CN101140239A

CN101140239A - 核糖核苷酸还原酶m1基因检测试剂盒及应用

Info

Publication number: CN101140239A
Application number: CNA2007100715964A
Authority: CN
Inventors: 苏丹; 马胜林
Original assignee: Zhejiang Cancer Hospital
Current assignee: Zhejiang Cancer Hospital
Priority date: 2007-09-30
Filing date: 2007-09-30
Publication date: 2008-03-12

Abstract

一种核糖核苷酸还原酶M1基因检测试剂盒，由盒体1、衬垫2、染料法PCR反应液3、Taq酶4、标准品5、阴性对照6、阳性对照7组成，衬垫2上设有容器孔，分别放置染料法PCR反应液3、Taq酶4、标准品5、阴性对照6、阳性对照7。本发明通过优化PCR的引物、SYBR Green I荧光染料和PCR的条件，避免了SYBR Green I荧光染料的缺陷，非特异性的扩增，本试剂盒不仅保持了PCR的高灵敏性，而且使得被检测基因的特异性大大提高。本发明设计合理，与现有探针法相比较，不需要设计荧光探针，使用方便而且成本低，可在检测肿瘤组织中核糖核苷酸还原酶M1基因表达水平中的应用。

Description

核糖核苷酸还原酶M1基因检测试剂盒及应用

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及核糖核苷酸还原酶M1基因检测试剂盒，是通过利用SYBR GREEN I荧光定量PCR，检测肿瘤组织中吉西他滨抗癌药敏感性相关基因，核糖核苷酸还原酶M1亚单位(RRM1)基因mRNA表达水平的试剂盒。

技术背景

核糖核苷酸还原酶(ribonucleotide reductase，RR)是DNA合成通路中的限速酶，它能逆转二磷酸核苷酸为二磷酸脱氧核苷酸，后者是DNA合成和修复必不可少的。RR包括2个亚单位：M1和M2。M1亚单位控制底物的特异性和整个酶的活性；M2亚单位携带接触抑制区，控制底物转化。RRM1基因被认为是一种抑癌基因，能抑制肿瘤转移，定位于染色体11q15.5区域着丝粒部分，该区域称为LOH11A，75％的NSCLC患者有异质性缺失，这种异质性缺失与患者预后差成正比。

吉西他滨是嘧啶类抗代谢药物，主要作用于DNA合成期(S期)，也可阻止G1期向S期进展，是细胞周期特异性药物。吉西他滨作为一种前药在细胞内是脱氧胸苷激酶磷酸化的良好底物，在酶的作用下转化成吉西他滨一磷酸盐、吉西他滨二磷酸盐、吉西他滨三磷酸盐，其中吉西他滨二磷酸盐、吉西他滨三磷酸盐为活性产物。吉西他滨三磷酸盐插入DNA链后，可抑制DNA聚合，进而抑制DNA合成和修复；吉西他滨二磷酸盐可抑制核糖核苷酸还原酶，从而减少了DNA合成和修复所需的脱氧核苷酸的量，使DNA合成发生障碍。当RRM1表达过高，则会干扰吉西他滨的代谢，产生耐药。在一些回顾性研究中发现，RRM1与吉西他滨耐药密切相关，接受过吉西他滨和顺铂联合治疗的NSCLC患者，体内低RRM1mRNA水平与生存时间成正比。

免疫组化是检测组织标本中RRM1蛋白表达常用的方法，但大多数肿瘤患者是晚期，失去了手术机会，大快肿瘤组织难以获得。而实时荧光定量PCR技术以其特异性强、所需组织少(活检组织，脱落细胞等)、定量、敏感、方便等优点已得到全世界的公认，广泛用于肿瘤相关基因、病原体等诸多临床检测。用定量RT-PCR法检测药物敏感相关基因来预测药物疗效是必然趋势，而成熟、标准的试剂盒是定量PCR成功检测的关键。目前荧光实时定量PCR所使用的荧光化学方法主要有染料法(SYBR Green I染料)和探针法。其中SYBRGreen I染料法不需要设计合成序列特异性探针，而且熔点曲线来分析产物的均一性有助于更准确地分析和识别扩增产物和引物二聚体，是一种简便，性价比较高的实时监测方法。

发明内容

本发明的目的是为克服定量PCR探针法技术需要设计合成序列特异性探针，检测成本高的不足之处，采用SYBR Green I染料定量PCR技术，提供一种核糖核苷酸还原酶M1基因检测试剂盒。

