BR112015015050B1 - Método para diagnosticar melanoma em um indivíduo, e, método para determinar probabilidade de responder ao tratamento com um inibidor de quinase em um indivíduo com melanoma - Google Patents

Abstract

MÉTODOS PARA DIAGNOSTICAR MELANOMA E CARCINOMA DA CÉLULA BASAL EM UM INDIVÍDUO E PARA DETERMINAR PROBABILIDADE DE RESPONDER AO TRATAMENTO COM UM INIBIDOR DE QUINASE EM UM INDIVÍDUO COM MELANOMA OU CARCINOMA DA CÉLULA BASAL, E, USO DE UM INIBIDOR DO DDR2. São descritos aqui métodos para diagnosticar melanoma ou carcinoma da célula basal com base em mutações no gene DDR2. Adicionalmente, um subgrupo distinto de melanomas BRAF-mutado tem mutações somáticas no gene DDR2 igualmente. Aplicações desta descoberta para diagnósticos de rotina incluem a estratificação molecular de melanoma, e a identificação de tecido de mutações de quinase do DDR2 alvejáveis em seções embebidas em parafina fixadas em formalina de rotina. São descritos métodos, composições e kits relacionados com a descoberta de que as mutações do DDR2 podem ser marcadores para melanoma no geral, e melanoma mediada por BRAF em particular, abrindo a possibilidade de dupla terapia para melanoma alvejando tanto DDR2 quanto BRAF.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente tecnologia refere-se a mutações inéditas no gene DDR2 em melanoma e carcinoma da célula basal.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] A descrição seguinte é fornecida para ajudar no entendimento do leitor. Nenhuma das informações fornecidas ou referências citadas é considerada da técnica anterior da presente invenção.

Melanoma e Carcinoma da Célula Basal

[003] Câncer de pele é o mais comum de todos os cânceres, que aflige mais de um milhão de americanos a cada ano, um número que está subindo rapidamente. Ele é também o mais fácil de ser curado, se diagnosticado e tratado no início. Se deixado progredir até o ponto onde ele se espalha para outros locais, o prognóstico é muito fraco. Mais que 8.000 mortes por melanoma ocorrem atualmente por ano.

[004] Melanoma é um tumor maligno de melanócitos. Melanócitos ocorrem predominantemente na pele, entre a camada externa da pele (a epiderme) e a camada seguinte (a derme), mas são também encontrados em outras partes do corpo, incluindo o intestino e o olho (vide melanoma uveal). Melanoma pode ocorrer em qualquer parte do corpo que contém melanócitos ou como um tumor metastático de lesão primária desconhecida. Melanoma é menos comum que outros cânceres de pele, mas é muito mais perigoso e causa a maioria (75%) das mortes relacionadas a câncer de pele.

[005] Melanoma surge de dano do DNA nos melanócitos. O estágio inicial da doença normalmente começa com uma fase de crescimento radial, quando o tumor é confinado na epiderme, seguido por uma “fase de crescimento vertical” dérmica (VGP). Alguns melanomas atingem potencial ainda mais invasivo, crescendo no tecido vizinho e podem espalhar em torno do corpo através do sangue ou vasos linfáticos para formar metástases.

[006] Uma reação imunológica contra o tumor durante a VGP pode ser julgada pela presença e atividade dos linfócitos infiltrando o tumor (TILs). Essas células algumas vezes atacam o tumor primário e, em certos casos, o tumor primário regride com diagnóstico somente do tumor metastático.

[007] Múltiplos eventos genéticos foram relacionados à patogênese (desenvolvimento da doença) de melanoma. Alguns casos de melanoma têm uma clara predisposição genética. Mutações da linha germinal em CDKN2A, CDK4, MC1R, MDM2 SNP309 e em genes associados com xerodermia pigmentosa (XP) predispõem pacientes a desenvolver melanoma. Outros casos de melanoma familiar são geneticamente heterogêneos, e loci putativos para melanoma familiar foram identificados nos braços de cromossomo 1p, 9p e 12q.

Diagnóstico Clínico e Patológico

[008] Melanoma é normalmente primeiro detectado por exame visual de lesões pigmentadas da pele, notavelmente aquelas que mostram: (A) assimetria, (B) uma borda que é irregular, serrilhada ou entalhada, (C) coloração de diferentes tonalidades de marrom, preto ou bronzeado e (D) diâmetro que recentemente mudou de tamanho. Ao contrário, verrugas ou pintas não neoplásticas são simétricas, têm uma borda regular, coloração uniforme e não apresentam nenhuma mudança de tamanho/diâmetro com o tempo. A principal preocupação de diagnóstico é a distinção de uma pinta benigna, uma pinta displásica, que pode mostrar progressão com o tempo, e um melanoma. Verrugas que são irregulares na cor ou forma passam por desenvolvimento adicional para melanoma. Após um exame visual e um exame dermatoscópico, ou ferramentas de diagnóstico in vivo, tal como um microscópio confocal, uma amostra (biópsia) da verruga suspeita é normalmente obtida.

Preparação da Amostra

[009] Quando uma verruga atípica for identificada, ocorre uma biópsia de pele a fim de diagnosticá-la melhor. Anestésico local é usado para entorpecer a área, então a verruga passa por biópsia. O material de biópsia é então enviado para um laboratório para ser avaliado por um patologista. Uma biópsia de pele pode ser uma biópsia de punção ou raspagem, ou excisão completa. A excisão completa é o método preferido, mas uma biópsia de punção pode bastar, se o paciente tiver preocupações cosméticas (isto é, o paciente não quiser uma cicatriz) e a lesão for pequena. Uma biópsia de barbear de cureta ou profunda é no geral evitada, devido ao risco de transectar um melanoma e por meio disso perder importante informação de prognóstico.

[0010] A maioria dos dermatologistas e dermatopatologistas usa um esquema de diagnóstico para classificar lesões melanocíticas com base em quão simétrica é a lesão e no grau de atipia citológica nos melanócitos. Nesta classificação, uma pinta é classificada como inequivocamente benigna, atípica/displásica ou claramente melanoma. Uma pinta benigna não exibe nenhuma atipia citológica e crescimento simétrico significante. Uma verruga atípica é interpretada tanto com crescimento simétrico e/quanto com atipia citológica (média, moderada ou grave). Normalmente, atipia citológica é de preocupação clínica mais importante do que atipia arquitetural. Junto com melanoma, pintas com atipia citológica moderada a grave pode exigir excisão adicional para certificar de que a margem cirúrgica ficou completamente livre da lesão.

[0011] Aspectos importantes da biópsia de pele reportam melanoma, incluindo o padrão (presença/ausência de um componente in situ, crescimento radial ou vertical), profundidade da invasão, presença de infiltrado de linfócito, presença/ausência de invasão vascular ou linfática, presença/ausência de um melanoma benigno pré-existente e o índice mitótico. Um aspecto importante adicional da biópsia de pele reporta pintas atípicas e melanoma é para o patologista para indicar se a margem excisão está livre de tumor. Se existir qualquer melanócito atípico na margem, ou se um melanoma for diagnosticado, uma reexcisão é realizada. Dissecação de linfonodo pode também ser realizada com base nos parâmetros do tumor vistos na biópsia inicial e na reexcisão.

[0012] Teste molecular adicional pode ser realizado em amostras de biópsias de melanoma, reexcisão ou linfonodo metastático para avaliar quanto a mudanças genéticas alvejáveis para ajudar selecionar terapia ideal.

BRAF

[0013] BRAF é um gene de humano que produz uma proteína chamada B-Raf. O gene é também referido como proto-oncogene B-Raf e homólogo B1 do oncogene do sarcoma viral de murino v-Raf, enquanto a proteína é mais formalmente conhecida como proteína serina/treonina quinase B-Raf. B-Raf é um elemento da família quinase Raf de proteína serina/treonina específica de quinases. Esta proteína desempenha um papel de regular o caminho de sinalização de quinase MAP/ERK, que afeta divisão, diferenciação e expressão do fator do crescimento celular.

[0014] Em 2002, BRAF mostrou ser mutado em cânceres de humano. Mais que 30 mutações do gene BRAF associadas com cânceres de humano foram identificadas. A frequência de mutações BRAF varia amplamente em cânceres de humano de aproximadamente 60% de melanomas e alguns tipos de pintas benignas, a aproximadamente 1-10% de carcinomas comuns tal como adenocarcinoma de pulmão (ACA) e câncer colorretal. Em 90% dos tumores mutados de BRAF, timina é usada em substituição a adenina no nucleotídeo 1799. Isto leva a valina (V) sendo usada em substituição a glutamato (E) no códon 600 (V600E) no segmento de ativação. Esta mutação foi amplamente observada em carcinoma da tireoide papilar, câncer colorretal, melanoma e câncer do pulmão de célula não pequena. Em junho de 2011, uma equipe de cientistas Italianos usou sequenciamento massivamente paralelo para identificar mutação V600E como uma provável mutação condutora em 100% dos casos de leucemia da célula capilar. Menos comumente, mutação V600E pode também ocorrer por uma dupla substituição de nucleotídeo.

