CN103088121A - 一种检测 RRM1 mRNA 基因表达量的试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测RRM1 mRNA基因表达量的试剂盒及方法。该试剂盒包括用于制作标准曲线的标准品、内参基因实时定量PCR体系。通过该方法能准确、快速、定量地确定RRM1基因表达量。本发明所述方法和试剂盒应用在临床中，有利于医生合理化选择吉西他滨进行治疗。

Description

一种检测 RRM1 mRNA 基因表达量的试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测 RRM1 mRNA 基因表达量的试剂盒及方法。

背景技术

吉西他滨 (Gemcitabine) 为脱氧胞嘧啶核苷的类似物，为核苷酸还原酶抑制剂。属细胞周期特异性抗代谢类化疗药，主要作用于S期（DNA合成期）的肿瘤细胞，同时也阻断细胞周期由G1期（DNA合成前期）向S期过渡。吉西他滨作为一种前体药在细胞内是脱氧胸苷激酶磷酸化的底物，在酶的作用下转化成活性代谢物dFdCDP（吉西他滨二磷酸盐）和dFdCTP（吉西他滨三磷酸盐）。dFdCDP可抑制核糖核苷酸还原酶（ribonucleotide reductase，RR），导致dFdCTP大量积聚。dFdCTP则与dCTP竞争结合进入DNA链，插入至DNA链中脱氧胞苷的位点，并允许鸟苷与其配对，使其免受核糖核酸外切酶的移除修复，造成DNA链合成停止，进而导致DNA断裂、细胞死亡，达到治疗肿瘤的目的。临床上主要用于治疗非小细胞肺癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌和其他实体肿瘤。

RRM1基因（定位于1号染色体短臂）编码核糖核苷酸还原酶M1亚单位(RRM1)。核糖核苷酸还原酶(RR)参与核糖核苷酸还原成脱氧核糖核酸的过程，是DNA合成通路中的限速酶。RRM1是吉西他滨作用的靶点之一。所有肿瘤细胞中都存在RRM1表达，而且表达水平差异很大。临床研究显示，患者RRM1表达水平与吉西他滨的疗效相关，RRM1 mRNA低表达的非小细胞肺癌患者经吉西他滨治疗疗效较好，中位生存期较长(Bepler G et al. J Clin Oncol. 2006; 24(29): 4731-4737; Reynolds C et al. J Clin Oncol.2009; 27(34):5808-15.)。RRM1 mRNA也可以预测乳腺癌、胰腺癌、胆管癌患者的化疗受益情况及预后（Jordheim LP et al. Lancet Oncol. 2011; 12(7): 693-702.）。因此，美国国家综合癌症网络（NCCN）临床实践指南（第二版，2010）中指出：非小细胞肺癌患者RRM1的表达与吉西他滨的疗效密切相关，在吉西他滨用药前应进行RRM1基因表达水平的检测 （NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology for NSCLC.V2.2010） 。因此，对 RRM1 表达量实时、准确、定量地检测，有利于临床医生及时、准确、合理的制定个体化治疗方案。

荧光定量PCR技术的出现，为本发明提供了一种操作简单快速、易标准化、检测费用低，准确可靠、定量检测mRNA的方法。通过该方法可以快速检测肿瘤细胞 (来源于肿瘤组织、循环肿瘤细胞、穿刺标本、胸腹水等) 中RRM1 mRNA的表达量，用于临床医生对吉西他滨的合理化使用。

发明内容

本发明旨在提供一种检测 RRM1 基因mRNA表达量的荧光定量PCR检测试剂盒，能简单快速、准确可靠的检测RRM1基因。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

一种检测RRM1基因表达量的荧光定量PCR试剂盒，包含以下组成部分：

（1）RRM1基因标准品：含有RRM1基因编码序列的重组载体，所述RRM1基因编码序列如SEQ ID NO.1所示；

（2）内对照β-actin基因标准品：含有β-actin基因编码序列的重组载体，所述β-actin基因编码序列如SEQ ID NO.2所示；

（3）检测RRM1基因的上、下游引物：

RRM1-上游引物：5’- CTGGAAGCAGGGTTTGAAGAC -3’（SEQ ID NO.3）

RRM1-下游引物：5’- GATTGGATTAGCCGCTGGTC -3’（SEQ ID NO.4）

（4）检测β-actin基因的上、下游引物：

β-actin -上游引物：5’- CTCGCCTTTGCCGATCC -3’（SEQ ID NO.5）

β-actin -下游引物：5’- CATGCCGGAGCCGTTG -3’（SEQ ID NO.6）

进一步，所述含有RRM1基因编码序列的重组载体和含有β-actin基因编码序列的重组载体的空载体均为pUC57载体；

进一步，该试剂盒还包含逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆转录酶、定量PCR缓冲液和TaqDNA聚合酶。

