KR20100012876A

KR20100012876A - Ｅｒｃｃ1 발현에 기초한 화학요법을 결정하는 방법

Info

Publication number: KR20100012876A
Application number: KR1020097026317A
Authority: KR
Inventors: 캐슬린 디 데이넨버그
Original assignee: 리스판스 지네틱스, 인크.
Priority date: 2000-12-01
Filing date: 2001-11-29
Publication date: 2010-02-08
Also published as: US20020123051A1; TWI321155B; US6573052B2; KR101014345B1; US6518416B1

Abstract

본 발명은 의학, 특히 암 화학요법에 유용한 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명의 목적은 고정된 또는 고정된 파라핀 포매 조직에서 ERCC1 발현 수준을 평가하고, 환자의 종양 세포에서 ERCC1 mRNA의 양을 검사하고 이것을 선결된 역치 발현 수준과 비교함으로써 백금계 화학요법을 결정하는 방법을 제공하는 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍 ERCC1을 제공하고, 이를 ERCC1 mRNA의 수준의 검출에 사용하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

Description

ＥＲＣＣ1 발현에 기초한 화학요법을 결정하는 방법{METHOD OF DETERMINING A CHEMOTHERAPEUTIC REGIMEN BASED ON ERCC1 EXPRESSION}

본 발명은 의학, 특히 암 화학요법에 유용한 진단 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 환자의 종양 세포 유전자 발현의 평가 방법에 관한 것이다. DNA를 표적으로 하는 화학요법제, 특히 백금산염화하는 방식으로 DNA를 손상시키는 작용제로 치료한 환자의 생존율은 인간의 DNA 복구에 관여하는 유전자로부터 발현된 mRNA를 검사함으로써 분석한다.

암은 정상 세포가 신생물 변형을 겪고 악성 세포가 될 때 발생한다. 변형된(악성) 세포는 세포 표현형을 특정하고 세포 증식을 억제하는 정상의 생리학적 제어를 회피한다. 이렇게 하여 개체의 체 내에서 변형된 세포가 증식하여 종양을 형성한다. 종양이 발견될 때, 임상적 목적은 치료를 받는 개체에서 정상 세포에 야기된 어떠한 피해를 완화하면서 악성 세포를 선택적으로 파괴하는 것이다.

화학요법은 암 세포에 선택적으로 독성이 있는(세포 독성의) 약물의 사용에 기초하는 것이다. 여러 가지 일반적 종류의 화학요법 약물이 개발되어 왔는데, 예컨대, 핵산 합성, 단백질 합성 및 기타 중요한 대사 과정에 관여하는 약물이 있다. 이들은 일반적으로 항대사물질 약물로 지칭된다. 기타 종류의 화학요법 약물은 세포성 DNA에 손상을 끼친다. 이러한 종류의 약물은 일반적으로 유전자 독성이 있다고 언급된다. 그러나, 목적 화학요법 약물 또는 종종 약물들의 배합물에 대한 개체 신생물의 민감성은 치료의 시행 기간 후에만 정확히 평가할 수 있다. 성공적이지 못한 시행 기간에 투자된 시간은 활동성 악성 종양의 임상적 관리에 상당한 위험을 부과한다.

세포성 DNA에 대한 손상의 복구가 세포의 효소적 DNA 복구 기구에 의해 수행되는 중요한 생물학적 과정이다. 세포의 게놈에서의 비복구된 병변은 DNA 복제를 방해하고, 새로이 합성된 DNA의 복제 충실도 및/또는 세포 생존에 필요한 유전자의 발현을 방해할 수 있다. 따라서, 유전자 독성 약물은 일반적으로 비활동성 비분열성 세포에 대한 것보다 DNA 합성에 관여하는 활동적으로 분열하는 세포에 더 독성이 있는 것으로 간주된다. 다수의 신체 조직의 정상 세포는 비활동성이고 드물게 세포 주기로 다시 진입하여 분열한다. 일반적으로 화학요법적 유전자 독소에 의해 영향을 받는 정상 세포에서의 DNA 손상의 복구에는 세포 분열의 순환 사이에 보다 긴 시간이 소요된다. 결과적으로, 암 세포를 죽이는 데는 약간의 선별이 이루어진다. 다수의 치료 방법이 상기 일반적인 종류 중 2종 이상에 속하는 화학요법 약물을 동시 투여함으로써 암 세포에 대한 선별능을 개선시키기 위한 시도를 반영한다.

고형 종양에서의 효과적인 화학요법이 통상 작용제의 배합을 필요로 하기 때문에, 각각의 단일 약물에 대한 내성이나 민감성의 결정인자의 확인 및 정량분석은 개체의 배합 화합요법을 고안하기 위한 중요한 도구가 되어 왔다.

세포성 DNA를 손상시키는 것으로 나타난 두 가지 널리 사용되는 유전자 독성 항암 약물은 시스플라틴(DDP) 및 카르보플라틴이다. 시스플라틴 및/또는 카르보플라틴은 현재 호흡기, 위장 및 생식기의, 중추신경계의, 그리고 머리와 목에서의 인상 기원의 암 및 육종을 비롯한, 상피 및 간엽의 선별된 다양한 신생물의 치료에 사용된다. 다른 작용제와의 배합물 상태의 시스플라틴은 현재 고환암의 처방에 선호되며, 다수의 경우에 지속직인 완화를 산출한다(Loehrer 등, 1984, 100 Ann. Int. Med. 704). 시스플라틴(DDP)은 가닥내 부가물의 형성을 통해 DNA 구조를 파괴한다. DDP와 같은 백금제에 대한 내성은 백금 부가물에 대한 증가된 관용성, 감소된 약물 축적 또는 증가된 DNA 복구의 원인이 되어 왔다. DDP에 대한 내성은 다인자성이지만, DNA 복구 메카니즘에서의 변형이 아마도 중요한 역할을 할 것이다. 백금제에 의해 형성된 것과 같은 대형 DNA 부가물의 절제 복구가 DNA 손상 인식 및 절제에 관여하는 유전자에 의해 매개되는 것으로 보인다(Cleaver 등, Carcinogenesis 11:875-882 (1990); Hoeijimakers 등, Cancer Cells 2:311-320 (1990); Shivji 등, Cell 69:367-374 (1992)). 실제로, 효소적 DNA 복구 기구의 하나 이상의 요소에 유전적 결함을 보유한 세포는 시스플라틴에 극히 민감하다(Fraval 등 (1978), 51 Mutat. Res. 121, Beck and Brubaker (1973), 116 J. Bacteriol 1247).

절제 복구 상호 보상(ERCC1) 유전자가 DNA 부가물의 복구에 필수적이다. 인간의 ERCC1 유전자는 클로닝되었다(Westerveld 등, Nature(런던) 310:425-428 (1984); Tanaka 등, Nature 348:73-76 (1990)). 상기 유전자에 결함이 있는 돌연변 이 인간 및 햄스터 세포주를 사용한 여러 가지 연구는 ERCC1에 의해 암호화된 생성물이 백금-DNA 부가물의 절제 복구에 관여한다는 것을 나타낸다(Dabholkar 등, J. Natl. Cancer Inst. 84:1512-1517 (1992); Dijt 등, Cancer Res. 48:6058-6062 (1988); Hansson 등, Nucleic Acids Res. 18: 35-40(1990)).

DNA-복구 결손 CHO 세포 내로 형질감염시킬 때, ERCC1은 백금-DNA 부가물을 복구하는 능력과 함께 시스플라틴에 대한 세포 내성을 부여한다(Hansson 등, Nucleic Acids Res. 18: 35-40(1990)). 현재 받아들여지고 있는 절제 복구의 모델은 손상 인식/절제 단계가 절제 복구 과정에서 속도 결정 단계임을 시사한다.

백금계 요법을 받은 암 환자로부터 얻은 악성 세포에 ERCC1과 같은 절제 복구 유전자의 발현의 상대 수준이 검사되어 왔다(Dabholkar 등, J. Natl. Cancer Inst. 84:1512-1517 (1992)). 시스플라틴(DDP)/플루오로우라실의 화학요법으로 치료할 때 위암 환자에서의 ERCC1 과다발현이 종양 반응 및 궁극적인 생존율에 부정적인 영향을 미치는 것으로 보고되었다(Metzger 등, J Clin Oncol 16:309, 1998). 최근의 증거는 겜시타빈(Gem)이 ERCC1 뉴클레오티드 절제 복구(NER) 활성을 조절할 수 있다는 것을 나타내고 있다. 따라서, ERCC1 발현의 종양내 수준이 DDP 및 GEM이 암 환자에게 효과적인 화학요법제가 될 것인지 여부를 결정하는 주요한 예후 인자가 될 수 있다.

대부분의 병리학적 샘플은 통상적으로 고정되고 파라핀에 매립되어(FPE) 조직학적 분석 및 후속의 기록 저장능 가능하게 한다. 따라서, 대부분의 생검 조직 샘플은 그러한 연구가 유전자 발현의 정확한 측정을 할 수 있도록 RNA의 높은 완전 성을 필요로 하기 때문에 유전자 발현의 분석에는 유용하지 않다. 현재, 유전자 발현 수준은 단백질 발현 수준을 모니터하기 위해 면역 조직 화학적 염색법을 사용하여 그러한 고정된 포매 샘플에서 정성적으로만 모니터할 수 있다.

지금까지, ERCC1 발현에 대한 것을 포함하는 정량적 유전자 발현 연구는 생 조직 또는 동결된 조직으로부터 RNA의 역전사효소 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 증폭에만 국한되어 왔다. 미국 특허 제5,705,336호(Reed 등)에는 난소 종양 조직으로부터 ERCC1 mRNA를 정량 분석하고, 조직이 백금계 화학요법에 민감한지 여부를 측정하는 방법이 개시되어 있다. Reed 등은 동결된 난소 종양 생검으로부터 ERCC1 mRNA를 정량 분석한다.

Reed 등의 특허에 기재된 것과 같은 건강 보호 전문가에 의한 동결 조직의 사용은 실질적인 불편을 초래한다. 조직과 후속의 mRNA의 분해를 피하기 위한 신속한 생검 전달이 임의의 RNA계 정량적 유전자 마커 분석을 계획할 때 주요한 관심거리이다. 생검을 실시하는 건강 보호 전문가는 조직 샘플 수령 즉시 RNA 추출 프로토콜을 수행하도록 장치된 설비로 조직 샘플을 신속히 전달해야 한다. 그러한 설비를 이용할 수 없으면, 임상의는 mRNA 분해를 방지하기 위하여 샘플을 신속히 동결시켜야 한다. 진단 설비가 조직 및 RNA 분해 이전에 유용한 RNA 추출 프로토콜을 실시하도록 하기 위하여, 조직 샘플은 그것이 아무리 멀리 떨어져 있더라도 진단 설비에 도달할 때까지 동결된 채로 유지되어야 한다. 액체 질소 및 드라이 아이스가 채워진 전문 운송 수단을 사용하여 수송하는 중의 동결 조직의 완전도의 유지는 상당한 비용을 들여야만 가능하다.

