CN102002524B - 一种dab2ip基因的实时荧光pcr检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
一种dab2ip基因的实时荧光pcr检测试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102002524B CN102002524B CN2010105404501A CN201010540450A CN102002524B CN 102002524 B CN102002524 B CN 102002524B CN 2010105404501 A CN2010105404501 A CN 2010105404501A CN 201010540450 A CN201010540450 A CN 201010540450A CN 102002524 B CN102002524 B CN 102002524B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pcr
- fluorescence
- dab2ip
- primer
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 101000915396 Homo sapiens Disabled homolog 2-interacting protein Proteins 0.000 title abstract description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 22
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 10
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims abstract description 5
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 101150101472 DAB2IP gene Proteins 0.000 claims description 23
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 18
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 18
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 11
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 6
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 claims description 5
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 4
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 4
- -1 nucleoside triphosphate Chemical class 0.000 claims description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 3
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 6
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 abstract description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 4
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 abstract 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 abstract 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 102100028571 Disabled homolog 2-interacting protein Human genes 0.000 description 12
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100532034 Drosophila melanogaster RTase gene Proteins 0.000 description 2
- 102100038970 Histone-lysine N-methyltransferase EZH2 Human genes 0.000 description 2
- 101000882127 Homo sapiens Histone-lysine N-methyltransferase EZH2 Proteins 0.000 description 2
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 2
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 2
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 2
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N parathion Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101150012162 H-RAS gene Proteins 0.000 description 1
- 101000686227 Homo sapiens Ras-related protein R-Ras2 Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 1