[0015] Mutações de BRAF que foram encontradas são R462I, I463S, G464E, G464V, G466A, G466E, G466V, G469A, G469E, N581S, E586K, D594V, F595L, G596R, L597V, T599I, V600D, V600E, V600K, V600R, K601E, E602K e A728V, etc. A maioria dessas mutações é agrupada em duas regiões do gene: o laço P rico em glicina do lóbulo N e o segmento de ativação e regiões de flanqueamento. Muitas dessas mutações mudam o segmento de ativação de um estado inativo para um estado ativo. Por exemplo, em mutações V600, a cadeia lateral alifática de Val600 interage com o anel fenila de Phe467 no laço P. Substituir a cadeia lateral Val hidrofóbica sintetizada pelo meio com um resíduo maior e carregado (tais como as mudanças de Val por Glu, Asp, Lys, ou de Arg vistas em tumores de humano) pode desestabilizar as interações que mantêm o motivo DFG em uma conformação inativa, resultando em deslocamento conformacional na posição ativa. Cada mutação de quinase BRAF tem um efeito variável na atividade de fosforilação MEK, com maioria das mutações com maior atividade de fosforilação do que a proteína B-Raf não mutada, mas algumas mutações mostram menor atividade quinase, ou mesmo nenhuma atividade, denominadas mutações “inibitórias” de BRAF. O efeito dessas mutações inibitórias parece ser para ativar C-Raf tipo selvagem, que então sinaliza para ERK.

[0016] BRAF tem também emergido como importante alvo de droga para terapia de tumor. Drogas que tratam cânceres acionados por mutações BRAF foram desenvolvidas. Em 17 de agosto de 2011, um deles, vemurafenib, foi aprovado pela FDA para tratamento de melanoma em estágio avançado. Outros inibidores de quinase direcionados por BRAF incluem GDC-0879, PLX-4720, tosilato de sorafenib, dabrafenib e LGX818.

DDR2

[0017] Família do receptor do domínio de discoidina, membro 2, também conhecido como DDR2 ou CD167b (agrupamento de diferenciação 167b), é um receptor tirosina quinase (RTK) que regula crescimento, diferenciação e metabolismo celular em resposta a sinais extracelulares. Mutação do DDR2 foi previamente reportada em 3 a 4% de carcinoma de célula escamosa (SCC) do pulmão. No SCC de pulmão, alguns casos com mutação do DDR2 mostraram ter resposta clínica a tratamento com o inibidor de tirosina quinase dasatinib (Cancer Discov. 2011 April 3; 1(1): 78-89). Os dados sugeriram que DDR2 pode ser um importante alvo terapêutico em SCC.

[0018] Proteína do DDR2 compreende um domínio de discoidina extracelular (DS), um domínio de transmembrana e um domínio quinase. O domínio quinase é localizado nos aminoácidos 563 a 849 da proteína de comprimento total (que inclui o peptídeo sinal) e o domínio DS é localizado nos aminoácidos 22-399. A sequência de nucleotídeo de variante 2 de RNAm DDR2 de humano é mostrada em GenBank Accession no. NM_006182.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0019] Métodos para diagnosticar melanoma em um indivíduo são descritos. Em um aspecto da presente invenção, um método para diagnosticar melanoma em um indivíduo compreende (a) analisar uma amostra biológica do indivíduo, (b) detectar a presença de um ácido nucleico que codifica uma proteína do DDR2 com uma mutação selecionada do grupo que consiste em R105C, P321L, R458H, S467F, P476S, I488S, F574C, S667F, S674F, R680L, L701F, R742Q e T836A na amostra, e (c) diagnosticar o indivíduo como portador de melanoma quando a mutação é detectada, indicando por meio disso que o indivíduo tem melanoma.

[0020] Em um outro aspecto, um método para diagnosticar melanoma em um indivíduo, compreende (a) analisar uma amostra biológica do indivíduo, (b) detectar a presença de uma proteína do DDR2 com uma mutação selecionada do grupo que consiste em R105C, P321L, R458H, S467F, P476S, I488S, F574C, S667F, S674F, R680L, L701F, R742Q e T836A na amostra, e (c) diagnosticar o indivíduo como portador de melanoma quando a mutação é detectada, indicando por meio disso que o indivíduo tem melanoma.

[0021] Em modalidades particulares, o melanoma é melanoma em estágio avançado. O indivíduo pode ter uma lesão de pele e/ou pode ser suspeito de ter um distúrbio de pele tal como, por exemplo, câncer de pele, ou melanoma.

[0022] Métodos para diagnosticar carcinoma da célula basal em um indivíduo são também descritos. Em um aspecto da invenção, um método para diagnosticar carcinoma da célula basal em um indivíduo compreende: (a) analisar uma amostra biológica do indivíduo, (b) detectar a presença de um ácido nucleico que codifica uma proteína do DDR2 com uma mutação selecionada do grupo que consiste em N146K, R399Q e S702F na amostra, e (c) diagnosticar o indivíduo como tendo carcinoma da célula basal quando a mutação é detectada, indicando por meio disso que o indivíduo tem carcinoma da célula basal.

[0023] Em um outro aspecto da invenção, um método para diagnosticar carcinoma da célula basal em um indivíduo, compreende: (a) analisar uma amostra biológica do indivíduo, (b) detectar a presença de uma proteína do DDR2 com uma mutação selecionada do grupo que consiste nas amostras de N146K, R399Q, e S702F, e (c) diagnosticar o indivíduo como tendo carcinoma da célula basal quando a mutação é detectada, indicando por meio disso que o indivíduo tem carcinoma da célula basal.

[0024] O indivíduo pode ter uma lesão de pele e/ou pode ser suspeito de ter um distúrbio de pele tal como, por exemplo, câncer de pele, ou carcinoma da célula basal.

[0025] Também são descritos métodos para determinar probabilidade de que um indivíduo com melanoma ou carcinoma da célula basal responderá ao tratamento com um inibidor de quinase, compreende: (a) analisar uma amostra biológica do indivíduo, (b) detectar a presença de uma mutação do DDR2 que confere sensibilidade a um inibidor de quinase em uma proteína do DDR2 ou ácido nucleico na amostra, e (c) identificar o indivíduo como provável a responder ao tratamento com um inibidor de quinase quando uma ou mais das mutações do DDR2 está presente, indicando por meio disso que o indivíduo provavelmente responde ao tratamento com um inibidor de quinase.

[0026] A Mutação do DDR2 pode ser uma mutação da proteína de DDR2 selecionada do grupo que consiste em R105C, P321L, R458H, S467F, P476S, I488S, F574C, S667F, S674F, R680L, L701F, R742Q e T836A ou um ácido nucleico que codifica uma proteína do DDR2 com uma mutação selecionada do grupo que consiste em R105C, P321L, R458H, S467F, P476S, I488S, F574C, S667F, S674F, R680L, L701F, R742Q e T836A. A presença de qualquer dessas mutações pode ser em um indivíduo com melanoma em estágio avançado.

[0027] O método pode adicionalmente compreender detectar a presença de uma mutação de BRAF tal como V600E ou V600K em BRAF do indivíduo.

[0028] Em algumas modalidades, a mutação do DDR2 é uma mutação da proteína de DDR2 selecionada do grupo que consiste em N146K, R399Q e S702F; ou uma sequência de nucleotídeos do DDR2 que codifica uma mutação do DDR2 selecionada do grupo que consiste em N146K, R399Q e S702F. A presença de qualquer uma dessas mutações pode ser em um indivíduo com carcinoma da célula basal.

[0029] Em uma modalidade, a etapa de analisar uma amostra biológica compreende sequenciar o gene DDR2 quanto a presença de mutações conhecidas por conferir sensibilidade aos inibidores do DDR2. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico do DDR2 é examinada quanto a uma ou mais mutações que codificam N146K, R399Q, S702F, R105C, P321L, R458H, S467F, P476S, I488S, F574C, S667F, S674F, R680L, L701F, R742Q, ou T836A em DDR2.

