JP5722569B2

JP5722569B2 - Ｅｒｃｃ１及びｔｓ発現に基づく化学療法剤投与計画の決定方法

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Publication number: JP5722569B2
Application number: JP2010177164A
Authority: JP
Inventors: ディー．ダネンバーグ，キャスリーン
Original assignee: レスポンスジェネティクス，インコーポレイティド
Priority date: 2000-12-01
Filing date: 2010-08-06
Publication date: 2015-05-20
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Description

本発明は、医学、特に癌の化学療法、に有用な予測方法に関する。より特に、本発明は、患者の腫瘍細胞の遺伝子発現の評価に関する。細胞傷害性化学療法剤、特に代謝拮抗物質及びに白金を含む薬剤に関する方法によるＤＮＡを傷つける薬剤に対する腫瘍細胞の抵抗性を、ヒトのヌクレオチド合成及びＤＮＡ修復に関係している遺伝子からｍＲＮＡを検査することによりアッセイする。

正常な細胞が悪性形質転換を受けて、悪性の細胞になったときに癌が生じる。形質転換した（悪性の）細胞は、細胞発現型を特定し、かつ、細胞増殖を抑える正常な生理学的制御を逸脱する。よって、個体内の形質転換細胞は、増殖し、腫瘍を形成する。腫瘍が見つかった場合、臨床の目的は、選択的に悪性の細胞を破壊する一方で、治療を受けている個体の正常な細胞に起きた全ての害を和らげることである。

化学療法は、癌細胞に対して選択的に有毒な（細胞傷害性の）薬物の使用に基づく。核酸合成、タンパク質合成、及び他の重要な新陳代謝プロセスを妨げる薬物を含む数個の一般的な分類の化学療法剤が開発されている。これらは一般に代謝拮抗薬と呼ばれる。他の分類の化学療法剤は、細胞ＤＮＡに損害を与える。一般に、これらの分類の薬は、遺伝毒性薬と呼ばれる。

しかし、しばしば、所望の化学療法剤又は薬物の組み合わせに対する個々の新生物の感受性は、治療の試用期間後にのみ正確に評価されうる。成功しなかった試用期間に費やされた時間は、攻撃的な悪性腫瘍の臨床管理における重大な危険性をもたらす。

細胞ＤＮＡへの損害の修復は、細胞の酸素的ＤＮＡ修復機構により実行される重要な生物学的な過程である。細胞ゲノム内の修復されていない病変は、ＤＮＡの複製を妨げて、新しく合成されたＤＮＡの複製忠実度を下げて、及び／又は細胞の生存のために必要とされている遺伝子の発現を妨げる可能性がある。

このように、遺伝毒性薬は、一般に静止状態の、無分裂の細胞よりもＤＮＡ合成を行う活発に分裂する細胞に対してより有毒であると考えられる。しかし、多くの体組織の正常な細胞は、静止状態にあり、細胞周期及び分裂に再突入する。細胞分裂における各回の間の非常に長い時間が、化学療法剤の遺伝毒性物質によって加えられた正常細胞におけるＤＮＡ損害の修復のために一般に与えられる。結果として、いくらかの選択性は、癌細胞の殺傷を達成する。多くの治療投与計画は、これらの一般分類の２以上に属している化学療法剤を同時投与することによって癌細胞に対する選択性を改善する試みを反映する。

固形腫瘍に有効な化学療法は、しばしば薬剤の組み合わせを必要とするので、各々の単独の薬物への抵抗性又は感受性の同定及び定量化の測定は、個々の多剤併用療法を設計するための重要な道具になった。

細胞ＤＮＡに損害を与えることが示された広く使用される遺伝毒性抗癌剤は、シスプラチン（ＤＤＰ）及びカルボプラチンである。シスプラチン及び／又はカルボプラチンは、呼吸器、胃腸及び生殖管の、中枢神経系の、並びに頭及び首の扁平上皮乳頭腫起源の癌腫及び肉腫を含めた上皮及び間葉細胞起源の、選択された様々な新生物の治療に現在使用される。現在、他の薬剤と組み合わせたシスプラチンは、睾丸癌の管理のために好ましく、そして多くの事例が持続的な寛解を引き起こす（非特許文献１：Ｌｏｅｈｒｅｒｅｔａｌ．，１９８４，１００Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．７０４）。シスプラチン（ＤＤＰ）は、鎖内付加物の形成を通してＤＮＡ構造を乱す。ＤＤＰのような白金薬剤に対する抵抗性は、白金付加物への高められた耐性、減少させられた薬物蓄積、あるいは高められたＤＮＡ修復によるものとされた。

２−ジアミノシクロヘキサン環を担持する他の白金ベースの化学療法剤であるオキサリプラチンは、試験管内及び生体内で抗腫瘍効果を示た。このかさばる担体基が、白金−ＤＮＡ付加物を導くと考えられ、それは、他の白金薬剤から形成された付加物よりも細胞障害性であり、そしてＤＮＡ複製の妨害によって有効である。最近のデータは、ミスマッチ修復システム（ＭＭＲ）の欠乏、並びにＤＮＡ損傷部位を通り過ぎてＤＮＡを合成する、複製複合体の高められた能力（高められた複製バイパス）が、シスプラチンに抵抗性を引き起こすが、しかしオキサリプラチンには抵抗性を引き起こさないことを示した（非特許文献２：Ｒａｙｍｏｎｄｅｔａｌ．，ＳｅｍｉｎＯｎｃｏｌ２５，Ｓｕｐｐｌ５：４−ｌ２，１９９８）。

白金薬剤によって形成された、かさばるＤＮＡ付加物の除去修復は、ＤＮＡ損傷認識と除去に関係している遺伝子によって仲介されるように思われる。非特許文献３：Ｃｌｅａｖｅｒｅｔａｌ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ１１：８７５−８８２（１９９０）；非特許文献４：Ｈｏｅｉｊｍａｋｅｒｓｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌｓ２：３１１−３２０（１９９０）；非特許文献５：Ｓｈｉｖｊｉｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ６９：３６７−３７４（１９９２）。実際、酸素的ＤＮＡ修復機構の１以上の要素の遺伝的欠陥を担持する細胞が、シスプラチンに対して非常に感受性が高い。非特許文献６：Ｆｒａｖａｌｅｔａｌ．，（１９７８），５１Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．１２１；非特許文献７：ＢｅｃｋａｎｄＢｒｕｂａｋｅｒ（１９７３），１１６Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ１２４７。

交差補完除去修復（ｅｘｃｉｓｉｏｎｒｅｐａｉｒｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）（ＥＲＣＣ１）遺伝子は、ＤＮＡ付加物の修復に必要不可欠である。ヒトＥＲＣＣ１遺伝子はクローン化された。非特許文献８：Ｗｅｓｔｅｒｖｅｌｄｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３１０：４２５−４２８（１９８４）；非特許文献９：Ｔａｎａｋａｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４８：７３−７６（１９９０）；（登録番号ＸＭ−００９４３２、配列番号：１０と共に本明細書中に援用する）。この遺伝子に欠く突然変異ヒト及びハムスター細胞系を使ったいくつかの研究、並びにヒト腫瘍組織における研究は、ＥＲＣＣ１によってコードされた産物が白金ＤＮＡ付加物の除去修復に関係していることを示す。非特許文献１０：Ｄａｂｈｏｌｋａｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．８４：１５１２−１５１７（１９９２）；非特許文献１１：Ｄｉｊｔｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４８：６０５８−６０６２（１９８８）；非特許文献１２：Ｈａｎｓｓｏｎｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８：３５−４０（１９９０）。

ＤＮＡ修復欠損ＣＨＯ細胞中にトランスフェクトされた場合、ＥＲＣＣ１は、白金−ＤＮＡ付加物を修復するその能力により白金ベースの化学療法に対する細胞抵抗性を与える。非特許文献１２：Ｈａｎｓｓｏｎｅｔａｌ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８：３５−４０（１９９０）。現在受け入れられた除去修復のモデルは、損害認識／除去ステップが除去修復プロセスの律速であることを示唆する。

白金ベースの治療を受けている癌患者からの悪性細胞中のＥＲＣＣ１のような除去修復遺伝子の発現に関係するレベルが検査された。非特許文献１０：Ｄａｂｈｏｌｋａｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．８４：１５１２−１５１７（１９９２）。胃癌患者のＥＲＣＣ１の過剰発現が、白金ベースと代謝拮抗物質ベースの化学療法剤の同時投与計画（シスプラチン／フルオロウラシル）により治療した場合に、腫瘍応答及び最終的な生存で否定的な影響をもつと報告されている（非特許文献１３：Ｍｅｔｚｇｅｒ，ｅｔａｌ．，ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ１６：３０９，１９９８）。ＥＲＣＣ１発現の腫瘍内レベルは、単独か、又は代謝拮抗物質ベースの治療と組み合わせた白金ベースの化学療法が癌患者の治療に有効であるかどうかを決定するために重要な予測要因である。

代謝拮抗細胞傷害性化学療法化合物は、核酸合成、タンパク質合成、及び他の重要な新陳代謝過程を妨害する薬物を含む。例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）は、ＧＩ管の癌及び乳癌のような主要な癌を含む、多くの異なる種類の癌の治療のために使用される薬物である（非特許文献１４：Ｍｏｅｒｔｅｌ，Ｃ．Ｇ．ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３０：１１３６−１１４２，１９９４）。単独の薬剤としての５−ＦＵは、４０年以上の間、結腸直腸癌の標準的な第一線の治療だったが、しかし５−ＦＵとＣＰＴ−１１の組み合わせが、進行性結腸直腸癌に対する代わりの第一線の治療として最近紹介された（非特許文献１５：Ｓａｌｔｚｅｔａｌ．，ＩｒｉｎｏｔｅｃａｎＳｔｕｄｙＧｒｏｕｐ．ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ．３４３：９０５−１４，２０００）。５−ＦＵとオキサリプラチンの組み合わせは、結腸直腸癌における高い応答率を生じた（非特許文献２：Ｒａｙｍｏｎｄｅｔａｌ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２５：４−１２，１９９８）。このように、現在の化学療法剤投与計画の中心的な構成要素のままなので、５−ＦＵが長年の間の癌治療で使用される可能性が高い。さらに、単独の薬剤としての５−ＦＵ療法は、ＣＰＴ−１１又はオキサリプラチンとの組み合わせ療法が過度に有毒であることが見込まれる患者のために使用され続ける。

一部の患者だけが治療への好ましい応答を経験するという点で、５−ＦＵは大部分の抗癌剤の典型である。多数の無作為化された臨床試験は、転移性結腸直腸癌の患者に関して単独の薬剤としての５−ＦＵに対する腫瘍の総体的な応答率が、１５〜２０％の範囲内にあることを示した（非特許文献１４：Ｍｏｅｒｔｅｌ，Ｃ．Ｇ．ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３０：１１３６−１１４２，１９９４）。前記の他の化学療法剤との組み合わせで、５−ＦＵベースの投与計画に対する腫瘍応答率は、ほぼ４０％まで増えた。それにしても、５ＦＵベースの化学療法を受けることから、治療された患者の大多数は、実際の利益を得ないで、かつ、重大な危険、不快、及び経費に晒される。治療より前に個体の応答性を予想する信頼性が高い手段がなかったので、過半数が不満足な転帰に苦しむことを完全に認めて、標準的な臨床試験は全ての患者に５−ＦＵベースの治療を受けさせることになっている。

５−ＦＵの作用機序と代謝経路は、薬物の抗腫瘍活性の最も重要な生化学的決定因子を確認するために何年にもわたって集中的に研究されていた。究極の目標は、ａ）その細胞内代謝及び生化学の調節、及びｂ）治療より前に患者の腫瘍において、患者が上記薬物に対して応答する可能性が最も高い（あるいは応答する可能性が最も低い）のかを予測するための応答決定因子を計測することによって５−ＦＵの臨床効果を改善することだった。

