JP2013501523A - Braf変異の検出に有用な方法、プライマー、プローブ、及びキット - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国特許出願61/233,054(2009年8月11日出願);同61/237,078(2009年8月26日出願)、及び同61/301,790(2010年2月5日出願)に対する優先権を主張する。
本発明は、サンプル中の変異BRAF配列の存在を検出するために、特に、BRAF V600E、V600D、V600K、V600M、及びV600A変異の存在を検出するための方法、プライマー、及びプローブに関する。
正常な細胞が腫瘍性形質転換を経て悪性細胞に成る場合、癌が生じる。形質転換された(悪性)細胞は、細胞表現型を明示する及び細胞増殖を抑制する、正常な生理学的制御を免れる。個人の体における形質転換された細胞は、それ故増殖し、腫瘍を形成する。腫瘍が見つけられた場合、臨床の目的は、個人が受ける治療において、正常細胞に対して引き起こされる何らかの害を軽減する一方で、悪性細胞を選択的に破壊することである。
本発明は、サンプル中のBRAF V600E、V600D、V600K、V600M、及びV600A変異を検出する方法を開示する。本発明は、サンプル中に存在するV600E、V600D、V600K、V600M、又はV600A変異BRAF配列の増幅及び検出に用いられる、プライマー及びプローブ配列を含む組成物を開示する。本明細書に開示されるように、特定のプライマーの組み合わせは、特定のBRAF変異を増幅することに用いられる。1798−1799GT>AA二重変異に特異的なプライマーを設計することもまたできることは、当業者により評価される。
本発明は、BRAF変異の検出のために有用な方法、プライマー、プローブ及びキットを提供する。本発明の方法、プライマー、プローブ及びキットは、多数の様々な細胞種類において、BRAF V600E、V600D、V600K、V600M及びV600A変異を検出するために用いられることができ、それ故、例えばメラノーマ、結腸直腸癌、肺癌、及び甲状腺癌であるがこれに限定されない多数の様々な癌の診断に用いられることができる。本発明の方法は、癌患者についての、結果の予測として有用であり得る。何らかの疾患、及び特に癌に罹患した患者のための改善された転帰に寄与する重要な要因の一つは、その進行する侵襲的な性質のために、早期の正確な診断である。本発明の方法は、その存在が転移する疾患の陽性指標である、変異BRAF配列を検出するための迅速、非侵襲、且つ正確なスクリーニングアッセイのための切望される需要に対処する。そのようなものとして、それは、より積極的な治療計画で治療されることを必要するそれらの患者を同定する。さらに、本発明はDNA又はRNAを用いることができ、サンプル調製は容易であるので、従って、サンプル調製に関連する検査技師の専門的レベルにおける違いからもたらされ得るアッセイ変動性は減少する。
本方法は、対象(例えば哺乳動物)から組織または体液のサンプルを得ることを含み、ここでサンプルは核酸を含む。用いられ得る組織又は体液の非限定的な例は、血液、血漿、リンパ液、腫瘍生検標本、体組織を含む。一つの実施形態では、組織サンプルは、パラフィン包理組織標本を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、デオキシリリボ核酸(DNA)である。いくつかの実施形態では、核酸は、リボ核酸(RNA)である。
本発明の実施形態では、当業者に知られているDNA単離の方法を用いる。一般的に、目的は、他の細胞成分から細胞の核に存在するDNAを分離することである。DNAの単離は、通常、組織又は細胞の溶解又は分解と共に始まる。このプロセスは、タンパク質構造の破壊が必須であり、核からの核酸の放出を可能にする。溶解は、タンパク質を変性させる界面活性剤、又はプロテアーゼ(タンパク質を分解する酵素)、例えばプロテイナーゼK、場合により双方、を含む塩溶液中で行われる。それは、細胞の分解及び膜の溶解をもたらす。DNA単離の方法は、フェノール:クロロホルム抽出、高塩析沈殿、アルカリ変性、イオン交換カラムクロマトグラフィー、樹脂結合、及び常磁性ビーズ結合を含むがこれに限定されない。
本発明の実施形態は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、ヘリカーゼ依存性増幅(HDA)、及び核酸配列ベース増幅(NASBA)、及び増幅難治性変異系(ARMS)を含むがこれに限定されない、熱及び等熱増幅方法を用いる。好ましい実施形態では、プライマー及びプローブはARMSに用いられる。
