（図２Ｅ）。ＷＢＣで検出された変化の数は、年齢と共に増加した（ｒ^２＝０．３６、指数相関）（図２Ｆ）。

１７個のミスセンス変異、２個のナンセンス変異、１個のインフレーム欠失及び１個のスプライス部位変異を含む２１個の配列変化がｃｆＤＮＡ中のＴＰ５３において観察された（図２Ｇ、表６）。ＴＰ５３で観察されたｃｆＤＮＡ配列の変化のうち、１５がＷＢＣ配列で同定され、また、対応するｃｆＤＮＡに存在しなかった３つの変化がＷＢＣにおいて同定された（図２Ｇ、表７）。ベースラインでｃｆＤＮＡ中に最初に検出された２１個のＴＰ５３変化から、停止変化を有する２つ（Ｑ１９２＊及びＳ１６６＊）及び４つのミスセンス変異（Ｒ１７５Ｈ、Ｖ２１６Ｍ、Ｎ２３９Ｓ、Ｒ２４８Ｗ）を含む６つのみが腫瘍特異的変異として同定された。ｃｆＤＮＡにおいて検出された２１個のＴＰ５３変化の断片長分布をさらに評価した。循環中に腫瘍特異的ＴＰ５３変異を有する断片は、クローン造血に関連するＴＰ５３バリアントを有する断片、並びに野生型ＴＰ５３コード領域を有する断片（ｐ＜０．００１、コルモゴロフ－スミルノフ検定）よりも有意に短いことが観察された（ｐ＜０．００１、コルモゴロフ－スミルノフ検定）（図２Ｈ；表７、８及び９）。興味深いことに、ＷＢＣバリアントは、ｃｆＤＮＡに腫瘍特異的変化を全く有しない１１人の患者で分析した複数の時点でＤＮＭＴ３Ａ、ＴＰ５３、ＥＲＢＢ４、ＭＬＨ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＦＧＦＲ３、ＥＳＲ１、ＩＤＨ２、及びＡＴＭで検出された（図８Ａ～図８Ｋ）。全体として、ベースラインでのＷＢＣバリアント又は腫瘍由来ｃｔＤＮＡバリアントの検出は、無イベント生存率又は全生存率において統計学的に有意な差を明らかにしなかった（図９Ａ～図９Ｄ）。

術前ｃｔＤＮＡは、胃がんにおける病理学的応答の代用バイオマーカーである：先に示したｃｆＤＮＡ及びＷＢＣの並列シーケンシングを使用してｃｔＤＮＡ変化を同定した後、術前化学療法の前後にｃｔＤＮＡレベルを評価した。ベースラインにおいて又はＷＢＣ配列変化のフィルタリング後の術前時点で、測定可能なｃｔＤＮＡを有する３０人の患者のうち（図２Ｃ）、１１人が全身治療の９週間後にｃｔＤＮＡレベルの完全な消失を示した（図１０Ａ～図１０Ｑ及び図１１Ａ～図１１Ｋ、表５）。一例として、診断時に腸型サブタイプ胃腺がんを示した患者ＣＧＳＴ３３は、ＴＰ５３ Ｑ１９２＊及びＥＲＢＢ２ Ｒ７５６Ｃｆｓ＊２についてそれぞれ２．３２％及び０．６４％の変異対立遺伝子分率濃度を有し、これらは術前時点で完全に排除された。このｃｔＤＮＡの低下は、手術時に得られた検体における大きな病理学的応答（ＴＲＧ２）に連動して生じた（図３Ａ）。対照的に、１９人の患者は術前時点で検出可能なｃｔＤＮＡを有しており（図１０Ａ～図１０Ｑ及び図１１Ａ～図１１Ｋ、表５）、一例として、患者ＣＧＳＴ１１０では、ベースラインでＥＲＢＢ４ Ｔ６３９Ｍについて０．１５％の変異対立遺伝子分率であり、術前時点で０．１２％の変異対立遺伝子分率であった（図３Ｂ）。この患者は、全身治療の９週間後に腫瘍退縮を示さず（ＴＲＧ５）、最終的に初期診断から３５ヶ月後に再発性疾患で死亡した（表１）。

術前化学療法後、７人のレスポンダーが同定され、そのうち３人が完全な病理学的応答に達し（ＴＲＧ１）、４人が大きな病理学的応答を達して、腫瘍細胞が散在する線維性外科標本を示した（ＴＲＧ２）。７人のレスポンダーはすべて、術前の時点でｃｔＤＮＡが検出されなかった（図３Ｃ）。より低い程度の腫瘍退縮（ＴＲＧ３～５）及び少なくとも１つの関与リンパ節（ｙｐＮ１、ｙｐＮ２、及びｙｐＮ３）を有する患者は、術前時点で検出可能なｃｔＤＮＡをより頻繁に示した（図３Ｃ、図１２Ａ）。対照的に、術前時点でのｃｔＤＮＡの欠如は、手術時の大きな病理学的退縮（ＴＧＲ１～２）と有意に関連していた（ｐ＝０．０３、フィッシャーの正確確率検定）（図３Ｄ）。予想した通り、再発はまた、より低い程度の病理学的応答（ｐ＝０．０３、フィッシャーの正確確率検定）（図３Ｅ）、少なくとも１つの関与リンパ節（ｐ＝０．００２、フィッシャーの正確確率検定）（図３Ｆ）、及び術前時点での検出可能なｃｔＤＮＡ（ｐ＝０．０２、フィッシャーの正確確率検定）に関連していた（図３Ｇ）。ＴＲＧスコア（ＴＲＧ１～２対ＴＲＧ３～５）及び病理学的リンパ節状態（ｙｐＮ０対ｙｐＮ＋）は、生存転帰と強く関連していた（図１２Ｂ及び図１２Ｃ）。注目すべきことに、術前時点でのＷＢＣ配列のフィルターなしでｃｆＤＮＡ中の変異を検出しても、再発（図３Ｈ）又は死亡（図１３Ａ）のリスクは予測されなかった。しかしながら、ＷＢＣ誘導造血フィルターを適用した場合、術前時点で検出されたｃｔＤＮＡは、有意に高い再発リスク及びより短い無イベント生存期間の中央値（１８．４ヶ月対中央値未到達）（ログランクｐ＝０．０１２、ＨＲ＝３．０、９５％ＣＩ＝１．３～６．９）（図３Ｉ）並びに高い死亡リスク及びより短い全生存期間の中央値（２８．７ヶ月対中央値未到達）（ログランクｐ＝０．０３、ＨＲ＝２．７、９５％ＣＩ＝１．１～６．７）（図１３Ｂ）に関連することが観察された。