５−ＦＵベースの治療における腫瘍応答予測の分野での最初の研究は、結腸直腸癌の標的酵素、チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）を中心とした。ＴＳもクローン化されている。（非特許文献１６：Ｋａｎｅｄａｅｌａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（３３），２０２７７−２０２８４（１９９０）；登録番号ＮＭ−００１０７Ｊ、配列番号：１１と共に本明細書中に援用する）。Ｌｅｉｃｈｍａｎら（非特許文献１７：Ｌｅｉｃｈｍａｎｅｔａｌ．，ｔＪ．ＣｌｉｎＯｎｃｏｌ．，７５：３２２３−３２２９，１９９７）は、結腸直腸癌からの処置前の生検におけるＲＴ−ＰＣＲによって決定される５−ＦＵへの腫瘍応答をＴＳ遺伝子発現と関連させるために見込みのある臨床試験を実行した。この研究は：１）これらの腫瘍中のＴＳ遺伝子発現レベルの５０倍高い範囲、及び２）応答と不応答腫瘍の間のＴＳ遺伝子発現の著しく異なるレベルを示した。応答群のＴＳレベルの範囲（内部標準に対して０．５〜４．１×１０^−３）は、不応答群のそれ（内部標準に対して１．６〜２３．０×１０^−３）よりも狭かった。治験責任医師らは、不応答者のみで上回る、結果的に生じた、ＴＳ発現の「不応答カットオフ」閾値を決定した。よって、この「不応答カットオフ」を上回るＴＳ発現を有する患者は、治療前に不応答者として明確に確認されることができた。「不応答」の分類は、＜５０％の腫瘍の縮小を有する全ての治療応答、＞２５％の腫瘍増加をもたらす進行性の増殖、及び＜５０％の縮小、変化なし、又は＜２５％の増加のいずれかを有する進行性ではない腫瘍を含んでいた。これらの腫瘍は最も高いＴＳレベルをもっていた。このように、高いＴＳ発現は、特に抵抗性腫瘍を特定する。ある閾値を上回るＴＳ発現レベルは、５−ＦＵに応答しない腫瘍のサブセットを特定し、一方でこの数値を下回るＴＳ発現レベルは、かなり高い応答率を予測した。

興味深いことに、Ｐａｐａｍｉｃｈａｅｌらは、オキサリプラチンが組み合わせ療法において５−ＦＵに関する同化経路を促進すると断定した（非特許文献１８：Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７８（Ｓｕｐｐｌ．２），９８ｐ，１２，１９９８；非特許文献１９：Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ１９９９；４（６）：４７８−８７。これは、癌における５−ＦＵとオキサリプラチンとの多剤併用療法治療の効果を支持するかもしれない。しかも、５−ＦＵベース及び白金ベースの化学療法が、それぞれＴＳ及びＥＲＣＣ１発現レベルに依存することが知られているため、５−ＦＵベース及び白金ベースの化学療法を予測するために、患者から得られた腫瘍組織サンプルからのＥＲＣＣ１発現及びＴＳ発現を正確に定量することが特に重要である。

大部分の、患者由来の病理サンプルは、規定どおりに固定されて、パラフィンに包埋されて（ＦＰＥ）、組織学的解析、そして続くアーカイバルな（ａｒｃｈｉｖａｌ）保存を可能にした。

このように、遺伝子発現の正確な計測が成されうるため、そのような研究がＲＮＡの高い完全性を必要とするので、ほとんどの生検組織サンプルは遺伝子発現の解析に役立たない。現在、遺伝子発現レベルは、タンパク質発現レベルを観察するための免疫組織化学染色を使うことにより、そのような固定され、そして包埋されたサンプルにおいて質的にのみ観察することができる。

これまで、ＥＲＣＣ１とＴＳ発現のそれを含む定量的な遺伝子発現の研究は、新鮮であるか又は冷凍組織からのＲＮＡの逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅に限られていた。Ｒｅｅｄらへの米国特許番号第５，７０５３３６号は、卵巣腫瘍組織からのＥＲＣＣ１ｍＲＮＡの定量方法を開示し、その組織が白金ベースの化学療法に感受性であるかどうかを決定する。Ｌｅｉｃｈｍａｎら及びＲｅｅｄらのとおりに、凍った腫瘍生検からのｍＲＮＡを定量する。

Ｌｅｉｃｈｍａｎら及びＲｅｅｄらが記載のとおり医療専門家による凍った組織の使用は、かなりの不便を課す。あらゆるＲＮＡベースの定量的な遺伝マーカー・アッセイを計画するとき、組織及び続くｍＲＮＡの分解を避けるための迅速な生検の輸送が、一番の関心事である。生検を実施している医療専門家は、組織サンプル受領後直ちにＲＮＡ抽出プロトコールの実施が可能な施設に、その組織サンプルを届けなくてはならない。そのような施設が利用可能でなければ、臨床医は、ｍＲＮＡ分解を防ぐためにすぐにサンプルを凍らせなければならない。診断施設に関して、組織及びＲＮＡ分解より前の有用なＲＮＡ抽出プロトコールを実施するために、それがいくら遠くにあろうとも診断施設に届くまで、組織サンプルは凍ったままでなければならない。液体窒素とドライアイスを備えた専門的な宅配便を使った輸送の間、凍った組織の完全な状態を維持することは、多大な経費のみを生じる。

規定どおりの生検は、一般に間質と腫瘍組織の不均一な混合を含む。新鮮又は凍っている組織と異なり、ＦＰＥ生検組織サンプルは、すぐに顕微解剖されて、間質と腫瘍組織に分けられて、それにより新鮮又は凍っている組織の使用を上回る利点を提供する。しかし、固定された組織、特に固定され、そしてパラフィン包埋された組織からのＲＮＡの単離は、遺伝子発現研究に適用できると一般に思われない高度に分解されたＲＮＡをもたらす。

相当数の技術が、生体サンプルからのＲＮＡの精製のために存在するが、しかしいずれもＦＰＥサンプルからのＲＮＡの単離のために当てにできない。例えば、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ（特許文献１：米国特許番号第５，３４６，９９４号）は、フェノールとグアニジン・イソチオシアネートを使った液相分離に基づく、組織からのＲＮＡ精製方法を記載する。生体サンプルを、フェノールとグアニジン・イソチオシアネート水性溶液中でホモジナイズし、その後このホモジネートを、クロロホルムと混合した。遠心分離に続いて、前記ホモジェネートを有機相、中間相、及び水相に分離させる。タンパク質は有機相に、ＤＮＡは中間相に、そしてＲＮＡは水相に隔離される。ＲＮＡを水相から沈澱させることができる。残念ながら、この方法は、固定され、そしてパラフィン包埋されている（ＦＰＥ）組織サンプルには適用できない。

ＲＮＡを単離するための他の知られた技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋＪ．ら（１９８９年）の７．３〜７．２４ページ、及びＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９９４年）の４．０．３〜４．４．７ページに記載されるように、一般にグアニジン塩又はフェノール抽出を利用する。同様に、既知の方法は全て、パラフィン包埋組織サンプルからのＲＮＡの単離の再現性のある定量的な結果を提供しない。

ある受容体又は酵素の発現レベルが特定の治療の成功の見込みを決定するために使用されるので、それ故、パラフィン包埋組織からのＲＮＡの単離のための技術が、特に腫瘍組織の遺伝子発現の研究のために必要とされる。

オキサリプラチンに対する抵抗性又は感受性に関する予測のための分子マーカーは、まだ決定されていない。オキサリプラチン／５−ＦＵベースの治療の成功の可能性を決定するためのそのようなマーカーが必要である。我々は、除去修復遺伝子ＥＲＣＣ１の腫瘍内ｍＲＮＡ発現、及びチミジル酸シンターゼ遺伝子（ＴＳ）の腫瘍内ｍＲＮＡ発現の両方について、５−ＦＵ／オキサリプラチン多剤併用療法を受けた腫瘍をもつ患者における臨床の成果との有意な反比例の関係を本明細書中で報告する。

米国特許番号第５，３４６，９９４号

Ｌｏｅｈｒｅｒｅｔａｌ．，１９８４，１００Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．７０４Ｒａｙｍｏｎｄｅｔａｌ．，ＳｅｍｉｎＯｎｃｏｌ２５，Ｓｕｐｐｌ５：４−ｌ２，１９９８Ｃｌｅａｖｅｒｅｔａｌ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ１１：８７５−８８２（１９９０）Ｈｏｅｉｊｍａｋｅｒｓｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌｓ２：３１１−３２０（１９９０）Ｓｈｉｖｊｉｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ６９：３６７−３７４（１９９２）Ｆｒａｖａｌｅｔａｌ．，（１９７８），５１Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．１２１ＢｅｃｋａｎｄＢｒｕｂａｋｅｒ（１９７３），１１６Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ１２４７Ｗｅｓｔｅｒｖｅｌｄｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３１０：４２５−４２８（１９８４）Ｔａｎａｋａｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４８：７３−７６（１９９０）Ｄａｂｈｏｌｋａｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．８４：１５１２−１５１７（１９９２）Ｄｉｊｔｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４８：６０５８−６０６２（１９８８）Ｈａｎｓｓｏｎｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８：３５−４０（１９９０）。Ｍｅｔｚｇｅｒ，ｅｔａｌ．，ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ１６：３０９，１９９８）Ｍｏｅｒｔｅｌ，Ｃ．Ｇ．ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３０：１１３６−１１４２，１９９４Ｓａｌｔｚｅｔａｌ．，ＩｒｉｎｏｔｅｃａｎＳｔｕｄｙＧｒｏｕｐ．ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ．３４３：９０５−１４，２０００Ｋａｎｅｄａｅｌａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（３３），２０２７７−２０２８４（１９９０）Ｌｅｉｃｈｍａｎｅｔａｌ．，ｔＪ．ＣｌｉｎＯｎｃｏｌ．，７５：３２２３−３２２９，１９９７Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７８（Ｓｕｐｐｌ．２），９８ｐ，１２，１９９８Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ１９９９；４（６）：４７８−８７

それ故に、提案された遺伝毒性癌療法に関する素早い予測を提供するための腫瘍組織からのＥＲＣＣ１及び／又はＴＳのｍＲＮＡを定量化する方法を提供することが本発明の目的である。固定されて、そしてパラフィン包埋されている（ＦＰＥ）組織におけるＥＲＣＣ１及び／又はＴＳレベルを評価し、そして患者の腫瘍細胞におけるＥＲＣＣ１及び／又はＴＳのｍＲＮＡを検討し、そしてそれを所定の閾値発現レベルと比較することにより、５−ＦＵとオキサリプラチンによる治療に対する患者の腫瘍の可能性のある抵抗性を予測する方法を提供することが本発明の目的である。

本発明の１の側面において、固定されたか、又は固定されそしてパラフィン包埋された（ＦＰＥ）腫瘍細胞から得られたＥＲＣＣ１ｍＲＮＡの発現レベルを評価する方法を提供する。

本発明の他の側面において、固定されたか、又は固定されそしてパラフィン包埋された（ＦＰＥ）腫瘍細胞からのＴＳｍＲＮＡの発現レベルを評価する方法を提供する。

本発明の他の側面において、固定され、そしてパラフィン包埋された（ＦＰＥ）組織サンプルからの内部標準に対するＥＲＣＣ１ｍＲＮＡ発現の量の定量方法を提供する。この方法は、前記サンプルから全ｍＲＮＡの単離を含み、そして内部標準遺伝子のｍＲＮＡの量に対するＥＲＣＣ１ｍＲＮＡの量を測定する。

本発明の他の側面において、固定され、そしてパラフィン包埋された（ＦＰＥ）組織サンプルからの内部標準に対するＴＳｍＲＮＡ発現の量の定量方法を提供する。この方法は、前記サンプルからの全ｍＲＮＡの単離を含み、そして内部標準遺伝子のｍＲＮＡの量に対するＴＳｍＲＮＡの量を測定する。

本発明のこの側面の１の態様において、ＥＲＣＣ１−５０４Ｆ（配列番号：１）又はＥＲＣＣ１−５７４Ｒ（配列番号：２）の配列、及び実質的にそれに一致する配列をもつオリゴヌクレオチド・プライマーを提供する。本発明は、ストリンジェントな条件下、配列番号：１又は配列番号：２、あるいはそれらの相補配列とハイブリダイズする配列をもつオリゴヌクレオチド・プライマーをも提供する。

本発明のこの側面の１の態様において、ＴＳ−７６３Ｆ（配列番号：３）又はＴＳ−８２５Ｒ（配列番号：４）の配列、及び実質的にそれに一致する配列をもつオリゴヌクレオチド・プライマーを提供する。本発明は、ストリンジェントな条件下、配列番号：３又は配列番号：４、あるいはそれらの相補配列とハイブリダイズする配列をもつオリゴヌクレオチド・プライマーを提供する。