통상의 생검은 일반적으로 지질 및 종양 조직의 이질성 혼합물을 포함한다. 생 조직 또는 동결 조직과는 달리, FPE 생검 조직 샘플은 용이하게 미세분할되고 지질 및 종양 조직 내로 분리되며, 따라서, 생조직 또는 동결 조직의 사용에 비해 장점을 제공한다. 그러나, 고정된 조직 및 특히 고정된 파라핀 포매 조직으로부터의 RNA의 분리는 일반적으로는 유전자 발현 연구에 적용할 수 없는 고도로 분해된 RNA를 생성시킨다.

생물학적 샘플로부터 RNA를 정제하는 데는 다수의 기법이 존재하나, FPE 샘플로부터 RNA를 분리하는 신뢰할만한 기법은 없다. 예컨대, Chomczynski(미국 특허 제5,346,994호)는 페놀 및 구아니딘 이소티오시아네이트를 사용하여 액체상 분리에 기초하는 조직으로부터 RNA를 정제하는 방법을 개시하고 있다. 생물학적 샘플은 페놀 및 구아니딘 이소티오시아네이트의 수용액 중에 균질화시키고, 그 후 균질물을 클로로포름과 혼합한다. 원심분리 이후에, 균질물은 유기 상, 중간 상 및 수성 상으로 분리된다. 단백질은 유기 상 중에, DNA는 중간 상에, 그리고 RNA는 수성 상에 분리된다. RNA는 수성 상으로부터 침천시킬 수 있다. 불행하게도, 이 방법은 고정된 파라핀-포매(FPE) 조직 샘플에는 적용할 수 없다.

RNA를 분리하는 기타 알려진 기법은 통상 문헌[Sambrook, J. 등(1989) pp.7.3~7.24] 및 문헌[Ausubel, F. M. 등(1994) pp.4.0.3-4.4.7]에 기재된 바와 같이 구아니딘염 또는 페놀 추출을 이용한다. 다시 말하면, 공지의 방법들은 어느 것도 파라핀-포매 조직 샘플로부터 RNA를 분리를 초래하는 재현 가능한 정량 분석 결과를 제시하지 못한다.

따라서, 파라핀-매립 조직으로부터 RNA를 분리하는 기법은 특정 수용체 또는 효소의 발현 수준을 사용하여 특정 치료의 성공 가능성을 결정할 수 있기 때문에 종양 조직에서의 유전자 발현의 연구에 특히 필요하다.

제안된 유전자 독성 암 요법에 초기의 예후를 제공하기 위하여 파라핀화된 조직으로부터 ERCC1 mRNA를 정량 분석하는 방법이 필요하다. 결과적으로, 고정되고 파라핀화된(FPE) 조직에서 ERCC1 발현의 정량 분석을 얻기 위해서 당해 분야에서 아직 성공하지 못한 합의된 노력이 경주되어 왔다. 따라서, 본 발명의 목적은 고정된 파라핀 포매(FPE) 조직에서 ERCC1 수준을 평가하고, DNA 손상제를 사용한 치료에 대한 환자의 종양의 가능한 내성을 예측하며, 환자의 종양 세포에서 ERCC1 mRNA의 양의 검사에 의해 DNA 백금화제에 의해 생성되는 DNA 중의 병변의 유형을 생성시키고, 그것을 선결된 역치 발현 수준과 비교하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 해결하고자 하는 과제는 고정된 파라핀 포매(FPE) 조직에서 ERCC1 수준을 평가하고, DNA 손상제를 사용한 치료에 대한 환자의 종양의 가능한 내성을 예측하며, 환자의 종양 세포에서 ERCC1 mRNA의 양의 검사에 의해 DNA 백금화제에 의해 생성되는 DNA 중의 병변의 유형을 생성시키고, 그것을 선결된 역치 발현 수준과 비교하는 방법을 제공코자 하는 것이다.

본 발명의 목적은 (a) 조직 샘플에서 파라핀을 제거하여 파라핀이 제거된 샘플을 얻는 단계; (b) 약 5 내지 약 120분의 시간 동안 약 75 내지 약 100℃의 온도 범위로 유효 농도의 카오트로픽제(chaotropic agent)를 포함하는 용액 내에서 상기 샘플을 가열시키고, 상기 카오트로픽제로부터 mRNA를 회수함으로서 상기 파라핀이 제거된 샘플로부터 mRNA를 분리하는 단계; (c) 서열번호 1의 서열 또는 이에 80% 이상 동일한 서열을 지닌 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 서열 또는 이에 80% 이상 동일한 서열을 지닌 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 1쌍을 사용하여 상기 mRNA를 증폭시켜 증폭된 샘플을 얻는 단계; 및 (d) 구성적으로 발현되는 유전자의 mRNA의 양에 상대적인 ERCC1 mRNA의 양을 측정하는 단계를 포함하는 고정된 파라핀 포매 조직 샘플에서 절제 복구 상호-보상(ERCC1) 유전자 발현 수준을 측정하는 방법을 제공하는 것이다.

또한 상기 구성적으로 발현되는 유전자는 β-액틴임을 특징으로 한다.

한편 본 발명의 또다른 목적은 서열번호 1의 서열 또는 이에 80% 이상 동일한 서열을 지니는 올리고뉴클레오티드 프라이머에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 2의 서열 또는 이에 80% 이상 동일한 서열을 지니는 올리고뉴클레오티드 프라이머와 함께 고정된 파라핀 포매 조직 샘플에서 추출된 RNA를 이용하여 ERCC1 유전자 부분을 증폭하는데 효과적임을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 또다른 목적은 서열번호 2의 서열 또는 이에 80% 이상 동일한 서열을 지니는 올리고뉴클레오티드 프라이머에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1의 서열 또는 이에 80% 이상 동일한 서열을 지니는 올리고뉴클레오티드 프라이머와 함께 고정된 파라핀 포매 조직 샘플에서 추출된 RNA를 이용하여 ERCC1 유전자 부분을 증폭하는데 효과적임을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제공하는 것이다.

한편 본 발명의 또다른 목적은 서열번호 1의 서열 또는 이에 80% 이상 동일한 서열을 지니는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 서열 또는 이에 80% 이상 동일한 서열을 지니는 올리고뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드 프라이머 1쌍을 포함하는 ERCC1 유전자 발현 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 효과는 고정된 파라핀 포매(FPE) 조직에서 ERCC1 수준을 평가하고, DNA 손상제를 사용한 치료에 대한 환자의 종양의 가능한 내성을 예측하며, 환자의 종양 세포에서 ERCC1 mRNA의 양의 검사에 의해 DNA 백금화제에 의해 생성되는 DNA 중의 병변의 유형을 생성시키고, 그것을 선결된 역치 발현 수준과 비교하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 측면으로, 고정된 파라핀 포매(FPE) 종양 세포로부터 얻은 ERCC1 mRNA의 발현의 수준을 평가하는 방법이 제시된다.

본 발명의 또 다른 측면으로는, 고정된 파라핀 포매(FPE) 조직 샘플로부터의 내부 대조군에 상대적인 ERCC1 mRNA 발현량을 정량 분석하는 방법이 제시된다. 이 방법은 상기 샘플로부터 총 mRNA를 분리하고, 내부 대조군 유전자의 mRNA의 양에 상대적인 ERCC1 mRNA의 양을 측정하는 것을 포함한다.

본 발명의 상기 측면의 일 양태로, ERCC1-504F(서열번호 1) 또는 ERCC1-574R(서열번호 2)의 서열과 이와 실질적으로 동일한 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드가 제시된다. 본 발명은 또한 서열번호 1 또는 서열번호 2에 하이브리드화되는 서열 또는 그 상보체를 엄중한 조건하에 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면으로, 환자에 대한 화학요법을 결정하는 방법이 제시되는데, 이 방법은 고정된 파라핀 포매(FPE) 종양 샘플로부터 RNA를 분리하는 단계; 샘플내 ERCC1의 유전자 발현 수준을 측정하는 단계; 샘플내 ERCC1 유전자 발현 수준을 ERCC1 유전자에 대한 선결된 역치 수준과 비교하는 단계; 및 선결된 역치 수준과 ERCC1 유전자 발현의 비교 결과에 기초하여 화학요법을 결정하는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 프리-태크맨(등록상표, pre-TaqMan

) 기술에 의해 분석된 샘플로부터 내부 대조군에 상대적인 공지의 ERCC1 발현 수준으로 태크맨(등록상표) 기술을 사용하여 분석된 조직 샘플내 내부 대조군 유전자에 상대적인 ERCC1의 미보정된 유전자 발현율(UGE)을 정규화하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 부분적으로는 종양에서의 ERCC1 mRNA의 양이 DNA 백금산염화제로 처리한 환자에서의 생존율과 상관 관계가 있다는 발견에 근거한다. 고수준의 ERCC1 mRNA을 발현시키는 종양 환자는 백금계 화학요법에 내성이 있는 것으로 간주되고, 이것은 더 낮은 수준의 생존능을 가진다. 역으로, 적은 양의 ERCC1 mRNA을 발현시키는 종양이 있는 환자들은 백금계 화학요법에 민감한 경향이 있고, 더 높은 수준의 생존능을 가진다. 종양 ERCC1 mRNA의 환자의 상대 발현율은 그것을 선결된 역치 발현 수준과 비교하여 판단한다.

본 발명은 내부 대조군의 유전자 발현에 비해 고정된 파라핀 포매(FPE) 조직에서의 ERCC1 mRNA 발현량을 정량 분석하는 방법에 관한 것이다. 본원 발명자들은 고정된 포매 조직에서의 ERCC1 발현의 정확한 평가를 할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 개발하였다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머인 ERCC1-504F(서열번호 1), ERCC1-574R(서열번호 2) 또는 그이들과 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머는 고정된 파라핀 포매(FPE) 종양 샘플로부터 추출된 RNA와 함께 사용하는 것이 바람직하다. ERCC1 유전자 발현의 이러한 측정은 백금계 화학요법의 예후에 사용할 수 있다.

*본 발명의 상기 양태는 첫째, FPE 샘플로부터 RNA의 신뢰가능한 추출 방법 및 둘째, 역전사 폴리머라제 연쇄 반응을 수행하기 위해, 한쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 바람직하게는 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍 ERCC1-504F(서열번호 1) 및 ERCC1-574R(서열번호 2) 또는 이들과 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드를 사용하는 샘플내 ERCC1 mRNA 함량의 측정 방법을 포함한다. RNA는 본 명세서에 전적으로 참고로 인용하는 미국 특허 출원 제09/469,338호(1999년 12월 20일 출원)에 기재된 바와 같이 상기 샘플로부터 mRNA를 분리하는 임의의 방법 중 하나에 의해 FPE 세포로부터 추출된다.