微小残存病変は胃がんにおける手術後の生存転帰を予測する：ＷＢＣフィルタリングアプローチを使用して、手術後の時点から入手可能な血液試料を用いて２０人の患者全員から得られた手術後の微小残存病変を評価した。手術後の中央値６．５週間で血液試料を採取した（表１）。大きな腫瘍応答（ＴＲＧ１及びＴＲＧ２）を有する４人の患者について、術後の時点で、ｃｆＤＮＡにおける腫瘍特異的変異の完全な排除が観察され、例えば患者ＣＧＳＴ３２は、ＢＲＡＦ Ｇ４６９Ａ及びＫＲＡＳ Ｇ１３Ｒのそれぞれについて０．６５％及び０．２４％のベースライン変異対立遺伝子分率濃度を示した（図４Ａ）。この患者の２つのホットスポットｃｔＤＮＡ変異は、大きな腫瘍退縮（ＴＲＧ２）を示した外科標本評価と一致して、術前又は術後のいずれの時点においても検出されなかった（図４Ａ、表１及び表８）。対照的に、術後腫瘍特異的変異は軽度の病理学的腫瘍応答があった又は病理学的腫瘍応答がなかった１６人の患者のうち９人で検出され（ＴＲＧ３－５）、例えば患者ＣＧＳＴ６８は、ベースライン時点でＨＲＡＳ Ｄ５４Ｅｆｓ＊５３フレームシフト変異について０．０３％の変異対立遺伝子分率を示した。この患者は、術前及び術後の時点でＨＲＡＳの変異対立遺伝子分率の漸進的増加を示し、その後、手術後に０．１６％の変異対立遺伝子分率で検出されるＥＲＢＢ４ Ｄ１１８４＊が出現した（図４Ｂ、表１及び表８）。中央値４２ヶ月の追跡期間後、術後時点で検出可能な腫瘍特異的変異を有さない１１人の患者全員が生存しており、再発していないことが観察された（図４Ｃ、表１）。一方、術後の時点で検出可能な腫瘍特異的変異を有する９人の患者のうち６人が疾患再発を発症し、転移性疾患で死亡した（図４Ｃ、表１）。この場合も、手術後のＷＢＣフィルターなしのｃｆＤＮＡにおける変異の検出は、再発（図１４Ａ）又は死亡（図４Ｄ）を予測しなかった。対照的に、ＷＢＣ誘導造血フィルターの場合、検出可能な腫瘍特異的変異を有する患者では、手術後に有意により短い無イベント生存期間の中央値及びより高い疾患再発リスクが観察され（１８．７ヶ月対中央値未到達、ログランクｐ＜０．００１、ＨＲ＝２１．８；９５％ＣＩ＝３．９－１２３．１）（図１４Ｂ）、また、有意により短い全生存期間の中央値が観察された（２８．７対中央値未到達、ログランクｐ＜０．００１、ＨＲ＝２１．８、９５％ＣＩ＝３．９－１２３．１）（図４Ｅ）。

考察
胃がんに関連する高い死亡率は、治療の選択肢が限られている場合の発症時における進行疾患の有病率を反映している（Ｖａｎ Ｃｕｔｓｅｍ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ ３８８，２６５４－２６６４，ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ０１４０－６７３６（１６）３０３５４－３（２０１６））。根治的な集学的治療のアプローチの有用性にもかかわらず、患者のかなりの割合が、局所領域再発、腹膜再発、又は遠隔転移の結果として最終的に死亡する（Ｓｏｎｇｕｎ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ １１，４３９－４４９，ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ１４７０－２０４５（１０）７００７０－Ｘ（２０１０）、Ｂｉｃｋｅｎｂａｃｈ，Ｋ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ ２０，２６６３－２６６８，ｄｏｉ：１０．１２４５／ｓ１０４３４－０１３－２９５０－５（２０１３））。手術後の疾患再発のリスクを推定するための現在の方法のほとんどは、病理学的病期分類及び微視的残存疾患スコアシステムの評価に依存している（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ ９８，１５２１－１５３０，ｄｏｉ：１０．１００２／ｃｎｃｒ．１１６６０（２００３）、Ｓｍｙｔｈ，Ｅ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３４，２７２１－２７２７，ｄｏｉ：１０．１２００／ＪＣＯ．２０１５．６５．７６９２（２０１６）、Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．＆Ｂｅｃｋｅｒ，Ｋ．Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈｉｖ：ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ４７２，１７５－１８６，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００４２８－０１７－２２３２－ｘ（２０１８））。しかしながら、これらのアプローチ、特に腫瘍退縮等級スケールには、観察者間のばらつきや標準化の欠如など、いくつかの限界があり、それが日常の臨床診療においてこれらのアプローチの実施を困難にする。さらに、根治目的の手術後に残存する疾患を検出するための現在利用可能なイメージング方法及び血液タンパク質バイオマーカーは感度が低く、これにより胃がんにおける微小残存病変を評価するためのｃｔＤＮＡを分析する機会が与えられた。ここでは、術前化学療法の完了後並びに切除可能な胃がんを有する患者の手術後にｃｆＤＮＡの腫瘍特異的変異を検出するために、対応するｃｆＤＮＡ及び白血球の超高感度シーケンシングを使用して組織非依存性シーケンシングアプローチを開発した。

