CN103451282B - 用于检测BRCA1mRNA的核酸检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于检测BRCA1mRNA的核酸检测试剂盒，包括红细胞裂解液、RNA提取液、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；其特征在于，检测体系PCR反应液包括PCR缓冲液、d NTP、Mg2+、检测用上下游引物BRCA1-F / BRCA1-R和探针BRCA1-Probe、参照用上下游引物Actin-F/ Actin-R探针Actin-Probe；其中，BRCA1-F：CAGCTACCCTTCCATCATAAGTGA；BRCA1-R：GGCCATGTATATGCGAATCTTTTT；BRCA1-Probe：FAM-TTCTGCC CTTGAGGACCTGCGAAAT-TAMRA；Actin-F：TGAGCGAGGCTACAGCTT； Actin-R：TCCTTGATGTCGCGCACGATTT；Actin-Probe：FAM-ACCACCACGG CCGAGCGG-TAMRA。
Description
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种基因检测试剂盒，采用探针实时荧光定量PCR技术，能够对人类乳腺癌中的BRCA1表达水平进行检测，可有效的节约检测时间，提高检测精度。
背景技术
乳腺癌作为女性的常见肿瘤，已成为癌症死亡的第二大原因。其诊断主要建立在影像学检查基础上，缺乏实验室特异性诊断指标，给早期诊断带来困难，容易漏诊或误诊，而手术切除又是乳腺癌首选治疗方法，但是术后影响形态，美观不佳，对患者造成较大困扰，更有部分患者因此产生的心理阴影，严重影响她们的生活质量。目前多认为乳腺癌应采取多种方法结合的综合治疗，原发病灶的彻底清理是乳腺癌治疗的关键。另外早期诊断也显得尤为重要，早发现是争取其良好预后的关键。
乳腺癌1号基因(breast cancel susceptibility gene1，BRCA1)是世界上第一个被发现的家族性乳腺癌抑癌基因，定位于17号染色体长臂上，由包括22个编码外显子和2个非编码外显子。目前研究发现,DNA修复是铂类化疗耐药性产生的主要机制之一。临床运用表明铂类药物的疗效存在显著的个体差异，部分患者获益，部分患者耐药并出现毒副作用。大量临床研究已经证实：铂类药物的疗效与肿瘤组织中BRCA1基因mRNA表达水平密切相关，即BRCA1基因表达水平低的患者对铂类药物敏感，反之表达水平高的患者表现耐药。然而，抗微管类化疗药是作用于细胞微管，通过影响纺锤体形成，从而抑制细胞有丝分裂的。这类药物时常出现治疗有效率低和副作用大的问题，而且存在显著的个体差异。大量的临床研究显示，抗微管药物的疗效与肿瘤组织中BRCA1基因的mRNA表达水平密切相关，即BRCA1基因表达水平高的患者对抗微管类药物敏感，反之表达水平低的患者表现耐药。因而，BRCA1表达水平对于后期的用药有很重要的指导作用。
在实际应用中，用于检测BRCA1表达的方法主要为免疫组化，尽管该法较为直观，但是试验过程过于繁琐，需要的试剂种类繁多，且试验结果需要经验丰富的专家来判读，判读结果存在较大的主观性，一定程度上限制了该法的应用。正是因为免疫组化法存在这些问题，才促使我们探索新的方法来检测BRCA1表达水平。
实时荧光定量PCR法具有较高的灵敏度和特异性,而且能对PCR进行实时在线检测,反应BRCA1在组织中的初始含量，试验节约了大量的检测时间,还避免了遗留污染的发生。常见的方法有SYBR GreenI染料法,双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBR GreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。因此本发明采用实时荧光PCR技术结合Taqman探针法应用于BRCA1基因检测。
发明内容
鉴于现有技术中检测BRCA1的不足，本发明设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，用荧光定量PCR技术检测BRCA1基因。通过调整两个基因的引物探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，开发了一种用于检测BRCA1mRNA的核酸检测试剂盒。
用于检测BRCA1mRNA的核酸检测试剂盒，包括红细胞裂解液、RNA提取液、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；其特征在于：
检测体系PCR反应液包括PCR缓冲液、d NTP、Mg2+、检测用上下游引物BRCA1-F/BRCA1-R和探针BRCA1-Probe、参照用上下游引物Actin-F/Actin-R探针Actin-Probe；其中，
BRCA1-F：CAGCTACCCTTCCATCATAAGTGA
BRCA1-R：GGCCATGTATATGCGAATCTTTTT
BRCA1-Probe：FAM-TTCTGCCCTTGAGGACCTGCGAAAT-TAMRA
Actin-F：TGAGCGAGGCTACAGCTT