所述逆转录缓冲液为常规逆转录缓冲液，如5×逆转录缓冲液 (有浓度为50mmol/L、pH为8.0的Tris-HCl、浓度为50mmol/L的KCl、浓度为4 mmol/L的MgCl2和浓度为10mmol/L的二硫苏糖醇DTT组成) 等；所述逆转录引物 Oligo-(dT) 为寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸；所述 dNTPs 溶液为 dATP (脱氧腺苷三磷酸) 的混合水溶液；所述定量 PCR 缓冲液为常规定量 PCR 缓冲液，如5×定量 PCR 缓冲液 (由浓度为10mmol/L，pH为8.0的Tris-HCl、浓度为50mmol/L 的 KCl 和浓度为2 mmol/L的 MgCl2 组成) 等。

本发明还提供了基于上述试剂盒检测RRM1 mRNA 基因表达量的方法，包括以下步骤：

（1）从待测标本 (肿瘤组织、循环肿瘤细胞、穿刺标本、胸腹水等) 中提取细胞总RNA，测定RNA浓度，加入逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液和M-MLV逆转录酶，将RNA逆转录为cDNA；

（2）分别将已知拷贝数的RRM1基因标准品和内对照β-actin基因标准品倍比稀释至10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10个拷贝数/μl；

（3）分别以步骤（1）所制备的待测cDNA及步骤（2）倍比稀释的RRM1基因标准品为模板，加入内对照β-actin基因标准品，检测RRM1基因的上、下游引物，检测内对照β-actin基因的上、下游引物，定量PCR缓冲液，dNTPs溶液以及TaqDNA聚合酶，进行荧光定量PCR；

（4）由于模板的循环阈值与该模板的初始拷贝数的对数存在线性关系，因此，根据倍比稀释的RRM1基因标准品和内对照β-actin基因标准品的循环阈值与初始拷贝数分别绘制RRM1基因和内对照β-actin基因标准曲线，再根据待测cDNA的循环阈值对其含有的RRM1基因和内对照β-actin基因的初始拷贝数进行定量，从标准曲线上读取其含有的RRM1基因和内对照β-actin基因的初始拷贝数。

进一步，所述步骤(3) 的PCR扩增条件为：95^oC预变性3分钟，然后95^oC变性30秒、57^oC退火40秒，共40个循环。

本发明的定量PCR检测试剂盒由于选择了合适的引物，制备了合适的RRM1基因标准品和内对照β-actin基因标准品，能够灵敏、特异、准确地同时检测RRM1基因，适用于临床上对吉西他滨疗效反应的评价，利于临床医生对治疗方案做出合理的选择。

附图说明

图1 为本发明RRM1基因的标准曲线；

图2 为本发明RRM1基因的溶解曲线；

图3 为本发明RRM1基因的扩增曲线。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。

一、RRM1基因的荧光定量PCR检测试剂盒的配置

本实施例的RRM1基因的荧光定量PCR检测试剂盒，包括以下组成部分：

1) RRM1基因标准品：含有RRM1基因编码序列 ( GeneBank编号为NM_001033.3的第2500位至第2564位碱基) 的重组pUC57载体；

2) 内对照β-actin基因标准品：含有β-actin基因编码序列 (GeneBank 编号为NM_001101.3的第37位至第133位碱基) 的重组pUC57载体；

3) 检测RRM1基因的上、下游引物：

RRM1-上游引物：5’- CTGGAAGCAGGGTTTGAAGAC-3’（SEQ ID NO.2）

RRM1-下游引物：5’- GATTGGATTAGCCGCTGGTC-3’（SEQ ID NO.3）；

4) 检测内对照β-actin 基因的上、下游引物：

β-actin -上游引物：5’- CTCGCCTTTGCCGATCC-3’

β-actin -下游引物：5’- CATGCCGGAGCCGTTG-3’；

5) 5×逆转录缓冲液，浓度为10pmol/μl的逆转录引物Oligo-(dT)16，浓度为20pmol/μl的dNTPs溶液，浓度为10U/μl的M-MLV逆转录酶，5×定量PCR缓冲液，浓度为2U/μl的TaqDNA聚合酶。

其中，RRM1和内对照β-actin基因标准品由以下方法制得：

a) 直接合成获得含有RRM1和β-actin基因编码序列的片段DNA；

b) 经琼脂糖凝胶电泳鉴定、切胶回收纯化后，克隆至pUC57载体进行连接；

c) 连接产物转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞，筛选阳性克隆；

d) 提取重组质粒，即得分别含有RRM1和β-actin基因编码序列的重组pUC57载体。

此外，逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆转录酶、定量PCR缓冲液和TaqDNA聚合酶均为RT-PCR的常规试剂，故本发明的检测试剂盒也可以不包括上述常规试剂。