本発明のさらに他の側面において、以下のステップ：固定され、そしてパラフィン包埋された（ＦＰＥ）腫瘍サンプルからＲＮＡを単離し；上記サンプル中のＥＲＣＣ１遺伝子発現レベルを測定し；上記サンプル中のＥＲＣＣ１遺伝子発現レベルをＥＲＣＣ１遺伝子に関する所定の閾値と比較し；そして上記ＥＲＣＣ１遺伝子発現レベルと所定の閾値との比較の結果に基づいて化学療法剤投与計画を決定する、を含む患者のために５−ＦＵ及びオキサリプラチン・ベースの化学療法剤投与計画を決定する方法を提供する。

本発明のさらに他の側面において、以下のステップ：固定され、そしてパラフィン包埋された（ＦＰＥ）腫瘍サンプルからＲＮＡを単離し；上記サンプル中のＴＳ遺伝子発現レベルを測定し；上記サンプル中のＴＳ遺伝子発現レベルをＴＳ遺伝子に関する所定の閾値と比較し；そして上記ＴＳ遺伝子発現レベルと所定の閾値との比較の結果に基づいて化学療法剤投与計画を決定する、を含む患者のために５−ＦＵ及びオキサリプラチン・ベースの化学療法剤投与計画を決定する方法を提供する。

本発明のさらに他の側面において、以下のステップ：固定され、そしてパラフィン包埋された（ＦＰＥ）腫瘍サンプルからＲＮＡを単離し；上記サンプル中のＥＲＣＣ１及びＴＳ遺伝子発現レベルを測定し；上記サンプル中のＥＲＣＣ１及びＴＳ遺伝子発現レベルをＥＲＣＣ１及びＴＳ遺伝子に関する所定の閾値と比較し；そして上記ＥＲＣＣ１及びＴＳ遺伝子発現レベルと所定の閾値との比較の結果に基づいて化学療法剤投与計画を決定する、を含む患者のために５−ＦＵ及びオキサリプラチン・ベースの化学療法剤投与計画を決定する方法を提供する。

本発明は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を使って分析された組織サンプル中の内部標準遺伝子に対するＥＲＣＣ１とＴＳの未修正の遺伝子発現（ＵＧＥ）を、ｐｒｅ−ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術により分析されたサンプルから内部標準に対する既知のＥＲＣＣ１及びＴＳ発現レベルに対して標準化する方法にさらに関する。

５−ＦＵ及びオキサリプラチン療法投与計画を受けた、高い（β−アクチンの遺伝子発現の約７．５×１０^−３倍より高い；ｎ＝７）、及び低い（β−アクチン遺伝子発現より約７．５×１０^−３倍より低い；ｎ＝４３）修正されたＴＳ発現レベルをもつ結腸直腸腺癌の患者の生存率及び月ごとの生存率の概算値を示すグラフである。５−ＦＵ及びオキサリプラチン療法投与計画を受けた、高い（β−アクチンの遺伝子発現の約４．９×１０^−３倍より高い；ｎ＝１０）、及び低い（β−アクチン遺伝子発現より約４．９×１０^−３倍より低い；ｎ＝４０）修正されたＥＲＣＣ１発現レベルをもつ結腸直腸腺癌の患者の生存率及び月ごとの生存率の概算値を示すグラフである。５−ＦＵ及びオキサリプラチン療法投与計画を受けた、高い（ＴＳ発現はβ−アクチンの遺伝子発現の約７．５×１０^−３倍より高く、かつ、ＥＲＣＣ１はβ−アクチンの遺伝子発現の約４．９×１０^−３倍より高い；ｎ＝１４）、及び低い（ＴＳ発現はβ−アクチン遺伝子発現より約７．５×１０^−３倍より低く、かつ、ＥＲＣＣ１はβ−アクチン遺伝子発現より約４．９×１０^−３倍より低い；ｎ＝３６）修正されたＴＳ及びＥＲＣＣ１発現レベルをもつ結腸直腸腺癌の患者の生存率及び月ごとの生存率の概算値を示すグラフである。単変量解析により分析したＥＲＣＣ１及びＴＳ発現に対する、オキサリプラチン／５−ＦＵ治療された結腸直腸癌患者の生存を示している表である。層別解析により分析したＥＲＣＣ１及びＴＳ発現に対する、オキサリプラチン／５−ＦＵ治療された結腸直腸癌患者の生存を示している表である。５−ＦＵ及びオキサリプラチン化学療法剤投与計画により治療された結腸直腸腺癌を担持する患者の相対的な応答を示しているグラフである。患者は、進行性の疾患（ＰＤ）、部分的な応答（ＰＲ）及び不変の疾患（ＳＤ）をもつものに分類される。低いレベルのＴＳ及びＥＲＣＣ１の両者をもつ患者が、最も良い応答を得た。内部標準遺伝子に対するＥＲＣＣ１発現の計算方法を説明するチャートである。前記チャートは、２点のテスト・サンプル（未知のもの１及び２）で得られたデータ、及び未修正の遺伝子発現データ（ＵＧＥ）の決定方法の説明を含んでいる。前記チャートは、ｐｒｅ−ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術により決定された既知の相対的なＥＲＣＣ１値を用いた、ＴａｑＭａｎ（登録商標）手段によりもたらされるＵＧＥの標準化方法をも説明する。これは、補正係数Ｋ_{ＥＲＣＣ１}にＵＧＥをかけることにより達成される。図中の内部標準遺伝子は、β−アクチンであり、そして較正ＲＮＡは、ヒト肝臓の全ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カタログ番号７３５０１７）である。内部標準遺伝子に対するＴＳ発現の計算方法を説明するチャートである。前記チャートは、２点のテスト・サンプル（未知のもの１及び２）で得られたデータ、及び未修正の遺伝子発現データ（ＵＧＥ）の決定方法の説明を含んでいる。前記チャートは、以前に公開されたＴＳ値を用いた、ＴａｑＭａｎ（登録商標）手段によりもたらされるＵＧＥの標準化方法をも説明する。これは、補正係数Ｋ_ＴＳにＵＧＥをかけることにより達成される。図中の内部標準遺伝子は、β−アクチンであり、そして較正ＲＮＡは、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製の普遍的なＰＥＲＮＡ；カタログ番号４３０７２８１，Ｌｏｔ番号３６１７８１２０１４である。ＴＳ発現に対する、オキサリプラチン／５−ＦＵ治療に対する結腸直腸癌患者の腫瘍の応答を示している表である。

それぞれ、本発明は、ＴＳ及びＥＲＣＣ１ｍＲＮＡの量が５−ＦＵとオキサリプラチン薬剤のそれぞれへの抵抗性と相関関係があるという発見の一部に属する。高レベルのＴＳ及び／又はＥＲＣＣ１ｍＲＮＡを発現している腫瘍は、白金ベースの化学療法に抵抗性をもつ可能性があると考えられている。逆に、少量のＴＳ及びＥＲＣＣ１ｍＲＮＡしか発現していないそれらの腫瘍は、白金ベースの化学療法に感受性であることが見込まれる。患者の腫瘍のＴＳ及びＥＲＣＣ１ｍＲＮＡ発現特性を、それを所定の閾値発現レベルと比較することにより判断する。

本発明は、内部標準遺伝子発現に対する、固定されたか、又は固定されそしてパラフィン包埋された（ＦＰＥ）組織中のＴＳ及び／又はＥＲＣＣ１ｍＲＮＡ発現の量の定量方法を提供する。本発明者らは、固定されたか、又は固定されそして包埋された組織中のＴＳ及びＥＲＣＣ１遺伝子発現の正確な評価を可能にするオリゴヌクレオチド・プライマーを開発した。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチド・プライマー、ＥＲＣＣ１−５０４Ｆ（配列番号：１）、ＥＲＣＣ１−５７４Ｒ（配列番号：２）、又は実質的にそれらと一致するオリゴヌクレオチド・プライマーは、固定されそしてパラフィン包埋された（ＦＰＥ）腫瘍サンプルから抽出されたＲＮＡと一緒に使用される。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチド・プライマー、ＴＳ−７６３Ｆ（配列番号：３）、ＴＳ−８２５Ｒ（配列番号：４）、又は実質的にそれらと一致するオリゴヌクレオチド・プライマーは、固定されそしてパラフィン包埋された（ＦＰＥ）腫瘍サンプルから抽出されたＲＮＡと一緒に使用される。そして、ＴＳ及び／又はＥＲＣＣ１遺伝子発現のこの計測を、白金ベースの化学療法の予測に使用する。

本発明のこの態様は、第１に、ＦＰＥサンプルからのＲＮＡの信頼性が高い抽出のための方法、そして第２に、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を実施するための１組のオリゴヌクレオチド・プライマー、好ましくはオリゴヌクレオチド・プライマー対、ＥＲＣＣ１−５０４Ｆ（配列番号：１）、及びＥＲＣＣ１−５７４Ｒ（配列番号：２）、又はそれらに実質的に一致するオリゴヌクレオチドを使用することによりサンプル中のＥＲＣＣ１ｍＲＮＡ含量の測定を伴う。

本明細書中に使用されるとき、「実質的に一致する」核酸の状況は、ストリンジェントな条件下で標的へのハイブリダイゼーションを意味し、そして比較された場合に、適当なヌクレオチド挿入及び削除をもつ核酸部分又はそれらの相補鎖が、適切にアラインされたとき、少なくとも約６０％の、一般に少なくとも約７０％の、より一般的には少なくとも約８０％の、通常少なくとも約９０％のヌクレオチドが、より通常少なくとも約９５〜９８％のヌクレオチドが同じでありもすることをも意味する。そのハイブリダイゼーションが特異性の全体の欠如より選択的なとき、選択的なハイブリダイゼーションが存在する。Ｋａｎｅｈｉｓａ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１２：２０３−２１３（１９８４）を参照のこと。

本発明のこの態様は、第１に、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を実施するための１組のオリゴヌクレオチド・プライマー、好ましくはオリゴヌクレオチド・プライマー対、ＴＳ−７６３Ｆ（配列番号：３）及びＴＳ−８２５Ｒ（配列番号：４）、又はそれらに実質的に一致するオリゴヌクレオチドを使用することによりサンプル中のＴＳｍＲＮＡ含量の測定をさらに伴う。ＲＮＡを、ＦＰＥ細胞から、１９９９年１２月２０日に提出された米国特許出願番号第０９／４６９，３３８号に記載の、そのようなサンプルからのｍＲＮＡ単離方法のいずれかにより抽出する。ここで、上記文献の全体を本明細書中に援用する。

当該方法は、患者からのどんな種類の組織にも適用されることができる。腫瘍組織の抵抗性の調査のために、腫瘍組織を検査することが好ましい。好ましい態様において、腫瘍が得られる患者からの正常組織の一部が検査されもする。そして、正常組織が白金ベースの化学療法剤化合物に抵抗力があることが見込まれる、すなわち高レベルのＴＳ及び／又はＥＲＣＣ１遺伝子発現を示す患者であって、上記化合物に感受性であることが見込まれる、すなわちその腫瘍が低レベルのＴＳ及び／又はＥＲＣＣ１遺伝子発現を示す患者を除いた患者は、より多量の化学療法剤組成物により治療される。

本発明の方法は、幅広い範囲の腫瘍の種類に用いられうる。これは、ＴＳ及び／又はＥＲＣＣ１の発現レベルが個々の患者サンプルにて測定され、そして様々な化学療法学への応答を予測することにより、個々の「腫瘍発現特性」の準備が可能になる。好ましくは、本発明の方法は、固形腫瘍、最も好ましくは結腸直腸腺癌に適用される。

本明細書中に規定されるとき、ＥＲＣＣ１発現に関する「所定の閾値レベル」は、腫瘍が５−ＦＵ及び／又はオキサリプラチン・ベースの化学療法剤投与計画に抵抗力があることが分かっているそれを上回るＥＲＣＣ１発現レベルである。この閾値を下回る発現レベルは、５−ＦＵ及び／又はオキサリプラチン・ベースの化学療法剤投与計画に感受性である腫瘍に見られることが見込まれる。白金ベースの化学療法剤投与計画に応答する腫瘍に共通する、ＥＲＣＣ１：β−アクチンの比率として表されたＥＲＣＣ１の相対的な発現の範囲は、約４．９×１０^−３である。白金ベースの化学療法剤投与計画に応答しない腫瘍は、ＥＲＣＣ１：β−アクチン比率が約４．９×１０^−３を上回る相対的な発現を有する。