[0030] Métodos para identificar um indivíduo com melanoma ou carcinoma da célula basal como um candidato para terapia com um inibidor do DDR2 são também descritos. Em algumas modalidades, um método para identificar um indivíduo com melanoma ou carcinoma da célula basal como um candidato a terapia com um inibidor do DDR2, compreende sequenciar o gene DDR2 quanto a presença de mutações conhecidas por conferir sensibilidade aos inibidores de quinase do DDR2. Em algumas modalidades, a sequência do DDR2 é examinada quanto a uma sequência que codifica pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste em R105C, P321L, R458H, S467F, P476S, I488S, F574C, S667F, S674F, R680L, L701F, R742Q e T836A. Em um método alternativo, o candidato a terapia com um inibidor do DDR2 é identificado pelos níveis de expressão de DDR2, em que baixos níveis de expressão de DDR2 tais como níveis de transcrição de DDR2 relativos a GAPDH normalizado abaixo de 0,025 indicam que o indivíduo é um candidato a terapia.

[0031] A invenção compreende um método para tratar melanoma ou carcinoma da célula basal em um indivíduo compreendendo administrar no indivíduo uma quantidade terapeuticamente efetiva de um inibidor do DDR2. Em algumas modalidades, o melanoma é melanoma em estágio avançado. Inibidores do DDR2 adequados incluem inibidores quinase, siRNA, shRNA, e um anticorpo que liga especificamente em DDR2 ou em um DDR2 com pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste em R105C, P321L, R458H, S467F, P476S, I488S, F574C, S667F, S674F, R680L, L701F, R742Q e T836A. Em algumas modalidades, o inibidor do DDR2 é um inibidor de tirosina quinase que inibe a atividade quinase do DDR2. Em algumas modalidades, o inibidor de quinase inibe a atividade tirosina quinase do DDR2 com pelo menos uma mutação no domínio quinase. Em algumas modalidades, o inibidor de quinase inibe a atividade tirosina quinase do DDR2 com pelo menos uma mutação no domínio discoidina (DS). Em algumas modalidades, o inibidor de tirosina quinase inibe a atividade quinase do DDR2 com pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste em R105C, P321L, R458H, S467F, P476S, I488S, F574C, S667F, S674F, R680L, L701F, R742Q e T836A.

[0032] Métodos descritos aqui podem ser usados para tratar melanoma ou carcinoma da célula basal em um indivíduo com uma mutação do DDR2 selecionada do grupo que consiste em uma mutação no domínio de discoidina DDR2, uma mutação no domínio de interação intracelular DDR2, e uma mutação no domínio quinase DDR2. A Mutação do DDR2 pode ser uma mutação da linha germinal ou uma mutação da célula somática. Em algumas modalidades a mutação do DDR2 é uma mutação N146K, R399Q ou S702F. A Mutação do DDR2 pode ser codificada por um gene DDR2 mutado.

[0033] Com relação a terapia, o indivíduo pode ser examinado quanto a mutações na proteína do DDR2, compreendendo sequenciar um ácido nucleico do DDR2 do indivíduo para determinar se o ácido nucleico codifica uma proteína do DDR2 com uma mutação e, subsequentemente, a probabilidade de que o indivíduo responderá a terapia com um inibidor do DDR2. Em modalidades particulares, a sequência do DDR2 do indivíduo pode ser determinada antes do início do tratamento ou durante o tratamento.

[0034] Um indivíduo com melanoma ou carcinoma da célula basal pode abrigar uma mutação em uma sequência de ácido nucleico do DDR2e/ou uma mutação em uma sequência de ácido nucleico de BRAF. A mutação pode ser no DNA e/ou no RNA genômico do indivíduo. Em algumas modalidades, os métodos para tratar melanoma ou carcinoma da célula basal descritos aqui são realizados em um indivíduo que não abriga uma mutação em um ácido nucleico do DDR2 ou um BRAF, ou em um indivíduo que carrega um DDR2 e/ou gene BRAF ou RNA mutado.

[0035] Em uma outra modalidade, um indivíduo com melanoma ou carcinoma da célula basal é também tratado com um inibidor de BRAF, tal como um inibidor que inibe a atividade de BRAF com uma mutação no códon 600 (tal como uma mutação V600E ou V600K) ou outras mutações BRAF sensíveis além de ser tratado com um inibidor do DDR2. Inibidores de BRAF adequados incluem inibidores de quinase de BRAF tais como, por exemplo, vemurafenib, GDC-0879, PLX-4720, sorafenib tosilato, dabrafenib e LGX818.

[0036] Também são fornecidas composições para tratar melanoma e/ou carcinoma da célula basal. Em uma modalidade, uma composição para o tratamento de melanoma ou carcinoma da célula basal compreende um inibidor do DDR2 sozinho, ou com um inibidor de BRAF. O inibidor do DDR2 pode ser um inibidor de quinase ou um ou mais inibidores selecionados do grupo que consiste em siRNA direcionado a um ácido nucleico do DDR2, shRNA direcionado a um ácido nucleico do DDR2, e um anticorpo que liga especificamente em um polipeptídeo do DDR2 e inibe a atividade quinase do DDR2. Em algumas modalidades, o inibidor de quinase do DDR2 inibe DDR2 com mutações no domínio quinase. Em algumas modalidades, o inibidor inibe DDR2 com mutações no domínio de discoidina. Em algumas modalidades, a composição compreende um inibidor de quinase do DDR2 que inibe a atividade quinase do DDR2 com uma ou mais das mutações R105C, P321L, R458H, S467F, P476S, I488S, F574C, S667F, S674F, R680L, L701F, R742Q e T836A. O inibidor de BRAF pode ser, por exemplo, um inibidor de quinase tais como vemurafenib, GDC-0879, PLX- 4720, sorafenib tosilato, dabrafenib e LGX818.

[0037] A invenção também inclui kits. Por exemplo, um kit para identificar a presença de mutações do DDR2 e/ou de BRAF, o kit compreendendo pelo menos um oligonucleotídeo iniciador selecionado de

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0038] Figura 1 é um alinhamento de sequência da proteína do DDR2 (linhas do topo) comparado com DDR1 (base) mostrando a sequência conservada entre as duas proteínas nos sítios de mutações do DDR2 vistos em domínios extracelulares DS (aminoácidos 22-399) e o domínio quinase (aminoácidos 563 a 849) incluindo F574C, S667F, R680L, L701F, R742Q e T836A.

[0039] Figura 2 mostra um alinhamento de sequência de três mutações no domínio quinase DDR2, F574C, S667F e L701F, identificadas por sequenciamento de DNA genômico de Ion Torrent extraído das seções de melanomas embebidas em parafina fixadas em formalina (FFPE) macrodissecadas; painéis do meio mostram confirmações de mutação por sequenciamento de Sanger bidirecional; painéis da base mostram alinhamento das mutações no domínio quinase DDR2 com as localizações homólogas em outras quinases, incluindo BRAF, EGFR e ALK.

[0040] Figura 3 mostra DDR2 expresso a baixos níveis em melanoma mutado no DDR2.

[0041] Figura 4 mostra uma mutação do domínio quinase S702F em carcinoma da célula basal.

[0042] Figura 5 mostra mutações bialélicas N146K e R399Q do DDR2 em carcinoma da célula basal.

DESCRIÇÃO DETALHADA Definições

[0043] Certos termos empregados nesta descrição têm os seguintes significados definidos. Termos que não são definidos têm seus significados reconhecidos na técnica. Ou seja, a menos que de outra forma definida, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm os mesmos significados comumente entendidos pelos versados na técnica aos quais esta invenção refere-se.

[0044] Da maneira aqui usada, a menos que de outra forma estabelecida, as formas singulares “um”, “uma”, “o” e “a” também incluem o plural. Assim, por exemplo, uma referência a “um oligonucleotídeo” inclui uma pluralidade de moléculas de oligonucleotídeo, uma referência a marca é uma referência a uma ou mais marcas, uma referência a sonda é uma referência a uma ou mais sondas, e uma referência a “um ácido nucleico” é uma referência a um ou mais polinucleotídeos.

[0045] Da maneira aqui usada, a menos que de outra forma indicada, com referência a um valor numérico, o termo “cerca de” significa mais ou menos 10% do valor enumerado.

[0046] Da maneira aqui usada, os termos “isolado”, “purificado” ou “substancialmente purificado” referem-se a moléculas, tal como ácido nucleico, que são removidas do seu ambiente natural, isoladas ou separadas, e são pelo menos 60% isentas, preferivelmente 75% isentas, e mais preferivelmente 90% isentas de outros componentes com os quais elas são naturalmente associadas. Uma molécula isolada é, portanto, uma molécula substancialmente purificada.

