CN103589786B - 检测RRM1 mRNA相对表达量的方法、试剂盒及引物和探针 - Google Patents

检测RRM1 mRNA相对表达量的方法、试剂盒及引物和探针 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种定量检测样品中RRM1 mRNA相对表达量的方法：采用实时荧光定量PCR技术，能够对样品中的RRM1 mRNA相对表达量进行定量检测；定量检测样品中RRM1 mRNA相对表达量时所使用的引物和探针，其中所述引物和探针包括检测用上下游引物RRM1‑F / RRM1‑R和探针RRM1‑Probe以及看家基因actin上下游引物Actin‑F/Actin‑R和探针Actin‑Probe。本发明还提供一种用于定量检测样品中RRM1 mRNA相对表达量的试剂盒。通过计算出该方法所获得的样品RRM1表达量与经过统计学获得的健康人正常基数的比值，获得RRM1 mRNA相对表达量，可有效地节约检测时间，提高检测精度。

Description

检测RRM1 mRNA相对表达量的方法、试剂盒及引物和探针
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，涉及一种定量检测样品中RRM1mRNA相对表达量的方法和试剂盒及其所使用的引物和探针，通过采用实时荧光定量PCR技术，能够对样品中的RRM1mRNA相对表达量进行定量检测。
背景技术
如今，肺癌是全球死亡率最高的恶性肿瘤之一。根据病理学分类，确诊的肺癌中约80%-85%为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。由于缺乏有效的早期诊断手段，初诊时约75％的患者已错过了最佳的手术时机，目前，预测NSCLC患者化疗反应的主要指标还不甚明确，也是目前肺癌研究领域的热点之一。有观点认为，应当引入个体化的分子标志物指标，以实现对NSCLC进行个体化治疗和预测。
核苷酸还原酶(ribonucleotide reductase,RR)是DNA合成通路中的限速酶，它能让二磷酸核苷酸转化为二磷酸脱氧核苷酸，而后者是DNA合成和修复所必不可少的原料。因此，RR是细胞存活的关键酶。RR包括2个亚单位：RRM1(ribonucleotide reductase M1)和RRM2(ribonucleotide reductase M2)。RRM2含有1个金属结合位点，携带接触抑制区，具有控制底物转化的功能；RRM1含有核苷酸结合位点，控制底物的特异性和整个酶的活性，同时也是核苷类似物的化疗药物的结合位点。作为NSCLC的重要化疗药物，吉西他滨(gemcitabine)隶属于嘧啶类抗代谢药物，其作用靶点即为核苷酸还原酶(RR)。吉西他滨通过干扰核苷酸还原酶的功能而减少脱氧核苷酸的产生，最终影响DNA的合成。因此可推测RRM1的表达量可能与吉西他滨耐药性有关。临床结果显示，在身体状况、体质等基本临床因素相似的情况下，个体差异对吉西他滨的化疗疗效仍有着显著影响。近来一些研究表明：当吉西他滨作用于肿瘤细胞时，RRM1的表达量增高会使肿瘤细胞对吉西他滨的耐药性增加。
在实际应用中，用于检测RRM1表达的方法主要为免疫组化法，尽管该法较为直观，但是试验过程过于繁琐，需要的试剂种类繁多，且试验结果需要经验丰富的专家来判读，判读结果存在较大的主观性，一定程度上限制了该法的应用。正是因为免疫组化法存在这些问题，才促使本发明探索新的方法来检测RRM1表达量。
实时荧光定量PCR法具有较高的灵敏度和特异性，而且能对扩增产物进行实时在线检测，反应RRM1在组织中的初始含量，从而节约了大量的检测时间，还避免了残留污染的发生。 常见的实时荧光定量PCR法有SYBR Green I染料法，双探针杂交法以及Taqman探针法等。其中SYBR Green I由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman探针法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。
此外，利用结合Taqman探针法的实时荧光PCR技术定量检测待测样品中的RRM1基因表达量，仅仅通过设置看家基因actin作为内参，来计算出待测样品目的基因RRM1表达量与待测样品看家基因actin表达量的比值仍然不足以判断该表达量是否正常。
发明内容
鉴于现有技术中检测RRM1的不足，因此本发明采用实时荧光PCR技术结合Taqman探针法应用于RRM1基因相对表达量（即RRM1mRNA相对表达量）的定量检测。本发明设计了检测看家基因/目的基因用引物、探针序列，用荧光定量PCR技术检测RRM1基因。通过调整两个基因的引物探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，开发出用于定量检测样品中RRM1mRNA的引物和探针，一种用于检测样品中RRM1mRNA相对表达量的核酸检测试剂盒，一种定量检测中RRM1mRNA相对表达量的方法。