胃がんのための根治目的での根拠に基づく現在の周術期戦略は、周術期化学療法、術後化学放射線療法及び術後化学療法を包含する（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５５，１１－２０，ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ０５５５３１（２００６）．Ｍａｃｄｏｎａｌｄ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４５，７２５－７３０，ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ０１０１８７（２００１）、Ｓａｓａｋｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２９，４３８７－４３９３，ｄｏｉ：１０．１２００／ＪＣＯ．２０１１．３６．５９０８（２０１１））。しかしながら、これらの治療アプローチは、特に外科的切除後に患者のコンプライアンスが低いという問題を抱えている。切除可能な胃がんの周術期戦略を調査する最近公開された第ＩＩＩ相臨床試験では、毒性、疾患進行又は拒絶のために、患者の５０～６０％しか術後治療レジメンを完了することができなかった（Ｃａｔｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ １９，６１６－６２８，ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ１４７０－２０４５（１８）３０１３２－３（２０１８）、Ａｌ－Ｂａｔｒａｎ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ ３９３，１９４８－１９５７，ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ０１４０－６７３６（１８）３２５５７－１（２０１９））。周術期治療の恩恵は、現在、治療の術前部分から得られると考えられている。したがって、現在実施されているＣＲＩＴＩＣＳ－ＩＩ試験は、ネオアジュバント戦略に焦点を当てており、アジュバント治療を含んでいない（Ｓｌａｇｔｅｒ，Ａ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ １８，８７７，ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１２８８５－０１８－４７７０－２（２０１８））。しかしながら、微小残存病変が存在するがゆえにアジュバント治療を必要とする患者を選定する緊急の臨床的必要性が依然として存在する。ここでは、アジュバント戦略のために患者を選定することができるＭＲＤの検出のための新しいｃｔＤＮＡアプローチを本明細書に提示する。本明細書の知見は、将来の介入試験において手術後のｃｔＤＮＡ分析に基づくリアルタイムの微小残存病変の評価を検討し、アジュバント治療を必要とする患者を選定する意思決定プロセスにおいて臨床医を支援するためのこのようなアプローチの臨床的有用性を論じることの裏付けとなる。

本明細書の研究は、循環中のクローン造血に関連するｃｆＤＮＡ変化を検出するためにｃｆＤＮＡ及びＷＢＣの並行ディープシーケンシングを行うことの有用性を検討し、このアプローチを用いて真の腫瘍特異的変化を長期的に同定するための最初の研究である。このアプローチは、腫瘍組織（多くの場合、限られた範囲でしか入手することができず、その場合、腫瘍内の不均一性によってシーケンシング分析が妨げられる可能性がある）を必要とすることなくｃｔＤＮＡを直接同定することを可能にする。本明細書ではまた、Ｌａｕｒｅｎの腸型サブタイプを有する患者からの血漿試料が、びまん性サブタイプ腫瘍を有する患者と比較した場合に、より高い変異対立遺伝子分率と関連していることも実証された。

非侵襲性液体生検を使用するＭＲＤアッセイの開発における主な課題は、生物学的変異に関連するバックグラウンド変化から腫瘍特異的変異を区別することである。健康な個体におけるｃｆＤＮＡの大部分は、造血細胞から生じる（Ｍｏｓｓ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ９，５０６８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０１８－０７４６６－６（２０１８））。正常な老化は、無症候性個体におけるＣＨＩＰの形態の骨髄由来造血細胞における体細胞変異の蓄積に関連がある（Ｘｉｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０，１４７２－１４７８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．３７３３（２０１４））。ＣＨＩＰの結果として生じるＷＢＣ由来の変化は、ＴＰ５３及びＫＲＡＳのホットスポット変化で観察されるように、一般的ながんドライバー遺伝子で起こり得るので、ｃｆＤＮＡのキャラクタライゼーションに基づく液体生検分析を混乱させる可能性がある（Ｈｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２４，４４３７－４４４３，ｄｏｉ：１０．１１５８／１０７８－０４３２．ＣＣＲ－１８－０１４３（２０１８））。５０人の患者のコホートに示されるように、ＷＢＣフィルターを用いないｃｆＤＮＡ分析では、無イベント生存率及び全生存率の点で、周術期治療から恩恵を受ける患者を適切に同定することができなかった。

本明細書では、周術期化学療法で治療された切除可能な胃がんを有する患者の腫瘍特異的ｃｆＤＮＡ変化を検出するように設計された組織非依存的アプローチを適用して、治療反応を予測し、疾患再発のリスクが高い患者を同定することができることを報告した。病期ＩＩＩの非小細胞肺がんを有する患者の術前免疫チェックポイント遮断に対する応答を評価するための最近のｃｔＤＮＡ分析は、同様に、大きな病理学的応答を有する個体における循環中の劇的な分子応答を明らかにした（Ａｎａｇｎｏｓｔｏｕ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７９，１２１４－１２２５，ｄｏｉ：１０．１１５８／０００８－５４７２．ＣＡＮ－１８－１１２７（２０１９））。これらの結果は、治療に対する応答及び固形腫瘍における微小残存病変の評価のためにｃｔＤＮＡ分析を使用するパラダイムを強化する。本明細書のアプローチは、ｃｔＤＮＡの非侵襲的検出が胃がんを有する患者の早期リスクの階層化及び臨床試験における新規介入のための治療決定に有用であろうという証拠を提供する。

実施例２：バイオマーカーとして変異を同定するための非侵襲性白血球誘導液体生検アプローチを使用した、病期ＩＩ及びＩＩＩの結腸直腸がん患者における微小残存病変の早期発見及び検出
１２０万人を超える個人が結腸直腸がん（ＣＲＣ）と毎年診断され、６０８，０００人を超える死亡者が毎年発生しており、これは先進国において３番目に多いがんになっており、がん関連死亡において３番目に多い原因になっている（１、２）。ＣＲＣは、腫瘍が検出されて除去された初期段階では治癒可能であるが、多くの場合、この疾患は進行期まで症状なしに進展する（３、４）。高い罹患率及び死亡率は、あまり効果的でない外科的及び治療的介入しか利用できない末期での診断に関連がある。疾患の検出を末期から早期に移行させるための効果的なスクリーニング及び早期発見方法を開発することが急務である。現在、ＣＲＣスクリーニング及び遮断のための有効なバイオマーカーが不足している。大腸内視鏡検査はＣＲＣを同定する有用な手段であるが、この処置は侵襲的であり、熟練した医師を必要とし、費用及び労働力の必要性の点で医療システムに負担をかけ、定期的なスクリーニングに参加している米国人口のわずか約６４％でのみ準最適のコンプライアンスを有する（５）。ＣＥＡは再発のバイオマーカーであるが、スクリーニングには有用ではなく（６、７）、便潜血検査又はメチル化ＳＥＰＴ９検査などの他の実施し得る非侵襲的方法は、低いコンプライアンス及び特異性に悩まされている（８～１１）。早期結腸直腸がん患者の切除後の微小残存病変の検出は、現在の標準治療を超えて改善することができた。病期ＩＩのＣＲＣと診断された患者は外科的切除を受けるが、追加の治療を受けず、患者の２０％が５年以内に再発しており、これは、これらの患者が追加の治療から利益を得ることができることを示している（１２～１８）。ＣＲＣを有する病期ＩＩＩの患者は外科的切除及びアジュバント化学療法を受けるが、これらの個体のサブセットは手術単独で治癒する場合がある。