Actin-R：TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
Actin-Probe：FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA。
进一步地，检测用上下游引物和探针的比例优选为：BRCA1-F︰BRCA1-R︰BRCA1-Probe的摩尔比为2︰2︰1。
参照用上下游引物和探针的比例优选为：Actin-F︰Actin-R︰Actin-Probe的摩尔比为2︰2︰1。
所述阳性对照品为含有BRCA1基因组的溶液；所述阴性对照品为无BRCA1基因组的溶液。
RNA提取液可用商业产品QIAGEN RNeasy FFPE Kit石蜡RNA抽提试剂盒替代。
使用本发明的试剂盒，将实时荧光PCR技术结合采用Tapman探针，可以对BRCA1mRNA进行检测，检测精度高，而且操作简单，可降低检测成本，节约检测时间。利用双标准曲线法，将检测结果与正常人的表达水平（0.75）相比，能衡量受测者体内BRCA1基因表达水平是否正常，该方法是一种新型的用于评价患者BRCA1表达水平的方法，也有助于患者的后期治疗方案的确定。由于引入了“正常人”替代了原有的单纯个体检测，不但能够对受测者体内BRCA1基因表达量进行检测，同时还能够与正常水平进行比较，指导后期用药，可用于辅助临床上乳腺癌的早期诊断、早期预防及高危人群的筛选。
附图说明
图1是阳性检测结果示意图；
图2是阴性检测结果示意图。
具体实施方式
实施例1
本发明的用于检测BRCA1mRNA的核酸检测试剂盒，包括：
红细胞裂解液；
RNA提取液：QIAGEN RNeasy FFPE Kit。
检测体系PCR反应液：THUNDERBIRD Probe qPCR Mix（2×）(包括PCR缓冲液、d NTP、Mg2+)、BRCA1引物各0.8uM、BRCA1-probe（探针）0.4uM；Actin引物各0.8uM、Actin-probe（探针）0.4uM；其中，
BRCA1-F：CAGCTACCCTTCCATCATAAGTGA，
BRCA1-R：GGCCATGTATATGCGAATCTTTTT，
BRCA1-Probe：FAM-TTCTGCCCTTGAGGACCTGCGAAAT-TAMRA，
Actin-F：TGAGCGAGGCTACAGCTT，
Actin-R：TCCTTGATGTCGCGCACGATTT，
Actin-Probe：FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA；
阳性对照品：含BRCA1基因组溶液；
阴性对照品：不含BRCA1基因组溶液。
实施例2
本发明试剂盒的使用方法：
（1）抽提石蜡切片中的组织RNA:切去组织或者石蜡片样本于1.5ml离心管中（刮拭）；加入1ml组织透明液，振荡混匀后13000rpm离心1min；去除上清加入500ml组织透明液振荡混匀后13000rpm离心1min；去除上清，加入1ml无水乙醇振荡混匀后13000rpm离心1min；去除上清后至于37度金属浴10min（开盖），直至液体干燥；参考QIAGEN RNeasy FFPE Kit石蜡RNA抽提试剂盒说明书，提取样本RNA。
（2）参考TOYOBO公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit试剂盒说明书，将RNA反转为cDNA。
（3）试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各X ul，每人份23ul分装：
X=23ul反应液×（8份内参（标准曲线）+8份目的基因（标准曲线）+n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照）。
（4）加样：加入检测体系PCR反应液中2ulcDNA；阳性对照和阴性对照直接加2ul阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2ul生理盐水或不加任何物质。
（5）检测：检测在实时荧光PCR仪上进行，可用仪器包括ABI7300，7500（美国AppliedBiosystems公司）等。反应条件：95℃预变性1min；95℃15s，58℃35sec40个循环，荧光信号于58℃35sec时采集。
（6）结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和CT值自动计算出拷贝数。按照以下公式进行计算：
1）对照组即为正常人，其目的基因/看家基因的比值经过大量样本的测试，稳定在0.75左右。
2）F值>1.5，判断为表达量偏高；F值<0.5，判断为表达量偏低；0.5<F<1.5，判断为正常。
3)阳性判断标准：，Ct<36，为阳性；35≤Ct≤38，为疑似阳性，需要再次验证；Ct＞38，为阴性。
实施例3
采用本发明核酸检测方法检测临床标本
取送检的乳腺癌患者（采用双管荧光定量PCR技术）的石蜡切片标本20例，按实施例2所述方法提取基因组RNA、配制试剂并检测。
每份标本加入检测体系PCR反应液中2ul。同时做阳性，阴性，空白对照，内参基因/目的基因的标准曲线各一份。一台96孔的荧光PCR仪可同时检测20份样品，每个样本2次重复，一份阳性对照，一份阴性对照和一份空白对照。检测时间仅为100分钟。