本明細書中に規定されるとき、ＴＳ発現に関する「所定の閾値レベル」は、腫瘍が５−ＦＵ、及び５−ＦＵとオキサリプラチン・ベースの化学療法剤投与計画に抵抗力があることが分かっているそれを上回るＴＳ発現レベルである。この閾値を下回る発現レベルは、５−ＦＵ、又は５−ＦＵとオキサリプラチン・ベースの化学療法剤投与計画に感受性である腫瘍に見られることが見込まれる。５−ＦＵ、又は５−ＦＵとオキサリプラチン・ベースの化学療法剤投与計画に応答する腫瘍に共通する、ＴＳ：β−アクチンの比率として表されたＴＳの相対的な発現の範囲は、約７．５×１０^−３である。５−ＦＵ、又は５−ＦＵとオキサリプラチン・ベースの化学療法剤投与計画に応答しない腫瘍は、ＴＳ：β−アクチン比率が約７．５×１０^−３を上回る相対的な発現を有する。

本発明の方法の実施において、５−ＦＵ及びオキサリプラチン・ベースの化学療法剤投与計画の効果を予測するために、ＥＲＣＣ１の発現レベル又はＴＳの発現レベルのいずれかが患者の腫瘍サンプルでアッセイされる。しかも、本発明の方法において、５−ＦＵベースの化学療法剤投与計画の効果を予測するために、ＴＳ発現レベルが患者の腫瘍サンプルでアッセイされる。さらに、本発明の方法において、オキサリプラチン・ベースの化学療法剤投与計画の効果を予測するために、ＥＲＣＣ１発現レベルが患者の腫瘍サンプルでアッセイされる。あるいは、混成５−ＦＵ及びオキサリプラチン・ベースの化学療法剤投与計画の効果を予測するために、ＥＲＣＣ１発現レベルとＴＳ発現レベルの両方が患者の腫瘍サンプルでアッセイされる。

本発明のこの態様の方法の実施において、好ましくは、腫瘍細胞は患者から分離される。固形又はリンパ腫、あるいはその部分が、患者から外科的に摘出されるか又はルーチンの生検により得られる。凍っているか又は新鮮なサンプルから単離したＲＮＡを、細胞から本技術分野で典型的な方法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，ＦｉｓｃｈｅｒａｎｄＭａｎｉａｔｉｓ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，（２ｎｄｅｄ．），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，（１９８９）により細胞から抽出した。好ましくは、抽出過程中のＲＮＡの分解を避けるように注意が払われる。

しかし、生検後に患者から得られた組織は、通常ホルマリン（ホルムアルデヒド）かグルタルアルデヒドにより、あるいは、例えばアルコール浸入によりしばしば固定される。固定された生体サンプルは、しばしば脱水されて、パラフィンか当業者に知られた他の固形支持体に包埋される。Ｐｌｅｎａｔｅｔａｌ．，ＡｎｎＰａｔｈｏｌ２００１Ｊａｎ；２ｌ（ｌ）：２９−４７を参照のこと。包埋されなかった組織や固定された組織、並びに固定され、そして包埋された組織が、当該方法で使用されうる。例えば、有機溶剤で除去可能な、例えば保存された組織の、続く再水和を可能にするための、固定された組織の包埋のための固形支持体が想像される。

１９９９年１２月２０日に提出された米国特許出願番号第０９／４６９，３３８号に記載のいずれかの方法により、ＲＮＡをＦＰＥ細胞から抽出し、上記文献の全てを本明細書中に援用する。本明細書中に記載されるとき、固定されそしてパラフィン包埋された（ＦＰＥ）組織は、保存できるか、又はアーカイバルな組織サンプルを参照する。ＲＮＡを、まず脱パラフィンされた、アーカイバルな病理サンプル又は生検サンプルから単離しうる。例えば典型的な脱パラフィン法は、キシレンのような有機溶剤によりパラフィン処理サンプルを洗浄することを伴い、例えば脱パラフィンしたサンプルは、低級アルコール水性溶液により再水和されうる。適当な低級アルコールは、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、及びブタノールを含む。例えば、脱パラフィンされたサンプルは、濃度を下げた低級アルコール溶液による連続的な洗浄により再水和されうる。あるいは、前記サンプルは、同時に脱パラフィンされて、そして再水和される。その後、ＲＮＡがサンプルから抽出される。

ＲＮＡ抽出のために、固定されたか、又は固定されそして脱パラフィンされたサンプルを、機械的、超音波又は他の均質化手段を使って均質化することができる。再水和されたサンプルは、グアニジニウム・チオシアネート（グアニジニウム・イソチオシアネートとして販売されてもいる）のようなカオトロピック剤を含む溶液中で均質化されうる。均質化したサンプルを、有効量のカオトロピック剤、例えばグアニジニウム化合物を含むカオトロピック溶液中、約５０〜約１００℃の範囲の温度に加熱する。好ましいカオトロピック剤は、グアニジニウム・チオシアネートである。

「カオトロピック剤の有効な濃度」は、カオトロピック剤の不存在中で単離される約１０倍より多量にパラフィン包埋サンプル中からＲＮＡが精製されるように選ばれる。カオトロピック剤は、例えば：グアニジニウム化合物、尿素、ホルムアミド、ヨウ化カリウム、カリウム・チオシアネート、及び類似の化合物を含む。本発明の方法のための好ましいカオトロピック剤は、グアニジニウム・イソチオシアネート（グアニジニウム・チオシアネートとして販売されもする）グアニジニウム塩酸塩ようなグアニジニウム化合物である。多くのアニオン性対イオンが有用であり、そして当業者は、そのような適切なアニオンをもつ多くのグアニジニウム塩を作ることができる。本発明で使用されたグアニジニウム溶液の有効な濃度は、約４Ｍの好ましい値をもつ約１〜約５Ｍの範囲内の濃度を一般に有する。ＲＮＡがすでに溶液の中にあれば、サンプルで約１〜約５Ｍの範囲内の終濃度が達成されるように、グアニジニウム溶液はより高い濃度であるかもしれない。グアニジニウム溶液は、好ましくは約３〜約６、より好ましくは約４のｐＨに、Ｔｒｉｓ−Ｃｌのような適当な生化学的緩衝物質により緩衝化されもする。カオトロピック溶液は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及びβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）のような還元剤をも含むかもしれない。カオトロピック溶液はＲＮＡｓｅ阻害薬をも含むかもしれない。

次に、ＲＮＡを、例えばフェノール−クロロホルム抽出、イオン交換クロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィーによりカオトロピック溶液から回収した。次に、抽出、電気泳動、クロマトグラフィー、沈殿の技術又は他の好適な技術を使ってＲＮＡをさらに精製しうる。

新鮮な、冷凍の又は固定されたものから精製した全ｍＲＮＡからのＴＳ又はＥＲＣＣ１ｍＲＮＡの定量を、好ましくは、例えば本技術分野に一般的である逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法を使って実施する。ＴＳ又はＥＲＣＣ１ｍＲＮＡの定量法は、例えば分子ビーコン及び複合ＰＣＲに有用な他の標識プローブの使用を含む。加えて、本発明は、例えばＩｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイ（ＴｈｉｒｄＷａｖｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）のそれらに類似した蛍光標識プローブを利用したＰＣＲを含まないシステムの使用によりＴＳ及び／又はＥＲＣＣ１ｍＲＮＡの定量化を構想する。最も好ましくは、ＴＳ及び／又はＥＲＣＣ１ｃＤＮＡと内部標準又はハウスキーピング遺伝子（例えば、β−アクチン）の定量化を、蛍光に基づくリアルタイム検出方法（ＡＢＩＰＲＩＳＭ７７００又は７９００配列検出システム［ＴａｑＭａｎ（登録商標）］、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）又はＨｅｉｄら（ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．１９９６；６：９８６−９９４）及びＧｉｂｓｏｎら（ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．１９９６；６：９９５−１００１）により記載された類似のシステムを用いて行う。ＡＢＩ７７００（ＴａｑＭａｎ（登録商標）装置）の出力は、Ｃｔ’ｓ又は「サイクル閾値」で表される。ＴａｑＭａｎ（登録商標）システムにより、サンプル中でより多数の標的分子を有する高度に発現された遺伝子は、少ない標的分子しかもたない低い相対的な発現からの遺伝子（より高いＣｔ）よりも、少ないＰＣＲサイクルによってシグナルを生じる（より低いＣｔ）。

本明細書中に使用されるとき、「ハウスキーピング」遺伝子又は「内部標準」は、その存在がＴＳ及び／又はＥＲＣＣ１ｍＲＮＡレベルの評価を可能にするあらゆる構造遺伝子又は全体的に発現された遺伝子を含むことを意味する。そのような評価は、遺伝子転写の総体的な構造レベル及びＲＮＡ回復の変化についての対照の測定を含む。「ハウスキーピング」遺伝子又は「内部標準」は、これだけに制限されることなく、サイクロ（登録商標）フィリン遺伝子、β−アクチン遺伝子、トランスフェリン受容体遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子などを含みうる。最も好ましくは、内部標準遺伝子は、Ｅａｄｓｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ１９９９；５９：２３０２−２３０６に記載のβ−アクチン遺伝子である。

ＲＮＡ回復の変化についての対照は、「較正用ＲＮＡ（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒＲＮＡ）」の使用を必要とする。「較正用ＲＮＡ」は、正確に前もって定量される対照ＲＮＡのための全ての利用可能な源であることが意図される。好ましくは、ＥＲＣＣ１の定量にヒト肝臓全ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号７３５０１７）が使用され、及びＴＳの定量に、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製の普遍的なＰＥＲＮＡ；カタログ番号４３０７２８１、ロット番号３６１７８１２０１４が使用される。

本明細書中に使用されるとき、「未修正の遺伝子発現（ＵＧＥ）」は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）装置により得られる内部標準遺伝子に対するＴＳ及び／又はＥＲＣＣ１発現の出力値を言及する。ＵＧＥの決定に使用される方程式は、実施例３及び４で示されて、そして図７及び８のサンプル計算で説明される。

この本発明のさらなる側面において、非ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術からもたらされた「既知の相対的な遺伝子発現」値を用いた、ＴａｑＭａｎ（登録商標）装置から得られた未修正の遺伝子発現（ＵＧＥ）値の標準化法を提供する。好ましくは、組織サンプルからＴａｑＭａｎ（登録商標）が導き出したＴＳ及び／又はＥＲＣＣ１ＵＧＥ値は、既知の非ＴａｑＭａｎ（登録商標）が導き出した相対的なＴＳ及び／又はＥＲＣＣ１：β−アクチン発現値をもつサンプルに対して標準化される。

本明細書中に使用されるとき、「修正された相対的なＥＲＣＣ１発現」は、標準化されたＥＲＣＣ１発現を言及し、ＥＲＣＣ１発現レベルが内部標準遺伝子に対する既知の範囲に匹敵しうる値としてもたらされた、ＥＲＣＣ１特有の補正係数（Ｋ_{ＥＲＣＣ１}）をＵＧＥにかけることにより標準化される。実施例３及び図７は、これらの計算を詳細に説明する。これらの数値は、特定のサンプルの「修正された相対的なＥＲＣＣ１発現」が「所定の閾値」を上回るか下回るかどうかの決定を可能にする。β−アクチンに対する修正された相対的なＥＲＣＣ１発現の所定の閾値レベルは、約４．９×１０^−３である。ＥＲＣＣ１、内部標準β−アクチン及び較正用ヒト肝臓全ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号７３５０１７）に関して特有のＫ_{ＥＲＣＣ１}は、１．５４×１０^−３である。

「既知の相対的な遺伝子発現」値は、先に分析した組織サンプルから導き出され、そして構造的に発現される内部標準遺伝子（例えばβ−アクチン、ＧＡＰＤＨなど）に対する標的遺伝子のＲＴ−ＰＣＲシグナルの比率に基づく。好ましくは、そのような組織サンプルは、ホルマリンで固定されて、そしてパラフィン包埋された（ＦＰＥ）サンプルであり、かつ、ＲＮＡは、実施例１及び１９９９年１２月２０日に提出された米国特許出願番号第０９／４６９，３３８号に記載のプロトコールに従ってそれらから抽出される。ここで、前記文献の全体を本明細書中に援用する。内部標準に対する遺伝子発現の定量のために、本技術分野で知られる標準的な定量的ＲＴ−ＰＣＲ技術が使用される。Ｐｒｅ−ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術ＰＣＲ反応は、固定されたサイクル数（すなわち３０）を行ない、そして終点の値を各々のサンプルについて記録する。これらの値は、その後ＥＲＣＣ１発現対β−アクチン発現の比として記録される。Ｒｅｅｄらに対する米国特許番号第５，７０５，３３６号を参照のこと。