本発明の実施形態は、増幅産物が検出可能なマーカーで標識されるような、増幅ステップの間に用いられるプライマーを標識すること、及び増幅産物と検出可能なマーカーで標識されたオリゴヌクレオチドプローブとがハイブリダイズさせることを含むが、これに限定されない検出方法を用いる。検出可能なマーカーは、化学発光タグ、蛍光タグ、及び放射性タグを含むがこれに限定されない。標識された増幅産物は、当業者に知られている方法に従って用いられる標識の種類に対応する方法を用いて直接測定され得る。標識されたプローブは、当業者に知られている方法により、増幅産物とハイブリダイズされ得る。
合成V600E構築物は、BRAF V600E変異を含む核酸を特異的に増幅するための、本発明のプライマー及びプローブの能力を試験するために作られた。BRAF V600E変異のためのプライマー/プローブの2セットは、検証のために用いられた。V600E合成構築物は、gDNAのバックグラウンドにおいて、17倍に段階的に希釈(1:2)された(0.67ng/μL、5ng/PCR)。変異濃度は、10fM〜0.15aMに及んだ。それぞれの希釈されたサンプルは、対照(エクソン13)及びV600E変異について、二重に6回試験された(合計12回)。
希なV600K BRAF変異は、V600E変異のために設計されたプライマーの同じ対を用いることで検出され得る。V600K変異は、1798−1799GT>AA二重変異である。配列番号2は、一重1799T>A変異の存在下でのみ、増幅産物をもたらす非常に特異的なプライマーを含む。従って、プライマー対:配列番号1及び配列番号10を用いる増幅反応、及びプライマー対:配列番号2及び配列番号10を用いる同じサンプルに関する別の反応を行う場合、最初の反応は、増幅生成物を与える(陽性)一方で、第二の反応は、生成物を与えない(陰性)。陽性及び陰性の結果のこの組み合わせは、V600K変異の存在を示す。
1.BRAF V600D、E、及びK変異を含むDNA合成フラグメントは生成された。
a.BRAF V600D:
AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGATAAATCTCGAT
GGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCATTT
b.BRAF V600E
c.BRAF V600K:
ACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAAAGAAATCTC
GATGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCATTTT
a.1799A_1GT(1799TからAの塩基対変化に特異的(V600E、V600D、及びV600K)
b.V600D_2GA(V600Dに特異的)
c.V600K_2AT(V600Kに特異的)
1.3つの合成フラグメントのそれぞれを、0.667ng/μlのゲノムDNA(Promega Corp.‐ヒトゲノムDNA、100μg)中200aMの濃度に希釈する。
2.全ての3つのプライマーセット(それぞれの変異に特異的)で、それぞれの変異についての合成特異的フラグメントをPCR増幅する。
3.排他性を分析する。
下記の二つのプライマー/プローブセットは、特定の変異を増幅するために設計されている。これらのプライマーは、排他性について試験するためにそれぞれの合成フラグメントで試験された。
a.1799A_1GT(V600E、V600D及びV600Kを増幅) このプライマー/プローブセットは、1799塩基におけるTからAの変化を増幅するために、アッセイ開発セクション(7)で記述されている。
b.V600D_2GA(V600Dに特異的) このプライマー/プローブセットは、1799−1800塩基において、TAへのTG変化を増幅するために、アッセイ開発セクション(7)で記述されている。
c.V600K_2AT(V600Kに特異的) このプライマー/プローブセットは、1798−1799塩基において、AAへのCT変化を増幅するために、アッセイ開発セクション(7)で記述されている。
本発明者らは、それぞれの合成及びプライマー/プローブ組み合わせについてのCtデータを回収した。
例:
V600D合成フラグメントについてのV600D_2GAの排他性=0
鋳型としてV600Dフラグメントを用いて、増幅はV600D_2GAプライマー/プローブで行われた。
dCt=30.39−30.39=0(排他的)
鋳型としてV600Dフラグメントを用いて、増幅は1799A_1GTプライマー/プローブで行われた。
dCT=30.34−30.39=−0.05(排他的)
鋳型としてV600Dフラグメントを用いて、増幅はV600K_2ATプライマー/プローブで行われた。
dCT=39.06−30.39=8.67(非特異的)