본 발명의 방법은 환자로부터 얻은 어떠한 조직 유형에도 적용할 수 있다. 종양 조직의 내성의 검사를 위해서는, 종양 조직을 검사하는 것이 바람직하다. 바람직한 양태에서, 종양을 얻은 환자의 정상 조직의 일부 역시 검사한다. 정상 조직이 백금계 화학요법 화합물에 내성이 있을 것으로, 즉 고수준의 ERCC1 유전자 발현을 나타낼 것으로 예측되지만, 그 종양이 그러한 화합물에 민감할 것으로, 즉 저수준의 ERCC1 유전자 발현을 나타낼 것으로 예측되는 환자는 화학요법 조성물의 보다 다량으로 치료할 수 있다.

역치 수준 이하의 ERCC1 유전자 발현 수준을 나타내는 환자들은 화학요법 조성물의 보다 다량으로 치료할 수 있는데, 이것은 이들이 역치 수준 이상의 ERCC1 유전자 발현 수준을 나타내는 종양을 가진 환자들보다 더 큰 생존능을 가질 것으로 예측되기 때문이다. 한편, 임상의는 역치 수준 이상의 ERCC1 유전자 발현을 나타내는 종양을 가진 환자가 낮을 것으로 예측된 생존능이 주어진 화학요법으로부터 어떠한 중요한 이점도 유도할 수 없다는 것을 측정할 수 있다.

본 발명의 방법은 광범위한 종양 유형에 적용할 수 있다. 이것은 개체의 "종양 발현 프로필"을 작성할 수 있게 함으로써 ERCC1의 발현 수준을 개개의 환자 샘플에서 측정하고 다양한 화학요법에 대한 반응을 예측한다. 바람직하게는 본 발명의 방법은 고형 종양에 적용되며, 가장 바람직하게는 비 소세포 폐암(NSCLC) 종양에 적용된다. 본 발명의 일부 양태를 특정 종양 유형에 적용하기 위해서는, 특정 ERCC1 발현과 백금계 화학요법에 대한 임상적 내성을 상호 관련시킬 수 있는 데이터세트를 수집함으로써 생존능에 대한 ERCC1 유전자 발현의 관계를 확인하는 것이 바람직하다.

본 명세서에서 "선결된 역치 수준(predetermined threshold level)"이란 종양이 백금계 화학요법에 내성이 있을 가능성이 있는 것으로 확인되는 것 이상의 ERCC1 종양 발현의 보정된 상대 수준이다. 이 역치 수준 이하의 종양 발현 수준은 백금계 화학요법에 민감한 종양에서 발견될 가능성이 있다. 백금계 화학요법에 반응하는 종양들 사이에서 ERCC1: β-액틴의 비로 표현되는 ERCC1의 보정된 상대 발현율의 범위는 약 6.7 x 10^-3 미만이다. 백금계 화학요법에 반응하지 않는 종양은 ERCC1: β-액틴의 비가 6.7 x 10^-3 이상이 상대 발현율을 가진다(실시예 4 참조).

"선결된 역치 수준"은 또한 백금계 화학요법을 받은 환자가 낮은 생존능을 가질 가능성이 있는 것 이상의 종양 보정된 상대 ERCC1 발현 수준으로 정의된다. 백금계 화학요법을 받은 환자에서 이 역치 수준 이하의 종양 보정된 상대 ERCC1 발현 수준은 높은 환자 생존능과 상관 관계가 있다. ERCC1: β-액틴의 비로 표현되는 역치 보정된 상대 ERCC1 발현율은 약 6.7 x 10^-3 미만이다(도 1, 실시예 4 참조). 그러나, 본 발명은 내부 대조군 유전자로서 β-액틴의 사용에 국한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 양태의 방법을 실시함에 있어, 종양 세포는 환자로부터 분리하는 것이 바람직하다. 고형 또는 림프형 종양 또는 이들의 부분을 환자로부터 외과적으로 절제하거나 통상의 생검으로 얻는다. 동결 또는 생 샘플로부터 분리된 RNA는 당해 분야에 통상적인 방법들(예컨대, Sambrook, Fischer and Maniatis, Molecular Cloning, 실험실 매뉴얼(2판), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 뉴욕(1989)) 중의 하나에 의해 세포로부터 추출한다. 추출 과정 중에 RNA의 분해를 방지하기 위해 주의를 기울이는 것이 바람직하다.

그러나, 생검후 환자에게서 얻은 조직은 통상 포르말린(포름알데히드) 또는 글루테르알데히드에 의해, 또는 알콜 침지에 의해 종종 고정된다. 고정된 생물학적 샘플은 종종 탈수되고 당해 분야의 숙련자에게는 알려진 파라핀 또는 기타 고형 지지체에 포매된다. 비포매 고정된 조직을 본 발명의 방법에 사용할 수도 있다. 그러한 고형 지지체는 보존된 조직의 후속 재수화를 위해 유기 용매로 제거할 수 있도록 한다.

RNA는 본원에 전적으로 참고로 인용하는 미국 특허 출원 제09/469,338호(1999년 12월 20일 출원)에 기재된 방법들 중 하나에 의해 FPE 세포로부터 추출한다. 본 명세서에 기재된 고정된 파라핀 포매(FPE) 조직 샘플은 저장 가능한 또는 기록용 조직 샘플로 언급된다. RNA는 먼저 파라핀이 제거되는 기록용 병리 샘플 또는 생검 샘플로부터 분리할 수 있다. 파라핀 제거 방법의 일례는 파라핀화된 샘플을 크실렌과 같은 유기 용매로 세척하는 것을 포함한다. 파라핀이 제거된 샘플은 저급 알코올 수용액으로 재수화할 수 있다. 적합한 저급 알코올로는 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올이 있다. 파라핀 제거된 샘플은 점차 감소하는 농도의 저급 알코올 용액으로 연속 세척하여 재수화시킬 수 있다. 한편, 샘플은 파라핀 제거와 재수화를 동시에 실시한다.

RNA 추출을 위해, 고정된 샘플 또는 고정되고 파라핀 제거된 샘플을 기계적, 초음파 또는 기타 균질화 수단을 사용하여 균질화할 수 있다. 재수화된 샘플은 구아디니디늄 티오시아네이트(구아니디늄 이소티오시아네이트로 판매되기도 함)와 같은 카오트로픽제(chaotropic agent)를 포함하는 용액 중에서 균질화할 수 있다. 균질화된 샘플을 구아니디늄 화합물과 같은 카오트로픽제의 효과적인 양을 함유하는 카오트로픽 용액 중에서 약 50 내지 약 100 ℃ 범위의 온도로 가열한다. 바람직한 카오트로픽제는 구아니디늄 티오시아네이트이다.

"카오프로픽제의 효과적인 농도"는 RNA가 카오트로픽제의 부재 하에 분리된 것의 약 10배보다 더 많은 양으로 파라핀-포매 샘플로부터 정제한다. 카오트로픽제로는 구아니디늄 화합물, 요소, 포름아미드, 요오드화칼륨, 티오시안산칼륨 및 유사 화합물이 있다. 본 발명의 방법에 바람직한 카오트로픽제는 구아니디늄 이소티오시아네이트(구아니디늄 티오시아네이트로도 판매됨) 및 염화구아니디늄과 같은 구아니디늄 화합물이다. 다수의 음이온성 짝이온이 유용하며, 당업자라면 그러한 적당한 음이온으로 다수의 구아니디늄염을 만들 수 있다. 본 발명에 사용된 구아니디늄 용액의 효과적인 농도는 일반적으로 약 1 내지 약 5M의 범위의 농도를 가지며, 바람직한 값은 4M이다. RNA가 이미 용액 중에 존재하면, 구아니디늄 용액은 샘플 내에 달성된 최종 농도가 약 1 내지 약 5M의 범위가 되도록 보다 더 높은 농도를 가질 수 있다. 구아니디늄 용액은 또한 Tris-Cl과 같은 적당한 생화학 완충제를 사용하여 약 3 내지 약 6의 pH로 완충시키는 것이 바람직하고, pH는 약 4인 것이 더 바람직하다. 카오트로픽 용액은 또한 디티오트레이톨(DTT) 및 β-메르캅토에탄올(BME)과 같은 환원제를 함유할 수 있다. 카오트로픽 용액은 RNAse 저해제를 함유할 수도 있다.

균질화된 샘플을 구아니디늄 화합물과 같은 카오트로픽제의 효과적인 양을 함유하는 카오트로픽 용액 중에서 약 50 내지 약 100 ℃ 범위의 온도로 가열한다. 바람직한 카오트로픽제는 구아니디늄 티오시아네이트이다.

그 후, RNA를 예컨대, 페놀 클로로포름 추출, 이온교환 크로마토그래피 또는 크기-배제 크로파토그래피에 의해 용액으로부터 회수한다. RNA는 또한 추출, 전기영동, 크로마토그래피, 침전 또는 기타 적당한 기술을 사용하여 추가로 정제할 수 있다.

생 샘플, 동결 샘플 또는 고정된 샘플에서 얻은 총 mRNA로부터 ERCC1 mRNA의 정량 분석은 당해 분야에서는통상적인 역전사효소 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 방법을 사용하여 수행하는 것이 바람직하다. ERCC1 mRNA의 정량 분석을 위한 기타 방법으로는 다중 PCR에 유용한 분자 비콘 및 기타 표지된 프로브를 사용하는 것이 있다. 또한, 본 발명은 인베이더(등록상표) 분석(써드 웨이브 테크놀로지스 인크)의 그것과 유사한 형광 표지된 프로브를 이용하여 PCR이 없는 시스템을 통해 ERCC1 mRNA를 정량 분석하는 것이다. ERCC1 cDNA 및 내부 대조군 또는 하우스 키핑 유전자(예컨대, β-액틴)의 정량 분석은 형광에 기초한 실시간 검출 방법(ABI PRISM 7700 또는 7990 서열 분석 시스템[태크맨], 캘리포니아주 포스터시 소재의 어플라이드 바이오시스템스), 또는 문헌[Heid 등, (Genome Res 1996;6:986-994)] 및 [Gibson 등(Genome Res 1996;6:995-1001)]에 기재된 것과 유사한 시스템을 사용하여 수행한다. ABI 7700(태크맨 인스트루먼트)의 생성물은 Ct 즉 "사이클 역치(cycle threshold)"로 표현한다. 태크맨 시스템으로, 샘플내 보다 많은 수의 표적 분자를 갖는 고도로 발현된 유전자는 더 적은 표적 분자를 갖는 보다 낮은(보다 높은 Ct) 상대 발현율의 유전자보다 더 적은(보다 낮은 Ct) PCR 사이클을 가진 신호를 발생시킨다.