[0047] Um “fragmento” no contexto de um fragmento de gene ou um fragmento de cromossomo refere-se a uma sequência de resíduos de nucleotídeo que tem pelo menos cerca de 10 nucleotídeos, pelo menos cerca de 20 nucleotídeos, pelo menos cerca de 25 nucleotídeos, pelo menos cerca de 30 nucleotídeos, pelo menos cerca de 40 nucleotídeos, pelo menos cerca de 50 nucleotídeos, pelo menos cerca de 100 nucleotídeos, pelo menos cerca de 250 nucleotídeos, pelo menos cerca de 500 nucleotídeos, pelo menos cerca de 1.000 nucleotídeos, pelo menos cerca de 2.000 nucleotídeos.

[0048] Os termos “identidade” e “idêntico” referem-se a um grau de identidade entre sequências. Pode existir identidade parcial ou identidade completa. Uma sequência parcialmente idêntica é uma que é menos que 100% idêntica a uma outra sequência. Sequências parcialmente idênticas podem ter uma identidade geral de pelo menos 70% ou pelo menos 75%, pelo menos 80% ou pelo menos 85%, ou pelo menos 90% ou pelo menos 95%.

[0049] A expressão “marca detectável” da maneira aqui usada refere- se a uma molécula ou um composto ou um grupo de moléculas ou um grupo de compostos associados com uma sonda e é usado para identificar a sonda hibridizada em um ácido nucleico genômico ou ácido nucleico de referência.

[0050] Da maneira aqui usada, o termo “detectar” refere-se a observar um sinal de uma marca detectável para indicar a presença de um alvo.

[0051] Mais especificamente, detecção é usada no contexto de detectar uma sequência específica.

[0052] A expressão “PCR múltiplo” da maneira aqui usada refere-se a um ensaio que fornece amplificação e detecção simultânea de dois ou mais produtos no mesmo vaso de reação. Cada produto é iniciado usando um par de oligonucleotídeo iniciador distinto. Uma reação múltipla pode adicionalmente incluir sondas específicas para cada produto que são marcadas de modo detectável com diferentes frações detectáveis.

[0053] A expressão “reação em cadeia de polimerase aninhada” é uma modificação de reação em cadeia de polimerase que, no presente contexto, é realizada para adicionar sequências a um amplicon. Reação em cadeia de polimerase aninhada envolve dois conjuntos de oligonucleotídeos iniciadores, usados em duas corridas sucessivas de reação em cadeia de polimerase, o segundo conjunto planejado para amplificar o alvo do primeiro produto corrido.

[0054] Da maneira aqui usada, o termo “oligonucleotídeo” refere-se a um polímero pequeno composto de deoxiribonucleotídeos, ribonucleotídeos, ou qualquer combinação destes. Oligonucleotídeos têm no geral entre cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25 ou 30 a cerca de 150 nucleotídeos (nt) de comprimento, mais preferivelmente cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25 ou 30 a cerca de 70 nt.

[0055] Da maneira aqui usada, o termo “sujeito” ou “indivíduo” refere-se a um mamífero, tal como um humano, mas pode também ser um outro animal como um animal doméstico (por exemplo, um cão, gato ou similares), um animal de fazenda (por exemplo, uma vaca, uma cabra, um porco, um cavalo, ou similares) ou um animal de laboratório (por exemplo, um macaco, um rato, um camundongo, um coelho, um porquinho-da-índia, ou similares).

[0056] Os termos “complemento”, “complementar” ou “complementariedade” da maneira aqui usada com referência a polinucleotídeos (isto é, uma sequência de nucleotídeos tal como um oligonucleotídeo ou um ácido nucleico genômico) relacionado pelas regras pareamento de base. O complemento de uma sequência de ácido nucleico da maneira aqui usada refere-se a um oligonucleotídeo que, quando alinhado com a sequência de ácido nucleico de maneira tal que a extremidade 5‘ de uma sequência é pareada com a extremidade 3‘ da outra, está em “associação antiparalela”. Por exemplo, para a sequência 5‘-A-G-T-3‘ é complementar à sequência 3‘-T-C-A-5‘. Certas bases não comumente encontradas em ácidos nucleicos naturais podem ser incluídas nos ácidos nucleicos da presente invenção e incluem, por exemplo, inosina e 7-deazaguanina. Complementariedade não precisa ser perfeita; duplexes estáveis podem conter pares de base de pareamento imperfeito ou bases não conjugadas. Versados na técnica da tecnologia de ácido nucleico podem determinar a estabilidade empiricamente duplex considerando inúmeras variáveis incluindo, por exemplo, o comprimento do oligonucleotídeo, composição de base e sequência do oligonucleotídeo, intensidade iônica e incidência de pares de base de pareamento imperfeito. Complementariedade pode ser “parcial”, em que somente algumas das bases de ácidos nucleicos são conjugadas de acordo com as regras de pareamento de base. Ou pode haver complementariedade “completa”, “total” ou “inteira” entre os ácidos nucleicos.

[0057] “Detecção” de uma mutação em um gene ou proteína pode ser efetuada realizando um ensaio apropriado. Para detectar uma mutação em um gene ou proteína em uma amostra biológica, a amostra biológica é ensaiada para determinar a presença ou ausência do gene mutado ou proteína mutada. O ensaio pode incluir extrair ácido nucleico (tal como, por exemplo, DNA e/ou RNA genômico total) da amostra e analisar o ácido nucleico extraído por métodos conhecidos na técnica. Um ensaio pode envolver isolar a proteína da amostra biológica e analisar a proteína. Entretanto, um ensaio não precisa envolver nem extração de ácido nucleico nem isolamento de proteína. Ou seja, podem ser empregados alguns ensaios que analisam diretamente uma amostra biológica sem extrair ou isolar ácido nucleico ou proteína.

Métodos de Diagnóstico

[0058] Em uma modalidade, é descrito um método para diagnosticar melanoma em um indivíduo, compreendendo (a) analisar uma amostra biológica do indivíduo, (b) detectar a presença de uma proteína do DDR2 com uma mutação selecionada do grupo que consiste em R105C, P321L, R458H, S467F, P476S, I488S, F574C, S667F, S674F, R680L, L701F, R742Q e T836A ou um ácido nucleico que codifica uma proteína do DDR2 como essa na amostra, e (c) diagnosticar o indivíduo como portador de melanoma quando a mutação é detectada, indicando por meio disso que o indivíduo tem melanoma. O melanoma pode ser um subconjunto particular de melanoma. Em algumas modalidades, o método é para diagnosticar melanoma em estágio avançado.

[0059] São também descritos métodos para diagnosticar carcinoma da célula basal em um indivíduo. Um método para diagnosticar carcinoma da célula basal em um indivíduo, compreende (a) analisar uma amostra biológica do indivíduo, (b) detectar a presença de uma proteína do DDR2 com uma mutação selecionada do grupo que consiste em N146K, R399Q e S702F, ou um ácido nucleico do DDR2 que codifica a proteína do DDR2 mutada na amostra, e (c) identificar o indivíduo com carcinoma da célula basal quando a mutação está presente, indicando por meio disso que o indivíduo tem carcinoma da célula basal.

[0060] O ácido nucleico pode ser DNA e/ou RNA.

[0061] Métodos de diagnóstico podem ser realizados em um indivíduo com uma lesão de pele. Uma “lesão de pele” é uma área de variação na cor e/ou textura na pele. Alternativa ou adicionalmente, o indivíduo pode ser suspeito de ter um distúrbio de pele tais como, por exemplo, câncer de pele, melanoma ou carcinoma da célula basal.

Métodos de Classificar/Prever Resposta ao Tratamento

[0062] Um outro aspecto da presente invenção fornece um método para determinar a probabilidade de resposta ao tratamento com um inibidor de quinase em um indivíduo com melanoma ou carcinoma da célula basal, compreendendo: (a) analisar uma amostra biológica do indivíduo para detectar a presença de uma mutação do DDR2 que confere sensibilidade a um inibidor de quinase, e (b) identificar o indivíduo como provável a responder ao tratamento com um inibidor de quinase quando uma ou mais mutações do DDR2 está presente, indicando por meio disso que o indivíduo provavelmente responde ao tratamento com um inibidor de quinase. Em algumas modalidades, a mutação do DDR2 é uma mutação de aminoácido em uma proteína do DDR2 selecionada do grupo que consiste em R105C, P321L, R458H, S467F, P476S, I488S, F574C, S667F, S674F, R680L, L701F, R742Q e T836A. Em outras modalidades, a mutação do DDR2 é uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína do DDR2 com uma mutação selecionada do grupo que consiste em R105C, P321L, R458H, S467F, P476S, I488S, F574C, S667F, S674F, R680L, L701F, R742Q e T836A.