本发明提供定量检测样品中RRM1mRNA相对表达量的引物和探针，所述引物和探针包括检测用上游引物RRM1-F、下游引物RRM1-R和探针RRM1-Probe以及看家基因actin上游引物Actin-F、看家基因actin下游引物Actin-R和看家基因actin探针Actin-Probe；其中所述引物序列为
RRM1-F：GATTTCTCTTACAATTACTTC
RRM1-R：GCCACTTTTCCATTGATCT
RRM1-Probe：FAM-CTTTAAGACGCTAGAGCGGTCTTATTT-TAMRA
Actin-F：TGAGCGAGGCTACAGCTT
Actin-R：TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
Actin-Probe：FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA。
进一步地，所述检测用上下游引物和探针的比例优选为：RRM1-F:RRM1-R:RRM1-Probe的摩尔比为2:2:1。
进一步地，所述看家基因actin上下游引物和探针的比例优选为：Actin-F:Actin-R:Actin-Probe的摩尔比为2:2:1。
进一步地，利用所述检测用上下游引物和探针以及所述看家基因actin上下游引物和探针，进行实时PCR扩增，然后计算样品中的RRM1mRNA表达量和actin表达量的比值Fs。
进一步地，根据所述Fs值计算Fs与Fr的比值F，其中Fr为正常基数。
进一步地，所述Fr值为0.83。
本发明还提供一种定量检测样品中RRM1mRNA相对表达量的方法，其特征在于：
(1)提取样品中的RNA；
(2)将(1)提取出的RNA逆转录为cDNA；
(3)加入(2)中所述的cDNA到反应管中，利用检测用上游引物RRM1-F、下游引物RRM1-R和探针RRM1-Probe定量检测样品中的RRM1表达量；利用看家基因actin上游引物Actin-F、看家基因actin下游引物Actin-R和看家基因actin探针Actin-Probe定量检测样品中的actin表达量，其中
RRM1-F：GATTTCTCTTACAATTACTTC
RRM1-R：GCCACTTTTCCATTGATCT
RRM1-Probe：FAM-CTTTAAGACGCTAGAGCGGTCTTATTT-TAMRA
Actin-F：TGAGCGAGGCTACAGCTT
Actin-R：TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
Actin-Probe：FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA；
(4)计算Fs值，即所述样品中的RRM1表达量与所述样品中的样品actin表达量的比值；
(5)计算F值，F=Fs/Fr，其中Fr=0.83。
进一步地，当F>10，判断为相对表达量偏高；F<3，判断为相对表达量偏低；3≤F≤10，判断为正常。
本发明还提供一种定量检测样品中RRM1mRNA相对表达量的试剂盒，所述试剂盒包括样品RNA提取液；红细胞裂解液；检测体系PCR反应液；阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其特征在于，所述检测体系PCR反应液包括THUNDERBIRD Probe qPCR Mix、检测用上游引物RRM1-F、下游引物RRM1-R和探针RRM1-Probe以及看家基因actin上游引物Actin-F、看家基因actin下游引物Actin-R和看家基因actin探针Actin-Probe，其中，
RM1-F：GATTTCTCTTACAATTACTTC
RRM1-R：GCCACTTTTCCATTGATCT
RRM1-Probe：FAM-CTTTAAGACGCTAGAGCGGTCTTATTT-TAMRA
Actin-F：TGAGCGAGGCTACAGCTT
Actin-R：TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
Actin-Probe：FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA。
利用本发明的引物和探针，将实时荧光PCR技术与Taqman探针结合使用，可以对RRM1mRNA相对表达量进行定量检测，检测精度高，而且操作简单，可降低检测成本，节约检测 时间。