無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の分析に基づく非侵襲的液体生検方法の開発は、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）の高感度かつ特異的な直接検出を通じてＣＲＣ患者における切除後の微小残存病変の早期発見及び検出の機会を提供する。次世代シーケンシング技術は、先進的なバイオインフォマティクスと共に、ｃｔＤＮＡベースのアッセイを様々ながん型における遺伝子タイピングの第一線に導いてきたが、現在の研究はほとんどが末期がん患者に適用されているか、又は血液中の変異分析をガイドするために腫瘍組織シーケンシングを使用している（１９～２６）。がんのスクリーニング及び早期発見は、腫瘍の存在及び高い特異性についての事前知識なしに血液中のｃｔＤＮＡを直接検出することを必要とするが、依然として既存のアプローチは、血漿中で同定される造血変化のバックグラウンドに悩まされている。本発明者らはここで、病期ＩＩ及び病期ＩＩＩのＣＲＣ患者における微小残存病変の早期発見及び検出の場面における血漿中の腫瘍由来変化の検出のための白血球誘導液体生検アプローチを提示する。

本発明者らは、病期ＩＩ及びＩＩＩのＣＲＣ患者から生物検体を採取するためにオランダで進行中の有望な観察研究であるＭＥＤＯＣＣ－ＰＬＣＲＣ試験に登録された５２人の患者からの試料を分析した。患者は診断時にベースライン採血を受けており、治療未経験であった。現在の標準治療に基づいて、すべての病期ＩＩ及びＩＩＩの患者は外科的切除を受け、その間にゲノム分析のために腫瘍組織を採取した。切除後の液体生検を、患者が治癒する時間を見越して手術後１週間～１２週間の間に採取し、微小残存病変が同定された患者について、実施し得るアジュバント療法が有効である治療的介入の範囲を定義した。ベースラインの液体生検から白血球の供給源としてバフィーコートを採取した。

本発明者らは、まず、本発明者らが以前に開発した超ディープターゲットシーケンシングアプローチを使用して、この実験の５２人の患者からのベースライン及び切除後の液体生検を分析した（２７）。本発明者らは、少なくとも３つの異なるＤＮＡ分子に変異が存在し、３つの重複分子が同一の塩基変化を有する場合に、０．０５％の変異対立遺伝子分率に至るまで、変異を同定した（２７）。各液体生検は、他の試料で同定された変異の知識なしに、独立して分析した。合計で、両方の時点にわたって５２人の患者で１５２の変異が特定された（以下の表１）。４７人の患者の１２８の変異がベースラインで同定され、３８人の患者の７６の変異が切除後に同定された（以下の表１）。本発明者らは、血漿中の変化のサブセットが腫瘍由来である一方で、サブセットがクローン造血又は生殖細胞系列の変化に起因するという仮説を立てた。次に、本発明者らは、独立した超ディープターゲットシーケンシングを使用して５２人の患者由来の対応する白血球を分析して、少なくとも１つの異なるＤＮＡ分子に存在し、少なくとも３つの重複分子が同一の変異を有する変異を同定した。対応する白血球でも同定されたベースライン又は切除後の血漿中の変異をさらなる分析から除去し、造血又は生殖細胞系列の変化と見なした。血漿中の変異を腫瘍由来の変異に限定するために、保存的アプローチを取り、血漿分析と比較してはるかに深いレベルまで白血球中の変異をコールして、白血球中にわずか０．０１％の変異対立遺伝子分率で存在する変異を除去した。

白血球において同定された変異には、クローン造血において変化することが周知の遺伝子であるＤＮＭＴ３Ａのバリアント、並びにＴＰ５３、ＡＰＣ及びＫＲＡＳなどのがんドライバーとしてより一般的に考えられている遺伝子が含まれた。本発明者らは、白血球における変化及び切除後の血漿のベースラインにおける同じ変化の変異対立遺伝子分率が高度に相関していること（Ｒ^２＝０．９７）を見出した（図１５）。造血変異もまた、ベースラインの血漿試料及び切除後の血漿試料の両方に同様の変異対立遺伝子分率で存在する可能性があった。

対応する白血球でも同定された血漿からの変化を除去した後、２８人の患者の６５の変異がベースラインの血漿に残り、８人の患者の１３の変異が切除後の血漿に残った（以下の表１）。これらの変異の由来をさらに調査するために、本発明者らは、独立したターゲットシーケンシングを使用して対応する腫瘍組織を分析してバリアントを同定した。本発明者らは、２３人の患者（８２％）におけるベースラインでの６５の変異のうち５０の変異（７７％）が、対応する腫瘍において高レベル（１０％以上）で一致することを見出した（以下の表１）。腫瘍シーケンシングは早期発見の場面では不可能であるが、血漿変化と腫瘍変化との一致が確認されたことは、白血球誘導アプローチを用いた分析後に残存する変異の大部分が腫瘍由来であり、ＣＲＣの存在を示唆する可能性が高いことを示す。

血漿中の腫瘍由来変異の検出のための白血球誘導アプローチを使用して、本発明者らは、ベースラインでの５２人の患者から２８人（５４％）を検出し、切除後の５２人の患者から８人（１５％）を検出した（図１６）。腫瘍由来変異は、ベースラインで０．１％から６．１７％の範囲であり、切除後で０．０９％から４．０６％の範囲であった。クローン造血に由来する変異は、低い変異対立遺伝子分率でクラスター化され、２５％を超える生殖系列変化もまた、対応する白血球の分析を通じて明らかとなった（図１５及び図１６）。切除後に検出された微小残存病変を有する患者（ｎ＝８）について、本発明者らは、臨床的再発が実証されたかどうかを評価したが、分子的再発を有する８人の患者のいずれも、標準的なモニタリングを使用したところ再発性ＣＲＣを発症しなかった。患者の２０％が５年以内に再発するが、本発明者らのコホートの追跡期間はわずか２．５年にしか達しておらず、タイムラインが延びるにつれて患者が再発する可能性がある。