[0063] Em algumas modalidades, a mutação do DDR2 é uma mutação da proteína de DDR2 selecionada do grupo que consiste em N146K, R399Q e S702F. Em algumas modalidades a mutação do DDR2 é uma sequência de ácido nucleico do DDR2 que codifica uma mutação do DDR2 selecionada do grupo que consiste em N146K, R399Q e S702F.

[0064] O método pode adicionalmente compreender detectar a presença de uma mutação V600E ou V600K em BRAF do indivíduo. O indivíduo pode ter melanoma em estágio avançado.

[0065] Ainda um outro aspecto da presente invenção descreve um método para estratificar melanoma no estágio inicial e final, compreendendo (a) analisar uma amostra biológica de um indivíduo com melanoma ou suspeito de ter melanoma, (b) detectar a presença de uma mutação do DDR2, tal como R105C, P321L, R458H, S467F, P476S, I488S, F574C, S667F, S674F, R680L, L701F, R742Q ou T836A na amostra, e (c) identificar o melanoma como estágio posterior quando a mutação do DDR2 é detectada. A presença dessas mutações é indicativo de melanoma estágio posterior dado sua ausência em melanomas cutâneos primários e sua presença em nódulos cutâneos secundários ou lesões metastáticas que têm prognóstico adverso (Balch CM et al. Prognostic Factors Analysis of 17,600 Melanoma Patients: Validation of the American Joint Committee on Cancer Melanoma Staging System. JCO August 15, 2001 vol. 19 no. 16 3622-3634, Balch CM et al. Final Version of 2009 AJCC Melanoma Staging and Classification. JCO December 20, 2009 vol. 27 no. 36 6199-6206).

[0066] Em um aspecto da presente invenção, um indivíduo é identificado como provável a responder a terapia com um inibidor do DDR2 tal como, por exemplo, um inibidor de quinase do DDR2, quando os níveis de transcrição do DDR2 relativos normalizados por GAPDH em uma amostra biológica do indivíduo estiverem abaixo de 0,025.

[0067] A expressão “amostra biológica” da maneira aqui usada refere- se a uma amostra contendo um ácido nucleico de interesse. Uma amostra biológica pode compreender uma amostra clínica (isto é, obtida diretamente de um paciente) ou ácidos nucleicos isolados e pode ser amostras de fluidos e/ou tecido celulares ou acelulares (por exemplo, biópsia). Em algumas modalidades, uma amostra é obtida de um tecido ou fluido corpóreo coletado de um sujeito. Fontes de amostra incluem, mas sem limitações, escarro (processado ou não processado), lavagem alveolar bronquial (BAL), tipo (por exemplo, linfócitos), fluidos corpóreos, fluido cérebro-espinhal (CSF), urina, lavagem bronquial (BW), células do sangue total ou sangue isolado de qualquer plasma, soro ou tecido (por exemplo, material de biópsia). Métodos de obter amostras de teste e amostras de referência são bem conhecidos pelos versados na técnica e incluem, mas sem limitações, aspirações, seções de tecido, coleta de sangue ou outros fluidos, biópsias cirúrgicas ou de agulha, coleta de tecido embebido em parafina, coleta de fluidos corpóreos, coleta de fezes e similares. No presente contexto a amostra biológica preferivelmente é sangue, soro ou plasma. A expressão “amostra do paciente” da maneira aqui usada refere-se a uma amostra obtida de um diagnóstico de busca e/ou tratamento de uma doença de humano, especialmente doença da próstata.

[0068] Para detectar a presença de uma mutação de DDR2 ou BRAF, amostras de ácido nucleico ou ácidos nucleicos alvos podem ser amplificadas e sequenciadas por vários métodos conhecidos pelos versados na técnica incluindo sequenciamento de Sanger e o assim chamado Sequenciamento de Próxima Geração (NGS). Sequenciamento de próxima operação diminui os custos e aumenta bastante a velocidade com relação aos métodos corante- terminador padrões da indústria. Exemplos de NGS incluem: (a) Sequenciamento de Assinatura Massivamente Paralela (MPSS) (b) Sequenciamento de Polony combinado com uma biblioteca pareada-marcada in vitro com PCR de emulsão (c) Pirossequenciamento 454 (d) Sequenciamento de Solexa (e) Tecnologia SOLiD (f) Nanoesfera de DNA (g) Molécula única Heliscope (h) Molécula única tempo real (SMRT) e (i) Sequenciamento por semicondutor iônico

[0069] Sequenciamento por semicondutor iônico acopla química de sequenciamento padrão com um sistema de detecção baseado no semicondutor inédito, que detecta íons de hidrogênio que são liberados durante a polimerização de DNA, ao contrário dos métodos óticos usados em outros sistemas de sequenciamento. Um micropoço contendo uma fita de DNA de molde a ser sequenciada é alagado com um único tipo de nucleotídeo. Se o nucleotídeo introduzido for complementar ao nucleotídeo molde condutor, ele é incorporado na fita complementar em crescimento. Isto causa a liberação de um íon de hidrogênio que dispara um sensor iônico hipersensível, que indica que ocorreu uma reação. Se repetições de homopolímero estiveram presentes na sequência molde, múltiplos nucleotídeos serão incorporados em um único ciclo. Isto leva a um número correspondente de hidrogênios liberados e um sinal eletrônico proporcionalmente maior.

[0070] Os termos “amplificação” ou “amplificar” da maneira aqui usada incluem métodos para copiar um ácido nucleico alvo, aumentando por meio disso o número de cópias de uma sequência de ácido nucleico selecionada. Amplificação pode ser exponencial ou linear. Um ácido nucleico alvo pode ser tanto DNA quanto RNA. As sequências amplificadas desta maneira formam um “produto de amplificação”, também conhecido como um “amplicon”. Embora os métodos exemplares descritos em seguida refiram-se à amplificação usando a reação em cadeia de polimerase (PCR), inúmeros outros métodos são conhecidos na técnica para amplificação de ácidos nucleicos (por exemplo, métodos isotérmicos, métodos de círculo de rolamento, etc.). Versados na técnica entenderão que esses outros métodos podem ser usados tanto no lugar de métodos de PCR, quanto junto com eles. vide, por exemplo, Saiki, “Amplificação de DNA genômico” em PCR Protocols, Innis et al., Eds., Academic Press, San Diego, CA 1990, pp. 13-20; Wharam et al., Nucleic Acids Res., 29(11):E54-E54, 2001; Hafner et al., Biotechniques, 30(4):852-56, 858, 860, 2001; Zhong et al., Biotechniques, 30(4):852-6, 858, 860, 2001.

[0071] Um recurso chave de PCR é “termociclagem” que, no presente contexto, compreende ciclagem repetida através de pelo menos três diferentes temperaturas: (1) fusão/desnaturação, tipicamente a 95°C (2) anelamento de um oligonucleotídeo iniciador no DNA alvo a uma temperatura determinada pelo ponto de fusão (Tm) da região de homologia entre o oligonucleotídeo iniciador e o alvo e (3) extensão a uma temperatura dependente da polimerase, mais comumente 72°C. Essas três temperaturas são então repetidas inúmeras vezes. Protocolos de termociclagem tipicamente também incluem um primeiro período de desnaturação prolongado, e terminam em um período prolongado de extensão.

[0072] A Tm de um oligonucleotídeo iniciador varia de acordo com o comprimento, teor de G+C e as condições de tampão, entre outros fatores. Da maneira aqui usada, Tm refere-se àquela no tampão usado para a reação de interesse.

[0073] Um oligonucleotídeo (por exemplo, uma sonda ou um oligonucleotídeo iniciador) que é específico para um ácido nucleico alvo “hibridizará” no ácido nucleico alvo em condições adequadas. Da maneira aqui usada, “hibridização” ou “hibridizar” refere-se ao processo pelo qual uma única fita de oligonucleotídeo anela com uma fita complementar através de pareamento de base em condições de hibridização definidas. É uma interação específica, isto é, não aleatória, entre dois polinucleotídeos complementares. Hibridização e a resistência de hibridização (isto é, a resistência da associação entre os ácidos nucleicos) são influenciadas por fatores tais como o grau de complementariedade entre os ácidos nucleicos, rigorosidade das condições envolvidas, e a Tm do híbrido formado.

Métodos de Tratamento

[0074] Em um aspecto da invenção, um método de tratar melanoma ou carcinoma da célula basal em um indivíduo compreende administrar no indivíduo uma quantidade terapeuticamente efetiva de um inibidor do DDR2. Um “inibidor do DDR2” é um composto que inibe função de DDR2 (incluindo atividade quinase do DDR2) e inclui inibidores de quinase que inibem atividade quinase do DDR2 bem como siRNA específico para ácido nucleico do DDR2, shRNA específico para ácido nucleico do DDR2 e um anticorpo que liga no DDR2 e inibe a atividade quinase do DDR2 associada.