鉴于仅仅通过设置看家基因actin作为内参，来计算出待测样品目的基因RRM1表达量与待测样品看家基因actin表达量的比值Fs仍然不足以判断该表达量是否正常，为此本发明根据临床上作为对照组的健康人样品的大量临床检测结果，利用统计学方法创造性地计算出健康人的正常基数Fr，其中Fr是通过计算1000例作为对照组的健康人样品中的RRM1基因表达量与作为对照组的健康人样品中的看家基因actin表达量的比值然后求这些比值的平均数而计算出来的，其值为0.83，即Fr=0.83，然后计算F值(F=Fs/Fr)。根据对大量RRM1相对表达量偏高的临床样品进行分析，所测得的F值均大于10，因此设定当F>10时，RRM1相对表达量偏高；根据对大量RRM1相对表达量正常的临床样品进行分析，所测得的F值均不小于3且不大于10，因此设定当3≤F≤10时，RRM1相对表达量正常；根据对大量RRM1相对表达量偏低的临床样品进行分析，所测得的F值均小于3，因此设定当F<3时，RRM1相对表达量偏低。再者，除了根据实时荧光PCR中的Ct值来判断样品是否对药物吉西他滨产生耐药性之外，利用F值也可有助判断这种药物耐药性是否产生。
此外，正是因为引入了健康人数值作为对照，通过计算出待测样品目的基因RRM1表达量与待测样品看家基因actin表达量的比值Fs与健康人正常基数Fr的比值F(F=Fs/Fr)，这样就可将F值作为一种衡量指标来判定待测者的RRM1相对表达量是否正常，从而能够对待测者的RRM1相对表达量进行全面的评价，并指导后期治疗与用药。这是因为仅仅根据Fs值只能评估待测者体内的RRM1表达量在一段时间内的波动，但是这种表达量本身是否处于正常范围之内，人们无法评判，而且实际中还存在Fs值下降但是待测者体内的RRM1表达量仍然偏高的情形，这时如果根据Fs下降就以为待测者健康状况好转从而停止治疗或者不更换药物而继续使用原有药物，那么就会错过最好的治疗时机，甚至导致病情恶化。但是如果依据F值，就可很好地克服这种Fs值下降但F值仍然偏高的情形。总之，该方法不但能够对待测者体内RRM1基因相对表达量进行检测，同时还能够指导后期治疗方案的确定和药物选择，还可用于辅助临床上NSCLC的早期诊断、早期预防及高危人群的筛选。
附图说明
图1是样品1的阳性检测结果示意图；
图2是样品2的阴性检测结果示意图；
图3是样品3的阴性检测结果示意图；
图4是样品3对应患者服用吉西他滨三个月后的阳性检测结果示意图。
具体实施方式
实施例1
用于定量检测样品中RRM1mRNA相对表达量的核酸检测试剂盒，包括：
红细胞裂解液(TIANGEN）
样品RNA提取液：QIAGEN RNeasy FFPE Kit；
检测体系PCR反应液：THUNDERBIRD Probe qPCR Mix（2×）、RRM1上游引物（RRM1-F）、下游引物（RRM1-R）各0.8μM、探针（RRM1-probe）0.4μM；看家基因actin上游引物（Actin-F）、下游引物（Actin-R）各0.8μM、探针（Actin-probe）0.4μM；其中，
RRM1-F：GATTTCTCTTACAATTACTTC
RRM1-R：GCCACTTTTCCATTGATCT
RRM1-Probe：FAM-CTTTAAGACGCTAGAGCGGTCTTATTT-TAMRA
Actin-F：TGAGCGAGGCTACAGCTT
Actin-R：TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
Actin-Probe：FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA；
阳性对照品：含RRM1基因的溶液；
阴性对照品：不含RRM1基因的溶液；
空白对照品：生理盐水或不加任何物质。
实施例2
本发明试剂盒的使用方法：
（1）抽提石蜡切片中的组织RNA:切去组织或者石蜡切片样品于1.5ml离心管中（刮拭）；加入1ml组织透明液，振荡混匀后13000rpm离心1min；去除上清加入500ml组织透明液，振荡混匀后13000rpm离心1min；去除上清，加入1ml无水乙醇，振荡混匀后13000rpm离心1min；去除上清后至于37℃金属浴10min（开盖），直至液体干燥；参考QIAGEN RNeasy FFPE Kit石蜡RNA抽提试剂盒说明书，提取样品RNA。
（2）参考TOYOBO公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit试剂盒说明书，将（1）中提取得到的样品RNA逆转录为cDNA。
（3）试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各X ul，每人份23ul分装：