本発明者らは、バイオマーカーとして変異を同定するための非侵襲性の白血球誘導液体生検アプローチを使用することで病期ＩＩ及びＩＩＩの結腸直腸がん患者の微小残存病変の早期発見及び検出が実行可能であり、疾患を表す腫瘍由来の変異が同定されることを示した。白血球における変化の除去は、血漿分析を混乱させる生殖細胞系列及び造血の変化からなるバックグラウンドを除去するために必要な工程である。本発明者らのデータは、血漿変異と対応する腫瘍において同定されたものとの高い一致が、白血球において同定された白血球変化を除去することによってのみ達成され得ることを示唆する。全体として、白血球誘導液体生検分析は、早期発見及び疾患モニタリングの状況においてがんの非侵襲的検出の特異性を高める可能性を有する。

実施例２の参考文献
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実施例３．転移性肺がん患者の免疫療法との関連での応答モニタリングのための、対応する白血球ＤＮＡ誘導液体生検アプローチ
本発明者らは、ｃｔＤＮＡ分子応答が免疫療法との関連での臨床応答モニタリングに関することから、ｃｔＤＮＡ分子応答の正確な判定における本発明者らの対応する白血球ＤＮＡ誘導液体生検アプローチの臨床的有用性を試験した。非がん性造血細胞のサブクローナル集団に由来するｃｆＤＮＡ変異に対して、どのｃｆＤＮＡ変異が真に腫瘍由来であるかを見極めることは、年齢や（放射線及び化学療法などの）曝露と同様に、転移状態において必要不可欠であり、体細胞変異を含有する血球サブクローンはクローン的に増殖し得る^１～４。これらのクローン造血（ＣＨ）細胞の分解が、しばしばＴＰ５３などの固形がんドライバー遺伝子に存在し得る変異を含むｃｆＤＮＡをもたらし、その結果、液体生検の解釈を混乱させる^５～９。この目的のために、本発明者らは、免疫療法についてレスポンダーをノンレスポンダーから区別する際にｃｔＤＮＡ動態及びそれらの予測値を解釈するべく、本発明者らの対応する白血球ＤＮＡ誘導液体生検アプローチを組み込んだ^１０。

コホートの説明。本発明者らは、臨床転帰を予測するために、免疫療法を含むレジメンを用いた非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の全身治療時のｃｔＤＮＡ動態を探索しモデル化する実験を設計した（図１７ａ）^１０。長期にわたる血漿及び全血検体の有望な生物検体採取プロトコルを用いて、免疫療法（ＩＯ）を含むレジメンで治療された進行性又は転移性非小細胞肺がん患者を同定した。臨床的静脈穿刺が適応された時点で血漿及び全血検体を採取した。取得できる場合は、腫瘍組織を全エクソームシーケンシング（ＷＥＳ）のために採取した。放射線応答（ＲＥＣＩＳＴ１．１）、無増悪生存率及び全生存率（ＰＦＳ及びＯＳ）及び６ヶ月での永続的又は非永続的な臨床的利益（ＤＣＢ又はＮＤＢ）などの応答評価に加えて、病理組織、ＰＤ－Ｌ１状態、及び臨床組織ベースの腫瘍変異プロファイリング（ＴＭＰ）などの臨床的特徴を収集した。

（ｉ）ＩＯ治療又はｃｈｅｍｏ－ＩＯ治療の少なくとも１サイクルを受けた研究コホート、（ｉｉ）無細胞ＤＮＡシーケンシングのための評価可能な少なくとも２つの血漿試料を有した研究コホート、（ｉｉｉ）対応するＷＢＣのシーケンシングのために評価可能な少なくとも１つの全血試料を有した研究コホート、及び、（ｉｖ）治療開始時から死亡時に至るまで又は少なくとも６ヶ月間にわたって臨床的追跡を受けた研究コホートに含めるために合計３１人の患者を選定した。コホートには、主に喫煙歴（ｎ＝３１中２７）、病期ＩＶ（ｎ＝２８）、腺がん組織構造（ｎ＝２３）、及び治療カテゴリー全体にわたる陽性ＰＤ－Ｌ１腫瘍割合スコア（ＴＰＳ、ｎ＝２０）を有する患者が含まれた。

血漿バリアントの分類。本発明者らは、３１人の患者のコホートについて、１４２個の血漿無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）検体及び４６個の白血球ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）検体のディープターゲット誤差訂正シーケンシングを行った。２４人の患者において、治療前に、ベースライン試料について血漿ｃｆＤＮＡシーケンシングを完了した（範囲－２．６～０週間）。対応するＷＢＣのシーケンシングを２６人の患者で完了した。報告されたすべての試料について、５８個のがん関連遺伝子の領域を包含するターゲット捕捉ライブラリーを超高感度ターゲットシーケンシングに供し、続いて配列アラインメント、エラー訂正、及びバリアントコールを行った。３８個の遺伝子の合計１６０個のバリアントが血漿ｃｆＤＮＡにおいて検出され、２１個の遺伝子の６６個のバリアントがＷＢＣ ｇＤＮＡにおいて検出された（図１Ｂ）。これらの血漿ｃｆＤＮＡバリアントは、ＷＢＣバリアント又はｃｔＤＮＡバリアントとして分類された。対応する血漿ｃｆＤＮＡ及びＷＢＣ ｇＤＮＡが評価可能であった場合、ＷＢＣ ｇＤＮＡ中に検出された血漿バリアントをＷＢＣバリアントとして分類し、ｃｔＤＮＡバリアントとして除外した。この分類システムを使用すると、４６％の血漿バリアント（ｎ＝７４／１６０）が血漿中においてのみ見出された（図１Ｂ及び図１Ｃ）。血漿ｃｆＤＮＡバリアントのほぼ３分の１（３２％、ｎ＝５１／１６０）がＣＨバリアントと見なされ、ｃｆＤＮＡプールの多様性に関する本発明者らの以前の知見、及び分子応答の評価を混乱させ得るクローン造血変化を除去するための本発明者らの血漿／対応する白血球のペアのＤＮＡシーケンシングアプローチの重要性を確認した。（図１７Ｂ及び図１７Ｃ）。