本发明由盒体、衬垫，染料法(SYBR Green I染料)PCR反应液、Taq酶、标准品、阴性对照、阳性对照组成，衬垫上设有容器孔，分别染料法(SYBRGreen I染料)PCR反应液、Taq酶、标准品、阴性对照、阳性对照。

其中PCR反应液的成份包含：PCR缓冲液、SYBR Green I染料、MgCl2、dNTPs、检测用引物。

检测用引物有两对：检测基因，RRM1；管家基因：3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。

其中RRM1引物：

RRM1-F ACCTGGAGCCTTGGCATTTAGAC

RRM1-R TACAACTTTGCGGACACGACCTT

GAPDH引物：

GAPDH-F GAAGGTGAAGGTCGGAGTC

GAPDH-R GAAGATGGTGATGGGATTTC

RRM1标准品序列为：

acc tggagccttg gcatttagac atctttgaat tccttgattt aaagaagaac acaggaaagg aagagcagcg

tgccagagat cttttctttg ctctttggat tccggatctc ttcatgaaac gagtggagac taatcaggac

tggtctttga tgtgtccaaa tgagtgtcct ggtctggatg aggtttgggg agaggaattt gagaaactat

atgcaagtta tgagaaacaa ggtcgtgtcc gcaaagttgt a

GAPDH标准品序列为：

gaa ggtgaaggtc ggagtcaacg gatttggtcg tattgggcgc ctggtcacca gggctgcttt taactctggt

aaagtggata ttgttgccat caatgacccc ttcattgacc tcaactacat ggtttacatg ttccaatatg

attccaccca tggcaaattc catggcaccg tcaaggctga gaacgggaag cttgtcatca atggaaatcc

catcaccatc ttc

对照品分为阳性对照和阴性对照，阴性对照为无RRM1表达的cDNA样本，阳性对照为有RRM1表达的cDNA样本。

本试剂盒保存于-4℃，尽量减少反复冻融。

本发明的另一个目的是提供核糖核苷酸还原酶M1基因检测试剂盒在检测肿瘤组织中核糖核苷酸还原酶M1基因表达水平中的应用。

本发明建立了利用SYBR Green I荧光染料PCR技术检测RRM1表达的方法，并经检测患者标本证实该方法切实可行。SYBR Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料，检测灵敏度很高。但是，由于SYBR Green I与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。在本检测项目中，通过优化引物和SYBR Green I PCRM反应液，避免了非特异性的扩增，通过溶解曲线分析确定这种定量方法不仅保持了PCR的高灵敏性，而且使得被检测基因的特异性大大提高。与探针法相比较，方便且便宜。本发明主要用于在化疗前通过检测肿瘤组织中RRM1表达的水平来预测患者对吉西他滨抗癌药的敏感性，从而指导临床化疗方案的选择，有利于患者进行个体化治疗。

本试剂盒使用方法：

每次检测均应设立阳性和阴性对照。标准品用无菌去离子水稀释为1×10⁸-1×10¹²拷贝/ml。

扩增检测：在荧光定量PCR仪上进行，总体积50ul，其中47.5ul PCR反应液，2.0ul检测样品(逆转录产物、标准品、阳性和阴性对照)，0.5ul Taq DNA聚合酶。反应条件：50℃2分钟，95℃10分钟，95℃15秒、60℃1分钟共40个循环，72℃10分钟。溶解曲线分析扩增产物确定无非特异性扩增，根据所获得的标准曲线，分别计算标本中RRM1和GAPDH的量(拷贝/ul)。RRM1与GAPDH的比值即为RRM1表达指数。

本发明具有的特点是：探针法和SYBR Green I荧光染料法是实时定量PCR中的常用方法，本发明通过优化PCR的引物、SYBR Green I荧光染料和PCR的条件，避免了SYBR Green I荧光染料的缺陷，非特异性的扩增，通过溶解曲线分析该试剂盒不仅保持了PCR的高灵敏性，而且使得被检测基因的特异性大大提高。本发明设计合理，与现有探针法相比较，不需要设计荧光探针，使用方便而且成本低。

附图说明

图1为本发明试剂盒结构示意图。

图2为GAPDH标准品(浓度为1×10¹²-1×10⁸拷贝/ul)扩增曲线。

图3为GAPDH标准曲线。

图4为GAPDH标准品溶解曲线。

图5为RRM1标准品(浓度为1×10¹²-1×10⁸拷贝/ul)扩增曲线。

图6为RRM1标准曲线。

图7为RRM1标准品溶解曲线。

具体实施方式

本发明结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

实施例1

参见图1，本发明试剂盒由盒体1、衬垫2，染料法(SYBR Green I染料)PCR反应液3、Taq酶4、标准品5、阴性对照6、阳性对照7组成，衬垫2上设有容器孔，分别放置染料法(SYBR Green I染料)PCR反应液3、Taq酶4、标准品5、阴性对照6、阳性对照7。