X=23ul反应液×（8份看家基因（标准曲线）+8份目的基因（标准曲线）+n份样品+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照）。
（4）加样：将2ul步骤（2）中获得的cDNA加入到检测体系PCR反应液中；对阳性对照 和阴性对照实验而言，直接加2ul阳性对照品和阴性对照品；对空白对照实验而言，加2ul生理盐水或不加任何物质。
（5）检测：检测在实时荧光PCR仪上进行，可用仪器包括ABI7300，7500（美国Applied Biosystems公司）等。反应条件：95℃预变性1min；95℃15s，58℃35sec.40个循环，荧光信号于58℃35sec.时采集。
（6）结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和Ct值自动计算出待测样品中目的基因RRM1的表达量(也被称作浓度，或者表达量)和看家基因actin的表达量(也被称作浓度)。按照以下公式进行计算：
1 ）对作为对照组的健康人而言，其目的基因浓度 / 看家基因浓度的比值经过大量样品的测试，稳定在 0.83 左右，即 Fr=0.83 。
2）根据F=Fs/Fr，可计算出F值。F值>10，判断为相对表达量偏高；F值<3，判断为相对表达量偏低；3≤F≤10，判断为正常。
3)阳性判断标准：Ct<35，为阳性；35≤Ct≤38，为疑似阳性，需要再次验证；Ct＞38，为阴性。
实施例3
采用本发明核酸检测方法检测临床样品
取送检的非小细胞肺癌(NSCLC)患者的石蜡切片样品20例，按实施例2所述方法提取组织RNA、配制试剂并检测。
对每份样品而言，取2ul经逆转录产生的cDNA，加入到检测体系PCR反应液中。同时做阳性、阴性、空白对照实验，看家基因/目的基因的标准曲线各一份。一台96孔的荧光PCR仪可同时检测20份样品，每份样品重复2次，一份阳性对照品，一份阴性对照品和一份空白对照品。检测时间仅为100分钟。
实验结果与免疫组化试验报告结果相比较，确定样品检测的准确率。部分阳性结果如表1所示：
表1：实施例3的检测结果
从表1可以看出，20例样品中有7例为高表达，12例为正常表达，1例为低表达。其中仅2例与免疫组化结果有出入，但后续随访记录表明2例患者并未对吉西他滨产生耐药性，证明本发明检测的结果预测性较免疫组化更强。正是因为引入了健康人数值作为对照，最终能够对待测者的RRM1相对表达量进行全面的评价，从而指导后期治疗与用药。该法不但结果准确性高，而且对于临床有一定的指导意义。
实施例4临床样品检测
取经临床实验验证吉西他滨耐药/非耐药非小细胞肺癌(NSCLC)患者石蜡切片样品各一例，按实施例2所述方法提取组织RNA、配制试剂并检测。
对每份样品而言，取2ul经逆转录产生的cDNA，加入到检测体系PCR反应液中，同时做阳性、阴性、空白对照实验各一次。用荧光PCR仪检测，时间为100分钟。
样品1为经临床实验验证吉西他滨耐药的非小细胞肺癌患者石蜡切片样品，检测结果图如 图1所示，看家基因actin的扩增信号显示待测样品基因组提取成功，样品1的RRM1基因在Ct<35之前有扩增信号，所以检测结果有效。根据看家基因actin和目的基因RRM1各自的定量标准曲线得到样品1的RRM1基因表达量为10.5，与正常基数Fr作比得到F>10，因此可将样品1定性为RRM1基因相对高表达量，这与临床实验得到的样品1对吉西他滨产生耐药性的结果是相一致的。
样品2为经临床实验验证吉西他滨非耐药的非小细胞肺癌患者石蜡切片样品，样品2的检测结果图如图2所示，看家基因actin的扩增信号显示被检样品基因组提取成功，检测结果有效，样品2在Ct>38之后无扩增信号。因此样品2的RRM1表达量检测结果为0，与正常基数Fr作比得到F<3，因此该样品定性为RRM1基因相对低表达量，这与临床实验得到的样品2未对吉西他滨产生耐药性的结果是相一致的。
实施例5临床样品检测
样品3为经临床实验验证吉西他滨非耐药的非小细胞肺癌(NSCLC)患者，按实施例2所述方法提取组织RNA、配制试剂并检测。
取2ul经逆转录产生的cDNA，加入到检测体系PCR反应液中，同时做阳性、阴性、空白对照实验各一次。用荧光PCR仪检测，时间为100分钟。
检测结果如图3所示，看家基因actin的扩增信号显示被检样品基因组提取成功，且样品3的RRM1基因在Ct<35之前有扩增信号，所以检测结果有效。根据看家基因actin和目的基因RRM1各自的定量标准曲线得到样品3的RRM1基因表达量为3.5，与正常基数Fr作比得到:3<F<10，因此样品3定性为RRM1基因正常表达，这与临床实验得到的样品3未对吉西他滨产生耐药性的结果是相一致的。
样品3对应患者服用吉西他滨三个月后，临床表现出现明显的耐药现象。因而再次进行RRM1基因相对表达量检测，按实施例2所述方法提取组织RNA、配制试剂并检测。