본 명세서에 언급되는 "하우스 키핑" 유전자 또는 "내부 대조군(internal control)"는 ERCC1 mRNA 수준의 평가를 가능하게 하는 임의의 구성적으로 또는 전체적으로 발현되는 유전자를 의미한다. 그러한 평가는 유전자 전사의 전체적인 구성 수준의 측정 및 RNA 회수에서의 변수의 제어를 포함한다. "하우스-키핑" 유전자 또는 "내부 대조군"으로는 시클로필린 유전자, β-액틴 유전자, 트랜스페린 수용체 유전자, GAPDH 유전자 등이 있으나, 이에 국한되지 않는다. 내부 대조군 유전자는 문헌[Ead 등, Cancer Research 1999; 59:2302-2306]에 기재된 바와 같이 β-액틴 유전자가 가장 바람직하다.

RNA 회수에서의 변수의 제어는 "검정 RNA"의 사용을 필요로 한다. "검정 RNA"는 정확히 사전 정량 분석된 제어 RNA의 임의의 이용 가능한 소스로 의도된다. 인간의 간 총 RNA(스트라타진, Cat #735017)를 사용하는 바람직하다.

본 명세서에 사용된 "미보정된 유전자 발현율(UGE)이란 태크맨 기기에 의해 생성된 내부 대조군 유전자에 상대적인 ERCC1 발현의 생성물 수를 의미한다. UGE를 측정하는 데 사용된 방정식은 실시예 3에 나타내며, 도 2에 샘플 계산과 함께 예시한다.

본 발명의 또 다른 측면은 비태크맨 기술로부터 유래한 "공지의 상대 유전자 발현"값을 사용하여 태크맨 기기로부터 얻은 미보정된 유전자 발현(UGE)값을 정규화하는 방법을 제공한다. 공지의 비태크맨 유래 상대 ERCC1: β-액틴 발현값은 조직 샘플로부터 태크맨 유래 ERCC1 UGE값으로 정규화하는 것이 바람직하다.

본 명세서에 사용된 "보정된 상대 ERCC1 발현율"이란 정규화된 ERCC1 발현을을 의미하는데, 이것에 의해 UGE를 ERCC1 비보정계수(K_ERCC1)와 곱하여 내부 대조군 유전자에 상대적인 ERCC1 발현 수준의 공지 범위에 비교될 수 있는 값을 산출한다. 실시예 3 및 도 2는 이러한 계산을 상세히 예시한다. 이들 수치는 특정 샘플의 "보정된 상대 ERCC1 발현"이 "선결된 역치" 수준 상하에 속하는지 여부를 결정할 수 있게 한다. β-액틴 수준에 대한 보정된 상대 ERCC1 발현의 선결된 역치 수준은 약 6.7 x 10^-3이다. ERCC1, 내부 대조군 β-액틴 및 검정 인간 간 총 RNA(스트라타진, Cat #735017)에 특이적인 K_ERCC1은 1.54 x 10^-3이다.

"공지된 상대 유전자 발현율" 값은 이미 분석된 조직 샘플로부터 유래한 것이고, 구성적으로 발현되는 내부 대조군 유전자(예컨대, β-액틴, GAPDH 등)에 대한 표적 유전자의 RT-PCR 신호의 비에 기초한 것이다. 그러한 조직 샘플은 포르말린 고정된 파라핀 포매(FPE) 샘플이 바람직하고, RNA는 실시예 1 및 본원에 전적으로 참고로 인용하는 미국 특허 출원 제09/469,338호(1999년 12월 20일 출원)에 기재된 프로토콜에 따라 그들로부터 추출한다. 내부 대조군 표준에 상대적인 유전자 발현율을 정량 분석하기 위해 당해 분야에 알려진 정량적 RT-PCR 기술을 사용한다. 프리-태크맨 기술 PCR 반응은 고정된 사이클 수(즉, 30) 동안 시행하고, 종말점 값을 각 샘플에 대해 보고한다. 이들 값은 β-액틴 발현에 대한 ERCC1 발현의 비로서 보고한다. Reed 등의 미국 특허 제5,705,336호 참조.

β-액틴 및/또는 인간의 간 총 RNA(스트라타진, Cat #735017)와는 상이한 검정 RNA 이외의 내부 대조군 유전자에 대해 K_ERCC1을 측정할 수 있다. 그렇게 하기 위해서는, 내부 대조군 유전자 및 검정 RNA를 그 특정 내부 대조군 유전자에 상대적인 ERCC1 발현 수준이 이미 측정된(즉, "공지의 상대 유전자 발현율") 조직 샘플에 대해 검정하여야 한다. 그러한 조직 샘플은 포르말린 고정된 파라핀 포매(FPE) 샘플이 바람직하고, RNA는 실시예 1 및 본원에 전적으로 참고로 인용하는 미국 특허 출원 제09/469,338호(1999년 12월 20일 출원)에 기재된 프로토콜에 따라 그들로부터 추출한다. 그러한 측정은 당해 분야에 널리 알려진 프리-태크맨 정량적 RT-PCR 기법을 사용하여 행한다. 그러한 측정 시에, 상기 샘플은 실시예 3에 기재한 새로운 내부 대조군 및/또는 검정 RNA에 특이적인 새로운 K_ERCC1을 측정하는 데 유용한 ERCC1의 "공지된 상대 유전자 발현" 수준을 가진다.

본 발명의 방법은 광범위한 조직 및 종양 유형에 적용 가능하며, 그래서, 환자의 임상 치료의 평가에 및 유방, 머리 및 목, 폐, 식도, 결장직장 및 기타를 포함하는 범위의 암에 대한 진단 또는 예후 수단으로서 사용할 수 있다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 방법은 비 소세포 폐암(NSCLC)의 예후에 적용된다.

예비 화학요법 치료 종양 생검은 일반적으로 이질성 조직을 매우 소량만 함유하는 고정된 파라핀 포매(FPE) 조직으로서만 통상 이용된다. 그러한 FPE 샘플은 미세 해부하기가 용이한데, 따라서, ERCC1 유전자 발현은 기질 조직으로 오염되지 않은 종양 조직에서 측정될 수 있다. 또한, 그러한 샘플은 두 유형의 조직을 함유하기 때문에 생검 조직 샘플 내의 기질 조직과 종양 조직을 비교할 수 있다.

일반적으로, ERCC1 유전자 영역에 인접하는 임의의 올리고뉴클레오티드 쌍을 사용하여 본 발명의 방법을 수행할 수 있다. 본 발명에 사용하기 위해 ERCC1 유전자 영역에 엄중 조건 하에 하이브리드되는 프라이머는 생성물을 20 내지 1000 염기쌍, 바람직하게는 50 내지 100 염기쌍, 가장 바람직하게는 100 염기쌍 미만을 증폭시킨다.

본 발명은 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍 및 이와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍을 제공하는데, 이들은 FPE 조직에서 ERCC1 발 현의 특히 정확한 평가를 가능하게 한다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 ERCC1-504F(서열번호 1) 및 ERCC1(서열번호 2)(또한, 본원에서는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍 ERCC1로도 지칭함) 및 이들과 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머가 바람직하다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 ERCC1-504F(서열번호 1) 및 ERCC1(서열번호 2)는 엄중한 조건 하에 ERCC1 유전자(서열번호 7)에 하이브리드되고, 예를 들면 실시예 1 및 본원에 전적으로 참고로 인용하는 미국 특허 출원 제09/469,338호(1999년 12월 20일 출원)에 기재된 바와 같이 mRNA 분리에 사용되는 임의의 방법에 의해 FPE 세포로부터 추출된 RNA를 사용하여 ERCC1 mRNA 수준을 측정하는데 특히 효과적인 것으로 밝혀졌다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이 핵산에서 "실질적으로 동일한"이란 엄중 조건 하에서 표적에 하이브리드되는 것을 의미하며, 또한 핵산 분절 또는 그 상보 가닥이 비교시에 적절한 뉴클레오티드 삽입 및 결실과 함께 적절히 배열될 때 뉴클레오티드의 약 60% 이상, 통상은 약 70% 이상, 더 통상적으로는 약 80% 이상, 보통은 약 90% 이상 및 더욱 보통으로는 약 95 내지 98% 이상이 동일한 것을 의미한다. 하이브리드화가 특이성의 총체적인 결핍보다는 더 선택적일 경우에 선택적인 하이브리드화가 존재한다. 문헌[Kanehisa, Nucleic Acids Res., 12:203-213(1984)] 참조.

본 발명은 엄중한 조건(전술함)하에서, ERCC1-504F(서열번호 1), 이의 상보 서열 또는 ERCC1-574R(서열번호 2), 또는 이의 상보 서열의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열의 일부 또는 전부에 하이브리드화하는 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

엄중한 하이브리드화 반응 조건에서, 단지 고도로 상보성이 있는, 즉 실질적으로 유사한 핵산 서열이 하이브리드화한다. 바람직하게는, 이러한 조건은 20개의 인접 뉴클레오티드중에서 4개 이상의 부정합(mismatch)을 가진 핵산, 더욱 바람직하게는 20 개의 인접 뉴클레오티드중에서 2개 이상의 부정합을 가진 핵산, 가장 바람직하게는 20개의 인접 뉴클레오티드 중에서 1개 이상의 부정합을 가진 핵산의 하이브리드화 반응을 방지한다.

핵산의 하이브리드화 반응 부위는 일반적으로 길이가 10개 이상(예컨대, 15개)의 뉴클레오티드이다. 하이브리드화 핵산의 하이브리드화 부위는 올리고뉴클레오티드 프라이머 ERCC1-504F(서열번호 1), 이의 보체 또는 ERCC1-574R(서열번호 2), 또는 이의 보체의 일부 또는 전부 서열과 약 80% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상, 또는 가장 바람직하게는 약 98% 이상 동일한 것이 바람직하다.

엄중한 조건하에서 핵산 샘플에 올리고뉴클레오티드 프라이머를 하이브리드화시키는 반응은 후술하는 바와 같다. 핵산 듀플렉스 또는 하이브리드 안정성은 융점 온도(T_m)로서 표현되는데, 이는 프로브가 표적 DNA로부터 해리되는 온도이다. 이 융점 온도는 필요한 엄중한 조건을 정의하는데 사용된다. 서열이 프로브와 동일하기 보다는 실질적으로 동일한 것으로 확인되는 경우, 특정 농도의 염(SSC 또는 SSPE)에 의해 균질한 하이브리드화 반응만이 일어나는 가장 낮은 온도를 먼저 설정하는 것이 유용하다. 이어서, 1%의 부정합이 T_m에서 섭씨 1도를 감소시킨다고 가정하면, 하이브리드화 반응에서 최종 세척 온도는 이에 대응하여 감소한다(예컨대, 프로브와 95%를 초과하는 동일성을 갖는 서열을 목적으로 하는 경우, 최종 세척 온도는 5 ℃씩 감소한다). 실제로, T_m의 변화는 1%의 부정합마다 0.5 내지 1.5 ℃이다.