Ｋ_{ＥＲＣＣ１}は、β−アクチン以外の内部標準遺伝子及び／又はヒト肝臓全ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号７３５０１７）と異なる較正用ＲＮＡに関して決定されることもある。そのために、当業者は、特定の内部標準遺伝子に対するＥＲＣＣ１発現レベルがすでに決定された（すなわち「既知の相対的な遺伝子発現」）組織サンプルに対し、内部標準遺伝子と較正用ＲＮＡの両者を較正しなければならない。好ましくは、そのような組織サンプルは、ホルマリンで固定されて、そしてパラフィン包埋された（ＦＰＥ）サンプルであり、かつ、ＲＮＡは、実施例１及び１９９９年１２月２０日に提出された米国特許出願番号第０９／４６９，３３８号に記載のプロトコールに従ってそれらから抽出される。ここで、前記文献の全体を本明細書中に援用する。そのような決定は、本技術分野で周知の標準的なＰｒｅ−ＴａｑＭａｎ（登録商標）、定量的ＲＴ−ＰＣＲ技術を使ってなされうる。そのような定量において、そのようなサンプルは、実施例３に記載のとおり、新しい内部標準及び／又は較正用ＲＮＡに特有の新しいＫ_{ＥＲＣＣ１}の決定に有用なＥＲＣＣ１の既知の相対的な遺伝子発現」レベルをもつ。

本明細書中に使用されるとき、「修正された相対的なＴＳ発現」は、標準化されたＴＳ発現を言及し、ＴＳ発現レベルが内部標準遺伝子に対する既知の範囲に匹敵しうる値としてもたらされた、ＴＳ特有の補正係数（Ｋ_ＴＳ）をＵＧＥにかけることにより標準化される。実施例４及び図８は、これらの計算を詳細に説明する。これらの数値は、特定のサンプルの「修正された相対的なＴＳ発現」が「所定の閾値」を上回るか下回るかどうかの決定を可能にする。β−アクチンに対する修正された相対的なＴＳ発現の所定の閾値レベルは、約７．５×１０^−３である。ＴＳ、内部標準β−アクチン及び較正用のＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製の普遍的なＰＥＲＮＡ；カタログ番号４３０７２８１、ロット番号３６１７８１２０１４に関して特有のＫ_ＴＳは、１２．６×１０^−３である。

Ｋ_ＴＳは、β−アクチン以外の内部標準遺伝子及び／又はＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製の普遍的なＰＥＲＮＡ；カタログ番号４３０７２８１、ロット番号３６１７８１２０１４と異なる較正用ＲＮＡに関して決定されることもある。そのために、当業者は、特定の内部標準遺伝子に対するＴＳ発現レベルがすでに決定された（すなわち「既知の相対的な遺伝子発現」又は「先に公開された」）組織サンプルに対し、内部標準遺伝子と較正用ＲＮＡの両者を較正しなければならない。好ましくは、そのような組織サンプルは、ホルマリンで固定されて、そしてパラフィン包埋された（ＦＰＥ）サンプルであり、かつ、ＲＮＡは、実施例１及び１９９９年１２月２０日に提出された米国特許出願番号第０９／４６９，３３８号に記載のプロトコールに従ってそれらから抽出される。ここで、前記文献の全体を本明細書中に援用する。そのような決定は、本技術分野で周知の標準的なＰｒｅ−ＴａｑＭａｎ（登録商標）、定量的ＲＴ−ＰＣＲ技術を使ってなされうる。そのような定量において、そのようなサンプルは、実施例４に記載のとおり、新しい内部標準及び／又は較正用ＲＮＡに特有の新しいＫ_ＴＳの決定に有用なＴＳの既知の相対的な遺伝子発現」レベルをもつ。

「先に公開された」相対的な遺伝子発現の結果は、構造的に発現される遺伝子（β−アクチン）に対する標的遺伝子のＲＴ−ＰＣＲシグナルの比に基づく。Ｐｒｅ−ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術での調査において、ＰＣＲ反応は、固定されたサイクル数（すなわち３０）を行ない、そして終点の値を各々のサンプルについて記録した。これらの値は、その後ＥＲＣＣ１又はＴＳ発現対β−アクチン発現の比として記録された。Ｓａｌｏｎｇａ，ｅｔａｌ．，ＣｌｉｎｉｃａｌＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，６：１３２２−１３２７，２０００の全体を本明細書中に援用する。

本発明の方法は、広範な組織及び腫瘍の種類に適用でき、それで患者の臨床の治療の評価のために、そして胸部、頭部及び首、肺、食道、並びに結腸を含む範囲の癌のための診断又は予測の道具として使用されることができる。好ましい態様において、当該方法は、結腸直腸腺癌の予後に適用される。

化学療法治療前の腫瘍生検は、一般に非常に少量の異質な組織を含む、固定されたパラフィン包埋（ＦＰＥ）組織としてのみ通常入手可能である。ＴＳ及び／又はＥＲＣＣ１遺伝子発現を間質組織が混入していない腫瘍組織で決定されうるように、そのようなＦＰＥサンプルは、顕微解剖に直ちに耐えられる。その上、そのようなサンプルはしばしば両方のタイプの組織を含んでいるので、比較対照は、生検組織サンプル内の間質と腫瘍組織の間で成されうる。

一般的に、配列番号：１０で示されるような、ＥＲＣＣ１遺伝子の部位の側面に位置するあらゆるオリゴヌクレオチド対が、本発明の方法を実施するために使用されうる。本発明における使用のための、ストリンジェントな条件下でＥＲＣＣ１遺伝子の部位にハイブリダイズするプライマーは、２０〜１０００塩基対、好ましくは５０〜１００塩基対、最も好ましくは１００未満の塩基対の産物を増幅するであろう。

本発明は、ＦＰＥ組織を使った特に正確なＥＲＣＣ１発現の評価を可能にする特異的なオリゴヌクレオチド・プライマー対、及びそれに実質的に一致するオリゴヌクレオチド・プライマーを提供する。好ましいものは、オリゴヌクレオチド・プライマー、ＥＲＣＣ１−５０４Ｆ（配列番号：１）及びＥＲＣＣ１（配列番号：２）、（本明細書中でオリゴヌクレオチド・プライマー対ＥＲＣＣ１と呼ばれもする）、そしてそれらと実質的に一致するオリゴヌクレオチド・プライマーである。オリゴヌクレオチド・プライマー、ＥＲＣＣ１−５０４Ｆ（配列番号：１）及びＥＲＣＣ１（配列番号：２）は、いずれかのｍＲＮＡ単離法、例えば実施例１に記載されるように、ＦＰＥ細胞から抽出されたＲＮＡを使用し、ＥＲＣＣ１ｍＲＮＡレベルを計測するために特に有効であることが示された。

さらに、一般的に、配列番号：１１で示されるような、ＴＳ遺伝子の部位の側面に位置するあらゆるオリゴヌクレオチド対が、本発明の方法を実施するために使用されうる。本発明における使用のための、ストリンジェントな条件下でＴＳ遺伝子の部位にハイブリダイズするプライマーは、２０〜１０００塩基対、好ましくは５０〜１００塩基対、最も好ましくは１００未満の塩基対の産物を増幅するであろう。

本発明は、ＦＰＥ組織における特に正確なＴＳ発現の評価を可能にする特異的なオリゴヌクレオチド・プライマー対、及びそれに実質的に一致するオリゴヌクレオチド・プライマーを提供する。好ましいものは、オリゴヌクレオチド・プライマー、ＴＳ−７６３Ｆ（配列番号：３）及びＴＳ（配列番号：４）、（本明細書中でオリゴヌクレオチド・プライマー対ＴＳと呼ばれもする）、そしてそれらと実質的に一致するオリゴヌクレオチド・プライマーである。オリゴヌクレオチド・プライマー、ＴＳ−７６３Ｆ（配列番号：３）及びＴＳ（配列番号：４）は、いずれかのｍＲＮＡ単離法、例えば実施例１に記載されるように、ＦＰＥ細胞から抽出されたＲＮＡを使用し、ＴＳｍＲＮＡレベルを計測するために特に有効であることが示された。

この本発明は、ＥＲＣＣ１−５０４Ｆ（配列番号：１）かその相補配列、若しくはＥＲＣＣ１−５７４Ｒ（配列番号：２）、又はその相補配列のオリゴヌクレオチド・プライマー配列、あるいはＴＳ−７６３Ｆ（配列番号：３）かその相補配列、若しくはＴＳ−８２５Ｒ（配列番号：４）、又はその相補配列のオリゴヌクレオチド・プライマー配列の全体か又はその一部に（本明細書中に記載のとおり）ストリンジェントな条件下、ハイブリダイズする実質的に一致するオリゴヌクレオチドを含む。

ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、本明細書中に規定されるとおり、高度に相補的であるもののみ、すなわち、実質的に類似する核酸配列がハイブリダイズする。好ましくは、そのような条件は、２０の隣接しているヌクレオチドの中の４超のミスマッチをもつ、より好ましくは２０の隣接しているヌクレオチドの中の２超のミスマッチをもつ、最も好ましくは２０の隣接しているヌクレオチドの中の１超のミスマッチをもつ核酸のハイブリダイゼーションを阻止する。

核酸のハイブリダイズする部分は、一般に少なくとも１０（例えば１５）ヌクレオチドの長さである。ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズする部分は、オリゴヌクレオチド・プライマー、ＥＲＣＣ１−５０４Ｆ（配列番号：１）かその相補配列、若しくはＥＲＣＣ１−５７４Ｒ（配列番号：２）、又はその相補配列、あるいはオリゴヌクレオチド・プライマー、ＴＳ−７６３Ｆ（配列番号：３）かその相補配列、若しくはＴＳ−８２５Ｒ（配列番号：４）、又はその相補配列の全体又はその一部に少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは少なくとも約９８％一致する。

ストリンジェントな条件下、核酸サンプルへのオリゴヌクレオチド・プライマーのハイブリダイゼーションを以下に規定する。核酸２本鎖又はハイブリッドの安定性は、プローブが標的ＤＮＡから解離する温度であるメルティング温度（Ｔｍ）として表される。このメルティング温度は、条件の必要とされるストリンジェントさを規定するために使用される。一致することよりむしろプローブと実質的に一致する配列を同定する場合、特定な濃度の塩（例えばＳＳＣ又はＳＳＰＥ）により相同的なハイブリダイゼーションだけが起こるより低い温度でまず確率することが有用である。そして１％のミスマッチングがＴｍの１℃の低下をもたらすと仮定し、ハイブリダイゼーション反応の最終の洗浄温度がそれに応じて低下する（例えば、プローブと＞９５％の相同性を持った配列を捜す場合には、最終の洗浄温度は５℃下げられる）。実際、Ｔｍの変化は、１％のミスマッチにつき０．５℃〜１．５℃でありうる。

ストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ／５×デンハルト溶液／１．０％ＳＤＳ中、６８℃でのハイブリダイズし、そして０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、室温で洗浄することを伴う。中程度のストリンジェントな条件は、３×ＳＳＣ中、４２℃での洗浄を含んでいる。プライマーと標的核酸の間の相同性の最善のレベルを達成するために、塩濃度と温度の指標は変化する。そのような条件に関しての追加の手引きは、本技術分野で、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，ＦｉｓｃｈｅｒａｎｄＭａｎｉａｔｉｓ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，（２ｎｄｅｄ．），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，（１９８９）及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌｅｄｓ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ（１９９４）ですぐに入手可能である。

本明細書中に開示したオリゴヌクレオチド・プライマーは、固定化されたか、又は固定化されそしてパラフィン包埋された組織、並びに冷凍又は新鮮な組織におけるＴＳ及び／又はＥＲＣＣ１遺伝子発現の正確な評価を可能にする。これは、新鮮な又は冷凍の組織のそれに対して、ＦＰＥサンプル由来のＲＮＡがより断片化されているという事実にもかかわらず起こる。このように、これまで固定された組織を使ったＴＳ及び／又はＥＲＣＣ１遺伝子発現のアッセイ法が存在しなかったが、本発明の方法は、ＦＰＥ組織中のＴＳ及び／又はＥＲＣＣ１遺伝子発現レベルのアッセイへの使用に好適である。