図１７Ａに示すように、本発明者らは、免疫療法で治療された肺がん患者から一連の血液及び組織試料の採取を可能にする生物検体及び臨床メタデータ収集プロトコルを実施した。血漿及び対応する白血球ＤＮＡ試料をディープシーケンシングし、クローン造血バリアントを除去し、患者の臨床表現型についてｃｔＤＮＡ分子応答を解釈した。図１７Ｂ及び図１７Ｃに示すように、本発明者らは、クローン造血と標準的に関連しない遺伝子において白血球由来のｃｆＤＮＡ変異を見出し、ここで再度、ｃｆＤＮＡ変異が腫瘍由来であるかＣＨ由来であるかを決定するために対応する白血球ＤＮＡのディープシーケンシングが重要であることを強調する。

免疫療法に応答する患者について代表的な例が図１８に示されており、血漿の次世代シーケンシングによっていくつかのバリアントが検出され、ＣＨ由来カテゴリーと腫瘍由来カテゴリーに適切に分類され、これにより治療開始３週間後に分子応答の評価が可能になった。生殖細胞系列又はクローン造血由来バリアントではなく腫瘍由来バリアントのレベルの変化は、免疫チェックポイント遮断に対する効果を予測した（図２Ｃ及び図２Ｄ）。全体として、本発明者らのＩＯ治療コホートに関し、ｃｔＤＮＡ動態は、ＣＨ由来変異を除去した後にのみ臨床応答を正確に捕えた。

これらの知見と、対応する白血球ＤＮＡシーケンシング及び分析の重要性とをさらに探るために、本発明者らは、ＣＨ由来変異を除去した場合と除去しない場合のｃｔＤＮＡ分子応答の予測性能及び予後性能を調べた。図１９に示すように、ＣＨ由来バリアントを含めると、無増悪生存率及び全生存率を予測する際のｃｔＤＮＡ動態の臨床的有用性が完全に失われた。

図１９に示されるように、ＣＨ由来の変異及び生殖細胞系列の変異を含めると、ｃｔＤＮＡ分子応答を正確に判定することができず、ｃｔＤＮＡ動態は無増悪生存及び全生存と関連しなかった（上のパネル）。対照的に、対応する白血球ＤＮＡのディープシーケンシングを採用した場合、バリアントは腫瘍由来及びＣＨ由来のカテゴリーに正確に分類され、これにより、分子ｃｔＤＮＡレスポンダーとノンレスポンダーの区別が可能になった。フィルタリング後、ｃｔＤＮＡレスポンダーは、有意に長い無増悪生存及び全生存を有していた（下のパネル）。

実施例４：初期食道がん患者の免疫療法の文脈における応答モニタリングのための対応する白血球ＤＮＡ誘導液体生検アプローチ
本発明者らの対応する白血球ＤＮＡアプローチの重要性は、免疫チェックポイント阻害と化学放射線療法の併用で治療される初期食道がんの疾患モニタリングの場面においても例示される。本発明者らは、ネオアジュバント免疫療法及び同時化学放射線（ＣＡ２０９－９０６、ＮＣＴ０３０４４６１３）による治療を受けている食道／胃食道接合部（Ｅ／ＧＥＪ）がんを有する患者において、クローン動態をモニタリングし、病理学的応答を予測するための一連の液体生検の有用性を調べた。本発明者らは、ＣＡ２０９－９０６試験の一部として、ネオアジュバントであるニボルマブによる治療、その後のニボルマブ及び化学放射線並びに手術を受けている、手術可能な病期ＩＩ／ＩＩＩのＥ／ＧＥＪがんを有する１６人の患者からの７９個の一連の血漿試料及び対応する白血球ＤＮＡに対して、高ターゲット誤差訂正シーケンシングを使用して、高深度の次世代シーケンシングを行った。液体生検を、治療前、ネオアジュバントであるニボルマブの２サイクルのそれぞれの後、並びに手術直前の同時ニボルマブ及び化学放射線療法の直後に、患者１人当たり平均４つの時点について評価した。

同定された各血漿バリアントについて、本発明者らは、ディープ次世代シーケンシングによって、それらが対応する白血球ＤＮＡにも存在するかどうかを調べた。血漿及び白血球ＤＮＡで同定されたバリアントは、生殖細胞系列又はクローン造血に由来すると考え、分析からさらに除外した。１６人の患者のうち８人は、いずれの時点においても検出可能な循環腫瘍由来ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を有していた。さらに、８人の患者の血漿中に１３個のＣＨ由来変異が検出された。ＣＨ由来変異の数は、患者の年齢の増加と相関していた。対応する白血球シーケンシングとの比較によるＣＨ由来変異の同定及び除去は、血漿中の真の腫瘍由来変異の動態の正確な評価を可能にした。

代表的な例が図２０に示されており、ここでは、生殖細胞由来バリアント及びＴＰ５３ ＣＨ由来バリアントが対応する白血球ＤＮＡシーケンシング分析によって除外された場合にのみ、腫瘍由来ＴＰ５３ Ｇ２４５Ｓ変異によって捕捉されたｃｔＤＮＡ動態が、切除時に認められた腫瘍退縮（１０％残存腫瘍）と一致したプロットを示している。

フィルタリング後、最後の手術前の時点で検出可能なｃｔＤＮＡが３人の患者で見られ、２０％を超える残存腫瘍と関連していた（検出可能なｃｔＤＮＡがある場合又はない場合で、それぞれ５０％対２３％）。その後に手術前に検出不能になる１つ又は複数のより早い時点で検出可能なｃｔＤＮＡであるｃｔＤＮＡクリアランスは、５人の患者で生じ、病理学的応答の改善に関連していた（ｃｔＤＮＡクリアランスを有する患者の８０％が２０％以下の残存腫瘍を有し、疾患進行の証拠はなかった）。さらに、ｃｔＤＮＡクリアランスを有していなかった３人の患者のうち２人が後に疾患進行を発症した。

要約すると、上記のパートＩ～ＩＩＩに要約された本発明者らの新たなデータは、がんを有する患者の診断、残存疾患の検出及び応答モニタリングを含む管理のほぼすべての段階に適用可能であり、複数のがんの種類、疾患の病期及び治療状況に及ぶ、本発明者らの対応する血漿－白血球ＤＮＡシーケンシングアプローチの革新的な態様及び臨床的有用性に関するさらなる証拠を提供する。