엄중한 조건은 5 x SSC/5x Denhart 용액/1.0% SDS 중에서 약 68 ℃에서 하이브리드화하는 단계, 실온에서 0.2 x SSC/0.1% SDS 중에서 세척하는 단계를 포함한다. 적당히 엄중한 조건은 약 42 ℃로 3 x SSC에서 세척하는 것을 포함한다. 염 농도 및 온도의 매개변수를 변형하면 프라이머 및 표적 핵산간의 최적 동일성 수준을 얻을 수 있다. 이러한 조건과 관련한 또 다른 지침은 당해 분야에서 쉽게 얻을 수 있는데, 예를 들면 문헌[Sambrook, Fischer & Maniatis, Molecular Cloning, a laboratory manual(2판), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1989) 및 F.M. Ausubel등 편저, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons(1994)]를 들 수 있다.

본원에 기재된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 고정 조직 또는 고정된 파라핀 포매 조직뿐만 아니라 동결 조직 또는 생 조직에서 ERCC1 유전자 발현의 정확한 평가를 가능케 한다. 이것은 생 조직 또는 동결 조직의 RNA 보다도 FPE 샘플에서 유래된 RNA가 더 단편화가 잘 된다는 사실에도 불구하고 그러하다. 그러므로, 종래에는 고정된 조직을 사용하여 ERCC1 유전자 발현을 분석할 방법도 전혀 없었던 것에 비하여, 본 발명의 방법은 FPE 조직에서 ERCC1 유전자 발현 수준을 분석하는데 사용하기 적합하다.

종양에서 발현되는 ERCC1 mRNA의 양의 측정으로부터, 숙련된 실무자는 특정 유전자 독소를 받은 환자의 생존능 또는 특정 유전자 독소에 대한 종양의 임상적 내성과 관련한 예후를 얻을 수 있다. 백금계 화학요법 또는 유사한 유형의 DNA 손상을 유도하는 화학요법이 바람직한 유전자 독소이다.

백금계 화학요법은 DNA의 "대형 부가물"을 야기하는데, 이것의 1차 효과는 이중 나선의 3차원 모양을 변형시키는 것이다. 그러한 화합물은 단독으로 투여되거나 또는 겜시타빈(Gem) 또는 5-플루오로우라실(5-FU)와 같은 기타 화학요법과 함께 투여되어야 한다.

백금계 유전자 독소 화학요법은 공유성 DNA 부가물을 형성하는 중금속 배위 화합물을 포함한다. 일반적으로, 이들 중금속 화합물은 DNA에 공유 결합하여 적당한 부분에 시스-1,2-쇄내 디뉴클레오티드 부가물을 형성한다. 일반적으로, 이러한 부류는 시스-디아민디클로로플래티늄(II)(시스플라틴)이 대표하며, 시스-디아민-(1,1-시클로부탄디카르복실라토)플래티늄(II)(카르보플라틴), 시스-디아미노-(1,2-시클로헥실)디클로로플래티늄(II) 및 시스-(1,2-에틸렌디아민) 디클로로플래티늄(II)를 포함한다. 백금 제1 작용제는 전술한 대표 화합물의 임의의 유사체 또는 유도체를 포함한다.

백금 배위 화합물에 의해 현재 처방 가능한 종양은 고환 세포, 자궁내막 세포, 경부 세포, 위장 세포, 인상 세포, 부신피질 세포 및 소세포 폐암과 골수아세포종 및 신경아세포종을 포함한다. 트란스-디아민디클로로플래티늄(II)(트란스-DDP)은 그 DNA 부가물의 신속 복구로 인해 임상적으로 무용하다. 본원에서 트란스- DDP의 화학요법제로서의 사용은 비선별된 세포에서 낮은 독성 및 선별된 세포에서 높은 상대 독성을 가진 화합물을 제공할 것으로 보인다. 바람직한 양태에서, 백금 화합물은 시스플라틴이다.

다수의 화합물이 통상 백금계 화학요법제와 함께 제공된다. 예컨대, BEP(블레오마이신, 에토포시드, 시스플라틴)는 고환암에 사용되고, MVAC(메토트렉세이트, 빈블라스틴, 독소루비신, 시스플라틴)은 담낭암에, MVP(미토마이신 C, 빈블라스틴, 시스플라틴)은 비 소세포 폐암 치료에 사용된다. 백금 함유 작용제들 사이의 상호작용에 관한 다수의 연구가 문서화되었다. 예컨대, 치료약 상승작용은 백금계 화학요법에 잠재적으로 포함되는 다수의 약물에 대해 보고되었다. 이에 대한 최근 문헌의 매우 짧은 리스트는 다음과 같다: Okamoto 등, Urology 2001; 57:188-192; Tanaka 등, Anticancer Research 2001; 21:313-315; Slamon 등, Seminars in Oncology 2001; 28:13-19; Lidor 등, Journal of Clinical Investigation 1993; 92:2440-2447; Leopold 등, NCI Monographs 1987;99-104; Ohta 등, Cancer Letters 2001; 162:39-48; van Moorsel 등, British Journal of Cancer 1999; 80:981-990.

기타 유전자 독성제는 지속적인 유전자 병변을 형성하는 것들이고, 암의 임상 처방에서 화학요법제로 사용하기에 바람직하다. 세포분열 주기를 통한 세포 성장 속도뿐만 아니라 유전자 독소 유도된 DNA 손상의 세포 복구 속도는 유전자 독소 요법의 결과에 영향을 끼친다. 세포의 게놈에서 미복구된 병변은 DNA 복제를 방해하고, 새로이 합성되는 DNA의 복제 충실도를 손상시키거나 세포 생존에 필요한 유전자의 발현을 방해한다. 따라서, 유전자 독성제의 세포 독성의 한 가지 결정인자 (세포 사망에 기여하는 경향)는 그로부터 형성되는 게놈의 병변의 세포 복구에 대한 내성이다. 지속적인 게놈 병변, 예컨대, 적어도 세포가 세포 주기로 넘어갈 때까지 게놈에 잔존하는 병변을 형성하는 유전자 독성제는 일반적으로 일시적이고 용이하게 복구되는 유전자 병변을 형성하는 작용제보다 더 효과적인 세포 독소이다.

다수의 암의 치료에 사용되고 ERCC1 발현의 수준에 의해 영향을 받는 유전자 독성 화합물의 일반적인 종류는 DNA 알킬화제 및 DNA 삽입제이다. 소랄렌이 건선, 백반, 진균 감염 및 피부 T 세포 림프종과 같은 피부병의 광화학요법적 치료에 유용한 것으로 알려진 유전자 독성 화합물이다(Harrison's Principles of Internal Medicine, Part 2 Cardinal Manifestations of Disease, Ch. 60(12판, 1991)). 또 다른 일반적 종류의 유전자 독성 화합물로는 그 멤버들이 DNA를 알킬화하고 DNA 내로 삽입되는 것으로서, 합성 및 자연 항생물질을 들 수 있다. 본원에서 특히 관심을 끄는 것은 다음 종류의 화합물을 포함하는 항신생물 항생물질이다: 암사크린; 액티노마이신 A, C, D(닥티노마이신으로도 알려져 있음) 또는 F(KS4로도 알려져 있음); 아자세린; 블레오마이신; 카르미노마이신(카루비신), 다우노마이신(다우나루비신) 또는 14-히드록시다우노마이신(아드리아마이신 또는 독소루비신); 미토마이신 A, B 또는 C; 미톡산트론; 플리카마이신(미트라마이신); 등.

통상 사용되고 DNA를 알킬화하는 또 다른 일반 종류의 유전자 독성제는 할로에틸니트로소우레아, 특히 클로로에틸니트로소우레아를 포함하는 것들이다. 이 광범위한 종류의 대표적인 것으로는 카르머스틴, 클로로조토신, 포테머스틴, 로머스틴, 니머스틴, 라니머스틴 및 스트렙토조토신이 있다. 할로에틸니트로소우레아 제1 작용제는 상기 대표 화합물 중 임의의 것의 유사체 또는 유도체일 수 있다.

또 다른 일반 종류의 유전자 독성제는 그 멤버가 DNA를 알킬화하는 것으로서, 황 및 질소 머스타드를 포함한다. 이들 화합물은 주로 구아닌의 N7 원자에 공유 부가물을 형성함으로써 DNA를 손상시킨다. 이 광범위한 종류의 대표적인 멤버로는 클로람부실, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 멜팔란, 메클로로에타민, 노벰비신, 트로포스파미드 등이 있다. 선별된 세포의 게놈에서 특이 서열과 공유 또는 비공유적으로 상호 작용하는 올리고뉴클레오티드 또는 그 유사체 역시 게놈 병변의 좌로서 하나 이상의 사전 확인된 게놈 표적을 선별하기 위한 것이라면 유전자 독성제로서 사용할 수 있다.

DNA를 알킬화시키는 또 다른 종류의 작용제로는 에틸렌이민 및 메틸멜라민이 있다. 이들 종류로는 알트레타민(헥사메틸멜라민), 트리에틸렌포스포라미드(TEPA), 트리에틸렌티오포스포라미드(티오 TEPA) 및 트리에틸렌멜라민이 있다.

DNA 알킬화제의 추가 종류로는 부설판으로 대표되는 알킬 설포네이트; 벤조데파로 대표되는 아지니딘; 및 미토구아존, 미톡산트론 및 프로카르바진으로 대표되는 기타 작용제가 있다. 이들 종류는 각각 그 대표 화합물들의 유사체 및 유도체를 포함한다.

지금까지 설명한 본 발명의 실시는 후술되는 실험예에 의해 예시된다. 숙련된 개업의라면 본 실시예에 사용된 재료 및 방법이 다양한 방식으로 변형될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 이러한 변형은 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 간주된다.

실시예 1

FPE 조직으로부터의 RNA 분리

RNA는 다음과 같은 일반 절차에 의해 파라핀-포매 조직으로부터 추출한다.

A. 단면의 파라핀 제거 및 수화:

(1) 대략 10 μM 단면의 일부를 1.5 ㎖ 플라스틱 원심분리 튜브에 넣는다.

(2) 600 ㎕의 크실렌을 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서(대략 20 내지 25℃) 약 10분 동안 격렬하게 진탕한다.

(3) 샘플을 벤치 탑 원심분리의 최대 속도(약 10~20,000 x g)로 실온에서 약 7분 동안 원심분리한다.

(4) 대부분의 파라핀이 용해될 때까지 단계 2 및 3을 반복한다. 본래의 샘플 부분에 포함된 파라핀의 양에 따라 정상적으로는 2회 이상이 요구된다.

(5) 저급 알코올, 바람직하게는 100% 에탄올(약 600 ㎕)로 약 3분 동안 격렬히 진탕하여 크실렌 용액을 제거한다.