其中PCR反应液的成份包含：PCR缓冲液、SYBR Green I染料、MgCl₂、dNTPs、检测用引物。

其中RRM1引物：

RRM1-F ACCTGGAGCCTTGGCATTTAGAC

RRM1-R TACAACTTTGCGGACACGACCTT

GAPDH引物：

GAPDH-F GAAGGTGAAGGTCGGAGTC

GAPDH-R GAAGATGGTGATGGGATTTC

RRM1标准品序列为：

tgccagagat cttttctttg ctctttggat tccggatctc ttcatgaaac gagtggagac taatcaggac

tggtctttga tgtgtccaaa tgagtgtcct ggtctggatg aggtttgggg agaggaattt gagaaactat

atgcaagtta tgagaaacaa ggtcgtgtcc gcaaagttgt a

GAPDH标准品序列为：

aaagtggata ttgttgccat caatgacccc ttcattgacc tcaactacat ggtttacatg ttccaatatg

attccaccca tggcaaattc catggcaccg tcaaggctga gaacgggaag cttgtcatca atggaaatcc

catcaccatc ttc

阴性对照6为无RRM1表达的cDNA样本，阳性对照7为有RRM1表达的cDNA样本。

实施例2SYBR Green I荧光染料PCR技术检测RRM1表达及应用

1.材料：

组织总RNA提取试剂盒购于美国Qiagen公司，逆转录试剂盒，SYBRGreen I荧光染料购于美国Invitrogen公司，pGEM-T Easy克隆系统，Taq DNA聚合酶购于美国Promega公司。7500型定量PCR仪为美国ABI公司产品。

2.引物及探针设计与合成：

分别以RRM1和GAPDH全长eDNA序列(GeneBank登录号分别为BC0064981和NM-002046)为模板，在www.idtdna.com网上设计并分析引物，并根据基因组DNA序列情况，从中选择最佳组合。

标准品PCR和检测用PCR引物序列相同，

RRM1-F ACCTGGAGCCTTGGCATTTAGAC

RRM1-R TACAACTTTGCGGACACGACCTT

GAPDH-F GAAGGTGAAGGTCGGAGTC

GAPDH-R GAAGATGGTGATGGGATTTC

3.检测准备品制备：

取卵巢癌癌组织，组织提取试剂盒提取总RNA，逆转录试剂盒逆转成cDNA，取0.5ulcDNA在普通PCR仪上扩增RRM1和GAPDH基因片段，凝胶电泳分离纯化PCR产物，PCR产物插入pGEM-T Easy克隆系统，取阳性克隆，EcoR I酶切鉴定，RRM1254bp，GAPDH 226bp。测定浓度并换算成(拷贝数/ul)。

4.标本检测：

30例经病理确诊的非小细胞肺癌活检癌组织标本，标本用组织提取试剂盒提取总RNA，逆转录试剂盒逆转成cDNA。标本cDNA、标准品(1×10⁸-1×10¹²拷贝/ul)、阳性和阴性对照各取2.0ul，总体积50ul，在荧光定量PCR仪ABI7500上分别进行RRM1和GAPDH扩增。反应条件：50℃2分钟，95℃l0分钟，95℃15秒、60℃1分钟共40个循环，72℃10分钟。溶解曲线分析扩增产物确定无非特异性扩增，根据所获得的标准曲线，得出标本中RRM1和GAPDH的量(拷贝/ul)。RRM1与GAPDH的比值即为RRM1表达指数。

5.结果

GAPDH标准品扩增结果参见图2。标准曲线见参图3，图中标准曲线的斜率为-3.19；相关系数为0.998。溶解曲线参见图4，图3溶解曲线表明GAPDH扩增无非特异性产物，特异性产物溶解温度为81.0℃。RRM1标准品扩增结果参见图5。标准曲线参见图6，图中标准曲线的斜率为-3.63；相关系数为0.999。溶解曲线参见图7，图中溶解曲线表明RRM1扩增无非特异性产物，特异性产物溶解温度为84.0℃。