dCT(フラグメントに特異的なプライマーを用いたCt−フラグメントに非特異的なプライマーを用いたCt)≦4
プリセット合否基準(アッセイ開発‐以下の表を参照のこと)は、プライマー/プローブ1799A_1GTが1799におけるTからA塩基対変化を検出し、それ故全ての変異を検出する、セクション7で記述された。
V600K_2ATは、V600K変異について排他的である。
V600D_2ATは、V600D変異について排他的である。
1799A_1GTは、それは全ての3つの変異(V600E、V600E、及びV600K)に含まれている、1799TからAへの変化について、排他的である。
Claims (16)
- サンプル中のBRAF変異の存在を検出するための方法であって、以下:(a)前記サンプルから核酸を単離すること、ここでサンプルはDNA配列を含む;(b)前記サンプルの前記DNA配列の増幅反応を行うこと、ここで前記増幅反応は、BRAF DNA配列中の第一の位置でBRAF変異体配列と特異的にアニーリングすることができる配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、又は配列番号9である第一のプライマーと、BRAF DNA配列中の第二の位置で特異的にアニーリングすることができる第二のプライマーとを含み、ここで前記第一及び第二のプライマーは、二本鎖BRAF DNA配列の異なる鎖にアニールし、ここで増幅反応は、サンプルのDNA配列が前記BRAF DNA配列の前記第一の位置で変異体配列を含むBRAF DNA配列を含む場合、BRAF変異体特異的増幅産物を生成することができる;及び(c)前記増幅反応により生成された増幅産物を視覚化すること、ここでBRAF変異体特異的増幅産物の検出は、前記サンプル中のBRAF変異の陽性指標である、を含む方法。
- サンプル中のBRAF変異の存在を検出するための方法であって、以下:(a)前記サンプルから核酸を単離すること、ここでサンプルはRNA配列を含む;(b)前記サンプルの前記RNA配列の増幅反応を行うこと、ここで前記増幅反応は、BRAF RNA配列中の第一の位置でBRAF変異体配列と特異的にアニーリングすることができる配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、又は配列番号9である第一のプライマーと、BRAF RNA配列中の第二の位置で特異的にアニーリングすることができる第二のプライマーとを含み、ここで前記第一及び第二のプライマーは、二本鎖BRAF RNA配列の異なる鎖にアニールし、ここで増幅反応は、サンプルのRNA配列が前記BRAF RNA配列の前記第一の位置で変異体配列を含むBRAF RNA配列を含む場合、BRAF変異体特異的増幅産物を生成することができる;及び(c)前記増幅反応により生成された増幅産物を視覚化すること、ここでBRAF変異体特異的増幅産物の検出は、前記サンプル中のBRAF変異の陽性指標である、を含む方法。
- 前記BRAF変異の存在が、前記サンプル中の転移性メラノーマの陽性指標である、請求項1に記載の方法。
- 前記BRAF変異の存在が、前記サンプル中の転移性メラノーマの陽性指標である、請求項2に記載の方法。
- 前記BRAF変異の存在が、BRAF V600E、BRAF V600D、BRAF V600K、BRAF V600M、及びBRAF V600A変異から成る群から選択される、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記サンプルが、血液、組織、又は細胞から成る群から選択される、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記の組織サンプルが、ホルマリン固定されたパラフィン包理組織である、請求項1又は2に記載の方法。
- BRAF核酸配列中の第二の位置で特異的にアニーリングすることができる前記の第二のプライマーが、配列番号10である、請求項1又は2に記載の方法。
- 患者において、腫瘍を治療するための化学療法計画を決定するための方法であって、以下:(a)固定された腫瘍サンプルを得るために、腫瘍の組織サンプルを得て、サンプルを固定すること;(b)固定された腫瘍サンプルからmRNAを単離すること;(c)BRAF増幅産物を得るために、BRAF遺伝子の領域を増幅することができる一対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、mRNAを増幅に供すること;(d)増幅されたサンプル中のBRAFmRNAの量を測定すること;(e)ステップ(d)からのBRAFmRNAの量を、内部対照遺伝子のmRNAの量と比較すること;及び(e)増幅されたサンプル中のBRAFmRNAの量、及びBRAF遺伝子発現についての閾値に基