[0075] Um “anticorpo” inclui um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, fragmentos de ligação de antígeno destes tais como F(ab').sub.2 e fragmentos Fab, e um anticorpo de cadeia única.

[0076] Da maneira aqui usada, um “inibidor de quinase” é uma composição que inibe a atividade quinase de uma proteína quinase. Um “inibidor de tirosina quinase” é uma composição que inibe a atividade tirosina quinase de uma proteína tirosina quinase, e um “inibidor de serina/treonina quinase” é um composto que inibe a atividade serina/treonina quinase de uma proteína serina/treonina quinase. Inibidores de quinase exemplares incluem imatinib, nilotinib, dasatinib, GDC-0879, PLX-4720, sorafenib, tosilato, dabrafenib, vemurafenib e LGX818. Imatinib mesilato (também resumidamente conhecido como STI571 ou 2-fenilaminopirimidina ou "imantinib"; comercializado como uma droga com a marca registrada "Gleevec" ou "Glivec") é um inibidor competitivo ATP de atividade tirosina quinase. Outras drogas inibidoras de quinase incluem bosutinib (SKI-606) e o inibidor de quinase aurora VX-680.

[0077] Um “inibidor de quinase do DDR2” é um composto que inibe a atividade quinase do DDR2, incluindo atividade quinase de um DDR2 com pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste em R105C, P321L, R458H, S467F, P476S, I488S, F574C, S667F, S674F, R680L, L701F, R742Q, T836A, N146K, R399Q e S702F. Um inibidor de quinase do DDR2 pode inibir atividade quinase de uma proteína do DDR2 diretamente, ou ele pode agir a montante inibindo ácido nucleico do DDR2 (por exemplo, inibindo transcrição ou tradução). Inibidores de quinase do DDR2 exemplares incluem imatinib, nilotinib e dasatinib.

[0078] Em uma modalidade deste aspecto da invenção, o método compreende administrar no indivíduo uma quantidade terapeuticamente efetiva de um inibidor de BRAF, além do inibidor do DDR2. Um “inibidor de BRAF” é qualquer composto que inibe a função de BRAF (incluindo atividade quinase de BRAF) e inclui inibidores de quinase que inibem a atividade quinase de BRAF, bem como siRNA específico para ácido nucleico de BRAF, shRNA específico para ácido nucleico de BRAF e anticorpos que ligam em BRAF e inibem atividade quinase de BRAF associada. O inibidor de BRAF pode ser um inibidor de serina/treonina quinase. Um “inibidor de quinase de BRAF” é um composto que inibe a atividade quinase de BRAF. Inibidores de quinase de BRAF exemplares incluem GDC-0879, PLX-4720, sorafenib, vemurafenib, tosilato, dabrafenib e LGX818.

[0079] Vias e frequência de administração dos agentes terapêuticos descritos aqui, bem como dosagem, variarão de indivíduo para indivíduo bem como com a droga selecionada, e podem ser facilmente estabelecidas usando técnicas padrões. Em geral, as composições farmacêuticas podem ser administradas, por injeção (por exemplo, intracutânea, intratumoral, intramuscular, intravenosa ou subcutânea), intranasalmente (por exemplo, por aspiração) ou oralmente. Em uma modalidade particular, a composição farmacêutica é administrada oralmente. Em um exemplo, entre 1 e 10 doses podem ser administradas por um período de 52 semanas. Preferivelmente, 6 doses são administradas, a intervalos de 1 mês, e tratamentos intensificadores podem ser dados periodicamente em seguida. Protocolos alternativos podem ser apropriados para pacientes individuais. Em uma modalidade, 2 injeções intradérmicas da composição são administradas com intervalos de 10 dias.

[0080] Uma "forma de dosagem oral sólida”, "forma de dosagem oral”, "forma de dose unitária”, "forma de dosagem para administração oral” e similares são usadas indiferentemente, e referem-se a uma composição farmacêutica na forma de um comprimido, cápsula, comprimido em forma de cápsula, cápsula de gelatina, comprimido de gelatina, pílula e similares.

[0081] Formas de dosagens tipicamente incluem um "excipiente”, que da maneira aqui usada, é qualquer componente de uma forma de dosagem que não é um API. Excipientes incluem ligantes, lubrificantes, diluentes, desintegrantes, revestimentos, componentes de camada de barreira, deslizantes, e outros componentes. Excipientes são conhecidos na técnica (vide HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS, FIFTH EDITION, 2005, editado por Rowe et al., McGraw Hill). Alguns excipientes servem múltiplas funções ou são os assim chamados excipientes de alta funcionalidade. Por exemplo, talco pode agir como um lubrificante, e um antiaderente, e um deslizante. Vide Pifferi et al., 2005, "Quality and functionality of excipients" Farmaco. 54:1-14; and Zeleznik and Renak, Business Briefing: Pharmagenerics 2004.

[0082] Uma dose adequada é uma quantidade de um composto que, quando administrada da maneira descrita anteriormente, é capaz de promover uma resposta imune anticancerígena, e é pelo menos 10 a 50% acima do nível basal (isto é, não tratada). Tal resposta pode ser monitorada usando métodos convencionais. Em geral, para composições farmacêuticas, a quantidade de cada droga presente em uma dose varia de cerca de 100 μg a 5 mg por kg de hospedeiro, mas versados na técnica perceberão que doses específicas dependem da droga a ser administrada e não são necessariamente limitadas a esta faixa geral. Igualmente, volumes adequados para cada administração variarão com o tamanho do paciente.

[0083] No contexto de tratamento, uma "quantidade terapeuticamente efetiva" de uma droga é uma quantidade de sal farmaceuticamente aceitável que elimina, suaviza, ou fornece alívio dos sintomas para os quais é administrada. As composições descritas são administradas de qualquer maneira adequada, frequentemente com veículos farmaceuticamente aceitáveis. Métodos adequados de administrar tratamento no contexto da presente invenção em um sujeito, e, embora mais que uma via possa ser usada para administrar uma composição particular, uma via particular pode frequentemente fornecer uma reação mais imediata e mais efetiva do que uma outra via. A dose administrada em um paciente, no contexto da presente invenção, poderia ser suficiente para promover uma resposta terapêutica benéfica no paciente com o tempo, ou inibir progressão da doença. Assim, a composição é administrada em um sujeito em uma quantidade suficiente para elicitar uma resposta efetiva e/ou para aliviar, reduzir, curar ou impedir pelo menos parcialmente sintomas e/ou complicações da doença. Uma quantidade adequada para realizar isto é definida como uma "dose terapeuticamente efetiva".

[0084] Em geral, uma dosagem e regime de tratamento apropriados envolvem administração do(s) composto(s) ativo(s) em uma quantidade suficiente para fornecer benefício terapêutico e/ou profilático. Uma resposta como essa pode ser monitorada estabelecendo um melhor resultado clínico (por exemplo, remissões mais frequentes, sobrevivência sem doença completa, parcial ou mais prolongada) em pacientes tratados comparados com pacientes não tratados.

[0085] Em alguma modalidade, IC50 para inibição de atividade quinase do DDR2 tipo selvagem é na faixa de 600 nM para imatinib, 50 nM para nilotinib e 1,5 nM para dasatinib (Day E, et al. Inibição de ativação 1 e 2 do receptor do domínio de discoidina induzido por colágeno por imatinib, nilotinib e dasatinib. Molec Cell Pharm 2008;599:44-53), que são abaixo das concentrações baixas de plasma obteníveis das drogas em sua dosagem oral diária atual (4 uM, 2 uM e 100 nM respectivamente, vide Bradeen et al. Blood 2006;108:2332-2338).

[0086] O inibidor do DDR2 e inibidor de BRAF, se ambos administrados, podem ser administrados sequencial ou simultaneamente, e podem ser formulados separadamente ou como uma única composição.