30例患者组织检测结果如下：

ID	GADPH Qty	RRM1 Qty	ratio
ID	GADPH Qty	RRM1 Qty	ratio	123456789101112131415161718192021222324252627282930	2.78E+105.07E+092.18E+109.30E+084.44E+107.87E+102.52E+101.62E+102.63E+071.53E+091.20E+096.16E+082.71E+082.03E+091.30E+092.37E+095.84E+076.18E+077.22E+101.60E+081.51E+096.09E+096.29E+071.75E+101.35E+084.76E+103.10E+111.66E+122.87E+121.13E+12	2.46E+081.58E+081.82E+082.62E+095.59E+088.06E+071.79E+092.12E+090.00E+005.35E+077.96E+070.00E+000.00E+000.00E+007.59E+080.00E+000.00E+004.65E+071.09E+096.26E+071.06E+099.25E+087.04E+071.22E+090.00E+001.29E+091.84E+097.63E+095.15E+091.66E+09	0.010.030.012.820.010.000.070.130.000.030.070.000.000.000.580.000.000.750.020.390.700.151.120.070.000.030.010.000.000.00

本发明涉及的序列：

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据RRM1mRNA序列设计的PCR检测上游引物序列

<400>1

ACCTGGAGCCTTGGCATTTAGAC 23

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据RRM1mRNA序列设计的PCR检测下游引物序列

<400>2

TACAACTTTGCGGACACGACCTT 23

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据GAPDH mRNA序列设计的PCR检测上游引物序列

<400>3

GAAGGTGAAGGTCGGAGTC 19

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据GAPDH mRNA序列设计的PCR检测下游引物序列

<400>4

GAAGATGGTGATGGGATTTC 20

<210>5

<211>254

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据RRM1mRNA序列设计的荧光定量检测标准品序列

<400>5

acc tggagccttg gcatttagac

atctttgaat tccttgattt aaagaagaac acaggaaagg aagagcagcg tgccagagat

cttttctttg ctctttggat tccggatctc ttcatgaaac gagtggagac taatcaggac

tggtctttga tgtgtccaaa tgagtgtcct ggtctggatg aggtttgggg agaggaattt

gagaaactat atgcaagtta tgagaaacaa ggtcgtgtcc gcaaagttgt a 254

<210>6

<211>226

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据GAPDH mRNA序列设计的荧光定量检测标准品序列

<400>6

gaa

ggtgaaggtc ggagtcaacg gatttggtcg tattgggcgc

ctggtcacca gggctgcttt taactctggt aaagtggata

ttgttgccat caatgacccc ttcattgacc tcaactacat

ggtttacatg ttccaatatg attccaccca tggcaaattc

catggcaccg tcaaggctga gaacgggaag cttgtcatca

atggaaatcc catcaccatc ttc 226

Claims

1.一种核糖核苷酸还原酶M1基因检测试剂盒，由盒体(1)、衬垫(2)，染料法PCR反应液(3)、Taq酶(4)、标准品(5)、阴性对照(6)、阳性对照(7)组成，衬垫(2)上设有容器孔，分别放置染料法PCR反应液(3)、Taq酶(4)、标准品(5)、阴性对照(6)、阳性对照(7)，PCR反应液的成份包含：PCR缓冲液、SYBR Green I染料、MgCl₂、dNTPs、检测用引物，

其中核糖核苷酸还原酶M1引物序列为：

RRM1-F ACCTGGAGCCTTGGCATTTAGAC

RRM1-R TACAACTTTGCGGACACGACCTT

3-磷酸甘油醛脱氢酶引物序列为：

GAPDH-F GAAGGTGAAGGTCGGAGTC

GAPDH-R GAAGATGGTGATGGGATTTC

核糖核苷酸还原酶M1标准品序列为：

tgccagagat cttttctttg ctctttggat tccggatctc ttcatgaaac gagtggagac taatcaggac

tggtctttga tgtgtccaaa tgagtgtcct ggtctggatg aggtttgggg agaggaattt gagaaactat

atgcaagtta tgagaaacaa ggtcgtgtcc gcaaagttgt a

3-磷酸甘油醛脱氢酶标准品序列为：

aaagtggata ttgttgccat caatgacccc ttcattgacc tcaactacat ggtttacatg ttccaatatg

attccaccca tggcaaattc catggcaccg tcaaggctga gaacgggaag cttgtcatca atggaaatcc

catcaccatc ttc。

2.根据权利要求1所述的一种核糖核苷酸还原酶M1基因检测试剂盒，其特征是：阴性对照为无核糖核苷酸还原酶M1表达的cDNA样本，阳性对照为有核糖核苷酸还原酶M1表达的cDNA样本。

3.根据权利要求1或2所述的一种核糖核苷酸还原酶M1基因检测试剂盒在检测肿瘤组织中核糖核苷酸还原酶M1基因表达水平中的应用。