实验结果与PCR组的报告结果相比较，确定样品检测的准确率。部分阳性结果如下表：
| Sample | 内参表达量 | BRCA1表达量 | 比值 | 与正常人的比值 | 表达水平 |
| 3108 | 89.02 | 220.05 | 2.47 | 3.30 | 高 |
| 3101 | 3.09 | 9.68 | 3.13 | 4.18 | 高 |
| 11713 | 20.14 | 13.19 | 0.65 | 0.87 | 正常 |
| 3110 | 23.25 | 39.94 | 1.72 | 2.29 | 高 |
| 3301 | 5.61 | <1 | 0.00 | 0.00 | 阴性 |
| 3325 | 37.15 | 33.8 | 0.91 | 1.21 | 正常 |
| 3531 | 2.56 | 12.86 | 5.02 | 6.70 | 高 |
| 3106 | 5.73 | 12.74 | 2.22 | 2.96 | 高 |
| 3518 | 19.73 | 17.51 | 0.89 | 1.18 | 正常 |
| 3321 | 78.06 | 167.35 | 2.14 | 2.86 | 高 |
| 3312 | 53.27 | 54.02 | 1.01 | 1.35 | 正常 |
| 3320 | 12.43 | 6.9 | 0.56 | 0.74 | 正常 |
| 21258 | 36.15 | 55.9 | 1.55 | 2.06 | 高 |
| 3304 | 67.17 | 144.67 | 2.15 | 2.87 | 高 |
| 3502 | 20.32 | 197.07 | 9.70 | 12.93 | 高 |
| 3302 | 69.38 | 377.12 | 5.44 | 7.25 | 高 |
| 522695 | 52.38 | 834.07 | 15.92 | 21.23 | 高 |
| 522664 | 3.15E-01 | 未检出 | 0.00 | 0.00 | 阴性 |
| 3322 | 7.73 | 8.68 | 1.12 | 1.50 | 正常 |
| 3329 | 39.31 | 13.23 | 0.34 | 0.45 | 低 |
表1为本次实验的结果
从上表可以看出，20例样本中有11例为高表达，6例为正常表达,1例为低表达，2例为阴性。正是因为引入了正常人数值作为参照，最终能够对受测者的BRCA1表达水平进行评价，从而指导后期治疗与用药。该法不但结果准确性高，而且对于临床有一定的指导意义。
实施例4临床样品检测
取待检的临床样品1和样品2，按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。
每份样品加入检测体系PCR反应液中2ul。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。用荧光PCR仪检测，时间为100分钟。
样品1的检测结果图如图1所示，内参基因actin的扩增信号显示被检样本基因组提取成功，检测结果有效，样品1的CT值<36之前有扩增信号，所以样品1为阳性。
样品2的检测结果图如图2所示，内参基因actin的扩增信号显示被检样本基因组提取成功，检测结果有效，样品2的CT值>38之后无扩增信号，所以样品2为阴性。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州艾迪康医学检验中心有限公司
<120> 用于检测BRCA1mRNA的核酸检测试剂盒
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<170> PatentIn version 3.3
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accaccacgg ccgagcgg 18
Claims (2)
1.一种用于检测BRCA1mRNA的PCR引物和探针，其特征在于，所述引物和探针的核苷酸序列包括检测用上下游引物BRCA1-F/BRCA1-R和探针BRCA1-Probe、参照用上下游引物Actin-F/Actin-R和探针Actin-Probe，其中：
BRCA1-F：CAGCTACCCTTCCATCATAAGTGA
BRCA1-R：GGCCATGTATATGCGAATCTTTTT
BRCA1-Probe：FAM-TTCTGCCCTTGAGGACCTGCGAAAT-TAMRA
Actin-F：TGAGCGAGGCTACAGCTT
Actin-R：TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
Actin-Probe：FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA。
2.根据权利要求1所述的PCR引物和探针，其特征在于BRCA1-F : BRCA1-R : BRCA1-Probe的摩尔比为2 : 2 : 1。
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