Kits

[0087] Em uma modalidade da invenção, um kit pode ser usado para conduzir os métodos de diagnóstico e prognóstico descritos aqui. Tipicamente, o kit poderia conter, em um veículo ou recipiente compartimentalizado, reagentes usados em qualquer das modalidades supradescritas do método de diagnóstico. O veículo pode ser um recipiente ou suporte, na forma, por exemplo, de saco, caixa, tubo, prateleira, e é opcionalmente compartimentalizado. O veículo pode definir um confinamento fechado com propósito de segurança durante transporte e armazenamento. Um kit descrito aqui pode conter instruções impressas ou eletrônicas para realizar um ensaio que emprega os reagentes contidos no kit. Em uma modalidade, o kit inclui um ou mais oligonucleotídeos iniciadores de PCR capazes de amplificar e sequenciar. Oligonucleotídeos iniciadores relevantes incluem

[0088] Da maneira aqui usada, um “oligonucleotídeo iniciador” é um oligonucleotídeo que é complementar a uma sequência de nucleotídeos alvo e leva a adição de nucleotídeos na extremidade 3‘ do oligonucleotídeo iniciador na presença de um DNA ou RNA polimerase. O nucleotídeo 3‘ do oligonucleotídeo iniciador poderia no geral ser idêntico à sequência alvo em uma posição de nucleotídeo correspondente para extensão e/ou amplificação ideais. A expressão “oligonucleotídeo iniciador” inclui todas as formas de oligonucleotídeos iniciadores que podem ser sintetizadas, incluindo oligonucleotídeos iniciadores do ácido nucleico de peptídeo, oligonucleotídeos iniciadores do ácido nucleico travados, oligonucleotídeos iniciadores modificados com fosforotioato, oligonucleotídeos iniciadores marcados e similares. Da maneira aqui usada, um “oligonucleotídeo iniciador direto” é um oligonucleotídeo iniciador que é complementar à fita de DNA antissentido. Um “oligonucleotídeo iniciador reverso” é complementar à fita de DNA sentido.

[0089] O kit pode também incluir tampões adequados, reagentes para isolar ácido nucleico e instruções para uso. Kits podem também incluir um microarranjo para medir nível de miRNA.

[0090] Os oligonucleotídeos iniciadores podem ser marcados com um marcador detectável tais como isótopos radioativos, ou marcadores de fluorescência. Instruções para usar o kit ou reagentes contidos nele são também incluídas no kit.

EXEMPLOS Exemplo 1: Identificação de mutações do DDR2 inéditas em câncer

[0091] O teste seguinte foi conduzido, que reporta um resultado DETECTADO/NÃO DETECTADO para qualquer mutação ou inserções- deleções observadas nos dezesseis éxons DDR2 codificantes e em éxons BRAF 11 e 15, que são os sítios de >99% das mutações BRAF de ativação conhecidas em melanoma identificado.

[0092] Ácido nucleico total foi extraído de tecidos embebidos em parafina em formas de bloco ou afixados em lâminas. Para um método de detecção, trinta e seis pares de oligonucleotídeos iniciadores foram projetados para amplificar sequências de DDR2 codificante total e éxon BRAF 11/15 que são localizados no cromossomo 1 e 7 em um dispositivo microfluídico, chip de Arranjo de Acesso 48.48. Todos os amplicons de cada amostra foram colhidos no chip Arranjo de Acesso. Os amplicons agrupados foram reparados na extremidade e um adaptador A codificado por barra exclusivo e um adaptador P1 foram ligados em ambas extremidades de amplicons para cada amostra. Os amplicons de DNA resultantes foram a “biblioteca de sequenciamento de DNA’ com uma sequência de código de barra exclusiva para cada amostra. 12~16 bibliotecas de DNA foram misturadas igualmente para produzir um agrupamento de fragmento de DNA de 300 milhões. A PCR em emulsão foi realizada misturando 1 mL de mistura da reação PCR contendo o agrupamento da biblioteca e Partícula de Esfera Iônica (ISP) e 9 mL de óleo. As microesferas de ISP foram recuperadas a partir de PCR em emulsão e as ISPs molde-positivas foram enriquecidas, as ISPs foram carregadas para um chip para análise de sequenciamento semicondutor. Dados brutos de sequenciamento foram transferidos para o Ion Torrent e processados nos formatos da sequência padrão da geração seguinte. Os dados da sequência foram alinhados e analisados por Software Ion Suite, SeqNext ou software NEXTGen usando número de acesso GenBank NM__006182 como referência. Este teste semiquantitativo reporta um resultado DETECTADO/NÃO DETECTADO para qualquer mutação ou inserções- deleções observados nos dezesseis éxons DDR2 codificante e nos éxons BRAF 11 e 15, que são os sítios de >99% de mutações BRAF de ativação conhecidas em melanoma identificado. Tabela 1 Controles Usados

Exemplo 2

[0093] Mutações somáticas em DDR2 foram identificadas em melanomas que continham uma mutação V600 BRAF. Todas as mutações foram detectadas por sequenciamento avançado de Ion Torrent e então confirmadas por sequenciamento de Sanger bidirecional. Tabela 2. Mutações Somáticas de DDR2 Inéditas Identificadas em Melanoma.

[0094] Mutações do DDR2 inéditas em resíduos conservados no DDR2 incluindo R105C, P321L, R458H, F574C, S667F e L701F foram identificadas em melanoma maligno de humano. Aproximadamente 50% das mutações do DDR2 em melanoma foram associados com mutações simultâneas da serina/treonina quinase do BRAF no códon 600. Com base nos níveis de mutação, mutações de DDR2 e BRAF são previstas estar presentes na maioria, se não todas, as células tumorais.

[0095] Essas descobertas sugerem que desregulagem por uma mutação do DDR2 desempenha um papel em progressão de melanoma em virtude de, diferente das mutações BRAF, não termos observado mutações do DDR2 nas pintas. Esta descoberta é interessante sob a luz de um estudo prévio, que demonstra que infrarregulagem de DDR2 em uma linhagem celular de melanoma pode modular seu potencial metastático (Oncol Rep 2011 Oct;26(4):971-8) e media interrupção do ciclo celular e o fenótipo de adesão de células de tumor primário (Frontiers in Bioscience 10, 2922-2931, September 1, 2005). Esta descoberta pode também ser usada para distinguir melanoma das pintas, que pode ser difícil de distinguir tanto clínica quanto histologicamente.

[0096] Mutações do DDR2 fornecem uma característica genética alvejável em um grupo de melanomas para inibidores de tirosina quinase tais como imatinib, dasatinib e nilotinib. IC50 para inibição de atividade quinase do DDR2 tipo selvagem é na faixa de 600 nM para imatinib, 50 nM para nilotinib e 1,5 nM para dasatinib (Day E, et al. Inibição da ativação 1 e 2 do receptor do domínio de discoidina induzido por colágeno por imatinib, nilotinib e dasatinib. Molec Cell Pharm 2008; 599:44-53), que são abaixo do plasma realizável através de concentrações das drogas em sua dosagem oral diária atual (4 uM, 2 uM e 100 nM respectivamente, vide Bradeen et al. Blood 2006;108:2332-2338).

[0097] Portanto, melanoma pode ser tratado por alvejando da atividade quinase do DDR2 junto com alvejamento da atividade quinase de BRAF. Esta descoberta, portanto, abre uma opção terapêutica adicional para pacientes com melanoma.

Exemplo 3

[0098] DNA genômico extraído de blocos FFPE ou seções de tecido em amostras de tumor clínicas de rotina pode ser sequenciado por padrão sequenciamento de terminação da cadeia dideóxi baseado em PCR (método "Sanger"). Oligonucleotídeos iniciadores relevantes incluem: Tabela 3. PCR de DDR2/ Oligonucleotídeos Iniciadores de Sequenciamento

Exemplo 4

[0099] Para avaliar se DDR2 é mutado ou desregulado em melanoma, classificamos DNA extraído de uma variedade de diferentes lesões melanocíticas, focando particularmente nos melanomas de alto estágio que seriam candidatos a terapia do inibidor de quinase.

[00100] Mutações no domínio quinase DDR2, F574C, S667F e L701F, foram identificadas por sequenciamento de Ion Torrent de DNA genômico extraído de seções de FFPE macrodissecadas de melanomas primários. Normalizadas para estimativas patologistas de porcentagens de tumor nas áreas macrodissecadas, todas as mutações foram previstas estar presentes a níveis heterozigotos (porcentagens indicam leituras não normalizadas de sequência mutante comparado com tipo selvagem). Mutações foram confirmadas por sequenciamento de Sanger bidirecional.