５−ＦＵとオキサリプラチンのベースの化学療法と組み合わせて使用されうる遺伝毒性薬は、持続的なゲノム病変を形成するものであり、癌の臨床管理における化学療法剤として使用するために好ましいものである。遺伝毒性物質により誘発されたＤＮＡ損傷の細胞性の修復の速度、並びに細胞分裂周期による細胞増殖の速度は、遺伝毒性物質療法の転帰に影響する。細胞ゲノム中の未修復の病変は、ＤＮＡ複製を妨げるか、新しく合成されたＤＮＡ複製の忠実度を損なわせるか、又は細胞の生存のために必要とされる遺伝子の発現を妨げる可能性がある。このように、遺伝毒性薬の細胞毒性（細胞死に寄与する傾向）の１つの決定要因は、それから形成されたゲノム病変の細胞性の修復に対する抵抗性である。持続的なゲノム病変、例えば細胞が少なくとも細胞周期に入るまでゲノムに残る病変を形成する遺伝毒性薬は、一般に、一時的で容易に修復されるゲノム病変を形成する薬剤より効果的な細胞毒である。

遺伝毒性物質であるオキサリプラチン、すなわちｃｉｓ−オキサラト（トランス−１−１，２−シクロヘキサンジアミン）プラチニウム（ＩＩ）が、米国特許番号第４，１６９，８４６号に記載されている。関連特許は、以下の：米国特許番号第５，２９０，９６１号；米国特許番号第５，２９８，６４２号；米国特許番号第５，３３８、８７４号；米国特許番号第５，４２０，３１９号、及びＰＣＴ／ＩＢ／００６１４を含んでいる。オキサリプラチンは、現在全面的に開発中のプラチニウム（ＩＩ）−トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン錯体のクラスに属している。前記錯体又は「ｄａｃｈ」錯体は、臨床的に試験済みで、メラノーマ、並びに卵巣、子宮、胃、及び腸などの腫瘍に対して特に効果的である。５−ＦＵとオキサリプラチン・ベースの化学療法を補うために使用されうる他の化合物は、オキサリプラチンの相似体の仲間、例えば「ｄａｃｈ」錯体及び電子対を共有したＤＮＡ付加物を形成するものを含むことができる。好ましい態様において、本発明に使用される補足的な白金化合物は、オキサリプラチンである。

白金配位化合物により容易に管理できる腫瘍は、髄芽腫及び神経芽細胞腫に加えて、精巣の癌、子宮内の癌、子宮頸部の癌、胃癌、扁平上皮細胞の癌、副腎皮質の癌、及び小細胞肺癌を含んでいる。

先に記載した本発明、つまり本発明の実施を以下に提供した実験的な実施例により説明する。当業者は、説明のための実施例で使用された物質及び方法が様々な方法で修飾されうることに気が付くであろう。そのような修飾は、本発明の範囲内にあると考えられる。

実施例１
ＦＰＥ組織からのＲＮＡ単離
以下の一般的な手順によりパラフィン包埋組織からＲＮＡを抽出する。
Ａ．脱パラフィンと切片の水和：
（１）約１０μＭの切片の一部をプラスチック製の１．５ｍＬ遠沈管に入れる。
（２）６００μＬのキシレンを加え、そしてこの混合物を室温（約２０〜２５℃）で約１０分間激しく振とうする。

（３）サンプルを、卓上遠心分離機の最大スピード（約１０〜２０，０００×ｇ）で、室温で約７分間遠心分離する。
（４）大部分のパラフィンが溶解するまでステップ（２）及び（３）を繰り返す。元のサンプル部分に含まれているパラフィンの量に依存して、通常２回以上を要する。
（５）低級アルコール、好ましくは１００％エタノール（約６００μＬ）と一緒に約３分間激しく振とうすることによりキシレン溶液を取り除く。

（６）ステップ（３）のように前記遠沈管を約７分間遠心分離する。上清をデカントし、捨てる。ペレットは白くなる。
（７）連続的にさらに希釈したエタノール溶液：最初は約９５％のエタノールを用いて、次に約８０％、そして最後に約７０％のエタノールを用いて、ステップ（５）及び（６）を繰り返す。
（８）ステップ（３）のようにサンプルを室温で７分間遠心分離する。上清を捨て、ペレットを室温で約５分間乾燥させる。

Ｂ．フェノール−クロロホルムによるＲＮＡの単離
（１）０．５％のサルコシンと８μＬのジチオスレイトールを含む４００μＬのグアニジン・イソチオシアネート溶液を添加する。
（２）次に、低速（スピード１）から高速（スピード５）に徐々にスピードを上げながら組織ホモジナイザー（Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ，ＩＫＡ−Ｗｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ）を用いてサンプルを約２〜３分間均質化する。
（３）次に、サンプルを約５〜２０分間約９５℃で加熱する。９５℃に加熱する前に細いゲージ針でサンプルを含む遠沈管のキャップに穴を開けておくことが好ましい。あるいは、前記キャップをプラスチックの鉗子又は実験用フィルムで貼っておく。
（４）次に、サンプルを、ｐＨ４．０の５０μｌの２Ｍ酢酸ナトリウムと６００μＬのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（１０：１．９３：０．０３６）により抽出し、１８ｍＬのフェノールを３．６ｍＬの１：４９イソアミルアルコール：クロロホルム溶液を混合することにより新たに調製する。この溶液を約１０秒間激しく振とうし、そして約１５分間の氷冷を行う。
（５）前記溶液を最大スピードで約７分間遠心分離する。上（水）相を新しい遠沈管に移す。

（６）約１０μＬのグリコーゲンと４００μＬのイソプロパノールを用いて−２０℃で３０分間、ＲＮＡを沈澱させる。
（７）卓上遠心分離機により最大スピードで約７分間遠心分離してＲＮＡをペレットにし；上清をデカントして、捨て；そしてこのペレットを約５００μＬの約７０〜７５％のエタノールで洗浄する。
（８）サンプルを再び最大スピードで７分間遠心分離する。上清をデカントし、ペレットを風乾した。次に、このペレットをさらなる実験のために適切な緩衝液（例えば、５０ｐＩ、５ｍＭＴｒｉｓ塩化物、ｐＨ８．０）中に溶解する。

実施例２
ｍＲＮＡ逆転写とＰＣＲ
逆転写：実施例１で説明されるように、及び１９９９年１２月２０日に提出された米国出願番号第０９／４６９，３３８号で先に記載のとおり、顕微解剖したか又は顕微解剖していないホルマリン固定したパラフィン包埋（ＦＰＥ）組織からＲＮＡを単離した。ここで、前記文献の全体を本明細書中に援用する。エタノールでの沈殿、そして遠心分離の後に、ＲＮＡペレットを５０μｌの５ｍＭＴｒｉｓ／ＣｌｐＨ８．０中に溶解した。Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素は、デオキシヌクレオチドの存在下、一本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ鋳型にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド・プライマーを伸長し、相補鎖を生み出す。得られたＲＮＡを、ランダム・ヘキサマーとＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＭ−ＭＬＶ逆転写酵素により逆転写した。２５μｌのＲＮＡ溶液を２５．５μｌの「逆転写ミックス」（以下を参照のこと）と混ぜることにより逆転写は達成された。前記反応は、２６℃で８分間（ＲＮＡへのランダム・ヘキサマーの結合のため）、４２℃で４５分間（Ｍ−ＭＬＶ逆転写酸素の反応のため）、そして９５℃で５分間（ＤＮＡｓｅの熱不活化のため）、サーモサイクラー中に置いた。

「逆転写ミックス」は、１０μｌの５Ｘ緩衝液（２５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３、３７５ｍＭＫＣｌ、１５ｍＭＭｇＣｌ_２）、０．５μｌのランダム・ヘキサマー（５０Ｏ．Ｄ．、５５０μｌの１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５中に溶解）、５μｌの１０ｍＭｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰ）、５μｌの０．１ＭＤＴＴ、１．２５μｌのＢＳＡ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ，ｐＨ７．５中、３ｍｇ／ｍｌ）、１．２５μｌのＲＮＡＧｕａｒｄ２４，８００Ｕ／ｍｌ（ＲＮＡｓｅ阻害薬）（ブタ、番号２７−０８１６、ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ）、並びに２．５μｌのＭ−ＭＬＶ２００Ｕ／μｌ（ＬｉｆｅＴｅｃｈカタログ番号２８０２５−０２）から成る。

反応組成物の終濃度は：５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ_２、１．０ｍＭのｄＮＴＰ、１．０ｍＭのＤＴＴ、０．００３７５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．６２Ｕ／μｌのＲＮＡＧｕａｒｄ、及びに１０Ｕ／μｌのＭ−ＭＬＶである。

ｍＲＮＡ発現のＰＣＲ定量化：ＥＲＣＣ１ｃＤＮＡ及び内部標準又はハウスキーピング遺伝子（例えば、β−アクチン）ｃＤＮＡの定量化を、Ｈｅｉｄら（ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．１９９６；６：９８６−９９４）；Ｇｉｂｓｏｎら（ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．１９９６；６：９９５−１００１）により記載されたとおり、蛍光に基づくリアルタイム検出法（ＡＢＩＰＲＩＳＭ７７００又は７９００ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ［ＴａｑＭａｎ（登録商標）］、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）を使用することで行った。手短に言えば、この方法は、正及び逆プライマー内に特異的にアニールする二重標識蛍光発生ＴａｑＭａｎ（登録商標）オリゴヌクレオチド・プローブ（ＥＲＣＣ１−５３０Ｔｃ（配列番号：５）、Ｔｍ＝７０℃；ＴＳ−７８１（配列番号：６）、β−アクチン−６１１（配列番号：７））を使用する。反応混合物を含む蓋の付いたウェル内でのレーザー刺激は、前記プローブがＰＣＲ伸長中のＤＮＡポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断され、５’リポーター色素（６ＦＡＭ）の放出を引き起こすまで、３’クエンチャー色素（ＴＡＭＲＡ）の放射を引き起こす。このように、単位複製配列の産生が、ＴａｑＭａｎ（登録商標）のＣＣＤ（電荷結合素子）検出カメラにより検出される蛍光シグナルを発生し、そしてＰＣＲ反応の純粋な指数期の間の閾値サイクルにおいて産生されたシグナルの量は、着目の配列の開始コピー数を反映する。着目の配列の開始コピー数と内部標準遺伝子の開始コピー数との比較は、相対的な遺伝子発現レベルを提供する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）分析は、２つの独立した測定（着目の遺伝子／内部標準遺伝子）の間の比として表されるレベルをもたらす。

ＰＣＲ応答混合物は、先に記載されたとおり準備したｃＤＮＡを含む０．５μｌの逆転写反応物、６００ｎＭのオリゴヌクレオチド・プライマー、ＥＲＣＣ１−５０４Ｆ（配列番号：１、Ｔｍ＝５９℃）及びＥＲＣＣ１−５７４Ｒ（配列番号：２、Ｔｍ＝５８℃、又はオリゴヌクレオチド・プライマー、ＴＳ−７６３Ｆ（配列番号：３）及びＴＳ−８２５Ｒ（配列番号：４）、２００ｎＭのＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（配列番号：５又は配列番号：６）、５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄポリメラーゼ、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、４００μＭのｄＴＴＰ、５．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、並びに２５μｌに等しいか又はそれ未満までの、基準色素を含む１×Ｔａｑｍａｎ緩衝液Ａ（全試薬がＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）から成る。サイクル条件は、９５℃１０分間、続いて９５℃１５秒間及び６０℃１分間で４５サイクルであった。内部標準遺伝子β−アクチンの定量に使用されたオリゴヌクレオチドは、β−アクチン−５９２Ｆ（配列番号：８）及びβ−アクチン−６５１Ｒ（配列番号：９）であった。