取2ul经逆转录产生的cDNA，加入到检测体系PCR反应液中。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。用荧光PCR仪检测，时间为100分钟。
检测结果如图4所示，看家基因actin的扩增信号显示被检样品基因组提取成功，且样品3对应患者经三个月治疗后的RRM1基因在Ct<35之前有扩增信号，所以检测结果有效。根据看家基因actin和目的基因RRM1各自的定量标准曲线得到样品3对应患者经三个月治疗后的RRM1基因表达量为10.2，与正常基数Fr作比得到:F>10，因而此时样品3对应患者被定性为RRM1基因相对高表达，这与临床实验得到的样品3对应患者经三个月治疗后对吉西他滨产生耐药性的结果是相一致的。
SEQUENCE LISTING
<110> 吉林艾迪康医学检验所有限公司
<120> 检测RRM1 mRNA相对表达量的方法、试剂盒及引物和探针
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
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<213> 人工序列
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gatttctctt acaattactt c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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<212> DNA
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accaccacgg ccgagcgg 18

Claims (4)

1.定量检测样品中RRM1 mRNA相对表达量的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括检测用上游引物RRM1-F、下游引物RRM1-R和探针RRM1-Probe以及看家基因actin上游引物Actin-F和看家基因actin下游引物Actin-R和看家基因actin探针Actin-Probe；其中所述引物和探针序列为
RRM1-F：GATTTCTCTTACAATTACTTC
RRM1-R：GCCACTTTTCCATTGATCT
RRM1-Probe：FAM- CTTTAAGACGCTAGAGCGGTCTTATTT -TAMRA
Actin-F：TGAGCGAGGCTACAGCTT
Actin-R：TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
Actin-Probe：FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA。
2.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，RRM1-F:RRM1-R:RRM1-Probe的摩尔比为2:2:1。
3.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，Actin-F:Actin-R:Actin-Probe的摩尔比为2:2:1。
4.一种定量检测样品中RRM1 mRNA相对表达量的试剂盒，所述试剂盒包括样品RNA提取液；红细胞裂解液；检测体系PCR反应液；阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其特征在于，所述检测体系PCR反应液包括THUNDERBIRD Probe qPCR Mix、检测用上游引物RRM1-F、下游引物RRM1-R和探针RRM1-Probe以及看家基因actin上游引物Actin-F、看家基因actin下游引物Actin-R和看家基因actin探针Actin-Probe，其中，
RM1-F：GATTTCTCTTACAATTACTTC
RRM1-R：GCCACTTTTCCATTGATCT
RRM1-Probe：FAM- CTTTAAGACGCTAGAGCGGTCTTATTT -TAMRA
Actin-F：TGAGCGAGGCTACAGCTT
Actin-R：TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
Actin-Probe：FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA。
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