づいて化学療法計画を決定すること、を含む方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプライマーが、オリゴヌクレオチドプライマー対:配列番号1及び配列番号10、又は配列番号2及び配列番号10、配列番号3及び配列番号10、配列番号4及び配列番号10、配列番号5及び配列番号10、配列番号6及び配列番号10、配列番号7及び配列番号10、配列番号8及び配列番号10、配列番号9及び配列番号10、又は少なくともそれと80%同一であるオリゴヌクレオチドプライマーの対から成る、請求項9に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドプライマー対:配列番号1及び配列番号10、又は配列番号2及び配列番号10、配列番号3及び配列番号10、配列番号4及び配列番号10、配列番号5及び配列番号10、配列番号6及び配列番号10、配列番号7及び配列番号10、配列番号8及び配列番号10、配列番号9及び配列番号10、又は少なくともそれと80%同一であるオリゴヌクレオチドプライマーの対を含む、BRAF遺伝子の発現を検出するためのキット。
- BRAF V600E、V600D、V600K、V600M、及びV600A変異に特異的な核酸プローブであって、配列番号11を含むプローブ。
- BRAF V600E、V600D、V600K、V600M、及びV600A変異に特異的な核酸プローブであって、配列番号12を含むプローブ。
- プローブを添加することを含む、変異体BRAF核酸配列の存在を検出する方法であって、前記プローブが配列番号11又は配列番号12のオリゴヌクレオチド配列を含む方法。
- サンプル中のBRAF V600K変異の存在を検出するための方法であって、以下:(a)前記サンプルから核酸を単離すること、ここでサンプルはDNA配列を含む;(b)前記サンプルの前記DNA配列の第一の増幅反応を行うこと、ここで前記増幅反応は、BRAF DNA配列中の第一の位置でBRAF変異体配列と特異的にアニーリングすることができる配列番号1である第一のプライマーと、BRAF DNA配列中の第二の位置で特異的にアニーリングすることができる第二のプライマーとを含み、ここで前記第一及び第二のプライマーは、二本鎖BRAF DNA配列の異なる鎖にアニールし、ここで、増幅反応は、サンプルのDNA配列が前記BRAF DNA配列の前記第一の位置で変異体配列を含むBRAF DNA配列を含む場合、BRAF変異体特異的増幅産物を生成することができる;(c)前記サンプルの前記DNA配列の第二の増幅反応を行うこと、ここで前記増幅反応は、配列番号2である第一のプライマーと、BRAF DNA配列中の第二の位置で特異的にアニーリングすることができる第二のプライマーとを含み、ここで第一のプライマーの厳密性のために、増幅反応はBRAF変異体特異的増幅産物を生成することができる;及び(d)前記第一の増幅反応により生成された増幅産物を視覚化すること、ここで一つのサンプル中のBRAF変異体特異的増幅産物の検出、及び第二の反応からの増幅産物の不在は、前記サンプル中のBRAF V600K変異の陽性指標である、を含む方法。
- サンプル中のBRAF V600K変異の存在を検出するための方法であって、以下:(a)前記サンプルから核酸を単離すること、ここでサンプルはRNA配列を含む;(b)前記サンプルの前記RNA配列の第一の増幅反応を行うこと、ここで前記増幅反応は、BRAF RNA配列中の第一の位置でBRAF変異体配列と特異的にアニーリングすることができる配列番号1である第一のプライマーと、BRAF RNA配列中の第二の位置で特異的にアニーリングすることができる第二のプライマーとを含み、ここで前記第一及び第二のプライマーは、二本鎖BRAF RNA配列の異なる鎖にアニールし、ここで増幅反応は、サンプルのRNA配列が前記BRAF RNA配列の前記第一の位置で変異体配列を含むBRAF RNA配列を含む場合、BRAF変異体特異的増幅産物を生成することができる;(c)前記サンプルの前記RNA配列の第二の増幅反応を行うこと、ここで前記増幅反応は、配列番号2である第一のプライマーと、BRAF RNA配列中の第二の位置で特異的にアニーリングすることができる第二のプライマーとを含み、ここで第一のプライマーの厳密性のために、増幅反応はBRAF変異体特異的増幅産物を生成することができる;及び(d)前記第一の増幅反応により生成された増幅産物を視覚化すること、ここで一つのサンプル中のBRAF変異体特異的増幅産物の検出、及び第二の反応からの増幅産物の不在は、前記サンプル中のBRAF V600K変異の陽性指標である、を含む方法。
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