実施例３
ＥＲＣＣ１に関する未修正の遺伝子発現（ＵＧＥ）の測定
２組の平行する反応（「試験」反応及び「較正」反応）を実施する（図７）。ＥＲＣＣ１増幅反応、及びβ−アクチン内部標準増幅反応が前記試験反応である。別々のＥＲＣＣ１及びβ−アクチン増幅反応が、較正用ＲＮＡ鋳型において実施され、そして較正反応と呼ばれる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）装置は、４つの異なるサイクル閾値（Ｃｔ）の値をもたらす：試験反応からのＣｔ_{ＥＲＣＣ１}及びＣｔ_{β−アクチン}、並びに較正反応からのＣｔ_{ＥＲＣＣ１}及びＣｔ_{β−アクチン}。２つの反応に関するＣｔ値の相違は、以下の方程式に従って決定される：
ΔＣｔ_試験＝Ｃｔ_{ＥＲＣＣ１}−Ｃｔ_{β−アクチン}（「試験」反応より）
ΔＣｔ_較正用＝Ｃｔ_{ＥＲＣＣ１}−Ｃｔ_{β−アクチン}（「較正」反応より）

次のステップは、以下の方程式に従い、２をマイナスΔＣｔ乗することを伴う。
２^−ΔＣｔ _試験（「試験」反応より）
２^−ΔＣｔ _較正用（「較正」反応より）
次に、ＴａｑＭａｎ（登録商標）装置からＥＲＣＣ１についての未修正の遺伝子発現を得るために以下の計算を実施する：
ＥＲＣＣ１に関する未修正の遺伝子発現（ＵＧＥ）＝２^−ΔＣｔ _試験／２^−ΔＣｔ _較正用

既知の相対的なＥＲＣＣ１発現レベルによるＵＧＥの標準化
標準化計算は、ＥＲＣＣ１及び特定の較正用ＲＮＡに特有の修正係数（Ｋ_{ＥＲＣＣ１}）をＵＧＥに乗算する必要がある。修正係数Ｋ_{ＥＲＣＣ１}を、あらゆる内部標準遺伝子及びあらゆる正確に、先に定量された較正用ＲＮＡについて決定することもできる。好ましくは、内部標準遺伝子β−アクチン、及び正確に、先に定量された較正用ＲＮＡであるヒト肝臓全ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号７３５０１７）を使用する。特定のこれらの試薬の修正係数Ｋ_{ＥＲＣＣ１}は１．５４×１０^−３に相当する。

標準化は、ユーザー公報番号２中、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＴａｑＭａｎ（登録商標）製造業者により記載された、及び先に記載したΔＣｔ法の変法を使って達成された。この手順を実施するために、６つの異なる試験組織のＵＧＥを、先に記載のＴａｑＭａｎ（登録商標）方法論を使ってＥＲＣＣ１発現について分析した。内部標準遺伝子β−アクチン及び較正用ＲＮＡであるヒト肝臓全ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号７３５０１７）を使用した。

平均していない修正係数Ｋを得るために、各々のサンプルＡＧ２２１、ＡＧ２２２、ＡＧ２５２、成人の肺、ＰＣ３、ＡｄＣｏｌの既知の相対的なＥＲＣＣ１発現レベルを、対応の、ＴａｑＭａｎ（登録商標）に導き出されたＵＧＥにより割った。
Ｋ_{平均していない}＝既知の値／ＵＧＥ

次に、全てのＫ値を平均し、ＥＲＣＣ１、ヒト肝臓全ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号７３５０１７）較正用ＲＮＡ及びβ−アクチンに特有のたった１つのＫ_{ＥＲＣＣ１}修正係数を決定する。
従って、ｐｒｅ−ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＥＲＣＣ１発現の試験と一致した規模での未知の組織サンプルにおける修正された相対的なＥＲＣＣ１発現を決定するために、同じ内部標準遺伝子及び較正用ＲＮＡの使用を前提として、当業者は特定の修正係数Ｋ_{ＥＲＣＣ１}を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）装置から導き出された未修正の遺伝子発現データ（ＵＧＥ）に単純にかける。
修正された相対的なＥＲＣＣ１発現＝ＵＧＥ×Ｋ_{ＥＲＣＣ１}

Ｋ_{ＥＲＣＣ１}は、いずれかの正確に前もって定量された較正用ＲＮＡ又は内部標準遺伝子を使用して決定される。正確に前もって定量されたＲＮＡの今後の源は、前記方法に記載のとおり、既知の相対的なＥＲＣＣ１発現レベルを有するサンプルに対し較正されうるか、あるいはヒト肝臓全ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号７３５０１７）のような先に較正を行った較正用ＲＮＡに対してここで再び較正されるかもしれない。

例えば、その後のＫ_{ＥＲＣＣ１}を異なる内部標準遺伝子及び／又は異なる較正用ＲＮＡに関して決定する場合、当業者は、その特定の内部標準遺伝子に対するＥＲＣＣ１発現レベルがすでに決定された組織サンプル対する内部標準遺伝子及び較正用ＲＮＡの両者を計測しなくてはならない。そのような測定は、本技術分野で周知の標準的なｐｒｅ−ＴａｑＭａｎ（登録商標）、定量的なＲＴ−ＰＣＲ技術を使用して成される。これらのサンプルに関する既知の発現レベルを、それらの対応するＵＧＥレベルによって割り、上記サンプルに関するＫを決定する。次に、既知のサンプルの数によってＫ値を平均して、異なる内部標準遺伝子及び／又は較正用ＲＮＡに特有な新しいＫ_{ＥＲＣＣ１}を決定する。

実施例４
ＴＳに関する未修正の遺伝子発現（ＵＧＥ）の測定
２組の平行する反応（「試験」反応及び「較正」反応）を実施する（図８）。ＴＳ増幅反応、及びβ−アクチン内部標準増幅反応が前記試験反応である。別々のＴＳ及びβ−アクチン増幅反応が、較正用ＲＮＡ鋳型において実施され、そして較正反応と呼ばれる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）装置は、４つの異なるサイクル閾値（Ｃｔ）の値をもたらす：試験反応からのＣｔ_ＴＳ及びＣｔ_{β−アクチン}、並びに較正反応からのＣｔ_ＴＳ及びＣｔ_{β−アクチン}。２つの反応に関するＣｔ値の相違は、以下の方程式に従って決定される：
ΔＣｔ_試験＝Ｃｔ_ＴＳ−Ｃｔ_{β−アクチン}（「試験」反応より）
ΔＣｔ_較正用＝Ｃｔ_ＴＳ−Ｃｔ_{β−アクチン}（「較正」反応より）

次のステップは、以下の方程式に従い、２をマイナスΔＣｔ乗することを伴う。
２^−ΔＣｔ _試験（「試験」反応より）
２^−ΔＣｔ _較正用（「較正」反応より）
次に、ＴａｑＭａｎ（登録商標）装置からＴＳについての未修正の遺伝子発現を得るために以下の計算を実施する：
ＴＳに関する未修正の遺伝子発現（ＵＧＥ）＝２^−ΔＣｔ _試験／２^−ΔＣｔ _較正用

既知の相対的なＴＳ発現レベルによるＵＧＥの標準化
標準化計算は、ＴＳ及び特定の較正用ＲＮＡに特有の修正係数（Ｋ_ＴＳ）をＵＧＥに乗算する必要がある。修正係数Ｋ_ＴＳを、あらゆる内部標準遺伝子及びあらゆる正確に、先に定量された較正用ＲＮＡについて決定することもできる。好ましくは、内部標準遺伝子β−アクチン、及び正確に、先に定量された較正用ＲＮＡであるＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製の普遍的なＰＥＲＮＡ；カタログ番号４３０７２８１、ロット番号３６１７８１２０１４を使用する。特定のこれらの試薬の修正係数Ｋ_ＴＳは１２．６×１０^−３に相当する。

標準化は、ユーザー公報番号２中、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＴａｑＭａｎ（登録商標）製造業者により記載された、及び先に記載したΔＣｔ法の変法を使って達成された。この手順を実施するために、６つの異なる先に公開された試験組織のＵＧＥを、先に記載のＴａｑＭａｎ（登録商標）方法論を使ってＴＳ発現について分析した。これらの組織サンプルは、Ｓａｌｏｎｇａ，ｅｔａｌ．，ＣｌｉｎｉｃａｌＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，６：１３２２−１３２７，２０００中に記載されている。前記文献の全体を本明細書中に援用する。内部標準遺伝子β−アクチン及び較正用ＲＮＡであるＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製の普遍的なＰＥＲＮＡ；カタログ番号４３０７２８１、ロット番号３６１７８１２０１４を使用した。

平均していない修正係数Ｋを得るために、各々のサンプルＬ９、Ｌ９１、Ｌ１２１、Ｌ１５０、Ｌ２２０、Ｌ１６４の先に公開された相対的なＴＳ発現レベルを、対応の、ＴａｑＭａｎ（登録商標）に導き出されたＵＧＥにより割った。
Ｋ_{平均していない}＝既知の値／ＵＧＥ

次に、全てのＫ値を平均し、ＴＳ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製の普遍的なＰＥＲＮＡ；カタログ番号４３０７２８１、ロット番号３６１７８１２０１４較正用ＲＮＡ及びβ−アクチンに特有のたった１つのＫ_ＴＳ修正係数を決定する。
従って、ｐｒｅ−ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＴＳ発現の試験と一致した規模での未知の組織サンプルにおける修正された相対的なＴＳ発現を決定するために、同じ内部標準遺伝子及び較正用ＲＮＡの使用を前提として、当業者は特定の修正係数Ｋ_ＴＳを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）装置から導き出された未修正の遺伝子発現データ（ＵＧＥ）に単純にかける。
修正された相対的なＴＳ発現＝ＵＧＥ×Ｋ_ＴＳ

Ｋ_ＴＳは、いずれかの正確に前もって定量された較正用ＲＮＡ又は内部標準遺伝子を使用して決定される。正確に前もって定量されたＲＮＡの今後の源は、前記方法に記載のとおり、既知の相対的なＴＳ発現レベルを有するサンプルに対し較正されうるか、あるいはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製の普遍的なＰＥＲＮＡ；カタログ番号４３０７２８１、ロット番号３６１７８１２０１４のような先に較正を行った較正用ＲＮＡに対してここで再び較正されるかもしれない。

例えば、その後のＫ_ＴＳを異なる内部標準遺伝子及び／又は異なる較正用ＲＮＡに関して決定する場合、当業者は、その特定の内部標準遺伝子に対するＴＳ発現レベルがすでに決定されたか又は公開された組織サンプル対する内部標準遺伝子及び較正用ＲＮＡの両者を計測しなくてはならない。そのような測定は、本技術分野で周知の標準的なｐｒｅ−ＴａｑＭａｎ（登録商標）、定量的なＲＴ−ＰＣＲ技術を使用して成される。これらのサンプルに関する既知の発現レベルを、それらの対応するＵＧＥレベルによって割り、上記サンプルに関するＫを決定する。次に、既知のサンプルの数によってＫ値を平均して、異なる内部標準遺伝子及び／又は較正用ＲＮＡに特有な新しいＫ_ＴＳを決定する。

実施例５
患者の選択と化学療法治療
全ての患者は、１９９８−２０００年から南カリフォルニア大学医療センターで特別の（ｃｏｍｐａｓｓｉｏｎａｔｅ）プロトコール３Ｃ−９８−３により登録され、以下のオキサリプラチン／５ＦＵ組み合わせ療法投与計画を受けた：１３０ｍｇ／ｍ^２オキサリプラチンに加え５−ＦＵを連続的に注入する。全ての患者が、５−ＦＵによる前の治療の効果がなく、６０％（３０／５０）は、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）による追加のセカンドライン治療の効果がなかった。全ての患者は、プロトコール登録時にステージＩＶ結腸直腸癌の進行中の疾患を示した。

臨床評価と応答基準
化学療法中、パフォーマンス・ステータス、重量、腹痛、全血液検査、及び血清クレアチニンと血漿尿素窒素レベルについての毎週の評価を記録した。コンピューター断層撮影（ＣＴ）を使って全身腫瘍組織量を計測する。２次元的に計測可能な腫瘍質量を、プロトコール登録時点に必要とした。治療に対して応答する者は、少なくとも６週間で全身腫瘍組織量が５０％以上減少した患者として分類した。応答しない者は、不変の疾患又は癌の進行を有する者を含んだ。生存を、５−ＦＵ／オキサリプラチンによる化学療法開始の日からいずれかの原因での死までの日数として計算した。最後の追跡評価まで生きていた患者はその時点で打ち切った。