(6) 튜브를 단계 3에서처럼 약 7분 동안 원심분리한다. 상청액을 따라 버린다. 펠렛은 백색으로 된다.

(7) 더 묽은 에탄올 용액: 처음에는 약 95% 에탄올로, 그 다음에는 약 80%, 마지막에는 약 70% 에탄올로 연속으로 단계 5 및 6을 반복한다.

(8) 샘플을 단계 3에서처럼 실온에서 7분 동안 원심분리한다. 상청액을 버리고, 펠렛을 실론에서 약 5분 동안 건조되게 한다.

B. 페놀-클로로포름을 사용한 RNA 분리

(1) 0.5% 사르코신 및 8 ㎕의 디티오트레이톨을 포함하는 400 ㎕ 구아니딘 이소티오시아네이트 용액을 첨가한다.

(2) 샘플을 저속(속도 1)으로부터 고속(속도 2)으로 속도를 점진적으로 증가시키면서 조직 균질화기(노스 캐롤라이나 윌밍턴 소재의 IKA-웍스 인크의 울트라-터랙스)로 약 2 내지 3분 동안 균질화한다.

(3) 샘플을 약 95℃에서 약 5~20분 동안 가열한다. 95℃로 가열하기 전에 미세한 게이지 바늘로 샘플을 함유하는 튜브의 뚜껑에 구멍을 내는 것이 바람직하다. 한편, 뚜껑을 플라스틱 클램프 또는 실험실 필름으로 붙일 수 있다.

(4) 샘플을 pH 4.0의 2M 아세트산나트륨 50 ㎕로 추출하고, 이소아밀 알코올: 클로로포름의 1: 49 용액 3.6 ㎖와 페놀 18 ㎖를 혼합하여 새로이 만든 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올(10:1.93:0.036) 600 ㎕로 추출한다. 그 용액을 약 10초 동안 격렬히 진탕한 다음, 얼음 상에서 약 15분 동안 냉각시킨다.

(5) 용액을 최대 속도로 약 7분 동안 원심분리한다. 상부(수성) 상을 새로운 튜브로 옮긴다.

(6) RNA를 약 10 ㎕의 글리코겐으로 침전시키고, 400 ㎕의 이소프로판올로 -20℃에서 30분 동안 침전시킨다.

(7) RNA를 벤치탑 원심분리기에서 최대 속도로 약 7분 동안 원심분리하여 펠렛화하고; 상청액을 따라 버리고; 펠렛을 약 70 내지 75% 에탄올 약 500 ㎕로 세척한다.

(8) 샘플을 최대 속도로 7분 동안 다시 원심분리하였다. 상청액을 따르고, 펠렛을 공기 중에서 건조시킨다. 그 후 펠렛을 추가 실험을 위해 적당한 완충제(예컨대, 50 pI. 5mM Tris 클로라이드, pH 8.0)에 용해시킨다.

실시예 2

mRNA 역전사 및 PCR

역 전사: 실시예 1 및 본 명세서에 전적으로 참고로 인용하는 미국 특허 출원 제09/469,338호(1999년 12월 20일 출원)에 예시된 바와 같이 미세 절개된 또는 미세 절개되지 않은 포르말린 고정된 파라핀 포매(FPE) 조직으로부터 RNA를 분리하였다. 에탄올로 침전시키고, 원심분리 후에, RNA 펠렛을 pH 8.0의 5 mM Tris/Cl 50 ㎕에 용해시켰다. M-MLV 역전사효소는 데옥시뉴클레오티드의 존재 하에 1본쇄 RNA 또는 DNA 주형에 하이브리드되어 상보 가닥을 생성시키는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 연장시킨다. 생성되는 RNA는 무작위 헥사머 및 라이프 테크놀로지스사의 M-MLV 역전사효소로 역전사시켰다. 역전사 반응은 RNA 용액 25 ㎕를 "역전사 반응 혼합물" 25.5 ㎕와 혼합함으로써 수행하였다(하기 참조). 반응은 서모사이클러에서 26℃로 8분(무작위 헥사머를 RNA에 결합시키기 위해), 42℃로 45분(M-MLV 역전사효소 반응을 위해) 및 95℃로 5분(DNAse의 열 불활성화를 위해) 동안 유지하였다.

"역전사 반응 혼합물"은 10 ㎕ 5X 완충제(250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl₂), 0.5 ㎕ 무작위 헥사머(10 mM Tris-HCl pH 7.5 550 ㎕ 중에 50 O.D.로 용해된 것), 5 ㎕ 10 mM dNTP(dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP), 5 ㎕ 0.1 M DTT, 1.25 ㎕ BSA(10 mM Tris-HCl, pH 7.5 중의 3 ㎎/㎖), 1.25 ㎕ RNA 가드 24,800U/ ㎖(RNAse 저해제)(포르신 #27-0816, 아머샴 파마시아) 및 2.5 ㎕ MMLV 200 U/㎕(라이프 테크 Cat #28025-02)로 구성된다.

반응 성분들의 최종 농도는 다음과 같다: 50 mM Tris-HCl, pH8.3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 1.0 mM dNTP, 1.0 mM DTT, 0.00375 ㎎/㎖ BSA. 0.62 U/㎕ RNA 가드 및 10 U/㎕ MMLV.

mRNA 발현의 PCR 정량 분석. ERCC1 cDNA 및 내부 대조군 또는 하우스 키핑 유전자(예컨대, β-액틴) cDNA의 정량 분석은 문헌[Heid 등, (Genome Res 1996;6:986-994); Gibson 등(Genome Res 1996;6:995-1001)]에 기재된 바와 같이 형광계 실시간 검출 방법(ABI 프리즘 7700 또는 7900 서열 검출 시스템[태크맨], 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템스)을 사용하여 수행하였다. 간략히 말하면, 상기 방법은 이중 표지된 형광발생성 태크맨 올리고뉴클레오티드 프로브(ERCC1-530Tc(서열번호), T_m=70℃)을 사용하는데, 이 프로브는 순방향 및 역방향 프라이머 내에 특이적으로 어닐링된다. 반응 혼합물을 함유하는 뚜껑이 있는 웰 내에서의 레이저 자극은 프로브가 PCR 연장 중에 DNA 폴리머라제의 5' → 3' 뉴클레아제 활성에 의해 절단되어 5' 리포터 염료(6FAM)의 방출을 일으킬 때까지 3' 켄처 염료(TAMRA)의 방출을 일으킨다. 따라서, 앰플리콘의 생성은 태크맨의 CCD(전하 커플링된 장치) 검출 카메라에 의해 검출되는 형광 신호의 방출을 일으키며, PCR 반응의 순수하게 성장 단계 내에서 역치 주기로 생성되는 신호의 양은 관심 서열의 출발 사본수를 반영한다. 관심 서열의 출발 사본수와 내부 대조군 유전 자의 사본 수를 비교하면 상대 유전자 발현 수준이 제공된다. 태크맨 분석은 두 절대 측정(관심 유전자/내부 대조군 유전자) 사이의 비로서 표현되는 값을 산출한다.

PCR 반응 혼합물은 각각의 올리고뉴클레오티드 프라이머(ERCC1-504F(서열번호 1), T_m=59℃ 및 ERCC1 574R(서열번호 2), T_m=58℃) 600 nM, 200 nM 태크맨 프로브(서열번호 3), 5U 앰플리태크 올드 폴리머라제, 200 ㎛의 각각의 dATP, dCTP. 400 μM dTTP, 5.5 mM MgCl₂ 및 기준 염료를 함유하는 1 X 태크맨 완충제 A를 25 ㎕ 이하의 최종 부피로 함유하는 상기와 같이 제조된 cDNA를 함유하는 역전사 반응 0.5 ㎕로 구성되었다(모든 시약은 캘리포니아주 포스터 시티의 어플라이드 바이오시스템스에서 입수). 주기 조건은 95℃에서 10분, 이어서 95℃에서 15s 동안 및 60℃에서 1분 동안 45 주기였다. 내부 대조군 유전자 β-액틴을 정량 분석하는 데 사용되는 올리고뉴클레오티드는 β-액틴 태크맨 프로브(서열번호 4), β-액틴-592F(서열번호 5) 및 β-액틴-651R(서열번호 6)이었다.

전술한 반응에 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 ERCC1-504F(서열번호 1) 및 ERCC1-574R(서열번호 2)는 71 bp 생성물을 증폭시킬 것이다.

실시예 3

ERCC1에 대한 미보정된 유전자 발현(UGE)의 측정

"시험' 반응과 "검정" 반응의 두 쌍의 평행 반응을 수행하였다. ERCC1 증폭 반응 및 β-액틴 내부 대조군 증폭 반응이 시험 반응이다. 별개의 ERCC1 및 β-액틴 증폭 반응을 실시하여 검정 RNA 주형 상에서 수행하고, 검정 반응이라고 지칭된 다. 태크맨 장치는 4개의 상이한 주기 역치(Ct) 값: 시험 반응으로부터 Ct _ERCC1 및 Ct_β-액틴그리고 검정 반응으로부터 Ct _ERCC1 및 Ct_β-액틴을 산출할 것이다. 두 반응에 대한 Ct 값의 차이는 다음 방정식에 따라 결정된다:

ΔCt_시험 = Ct _ERCC1 - Ct_β-액틴 ("시험" 반응으로부터)

ΔCt_검정 = Ct _ERCC1 - Ct_β-액틴 ("검정" 반응으로부터)

다음 단계는 다음 방정식에 따라 숫자 2를 음의 ΔCt로 올리는 것을 포함한다:

2^-ΔCt _시험 ("시험" 반응으로부터)

2^-ΔCt _검정 ("검정" 반응으로부터)

태크맨 기기로부터 ERCC1에 대한 미보정된 유전자 발현을 얻기 위해서는 다음 계산을 수행한다:

ERCC1에 대한 비보정된 유전자 발현율(UGE) = 2^-ΔCt _시험/2^-ΔCt _검정

공지의 상대 ERCC1 발현 수준을 사용한 UGE의 정규화

정규화 계산은 ERCC1 및 특정 검정 RNA에 특이적인 보정계수(K_ERCC1)와 UGE의 곱셈을 수반한다. 보정계수(K_ERCC1)는 또한 내부 대조군 유전자 및 임의의 정확히 사전 정량된 검정 RNA에 대해 측정될 수 있다. 내부 대조군 유전자 β-액틴 및 정확 히 사전 정량된 검정 RNA 인간 간 총 RNA(스트라타진, Cat #735017)를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 시약이 제공되면 보정계수 K_ERCC1는 1.54 x 10^-3과 동일하다.