二、RRM1基因的荧光定量PCR检测试剂盒的检测

本实施例的RRM1基因的荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

(1) 从待测外周血、肿瘤组织、穿刺标本或其它标本中提取总RNA，测RNA的浓度；

(2) 将所得RNA逆转录为cDNA，转录体系如表1所示：

表1

(3) 逆转录条件为：37^oC孵育1小时，再95^oC变性3分钟；

(4) 分别将已知拷贝数的RRM1和内对照β-actin基因标准品倍比稀释至10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10个拷贝数/μl；

(5) 分别以步骤 (1) 所得待测cDNA及步骤 (4) 所得倍比稀释的RRM1基因标准品为模板，进行荧光定量PCR；

(6) PCR体系如表2所示：

表2

(7) PCR条件为：95^oC预变性3分钟，然后95^oC变性30秒、57^oC退火40秒，共40个循环 (PCR条件可根据使用的荧光定量PCR仪略做调整) ；在每个循环结束时进行荧光检测；

(8) 模板的循环阈值与该模板的初始拷贝数的对数存在线性关系，根据倍比稀释的RRM1和内对照β-actin基因标准品的循环阈值与初始拷贝数，用荧光定量PCR仪工作软件分别绘制RRM1和内对照β-actin基因标准曲线，再根据待测cDNA的循环阈值，从标准曲线上读取其含有的RRM1和内对照β-actin基因的初始拷贝数。

采用本发明试剂盒及其检测方法，能够灵敏、特异、准确地检测RRM1基因表达量，指导临床对吉西他滨的合理使用。 

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  周宏灏

<120>  一种检测 RRM1 mRNA 基因表达量的试剂盒及方法

<160>  6    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  64

<212>  DNA

<213>  智人

<400>  1

ctggaagcag ggtttgaaga ctgggatgta ttatttaagg acaagaccag cggctaatcc     60

aatc                                                                  64

 

<210>  2

<211>  96

<212>  DNA

<213>  智人

<400>  2

ctcgcctttg ccgatccgcc gcccgtccac acccgccgcc agctcaccat ggatgatgat     60

atcgccgcgc tcgtcgtcga caacggctcc ggcatg                               96

 

<210>  3

<211>  21

<212>  DNA

<213>  智人

<400>  3

ctggaagcag ggtttgaaga c                                               21

 

<210>  4

<211>  20

<212>  DNA

<213>  智人

<400>  4

gattggatta gccgctggtc                                                 20

 

<210>  5

<211>  17

<212>  DNA

<213>  智人

<400>  5

ctcgcctttg ccgatcc                                                    17

 

<210>  6

<211>  16

<212>  DNA

<213>  智人

<400>  6

catgccggag ccgttg                                                     16

 

 

Claims (5)

1.一种检测 RRM1 mRNA 基因表达量的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括以下组成部分：

（1）RRM1基因标准品：含有RRM1基因编码序列的重组载体，所述RRM1基因编码序列如SEQ ID NO.1所示；

（2）内对照β-actin基因标准品：含有β-actin基因编码序列的重组载体，所述β-actin基因编码序列如SEQ ID NO.2所示；

（3）检测RRM1基因的上、下游引物：

RRM1-上游引物：5’- CTGGAAGCAGGGTTTGAAGAC -3’；

RRM1-下游引物：5’- GATTGGATTAGCCGCTGGTC -3’；

（4）检测β-actin基因的上、下游引物：

β-actin-上游引物：5’- CTCGCCTTTGCCGATCC -3’；

β-actin-下游引物：5’- CATGCCGGAGCCGTTG -3’。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述含有RRM1基因编码序列的重组载体和含有β-actin基因编码序列的重组载体中的空载体均为pUC57载体。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆转录酶、定量PCR缓冲液和TaqDNA聚合酶。

4.一种基于权利要求1至3任一项所述试剂盒检测 RRM1 mRNA 基因表达量的方法，包括如下步骤：

（1）从待测标本中提取总RNA，测定RNA浓度，加入逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液和M-MLV逆转录酶，将RNA逆转录为cDNA；

（2）分别将已知拷贝数的RRM1基因标准品和内对照β-actin基因标准品倍比稀释至10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10个拷贝数/μl；

（3）分别以步骤（1）所制备的待测cDNA及步骤（2）倍比稀释的RRM1基因标准品为模板，加入内对照β-actin基因标准品，检测RRM1基因的上、下游引物，检测内对照β-actin基因的上、下游引物，定量PCR缓冲液，dNTPs溶液以及TaqDNA聚合酶，进行荧光定量PCR；

（4）根据倍比稀释的RRM1基因标准品和内对照β-actin基因标准品的循环阈值与初始拷贝数分别绘制RRM1基因和内对照β-actin基因标准曲线，再根据待测cDNA的循环阈值，从标准曲线上读取其含有的RRM1基因和内对照β-actin基因的初始拷贝数。

5.根据权利要求 4 所述的方法，其特征在于：所述步骤(3) 的PCR扩增条件为：95^oC预变性3分钟，然后95^oC变性30秒、57^oC退火40秒，共40个循环。

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