[00101] Sequenciamento iônico foi realizado na plataforma PGM em um chip 316 e a química de sequenciamento de base 200; PCR em emulsão foi realizada no OneTouch ES ou 2 (todos da Life Technologies). Para produzir a biblioteca, PCR singleplex foi realizada no sistema de Arranjo de Acesso (Fluidigm, São Francisco do Sul, CA) usando oligonucleotídeos iniciadores projetados sob medida para 48 amplicons cobrindo toda a região codificante do DDR2 e éxons 11 e 15 de BRAF. Análise da sequência foi realizada em software SequencePilot (JSI Medical Systems, Costa Mesa, CA) Sequenciamento de Sanger foi realizada em um 3700 Genetic Analyzer, após PCR padrão, limpeza e métodos de sequenciamento do ciclo usando reagentes Big Dye v.3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA)

[00102] Usando um ensaio de sequenciamento Ion Torrent™ (Life Tecnologias, South San Francisco, CA) baseado em DNA para avaliar toda a região codificante do DDR2 bem como éxons 11 e 15 de BRAF, com confirmação pelo método de sequenciamento Sanger, identificamos mutações pontuais errôneas de DDR2 em 12/269 (4,5%) dos casos de melanoma. A mutação frequência não diferiu notadamente por estado de mutação de BRAF V600 em que mutações do DDR2 foram detectadas em 6/140 casos de BRAF- mutado (V600E em 4, V600K em 2) e 7/129 sem mutações BRAF. Todos exceto um dos melanomas mutados no DDR2 estava em estágio avançado: 3 foram detectados em metástases extracutâneas, e 7 em nódulos de pele ou subcutâneos secundários, sem mutações do DDR2 identificado em melanomas cutâneos primários no estágio inicial 31 classificado. Também, não foram identificadas mutações do DDR2 em 29 pintas benignas, incluindo pintas azuis, dérmicas típicas e pintas do composto e pintas displásicas.

[00103] Em cinco casos, mutações do DDR2 envolveram resíduo altamente conservados evolucionariamente no domínio quinase (por exemplo, F574C, S667F, e L701F mostrados na figura 2) sugerindo efeitos hipofuncionais na atividade quinase do DDR2. Mutações nos quatro outros casos foram R458H, S467F, P476S e I488S, todas localizadas na região específica do DDR2 do domínio citoplásmico. O agrupamento de mutações em resíduos do domínio quinase altamente conservados em melanoma foi diferente das descobertas anteriores em carcinomas do pulmão, onde mutações foram mais amplamente dispersas e envolveram os domínios de discoidina e citoplásmicos e áreas menos conservadas dos domínios de quinase.

[00104] Níveis de transcrição do DDR2 foram avaliados a partir do RNA total extraído das seções de FFPE de amostras de melanoma de humano macrodissecadas, usando síntese de cDNA/transcrição reversa de uma etapa e PCR em tempo real com oligonucleotídeo iniciador de ensaio/conjuntos de sonda Gene Expression para os genes DDR1, DDR2 e GAPDH no sistema de detecção 7500 (todos da Applied Biosystems). Níveis de transcrição do DDR2 foram normalizados em GAPDH transcritos usando o método delta Ct. Amostras incluem melanomas em estágio avançado com mutação do DDR2 (n = 5), sem DDR2 ou mutação V600 BRAF (wt, n = 17), e com mutação V600 BRAF, mas sem mutação do DDR2 (n = 20).

[00105] Usando PCR de transcrição reversa em amostras de melanoma FFPE macrodissecadas, notamos que DDR2 foi sobexpresso em 4 dos 5 melanomas mutados no DDR2 com material disponível comparado com apenas uma pequena minoria de melanomas não mutados de DDR2/BRAF em estágio avançado ou casos de BRAF V600-mutado que não tiveram mutações do DDR2 (Figura 3). Mutações do DDR2 foram observadas em 4/10 casos com relação aos níveis de transcrição de DDR2/GAPDH abaixo de 0,025 comparados com 1/32 casos com razões acima de 0,025 (p =.008). Níveis de transcrição de DDR1 foram mais variáveis nas amostras de melanoma, mas também baixas no subgrupo do DDR2-mutado (dados não mostrados). Isto sugere que DDR2 expressão pode ser usada como uma ferramenta de classificação para mutações do DDR2.

[00106] Infrarregulagem do DDR2 também foi notado em carcinoma do pulmão, com suprarregulagem observada em alguns outros tipos de tumor. Nos melanomas mutados no DDR2 identificado aqui, menor atividade de DDR2 poderia ser produzida por uma combinação de mutações de inativação ou hipofuncionais em um alelo e infrarregulagem transcricional do outro alelo.

[00107] Mutações do domínio quinase do DDR2 ocorrem em um subconjunto de melanomas em estágio avançado BRAF-mutado e provavelmente produzem quinases hipofuncionais com base nos códons afetados. Em muitos casos, o DDR2-mutado sobrepõe com o grupo BRAF- mutado de melanomas expostos ao sol típicos, mas, BRAF diferente, mutações do DDR2 não foram ainda observadas em pintas.

Exemplo 5

[00108] Mutações somáticas do DDR2 foram identificadas em carcinoma da célula basal, incluindo no domínio de discoidina (N146K), o domínio de interação intracelular (R399Q) e o domínio quinase (S702F). Vide Figuras 4 e 5. A frequência de mutações do DDR2 em uma pequena amostragem de carcinomas da célula basal foi 32%.

[00109] Deve-se entender que embora a presente invenção tenha sido especificamente descrita por modalidades preferidas e recursos opcionais, modificação, melhoria e variação das invenções incorporadas nela aqui descritas podem ser usados pelos versados na técnica, e que tais modificações, melhorias e variações são consideradas no escopo desta invenção. Os materiais, métodos, e exemplos fornecidos aqui são representativos de modalidades preferidas, são exemplares, e são pretendem limitar o escopo da invenção.

[00110] A invenção foi descrita ampla e genericamente aqui. Cada qual das espécies mais estreitas e agrupamentos subgenéricos que caem na descrição genérica também forma parte da invenção. Isto inclui a descrição genérica da invenção com uma condição ou limitação negativa removendo qualquer matéria em questão do gênero, indiferente se o material excisado é ou não especificamente citado aqui.

[00111] Além do mais, onde recursos ou aspectos da invenção são descritos em termos de grupos Markush, versados na técnica perceberão que a invenção é também descrita por meio disso em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo Markush.

[00112] Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, e outras referências mencionadas aqui são expressamente incorporados pela referência na sua íntegra, até o ponto em que se cada qual fosse incorporado pela referência individualmente. Em caso de conflito, a presente especificação, incluindo definições, prevalecerá.

[00113] As invenções descritas ilustrativamente aqui podem adequadamente ser praticadas na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações, não especificamente descritos aqui. Assim, por exemplo, os termos “compreendendo”, “incluindo”, contendo”, etc. devem ser lidos extensivamente e sem limitação. Adicionalmente, os termos e expressões empregados aqui foram usados como termos de descrição e não de limitação, e não existe nenhuma intenção no uso de tais termos e expressões de excluir nenhum equivalente dos recursos mostrados e descritos ou porções destes, mas sabe-se que várias modificações são possíveis no escopo da invenção reivindicada.

[00114] Outras modalidades são apresentadas nas reivindicações seguintes.

Claims (5)

1. Método para diagnosticar melanoma em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) amplificar, a partir do DNA genômico extraído de uma amostra de tecido do indivíduo suspeito de ter melanoma, o ácido nucleico que codifica uma proteína do receptor 2 do domínio discoidina (DDR2) da SEQ ID NO: 170, (b) sequenciar os amplicons obtidos para detectar a presença de um ácido nucleico que codifica a proteína DDR2 com uma mutação, em que a mutação é selecionada do grupo que consiste em R105C, P321L, R458H, S467F, P476S, I488S, F574C, S667F, S674F, R680L, L701F, R742Q e T836A, e (c) diagnosticar o indivíduo como portador de melanoma quando a mutação de DDR2 é detectada, indicando por meio disso que o indivíduo tem melanoma.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o melanoma é melanoma em estágio avançado.

3. Método para determinar probabilidade de responder ao tratamento com um inibidor de quinase em um indivíduo com melanoma, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) amplificar, a partir do DNA genômico extraído de uma amostra de tecido do indivíduo suspeito de ter melanoma, o ácido nucleico que codifica uma proteína do receptor 2 do domínio discoidina (DDR2) da SEQ ID NO: 170, (b) sequenciar os amplicons obtidos para detectar a presença de uma sequência de ácido nucleico codificando a proteína DDR2 tendo uma mutação selecionada do grupo que consiste em R105C, P321L, R458H, S467F, P476S, I488S, F574C, S667F, S674F, R680L, L701F, R742Q e T836A, e (c) identificar o indivíduo como provável a responder ao tratamento com um inibidor de quinase quando uma ou mais das mutações do DDR2 são detectadas, indicando por meio disso que o indivíduo provavelmente responde ao tratamento com um inibidor de quinase.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente detectar a presença de uma mutação do proto-oncogene B-Raf (BRAF), em que a mutação é V600E ou uma V600K.

5. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem melanoma em estágio avançado.