문헌[Applied Biosystems, 태크맨 제조사, User Bulletin #2]에 기재되고, 전술한 바와 같이 ΔCt 방법의 변형을 사용하여 정규화를 수행한다. 이 절차를 수행하기 위해 전술한 태크맨 방법론을 이용하여 ERCC1 발현에 대해 6개의 상이한 시험 조직의 UGE를 분석하였다. 내부 대조군 유전자 β-액틴 및 검정 RNA, 인간 간 총 RNA(스트라타진, Cat #735017)룰 사용하였다.

각 샘플 AG221, AG222, AG252, 성인 폐, PC3, AdCol의 공지의 상대 ERCC1 발현 수준을 그 상응하는 태크맨 유래 UGE로 나누어서 미평균된 보정계수 K를 얻었다.

K_미평균 = 공지의 값/UGE

다음, 모든 K 값을 평균하여 검정 RNA 및 β-액틴으로부터 ERCC1, 인간 간 총 RNA(스트라타진, Cat. #735017)에 특이적인 단일의 K _ERCC1 보정계수를 측정하였다.

그러므로, 프리-태크맨 ERCC1 발현 연구와 일치하는 기준으로 미지의 조직 샘플에서 보정된 상대 ERCC1 발현율을 측정하기 위해, 동일한 내부 대조군 유전자 및 검정 RNA의 사용이 주어진다면, 태크맨 장치에서 유래한 미보정된 유전자 발현율 데이터(UGE)를 단지 K _ERCC1 특이 보정계수와 곱한다.

보정된 상대 ERCC1 발현율 = UGE x K _ERCC1

K _ERCC1 은 임의의 정확히 사전 정량된 검정 RNA 또는 내부 대조군 유전자를 사용하여 측정할 수 있다. 정확히 사전 정량된 RNA의 미래의 공급원은 상기 방법에서 기술한 공지의 상대 ERCC1 발현 수준을 가진 샘플에 대해 검정하거나, 전술한 인간 간 총 RNA(스트라타진, Cat. #735017)와 같은 사전 검정된 검정 RNA에 대해 검정할 수 있다.

예컨대, 후속 K _ERCC1 이 상이한 내부 대조군 유전자 및/또는 상이한 검정 RNA에 대해 측정되는 경우, 특정 내부 대조군 유전자에 상대적인 ERCC1 발현 수준이 이미 측정된 조직 샘플에 내부 대조군 유전자 및 검정 RNA를 검정하여야 한다. 그러한 측정은 당해 분야에 널리 알려진 표준 프리-태크맨 정량적 RT-PCR 기법을 사용하여 이루어질 수 있다. 이들 샘플에 대한 공지의 발현 수준은 그 상응하는 UGE 수준으로 나누어서 그 샘플에 대한 K를 측정한다. K값은 공지의 샘플 수에 따라 평균하여 상이한 내부 대조군 유전자 및/또는 검정 RNA에 특이적인 새로운 K _ERCC1 을 측정한다.

실시예 4

모든 환자들이 장래의 다중심 3개 아암의 무작위 시행의 시스플라틴/겜시타빈 아암에 등재되었다(GEPC/98-02, 시스플라틴/겜시타빈(CG)의 스페인 폐암 그룹 3단계 시행 대 시스플라틴/겜시타빈/비노렐빈(CGV) 대 겜시타빈/비노렐빈과 이어서 진행성 NSCLC에서 이포스파미드/비노렐빈(GV/IV)의 순차적 쌍). 모든 환자들은 매 3주마다 Gem 1250 ㎎/㎡을 1일, 8일에, 그리고, CDDP 100 ㎎/㎡을 1일에 투여받았 다. GEPC/98-02에 대한 적격 기준은 측정 가능한 단계 IV(무징후라면 뇌의 전이가 적격) 또는 단계 IIIB(악성 흉막 및/또는 심막 삼출 및/또는 쇄골위 선질환) NSCLC 및 이스턴 코오퍼레이트 그룹(ECOG) 실행 평가 0~2이었다. 모든 환자가 연구 개시 전에 흉부 x-선 및 흉부와 상복부의 컴퓨터화된 X선 단층 촬영을 했고, 적어도 6주 마다 평가를 반복하였다. 종양 반응은 WHO의 기준에 따라 완전 반응, 부분 반응, 안정 질병 및 진행성 질병으로 평가되었다. 종양은 기준선 종양 측정을 구축하는데 사용된 동일한 이미지화 방법으로 치료 중에 재평가되었다.

미세 절개된 FPE 예비 처리 종양 샘플로부터 총 mRNA를 분리하고, 실시예 2 및 3에 기재된 바와 같이 정량적 RT-PCR을 사용하여 보정된 상대 ERCC1 발현을 측정하였다. 그러한 샘플로부터의 mRNA의 분리 방법은 실시예 1 및 본 명세서에 전적으로 참고로 인용하는 미국 특허 출원 제09/469,338호(1999년 12월 20일 출원)에 기재된 것과 동일한다.

통계 분석

맨-휘트니(Mann-Whitney) U 시험을 사용하여 연속 시험 가변 보정된 상대 ERCC1 발현 과 2분법적 변수(환자의 성별, 평균 연령 상하의 연령, 중량 손실의 존재, 흉막 삼출의 존재, 종양 단계) 사이의 중요한 관련에 대해 시험하였다. 크러스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 시험을 사용하여 다중 그룹 내의 보정된 상대 ERCC1 발현에서의 중요한 차이점(ECOG 실행 상태, 조직병리학)에 대해 시험하였다. 반응 및 이분화된 보정된 상대 ERCC1 발현값을 포함하는 분류적인 임상 병리적 값의 분석에는 피셔(Fisher)의 정확한 시험을 사용하였다.

모든 환자들은 사망 또는 데이터가 감지될 때까지 제1 과제 치료로부터 추적되었다. 카플란-메이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선 및 로그 순위 시험을 사용하여 생존율 및 질병 없는 생존율에 대한 단변수 분포를 분석하였다. Miller 및 Siegmund의 최대 카이-평방법(Biometrics 1982; 38:1011-1016) 및 Halpern(Biometrics 1982; 38:1017-1023)을 변형하여 그룹화의 강도를 측정하는 데 사용된 통계로서의 로그-순위 시험으로 어느 발현 값이 환자들을 불량한 및 양호한 예후 서브그룹(생존 경향의 관점에서)으로 가장 잘 분리되는 지를 측정하였다. 최대 카이-평방 분석에 기초한 연합 강도의 척도로서 해석되는 P 값을 측정하기 위해, 1000 부트-스트랩-유사 자극을 사용하여 연합이 없다는 가정하에 최대 카이-평방 통계의 분포를 평가하였다(Biometrics 1982; 38:1017-1023). 단변수 분석에 중요한 인자의 콕스 비례 위험 모델링을 실시하여 어느 인자가 생존율에 중요한 영향을 끼치는 지를 확인하였다. SPSS 버전 10.0.5 소프트웨어(시카고주 일리노이 소재의 SPSS 인크)를 모든 통계 분석에 사용하였다. 모든 P값은 2가지 측면을 가졌다.

보정된 상대 ERCC1 발현 수준

ERCC1 mRNA 발현은 분석된 56개 샘플 모두에서 검출되었다. 내부 대조군 하우스키핑 유전자 β-액틴의 발현에 상대적인 평균 보정된 상대 ERCC1 발현율은 6.7 x 10^-3(범위 0.8 x 10^-3-24.6 x 10^-3)이었다. 보정된 상대ERCC1 발현 수준과 연령(P= 0.66), 성별(P=0.18), 무작위화 이전의 6개월 중의 중량 손실의 존재(P=0.74), 종양 단계(IIIB 대 IV, P=0.39) 또는 흉막 삼출의 존재(P=0.25, 모든 맨-휘트니 U 시험)와 같은 인자들 중의 임의의 것들 사이에 중요한 연관은 없었다. 상이한 실행 상태 등급(P=0.48, 크러스칼-월리스 시험) 또는 상이한 종양 세포형(모든 종양 유형, P=0.10, 크러스칼-월리스 시험)을 갖는 환자들 사이에서 보정된 상대 ERCC1 발현 수준 사이에도 중요한 차이점은 없으나, 선암(평균 5.2 x 10^-3, P=0.015, 맨-휘트니 시험)에 비해 SCC 종양(평균 8.6 x 10^-3)에서 보정된 상대 ERCC1 발현 수준이 상당히 더 높았다.

화학요법에 대한 반응

반응에 대해 평가할 수 있는 47명의 환자에 대한 종양 반응의 빈도는 도 3에 도시하였다. 전체 반응 속도는 44.7%였다. 완전 반응 및 부분 반응, 즉 "반응성" 종양에서의 보정된 상대 ERCC1 발현 수준(평균 4.3 x 10^-3, 범위 1.2 x 10^-3 - 24.6 x 10^-3)은 안정한 질병 및 진행성 질병, 즉 "비반응성" 종양에서의 수준(7.85 x 10^-3, 범위 0.8 x 10^-3 - 24.6 x 10^-3 _,P=0.31 맨-휘트니 시험)평균과는 크게 상이하지는 않았다. 임의의 ERCC1 수준(모든 피셔의 정확한 시험)보다 더 높고 낮은 보정된 상대 ERCC1 발현 값을 가진 반응성 및 비반응성 종양의 비율 사이에도 중요한 차이점은 없었다. 역치 값 이하의 보정된 상대 ERCC1 발현율("저" 발현율, 52% 반응자)을 가진 종양에서의 반응 속도는 역치 값 이상의 보정된 상대 ERCC1 발현율("고" 발현율, 36.4% 반응자, 피셔의 정확한 시험, P=0.38)을 가진 종양에 대한 것보다 더 높았다.

환자의 전체 생존율과 보정된 상대 ERCC1 발현 수준 사이의 연관

평균 전체 생존 시간은 36.6 주(범위 0~113.4 주)였고, 진행에 대한 평균 시간은 24.4 주(범위 0~102.9 주)였다. 불량한 및 양호한 예후 서브그룹으로 환자를 분리한 역치 보정된 상대 ERCC1 발현 수준을 확인하기 위한 로그 순위 시험 및 최대 카이-평방 통계의 사용으로, 식별성 값의 범위가 평균값을 포함하는 것으로 나타났고, 따라서, 이 평균값은 생존율 분석에 역치값으로 사용되었다. 그러므로, 역치 보정된 상대 ERCC1 발현 값은 NSCLC에 대해 6.7 x 10^-3인 것으로 측정되었다. 도 1은 역치 보정된 상대 ERCC1 발현 수준 상하의 종양내 보정된 상대 ERCC1 발현 수준을 가진 환자에 대한 카플란-메이어 생존 곡선을 나타낸다. 도 4에 도시한 바와 같이, 역치 이하의 보정된 상대 ERCC1 발현 수준을 가진 환자는 역치 이상의 보정된 상대 ERCC1 발현 수준을 가진 환자에 대한 20.4 주(95% C.I. 6.9, 33.9 주)에 비해 상당히 더 긴 평균 생존율 61.6 주(95% C.I. 42.4, 80.7 주)를 가졌다. 종양 단계에 대해 조정된, 낮거나 높은 보정된 상대 ERCC1 발현 및 총 생존율 사이의 관련에 대한 로그 순위 통계는 3.97이었고, P 값은 0.046이었다. 비조정된 로그 순위 결과는 도 4에 도시되어 있다.