実施例３及び実施例４の参考文献
１ Ｃｏｏｍｂｓ，Ｃ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｌｏｎａｌ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｎｏｎ－ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｃａｎｃｅｒｓ Ｉｓ Ｃｏｍｍｏｎ ａｎｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ａｄｖｅｒｓｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ．Ｃｅｌｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ２１，３７４－３８２ ｅ３７４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１７．０７．０１０（２０１７）。
２ Ａｃｕｎａ－Ｈｉｄａｌｇｏ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｕｌｔｒａ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ Ｈｉｇｈ Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｌｏｎａｌ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ Ａｄｕｌｔ Ｌｉｆｅ．Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ １０１，５０－６４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｊｈｇ．２０１７．０５．０１３（２０１７）。
３ Ｊａｉｓｗａｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｃｌｏｎａｌ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｄｖｅｒｓｅ ｏｕｔｃｏｍｅｓ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７１，２４８８－２４９８，ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１４０８６１７（２０１４）。
４ Ｚｉｎｋ，Ｆ．ｅｔａｌ．Ｃｌｏｎａｌ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ，ｗｉｔｈ ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｄｒｉｖｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，ｉｓ ｃｏｍｍｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｅｌｄｅｒｌｙ．Ｂｌｏｏｄ１３０，７４２－７５２，ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２０１７－０２－７６９８６９（２０１７）。
５ Ｌｅａｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ａｎａｌｙｓｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １１，５２５，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０２０－１４３１０－３（２０２０）。
６ Ａｂｂｏｓｈ，Ｃ．，Ｓｗａｎｔｏｎ，Ｃ．＆Ｂｉｒｋｂａｋ，Ｎ．Ｊ．Ｃｌｏｎａｌ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ：ａ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｎｏｉｓｅ ｉｎ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ａｎａｌｙｓｅｓ．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ：ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３０，３５８－３５９，ｄｏｉ：１０．１０９３／ａｎｎｏｎｃ／ｍｄｙ５５２（２０１９）。
７ Ｈｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｆａｌｓｅ－Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｐｌａｓｍａ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｄｕｅ ｔｏ Ｃｌｏｎａｌ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ：ａｎ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４，４４３７－４４４３，ｄｏｉ：１０．１１５８／１０７８－０４３２．ＣＣＲ－１８－０１４３（２０１８）。
８ Ｌｉｕ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｆ－ＤＮＡ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ：ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３０，４６４－４７０，ｄｏｉ：１０．１０９３／ａｎｎｏｎｃ／ｍｄｙ５１３（２０１９）。
９ Ｒａｚａｖｉ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ－ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｖａｒｉａｎｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２５，１９２８－１９３７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９１－０１９－０６５２－７（２０１９）。
１０ Ｍｕｒｒａｙ，Ｊ．ｅｔａｌ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｔｏ ｐｒｅｄｉｃａｔｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｆｉｒｓｔ－ｌｉｎｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３８，９５２５－９５２５（２０２０）。

（他の実施形態）
本発明をその詳細な説明と併せて説明してきたが、前述の説明は例示を意図しており、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではない。他の態様、利点、及び変更は、以下の特許請求の範囲内である。

本明細書で言及される特許及び科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本明細書で引用されるすべての米国特許及び公開又は未公開の米国特許出願は、参照により組み込まれる。本明細書で引用されるすべての公開された外国特許及び特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に引用されるアクセッション番号によって示されるＧｅｎｂａｎｋ及びＮＣＢＩの提出物は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で引用される他のすべての公開された参考文献、文書、原稿及び科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明を、その好ましい実施形態を参照しながら具体的に示し説明してきたが、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態及び詳細において様々な変更をなし得ることが当業者によって理解されるであろう。

Claims (39)

