CN103088122A - 一种检测 TYMS mRNA 基因表达量的试剂盒及方法 - Google Patents

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郭成贤
张伟
陈小平
刘昭前
周宏灏
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周宏灏
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Abstract

本发明公开了一种检测TYMS mRNA基因表达量的试剂盒及方法。该试剂盒包括用于制作标准曲线的标准品、内参基因实时定量PCR体系。通过该方法能准确、快速、定量地确定TYMS基因表达量。本发明所述方法和试剂盒应用在临床中，有利于医生合理化选择氟类药物进行治疗。

Description

一种检测 TYMS mRNA 基因表达量的试剂盒及方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测 TYMS mRNA 基因表达量的试剂盒及方法。
背景技术
氟尿嘧啶 (Fluorouracil, 5-FU) 是第一个抗代谢药物，也是目前临床上应用最广泛的抗嘧啶类药物。它对消化道肿瘤及其他实体瘤均有良好疗效，在肿瘤内科治疗中占有重要地位。5-FU本身没有抗肿瘤活性，当其进入人体后，可被转化为活性代谢产物：一磷酸氟尿嘧啶脱氧核苷 (FdUMP)、三磷酸氟尿嘧啶脱氧核苷 (FdUTP) 和三磷酸氟尿嘧啶 (FUTP)，进而产生抗肿瘤活性。除5-FU，氟类药物还包括替加氟、卡莫氟、氟尿苷、脱氧氟尿苷以及卡培他滨等。
TYMS（Thymidylate Synthetase，TS）基因编码的胸苷酸合成酶，是嘧啶核苷酸合成的限速酶，是肿瘤生长的重要因子，也是5-FU发挥细胞毒作用的目标酶。5-FU转化为FdUMP后，与TS、5,10-亚甲基四氢叶酸结合形成三联复合物， dUMP与TS结合后转化为脱氧胸腺嘧啶核苷dTMP，使DNA合成受限。
多种肿瘤的临床研究均显示TYMS mRNA表达水平与5-FU疗效密切相关，例如：结直肠癌、肺癌、乳腺癌、头颈鳞状细胞癌等。临床研究表明，低TYMS mRNA水平的肿瘤患者接受氟类化疗的效果较好，中位生存期较长。反之，TYMS高表达的患者接受氟类治疗疗效较差 (Yasumatsua R et al. Chemotherapy. 2009;55:36-41.)。
荧光定量PCR技术的出现，为本发明提供了一种操作简单快速、易标准化、检测费用低，准确可靠、定量检测mRNA的方法。通过该方法可以快速检测肿瘤细胞 (来源于肿瘤组织、循环肿瘤细胞、穿刺标本、胸腹水等) 中TYMS mRNA的表达量，用于临床医生对氟尿类的合理化使用。
发明内容
本发明旨在提供一种检测 TYMS 基因mRNA表达量的荧光定量PCR检测试剂盒及方法，能简单快速、准确可靠的检测TYMS基因。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
一种检测TYMS基因表达量的荧光定量PCR试剂盒，包含以下组成部分：
（1）TYMS基因标准品：含有TYMS基因编码序列的重组载体，所述TYMS基因编码序列如SEQ ID NO.1所示；
（2）检测TYMS基因的上、下游引物：
TYMS-上游引物：5’- CAACCCTGACGACAGAAGAATCA -3’（SEQ ID NO.2）
TYMS-下游引物：5’- ATGGCATGGAGGCAGCG -3’（SEQ ID NO.3）
进一步，所述含有TYMS基因编码序列的重组载体的空载体为pUC57载体；
进一步，该试剂盒还包含逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆转录酶、定量PCR缓冲液和TaqDNA聚合酶。
所述逆转录缓冲液为常规逆转录缓冲液，如5×逆转录缓冲液 (有浓度为50mmol/L、pH为8.0的Tris-HCl、浓度为50mmol/L的KCl、浓度为4 mmol/L的MgCl2和浓度为10mmol/L的二硫苏糖醇DTT组成) 等；所述逆转录引物 Oligo-(dT) 为寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸；所述 dNTPs 溶液为 dATP (脱氧腺苷三磷酸) 的混合水溶液；所述定量 PCR 缓冲液为常规定量 PCR 缓冲液，如5×定量 PCR 缓冲液 (由浓度为10mmol/L，pH为8.0的Tris-HCl、浓度为50mmol/L 的 KCl 和浓度为2 mmol/L的 MgCl2 组成) 等。
本发明还提供了基于上述试剂盒检测 TYMS mRNA 基因表达量的方法，包括以下步骤：
（1）从待测标本中提取总RNA，测定RNA浓度，加入逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液和M-MLV逆转录酶，将RNA逆转录为cDNA；
（2）分别将已知拷贝数的TYMS基因标准品倍比稀释至108、107、106、105、104、103、102、10个拷贝数/μl；
（3）分别以步骤（1）所制备的待测cDNA及步骤（2）倍比稀释的TYMS基因标准品为模板，加入检测TYMS基因的上、下游引物，定量PCR缓冲液，dNTPs溶液以及TaqDNA聚合酶，进行荧光定量PCR；
（4）由于模板的循环阈值与该模板的初始拷贝数的对数存在线性关系，因此，根据倍比稀释的TYMS基因标准品的循环阈值与初始拷贝数分别绘制TYMS基因标准曲线，再根据待测cDNA的循环阈值对其含有的TYMS基因的初始拷贝数进行定量分析，从标准曲线上读取其含有的TYMS基因的初始拷贝数。
进一步，所述步骤（3）的PCR扩增条件为：95oC预变性3分钟，然后95oC变性30秒、57oC退火40秒，共38个循环。
本发明的定量PCR检测试剂盒，能够灵敏、特异、准确地同时检测TYMS基因，适用于临床上对氟尿类疗效反应的评价，利于临床医生对治疗方案做出合理的选择。
附图说明
图1 为本发明TYMS基因的标准曲线；
图2 为本发明TYMS基因的溶解曲线；
图3 为本发明TYMS基因的扩增曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。
一、TYMS基因的荧光定量PCR检测试剂盒的配置
本实施例的TYMS基因的荧光定量PCR检测试剂盒，包括以下组成部分：
1) TYMS基因标准品：含有TYMS基因编码序列 ( GeneBank编号为NM 001071.2的第649位至第728位碱基) 的重组pUC57载体；
2) 检测TYMS基因的上、下游引物：
TYMS-上游引物：5’- CAACCCTGACGACAGAAGAATCA -3’（SEQ ID NO.2）
TYMS-下游引物：5’- ATGGCATGGAGGCAGCG -3’（SEQ ID NO.3）；
3) 5×逆转录缓冲液，浓度为10pmol/μl的逆转录引物Oligo-(dT)16，浓度为20pmol/μl的dNTPs溶液，浓度为10U/μl的M-MLV逆转录酶，5×定量PCR缓冲液，浓度为2U/μl的TaqDNA聚合酶。
其中，TYMS基因标准品由以下方法制得：
a) 直接合成获得含有TYMS基因编码序列的片段DNA；
b) 经琼脂糖凝胶电泳鉴定、切胶回收纯化后，克隆至pUC57载体进行连接；
c) 连接产物转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞，筛选阳性克隆；
d) 提取重组质粒，即得分别含有TYMS基因编码序列的重组pUC57载体。
此外，逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆转录酶、定量PCR缓冲液和TaqDNA聚合酶均为RT-PCR的常规试剂，故本发明的检测试剂盒也可以不包括上述常规试剂。
二、TYMS基因的荧光定量PCR检测试剂盒的检测
本实施例的TYMS基因的荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
(1) 从待测外周血、肿瘤组织、穿刺标本或其它标本中提取总RNA，测RNA的浓度；
(2) 将所得RNA逆转录为cDNA，转录体系如表1所示：
表1
(3) 逆转录条件为：37oC孵育1小时，再95oC变性3分钟；
(4) 分别将已知拷贝数的TYMS基因标准品倍比稀释至108、107、106、105、104、103、102、10个拷贝数/μl；
(5) 分别以步骤 (1) 所得待测cDNA及步骤 (4) 所得倍比稀释的TYMS基因标准品为模板，进行荧光定量PCR；
(6) PCR体系如表2所示：
表2
Figure DEST_PATH_IMAGE002
(7) PCR条件为：95oC预变性3分钟，然后95oC变性30秒、57oC退火40秒，共38个循环 (PCR条件可根据使用的荧光定量PCR仪略做调整) ；在每个循环结束时进行荧光检测；
(8) 模板的循环阈值与该模板的初始拷贝数的对数存在线性关系，根据倍比稀释的TYMS基因标准品的循环阈值与初始拷贝数，用荧光定量PCR仪工作软件分别绘制TYMS基因标准曲线，再根据待测cDNA的循环阈值，从标准曲线上读取其含有的TYMS基因的初始拷贝数。
采用本发明试剂盒及其检测方法，能够灵敏、特异、准确地检测TYMS基因表达量，指导临床对氟尿类的合理使用。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  周宏灏
<120>  一种检测 TYMS mRNA 基因表达量的试剂盒及方法
<160>  3    
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  79
<212>  DNA
<213>  智人
<400>  1
caaccctgac gacagaagaa tcatcatgtg cgcttggaat ccaagagatc ttcctctgat     60
ggcgctgcct ccatgccat                                                  79
 