별개의 보정된 상대 ERCC1 발현 역치 5.8 x 10^-3은 이 값이 이전의 연구에서 위암 환자에 대한 총 생존율과 연관되기 때문에 시험하였다(Metzger 등, J Clin Oncol 1998; 16:309-316). 보다 높은 6.7 x 10^-3 보정된 상대 ERCC1 발현 역치가 더 강력한 식별인자이지만, 총 생존율은 5.8 x 10^-3 미만의 ERCC1 수준을 가진 것들(로그 순위 통계 6.37, P=0.011)에 비해 5.8 x 10 미만의 보정된 상대 ERCC1 발현 수준로 이 연구에서 NSCLC 환자의 그룹에 대해 총 생존율은 상당히 더 양호하였다.

카플란 메이어 생존 곡선 및 로그 순위 시험을 사용하는 단변수 분석에 대해 총 생존율과 중요하게 연관된 기타 인자는 예비 치료 중량 손실 및 ECOG 실생 상태의 존재였다(표 2). 환자의 연령(P=0.18), 성별(P=0.87), 종양 단계(P=0.99), 종양 세포형(P=0.63) 및 흉막 삼출의 존재는 총 생존율에 중요한 예후적 인자가 아니었다. 보정된 상대 ERCC1 발현 수준, ECOG 실행 상태 및 중량 손실은 콕스 비례 위험 복귀 모델 다변수 분석에서의 생존율에 대한 중요한 예후 인자로 잔존하였다( 도 4). 종양 단계별로 계층화된 콕스 복귀 모델에 대한 P값은 ERCC1에 대해 0.038, 중량 손실에 대해 0.017 및 ECOG 실행 상태에 대해 0.02(PS 0 대 1 또는 2)였다.

상기 연구는 암 환자에 대한 백금계 화학요법으로 치료한 후에 더 낮은 ERCC1 mRNA 발현 수준과 향상된 생존률 사이의 연관을 발견하였다.

도 1은 NSCLC에서의 보정된 상대 ERCC1 발현에 대한 시스플라틴/Gem 치료를 받은 환자의 총생존율을 나타내는 그래프이다. 역치 6.7 x 10^-3 보다 더 낮은 환자의 보정된 상대 ERCC1 발현 수준은 상당히 더 양호한 생존율과 상관 관계가 있었다. 역치 6.7 x 10^-3 보다 더 높은 환자의 보정된 상대 ERCC1 발현 수준은 상당히 더 나쁜 생존율(P=0.009 로그 순위 시험)과 상관 관계가 있었다.

도 2는 내부 대조군 유전자에 상대적인 보정된 상태 ERCC1 발현율을 계산하는 방법을 예시하는 차트이다. 이 차트는 두 개의 시험 샘플(미지의 1 및 2)로 얻은 데이터를 포함하고, 미보정된 유전자 발현율 데이터(UGE)를 측정하는 방법을 예시한다. 이 차트는 또한 프리-태크맨 기술에 의해 측정된 공지의 상대 ERCC1값으로 태크맨 기기에 의해 생성된 UGE 를 정규화하는 방법을 예시한다. 이것은 UGE를 보정인자 K _ERCC1 에 곱하여 얻는다. 도 2중 내부 대조군 유전자는 β-액틴이고, 검정 RNA는 인간의 간 총 RNA(스트라타진, Cat.#735017)이다.

도 3은 연구 중인 56명의 환자의 통계 자료, 종양 단계 및 세포형을 나타내는 표이다. 받은 치료 사이클의 평균 수는 3이었다(1~6의 범위). 14명의 환자(25%)는 이미 화학요법을 받았는데, 주로(9명의 환자) 탁산 요법 단독으로 또는 DDP나 카르보플라틴과 함께 받았다. 56명의 환자 중 3명은 방사성 요법을 받았고, 5명의 환자는 1차 종양의 외과적 절제술을 받았다.

도 4는 역치 이하의 보정된 ERCC1 발현 수준을 가진 환자들이 역치 이상의 보정된 ERCC1 수준을 가진 환자들에 대한 20.4 주(95% C.I. 6.9, 33.9주)에 비해 상당히 더 긴 평균 생존 기간 61.6 주(95% C.I. 42.4, 80.7 주)를 가진다는 것을 나타내는 표이다. 낮거나 높은 ERCC1 발현과 총 생존율 사이의 관련에 대한 로그 순위 통계는 종양 단계에 대해 조정된 것으로 3.97이었고, P값은 0.046이었다. 미조정된 로그 순위 결과가 이 도면에 도시되어 있다. 카플란 메이어 생존 곡선과 로스 순위 시험을 사용하여 단변수 분석상 총 생존율과 상당히 연관된 인자들도 도시되어 있다. 이들은 예비 처리 중량 손실 및 ECOG 실행 상태의 존재이다. 환자의 연령(P=0.18), 성별(P=0.87), 종양 단계(P=0.99), 종양 세포형(P=0.63) 및 흉막 삼출(P=0.71)의 존재는 총 생존율에 중요한 예후 인자가 아니었다. 보정된 상대 ERCC1 발현 수준, ECOG 실행 상태 및 중량 손실은 콕스 비례 위험 복귀 모델 다변수 분석에서 생존율에 대한 중요한 예후 인자로 잔존하였다. 종양 단계별로 계층화된 콕스 복귀 모델에 대한 P값은 ERCC1에 대해 0.038, 중량 손실에 대해 0.017 및 ECOG 실행 상태에 대해 0.02(PS 0 대 1 또는 2)이었다.

SEQUENCE LISTING <110> Danenberg, Kathleen <120> METHOD OF DETERMINING A CHEMOTHERAPEUTIC REGIMEN BASED ON ERCC1 EXPRESSION <130> 11220/145 <140> Not assigned <141> - - <150> 09/877,095 <151> 2001-06-11 <150> 09/796,491 <151> 2001-03-02 <160> 7 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 1 gggaatttgg cgacgtaatt c 21 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 2 gcggaggctg aggaacag 18 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 3 cacaggtgct ctggcccagc acata 25 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 4 accaccacgg ccgagcgg 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 5 tgagcgcggc tacagctt 18 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 6 tccttaatgt cacgcacgat 20 <210> 7 <211> 1097 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 aagtgctgcg agccctgggc cacgctggcc gtgctggcag tgggccgcct cgatccctct 60 gcagtctttc ccttgaggct ccaagaccag caggtgaggc ctcgcggcgc tgaaaccgtg 120 aggcccggac cacaggctcc agatggaccc tgggaaggac aaagaggggg tgccccagcc 180 ctcagggccg ccagcaagga agaaatttgt gatacccctc gacgaggatg aggtccctcc 240 tggagtggcc aagcccttat tccgatctac acagagcctt cccactgtgg acacctcggc 300 ccaggcggcc cctcagacct acgccgaata tgccatctca cagcctctgg aaggggctgg 360 ggccacgtgc cccacagggt cagagcccct ggcaggagag acgcccaacc aggccctgaa 420 acccggggca aaatccaaca gcatcattgt gagccctcgg cagaggggca atcccgtact 480 gaagttcgtg cgcaacgtgc cctgggaatt tggcgacgta attcccgact atgtgctggg 540 ccagagcacc tgtgccctgt tcctcagcct ccgctaccac aacctgcacc cagactacat 600 ccatgggcgg ctgcagagcc tggggaagaa cttcgccttg cgggtcctgc ttgtccaggt 660 ggatgtgaaa gatccccagc aggccctcaa ggagctggct aagatgtgta tcctggccga 720 ctgcacattg atcctcgcct ggagccccga ggaagctggg cggtacctgg agacctacaa 780 ggcctatgag cagaaaccag cggacctcct gatggagaag ctagagcagg acttcgtctc 840 ccgggtgact gaatgtctga ccaccgtgaa gtcagtcaac aaaacggaca gtcagaccct 900 cctgaccaca tttggatctc tggaacagct catcgccgca tcaagagaag atctggcctt 960 atgcccaggc ctgggccctc agaaagcccg gaggctgttt gatgtcctgc acgagccctt 1020 cttgaaagta ccctgatgac cccagctgcc aaggaaaccc ccagtgtaat aataaatcgt 1080 cctcccaggc caggctc 1097

Claims

(a) 조직 샘플에서 파라핀을 제거하여 파라핀이 제거된 샘플을 얻는 단계;

(b) 약 5 내지 약 120분의 시간 동안 약 75 내지 약 100℃의 온도 범위로 유효 농도의 카오트로픽제(chaotropic agent)를 포함하는 용액 내에서 상기 샘플을 가열시키고, 상기 카오트로픽제로부터 mRNA를 회수함으로서 상기 파라핀이 제거된 샘플로부터 mRNA를 분리하는 단계;

(c) 서열번호 1의 서열 또는 이에 80% 이상 동일한 서열을 지닌 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 서열 또는 이에 80% 이상 동일한 서열을 지닌 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 1쌍을 사용하여 상기 mRNA를 증폭시켜 증폭된 샘플을 얻는 단계; 및

(d) 구성적으로 발현되는 유전자의 mRNA의 양에 상대적인 ERCC1 mRNA의 양을 측정하는 단계

를 포함하는 고정된 파라핀 포매 조직 샘플에서 절제 복구 상호-보상(ERCC1) 유전자 발현 수준을 측정하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 구성적으로 발현되는 유전자는 β-액틴임을 특징으로 하는 방법.
서열번호 1의 서열 또는 이에 80% 이상 동일한 서열을 지니는 올리고뉴클레 오티드 프라이머에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 2의 서열 또는 이에 80% 이상 동일한 서열을 지니는 올리고뉴클레오티드 프라이머와 함께 고정된 파라핀 포매 조직 샘플에서 추출된 RNA를 이용하여 ERCC1 유전자 부분을 증폭하는데 효과적임을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 2의 서열 또는 이에 80% 이상 동일한 서열을 지니는 올리고뉴클레오티드 프라이머에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1의 서열 또는 이에 80% 이상 동일한 서열을 지니는 올리고뉴클레오티드 프라이머와 함께 고정된 파라핀 포매 조직 샘플에서 추출된 RNA를 이용하여 ERCC1 유전자 부분을 증폭하는데 효과적임을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호 1의 서열 또는 이에 80% 이상 동일한 서열을 지니는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 서열 또는 이에 80% 이상 동일한 서열을 지니는 올리고뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드 프라이머 1쌍을 포함하는 ERCC1 유전자 발현 검출용 키트.