1. 対象の循環腫瘍ＤＮＡ中の胃腫瘍特異的変異を検出する方法であって、
   対象の全血の試料から得られた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）及び細胞ＤＮＡを含むゲノムＤＮＡのシーケンシングライブラリーを調製すること、
   参照ゲノム配列と比較して前記ｃｆＤＮＡ及び前記細胞ＤＮＡにおける配列変異を同定すること、
   前記ｃｆＤＮＡ及び前記細胞ＤＮＡの前記配列変異を比較すること、及びそれによって、
   胃腫瘍特異的変異を同定することを含む、方法。
2. 対象の循環腫瘍ＤＮＡ中の結腸直腸、肺及び／又は食道の腫瘍特異的変異を検出する方法であって、
   対象の全血の試料から得られた無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）及び細胞ＤＮＡを含むゲノムＤＮＡのシーケンシングライブラリーを調製すること、
   参照ゲノム配列と比較して前記ｃｆＤＮＡ及び前記細胞ＤＮＡにおける配列変異を同定すること、
   前記ｃｆＤＮＡ及び前記細胞ＤＮＡの前記配列変異を比較すること、及びそれによって、
   結腸直腸、肺及び／又は食道の腫瘍特異的変異を同定すること、を含む、方法。
3. 前記ｃｆＤＮＡが、前記対象の全血の血漿成分から得られる、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記細胞ＤＮＡが、前記対象の全血の白血球から得られる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. ｃｆＤＮＡ及び白血球ＤＮＡの両方で検出された配列特異的変異が腫瘍特異的変異として除外される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. ｃｆＤＮＡにおいて排他的に検出される配列特異的変異が腫瘍特異的変異として同定される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記腫瘍特異的変異ががんを示す、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記腫瘍特異的変異が胃がんを示す、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記腫瘍特異的変異が結腸直腸がんを示す、請求項２から７のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記腫瘍特異的変異が肺がんを示す、請求項２から７のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記腫瘍特異的変異が食道がんを示す、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
12. 変異が、ミスセンス変異、ナンセンス変異、欠失、挿入、スプライス変異又はそれらの組み合わせを含む、請求項６から１１のいずれか一項に記載の方法。
13. ｃｆＤＮＡ腫瘍特異的変異が、ＰＩＫ３ＣＡ、ＡＴＭ、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＢＲＡＦ、ＥＲＢＢ４、ＣＤＨ１、ＫＩＴ、ＭＹＣ、ＳＭＡＤ４、ＥＲＢＢ２、ＰＴＥＮ、ＥＧＦＲ、ＫＩＴ、ＣＤＫ４、ＪＡＫ２、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＲ、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＴＰ５３、ＨＲＡＳ、ＦＢＸＷ７、ＡＢＬ１、ＡＬＫ、ＣＴＮＮＢ１、ＡＰＣ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＪＡＫ２又はそれらの組み合わせを含む１つ又は複数の遺伝子において検出される、請求項６に記載の方法。
14. ｃｆＤＮＡ腫瘍特異的変異が、ＴＰ５３、ＭＹＣ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＡＬＫ、ＡＴＭ、ＫＩＴ、ＣＤＨ１又はそれらの組み合わせを含む１つ又は複数の遺伝子において検出される、請求項１３に記載の方法。
15. 胃がんに罹患している対象の臨床転帰を予測する方法であって、
    前記対象から全血試料を得ること、
    血漿及び細胞成分を分離して無細胞ＤＮＡ及び細胞ＤＮＡを得ること、
    前記無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）及び前記細胞ＤＮＡのシーケンシングライブラリーを調製すること、
    参照ゲノム配列と比較して前記ｃｆＤＮＡ及び前記細胞ＤＮＡにおける配列変異を同定すること、
    前記ｃｆＤＮＡ及び前記細胞ＤＮＡの前記配列変異を比較して配列変異ｃｆＤＮＡを同定すること、及びそれによって、
    胃がんに罹患している対象の臨床転帰を予測すること、を含む、
    方法。
16. 結腸直腸がん、肺がん及び／又は食道がんに罹患している対象の臨床転帰を予測する方法であって、
    前記対象から全血試料を得ること、
    血漿及び細胞成分を分離して無細胞ＤＮＡ及び細胞ＤＮＡを得ること、
    前記無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）及び前記細胞ＤＮＡのシーケンシングライブラリーを調製すること、
    参照ゲノム配列と比較して前記ｃｆＤＮＡ及び前記細胞ＤＮＡにおける配列変異を同定すること、
    ｃｆＤＮＡ及び細胞ＤＮＡの前記配列変異を比較して配列変異ｃｆＤＮＡを同定すること、及びそれによって、
    結腸直腸がん、肺がん及び／又は食道がんに罹患している対象の臨床転帰を予測すること、を含む、
    方法。
17. 前記細胞ＤＮＡが白血球から得られる、請求項１５又は１６に記載の方法。
18. ｃｆＤＮＡ及び白血球ＤＮＡの両方において検出される配列特異的変異が腫瘍特異的変異として除外される、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法。
19. ｃｆＤＮＡにおいて排他的に検出される配列特異的変異が腫瘍特異的変異として同定される、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の方法。
20. ｃｆＤＮＡにおける腫瘍特異的変異の検出が、前記対象における前記がんの再発の高いリスクを示す、請求項１９に記載の方法。
21. ｃｆＤＮＡにおける腫瘍特異的変異の検出ががん生存転帰を予測する、請求項１９に記載の方法。
22. 前記患者が術前又は術後療法を受けている、請求項１５から２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記術前又は術後療法が、化学療法、手術、放射線療法、免疫療法、腫瘍切除、ネオアジュバント療法、又はそれらの組み合わせを含む、請求項２２に記載の方法。
24. 治療前又は治療後にｃｆＤＮＡにおいて排他的に検出される変異の検出が残存腫瘍を示す、請求項１５から２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記腫瘍特異的変異が胃がんを示す、請求項１５から２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 変異が、ミスセンス変異、ナンセンス変異、欠失、挿入、スプライス変異又はそれらの組み合わせを含む、請求項２５に記載の方法。
27. ｃｆＤＮＡ腫瘍特異的変異が、ＰＩＫ３ＣＡ、ＡＴＭ、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＢＲＡＦ、ＥＲＢＢ４、ＣＤＨ１、ＫＩＴ、ＭＹＣ、ＳＭＡＤ４、ＥＲＢＢ２、ＰＴＥＮ、ＥＧＦＲ、ＫＩＴ、ＣＤＫ４、ＪＡＫ２、ＰＩＫ３Ｒ１、ＡＲ、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＴＰ５３、ＨＲＡＳ、ＦＢＸＷ７、ＡＢＬ１、ＡＬＫ、ＣＴＮＮＢ１、ＡＰＣ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＪＡＫ２又はそれらの組み合わせを含む１つ又は複数の遺伝子において検出される、請求項２６に記載の方法。
28. ｃｆＤＮＡ腫瘍特異的変異が、ＴＰ５３、ＭＹＣ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＡＬＫ、ＡＴＭ、ＫＩＴ、ＣＤＨ１又はそれらの組み合わせを含む１つ又は複数の遺伝子において検出される、請求項２７に記載の方法。
29. がんを有する対象の循環腫瘍ＤＮＡ中の変異の検出が外科的切除の適格性を決定する、請求項１５から２８のいずれか一項に記載の方法。
30. がんを有する患者の循環腫瘍ＤＮＡのレベルの変化の検出が、周術期化学療法による治療後の再発を予測する、請求項１５から２９のいずれか一項に記載の方法。
31. ネオアジュバント抗がん剤で治療された患者の循環腫瘍ＤＮＡのレベルの変化の検出が腫瘍退縮を示す、請求項１５から３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 患者の循環腫瘍ＤＮＡの検出が、がんを有する患者の術前化学療法に対する病理学的応答を予測する、請求項１５から３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 患者の循環腫瘍ＤＮＡの検出が、がんを有する患者の周術期治療後の再発を予測する、請求項１５から３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 患者の循環腫瘍ＤＮＡの検出が、がんを有する患者の周術期治療後のがん特異的生存を予測する、請求項１５から３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 患者の循環腫瘍ＤＮＡの検出が、がんを有する患者の周術期治療後の全生存率を予測する、請求項１５から３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 患者の循環腫瘍ＤＮＡの検出が、がんを有する患者の腫瘍切除後の微小残存病変を予測する、請求項１５から３６のいずれか一項に記載の方法。
37. 患者の循環腫瘍ＤＮＡの検出が、抗がん剤による全身治療に適格ながんを有する患者のクローン造血に関連する変化を予測する、請求項１５から３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 患者の循環腫瘍ＤＮＡの検出が、腫瘍切除前のネオアジュバント全身治療に反応する患者を同定する、請求項１５から３７のいずれか一項に記載の方法。
39. ベースラインの対照と比較した患者の循環腫瘍ＤＮＡの検出における低下が、陽性の治療転帰を示す、請求項１５から３８のいずれか一項に記載の方法。

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