統計分析
ＴａｑＭａｎ（登録商標）分析は、２つの絶対的な計測値（着目の遺伝子：内部標準遺伝子）の間の比として表されるレベルをもたらす。マン−ホイットニー検定及びクラスカル−ウォリス検定を使用し、（連続変数として）ＴＳ及びＥＲＣＣ１発現と患者の人口統計との関係を評価した（Ｚａｒ，ＢｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌＡｎａｌｙｓｉｓ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−ＨａｌｌＩｎｃ，ＥｎｇｌｅｗｏｏｄＣｌｉｆｆｓＮ．Ｊ．（１９７４）それぞれ１０９〜１１４ページ及び１３９〜１４２ページ）。ＭｉｌｌｅｒとＳｉｇｍｕｎｄ（Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ３８：１０１１−１０１６，１９８２）、及びＨａｌｐｅｍ（Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ３８：１０１７−１０２３，１９８２）の最大カイ二乗検定を、低い及び高いＴＳ及びＥＲＣＣ１発現サブグループ中の患者を最もうまく二分する切り捨て閾値レベルを決定するために適用した。ピアソンのカイ二乗検定を、二分された分子マーカー間の関連性、及び化学療法に対する応答を評価するために使用した（Ｚａｒ，ＢｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌＡｎａｌｙｓｉｓ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−ＨａｌｌＩｎｃ，ＥｎｇｌｅｗｏｏｄＣｌｉｆｆｓＮ．Ｊ．（１９７４），ｐｐ．５９−６８）。危険率を死亡の相対的リスクを計算するために使用した。Ｓｃｈｕｌｍａｎ，ＩｎｆｅｃｔｉｏｎＣｏｎｔｒｏｌ＆ＨｏｓｐｉｔａｌＥｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，１８：６５−７３，１９９７。これらの計算は、観察された事件数、及びログ−ランク検定統計量により計算される予想された事件数の使用を伴う、パイク推定値（Ｐｉｋｅｅｓｔｉｍａｔｅ）に基づいた（ＰｉｋｅＪＲＳｔａｔＳｏｃＳｅｒｉｅｓＡ１３５：２０１−２０３，１９７２）。最大カイ二乗分析の技術に基づく関連性の強さの尺度と解釈されるＰ値を決定するために、１０００ブート−ストラップのようなシミュレーションを、関連性なしの仮説の下で、最大カイ二乗統計量の分布を推定するために使用した（Ｈａｌｐｅｍ，Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ３８：１０１７−１０２３，１９８２）。有意水準をｐ＜０．０５に設定した。

人口統計と応答しうる患者と生存率
１４人（２８％）の女性と３６人（７２％）の男性から成り、５９歳（最年少：３４；最年長：８３）の中央値をもつ合計５０人の患者を、この研究において評価した。この群の人種的背景は、３９人の白人、６人のラテンアメリカ人、３人のアジア人、及び２人のアフリカ系アメリカ人を含んでいた。５０人の患者全てが、ＴＳ発現とＥＲＣＣ１発現レベルを生存と関連づけるために評価可能だった。４５人（９０％）が、この分子指標と先に引用した基準の関連性を試験するために評価可能であった。

ＴＳ発現レベルとＥＲＣＣ１発現レベル
全ｍＲＮＡを、顕微解剖したＦＰＥ前処置腫瘍サンプルから単離し、ＥＲＣＣ１：β−アクチン又はＴＳ：β−アクチンの相対的なｍＲＮＡ発現レベルを定量的なＲＴ−ＰＣＲを使っては計測した。そのようなサンプルからのｍＲＮＡの単離方法は、実施例１及び１９９９年１２月２０日に提出された米国特許出願番号第０９／４６９，３３８号に記載されている。ここで、前記文献の全体を本明細書中に援用する。実施例２に記載のとおり、ＥＲＣＣ１及びβ−アクチンの発現レベルを測定するために、逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ／ＰＣＲ）−ベースのアッセイ系を使用した。修正された相対的なＥＲＣＣ１及び／又はＴＳ発現を、それぞれ実施例３及び４に記載のとおり決定した。

ＴＳ遺伝子発現は、分析した５０のサンプルの全てで検出可能だった。ハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチンに対する修正されたＴＳ発現の中央値は、３．４×１０^−３（最小：０．１８×１０^−３；最大：１１．５×１０^−３）であった。修正されたＥＲＣＣ１遺伝子発現は、分析した４７（９４％）のサンプルで検出可能だった。修正されたＥＲＣＣ１遺伝子発現の中央値は、２．５３×１０^−３（最小：０．００；最大：１４．６１×１０^−３）。性別、年齢、及び人種的出身により分析した場合、修正されたＴＳ及びＥＲＣＣ１ｍＲＮＡ発現における顕著な違いは見つからなかった。

ＴＳ発現に関する生存
この研究で分析された５０人の患者について、１０．５ヶ月（９５％のＣ．Ｉ．：１．８、２１．２）の追跡期間の中央値をもつとき、生存の中央値は、８．４ヶ月（９５％のＣ．Ｉ．：６．４、１２．３）であった。７．５×１０^−３のＴＳ閾値を用いたとき、４３人（８６％）の患者が低い修正されたＴＳ発現レベルを持ち、７人（１４％）の患者が高い修正されたＴＳ発現レベルを持っていた。修正されたＴＳ遺伝子発現と生存の間の関連性を評価するためにログ−ランク検定を使用した。それぞれの生存曲線を図１に示す、そして低い修正ＴＳ発現群において１０．２ヶ月の生存の中央値を示し（９５％のＣ．Ｉ．：７．４、１５．１）、及び高い修正ＴＳ発現群において１．５ヶ月の生存の中央値を示す（９５％のＣ．Ｉ．：１．１、２．１）（Ｐ＜０．００１；ログランク検定）。６ヶ月での生存の確率は、高い発現を有する者の群についての０．００と比べて修正されたＴＳ発現≦７．５×１０^−３の患者についての０．７７であった。修正されたＴＳレベル＞７．５×１０^−３を有する患者は、単変量解析において、ＴＳレベル≦７．５×１０^−３の患者と比べて８．４倍（９５％のＣ．Ｉ．：２．６３、２７．１３）高い死亡の相対リスクを有する（ｐ＜０．００１、図４）。

ＥＲＣＣ１発現に関する生存
４．９×１０^−３の閾値を用いたとき、４０人（８０％）の患者が低い修正されたＥＲＣＣ１発現を持ち、そして１０人（２０％）の患者が高い修正されたＥＲＣＣ１発現を持っていた。図２は、推定された生存の確率、対、修正されたＥＲＣＣ１発現レベルのカプラン・マイヤー・プロットを表し、そして低い発現群についての１０．２ヶ月の生存の中央値を示し（９５％のＣ．Ｉ．：７．８、１５．１）、及び高い発現群についての１．９ヶ月の生存の中央値を示す（９５％のＣ．Ｉ．：１．１、４．９）（Ｐ＜０．００１；ログランク検定）。６ヶ月での生存の確率は、修正されたＥＲＣＣ１発現＞４．９×１０^−３を有する患者についての０．１６と比べて修正されたＥＲＣＣ１発現≦４．９×１０^−３の患者について０．７６であった。修正されたＥＲＣＣ１レベル＞４．９×１０^−３を有する患者は、単変量解析において、ＥＲＣＣ１レベル≦４．９×１０^−３の患者と比べて４．８倍（９５％のＣ．Ｉ．：２．０９、１５．８８）高い死亡の相対リスクを有する（ｐ＜０．００１、図４）。

組み合わせた混合性ＴＳ及びＥＲＣＣ１発現に関する生存
低い修正されたＴＳ及びＥＲＣＣ１発現は、３６人（７２％）の患者で検出され、そして１４人（２８％）の患者が高い修正されたＴＳ及び／又はＥＲＣＣ１発現レベルを持っていた。両遺伝子に関して低い発現レベルをもつ患者は、有意により長い生存する。生存の中央値は、低い修正されたＴＳ及びＥＲＣＣ１発現を有する者について１１．１ヶ月であり（９５％のＣ．Ｉ．：８．４、１７．５）、そして高い修正されたＴＳ及び／又はＥＲＣＣ１発現を有する者について１．９ヶ月であった（９５％のＣ．Ｉ．：１．１、４．９）（Ｐ＜０．００１；ログランク検定；図３）。両遺伝子について低い修正された発現レベルをもつ患者は、ＴＳ又はＥＲＣＣ１の少なくとも一方の遺伝子についての高い修正された発現レベルをもつ患者についての０．１０と比べて、０．８５の６ヶ月での生存の確率を有する。少なくとも１の遺伝子（ＴＳ又はＥＲＣＣ１）の高い修正された発現をもつ患者に関する死亡の相対リスクは、腫瘍において両遺伝子に関して低い発現レベルを示す患者と比較して７．１２倍（９５％のＣ．Ｉ．：２．６０、１９．５２）であった（ｐ＜０．００１、図４）。ＴＳ及びＥＲＣＣ１ｍＲＮＡ発現は、層別解析により明らかなように互いに独立である（図５）。

応答とＴＳ及びＥＲＣＣ１遺伝子発現レベルとの関連性
修正されたＴＳ発現レベルの中央値は、４５人の計測可能な患者について３．４×１０^−３（最小：０．１８×１０^−３；最大：１１．５０×１０^−３）であり、そして５０人の患者−集団全体に一致した。低−及び高ＴＳ発現を有する者の中で腫瘍を分けることにより応答を分析するとき、部分的な応答を有する患者の４人中３人（７５％）、不変の疾患をもつ患者の２７人中の２６人（９６％）、そして進行性の疾患をもつ患者の１４人中９人（６４％）が、低い修正されたＴＳ発現を有した（Ｐ＝０．０２；フィッシャーの正確検定；図９）。

修正されたＥＲＣＣ１発現レベルの中央値は、４５人の計測可能な患者について２．７×１０^−３（最小：０．００；最大：１４．６１×１０^−３）であり、そして５０人の患者−集団全体と有意な違いはなかった。しかし、ＥＲＣＣ１発現レベルは、化学療法に対する応答と統計的に有意な関連性はなかった（ｐ＝０．２９、フィッシャーの正確検定）。

Claims

５−フルオロウラシル、オキサリプラチン、又はその組み合わせ物を含む化学療法剤投与計画の腫瘍に対する予測される効果を決定する方法であって：
（ａ）固定及びパラフィン包埋された腫瘍サンプルを、有効量のカオトロピック剤を含む溶液中、７５℃から１００℃の温度で、５分から１２０分で加熱し、カオトロピック溶液からｍＲＮＡを回収することにより、前記サンプルからｍＲＮＡを分離するステップ；
（ｂ）上記ｍＲＮＡを、
（ｉ）交差補完除去修復（ＥＲＣＣ１）遺伝子の一部を増幅し得るオリゴヌクレオチド・プライマー対であって、配列番号：１の配列又はそれと少なくとも９０％同一な配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号：２の配列又はそれと少なくとも９０％同一な配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド・プライマー対、又は
（ii）チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）遺伝子の一部を増幅し得るオリゴヌクレオチド・プライマー対であって、配列番号：３の配列又はそれと少なくとも９０％同一な配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号：４の配列又はそれと少なくとも９０％同一な配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチド・プライマー対
を用いた増幅に供して、ＥＲＣＣ１及びＴＳ増幅サンプルを得るステップ；
（ｃ）上記増幅サンプル中のＴＳ及びＥＲＣＣ１ｍＲＮＡ量を測定するステップ；
（ｄ）ステップ（ｃ）からのＴＳ及びＥＲＣＣ１ｍＲＮＡ量を、内部標準遺伝子から増幅されたｍＲＮＡ量と比較するステップ；
（ｅ）上記増幅サンプル中のＴＳ及び／又はＥＲＣＣ１ｍＲＮＡ量、並びにＴＳ及びＥＲＣＣ１遺伝子発現に関する所定の閾値に基づいて、前記化学療法剤投与計画の腫瘍に対する効果を決定するステップを含んでなる方法。
前記内部標準遺伝子がβ−アクチン遺伝子であり、前記のＥＲＣＣ１遺伝子発現の閾値が、β−アクチン遺伝子の発現レベルの４．９×１０^−３倍である、請求項１に記載の方法。
前記内部標準遺伝子がβ−アクチン遺伝子であり、前記のＴＳ遺伝子発現の閾値が、β−アクチン遺伝子の発現レベルの７．５×１０^−３倍である、請求項１に記載の方法。