<210>  2
<211>  23
<212>  DNA
<213>  智人
<400>  2
caaccctgac gacagaagaa tca                                             23
 
<210>  3
<211>  17
<212>  DNA
<213>  智人
<400>  3
atggcatgga ggcagcg                                                    17
 
 

Claims (5)

1.一种检测 TYMS mRNA 基因表达量的试剂盒，其特征在于：包括以下组成部分：
（1）TYMS基因标准品：含有TYMS基因编码序列的重组载体，所述TYMS基因编码序列如SEQ ID NO.1所示；
（2）检测TYMS基因的上、下游引物：
TYMS-上游引物：5’- CAACCCTGACGACAGAAGAATCA -3’；
TYMS-下游引物：5’- ATGGCATGGAGGCAGCG -3’。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述重组载体的空载体为pUC57载体。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆转录酶、定量PCR缓冲液和TaqDNA聚合酶。
4.一种基于权利要求1至3任一项所述试剂盒检测 TYMS mRNA 基因表达量的方法，包括如下步骤：
（1）从待测标本中提取总RNA，测定RNA浓度，加入逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液和M-MLV逆转录酶，将RNA逆转录为cDNA；
（2）分别将已知拷贝数的TYMS基因标准品倍比稀释至108、107、106、105、104、103、102、10个拷贝数/μl；
（3）分别以步骤（1）所制备的待测cDNA及步骤（2）倍比稀释的TYMS基因标准品为模板，加入检测TYMS基因的上、下游引物，定量PCR缓冲液，dNTPs溶液以及TaqDNA聚合酶，进行荧光定量PCR；
（4）根据倍比稀释的TYMS基因标准品的循环阈值与初始拷贝数分别绘制TYMS基因标准曲线，再根据待测cDNA的循环阈值，从标准曲线上读取其含有的TYMS基因的初始拷贝数。
5.根据权利要求 4 所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）的PCR扩增条件为：95oC预变性3分钟，然后95oC变性30秒、57oC退火40秒，共38个循环。
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