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 102000003901 Ras GTPase-activating proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000231 Ras GTPase-activating proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100025003 Ras-related protein R-Ras2 Human genes 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 244000309743 astrovirus Species 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000012151 immunohistochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012764 semi-quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种DAB2IP基因的实时荧光PCR检测试剂盒，主要包括特异性引物和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，所述特异性引物和荧光探针序列如下：上游引物：5′-TGTGAAGTGGACCCAAGCAA-3′，下游引物：5′-ACGCAGTAGGAGTTGATGATTTTG-3′，荧光探针：5′-FAM-CCCGAGCACCAGGGCAACCTC-TAMRA-3′，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。本发明的有益效果主要体现在：采用本发明方法，DAB2IP基因的检测灵敏度高，特异性好，降低了常规PCR扩增的假阳性率；可实现对DAB2IP基因快速、准确、特异检测和分析，也可加入标准品进行定量检测，同时还可以加入管家基因(如β-actin基因等)进行相对定量检测。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种DAB2IP基因的实时荧光PCR检测试剂盒及其检测方法。
(二)背景技术
自适应及自我加速生长是恶性肿瘤发生发展的必经之路，作为重要的表达网络调节者，DAB2IP归属于RAS-GTP酶激活蛋白家族，具有抑制肿瘤细胞增殖的活性，能通过多种复杂的通路抑制肿瘤生长及转移。DAB2IP可减弱H-RAS，R-RAS和TC21等癌基因的表达，并与TNF-a介导的肿瘤细胞凋亡相关。作为EZH2的靶基因，DAB2IP可能参与EZH2参与的肿瘤表观遗传学沉默调节。此外，DAB2IP可介导PI3K-Akt通路失活，该通路是重要的肿瘤细胞信号传导途径，调节肿瘤的增殖，存活和转移。最新研究发现，DAB2IP还可通过NF-κB途径阻断肿瘤转移，并在关键的上皮-间质转化(EMT)过程中具有潜在的调节能力。因此，DAB2IP的表达高低与肿瘤生长，转移以及侵袭等多种重要特性密切相关，精确检测DAB2IP可明晰这一独特的抑癌基因在人体的表达，指导个体化抗肿瘤研究，治疗及预后判断。
目前DAB2IP研究方兴未艾，常规测定DAB2IP表达的方法仍然以免疫组化及半定量PCR为主，前者较难在外周血中测定，后者只能起到定性的作用。实时荧光定量PCR技术具有快速、准确、可定量等优点，能真实反映待测定样本的DAB2IP表达高低，从而协助临床甄别可能的抑癌活性，同时为肿瘤基础研究提供重要支持。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种检测DAB2IP基因的荧光检测试剂盒及其检测方法，以实现对DAB2IP基因快速、准确、特异检测。
本发明采用的技术方案是：
一种DAB2IP基因的实时荧光PCR检测试剂盒，主要包括特异性引物和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其特征在于所述特异性引物和荧光探针序列如下：
上游引物：5′-TGTGAAGTGGACCCAAGCAA-3′
下游引物：5′-ACGCAGTAGGAGTTGATGATTTTG-3′
荧光探针：5′-FAM-CCCGAGCACCAGGGCAACCTC-TAMRA-3′
其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。
本发明关键在于特异性引物和荧光探针序列的设计，试剂盒中其他组成，可按本领域常规进行选择，该试剂盒可用作DAB2IP基因的定性检测，也可加入标准品进行定量检测，同时还可以加入管家基因(如β-actin基因等)进行相对定量检测。
为达到精确定量测定的效果，所述试剂盒还包括可DAB2IP基因标准品，所述标准品序列如下：TGCGAAGTGGATCCCAGCAAGTGCTCGGCCGCTGACCTCCCAGAGCACCAGGGCAACCTCAGATGT GCTGCGAGCTGGCCTTCTGCAAGATCATCAACTCCTACTGTGT。
以标准品的梯度浓度的DNA溶液进行荧光PCR检测，根据拷贝浓度的对数值与标准品Ct值的关系可绘制得到标准曲线，测得样品DNA的Ct值后，对照标准曲线即可获得样品DNA的拷贝浓度。
一种DAB2IP基因的荧光定量PCR检测方法，所述方法如下：
(1)提取待测样本DNA；也可提取样本RNA后，进行逆转录获得其cDNA作为待测样本DNA；上述DNA或RNA提取方法或逆转录方法可按本领域常规方法进行；
本发明中样本RNA提取可采用RNAi Plus(大连宝生物，D19108A)提取总RNA，按照下述体系进行逆转录：
2×RT buffer 10.0μL
dNTP(各10mM) 1μL
Oligo dT(10uM) 1μL
RNAinhibitor 0.5μL
RTase 1μL
总RNA 1μg
水补足至20μL。
逆转录条件：30℃，10分钟；42℃，30分钟；95℃，5分钟。
(2)取特异性扩增引物及特异性探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，分别加入阴性对照品或待测样品逆转录产物cDNA配成PCR反应体系，于同等条件下进行PCR扩增反应，反应管置于定量荧光PCR仪进行荧光检测；
所述特异性引物和荧光探针序列如下：
上游引物：5′-TGTGAAGTGGACCCAAGCAA-3′
下游引物：5′-ACGCAGTAGGAGTTGATGATTTTG-3′
荧光探针：
5′-FAM-CCCGAGCACCAGGGCAACCTC-TAMRA-3′
其中FAM为荧光报告基团，TAMARA为荧光淬灭基团；
(3)选择荧光检测模式FAM荧光对应波长，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性。
所述阴性对照品可按本领域常规方法选择，通常选择不含有该靶基因的非人源性细胞。在对多个样品进行检测时，可根据样品DNA测得的Ct值大小，粗略判断不同样品之间DAB2IP基因表达量的差异(通常是Ct值越大，其DAB2IP基因表达量越低)。
进一步，所述方法同时以梯度浓度的前述标准品的DNA溶液在与样品DNA相同条件下进行PCR扩增反应，以标准品DNA溶液拷贝浓度的对数值为横坐标、标准品Ct值为纵坐标绘制标准曲线；根据样品DNA测得的Ct值，对照标准曲线，获得样品DNA的拷贝浓度。
所述PCR反应条件可按参照本领域常规荧光定量PCR方法，具体的，本发明中PCR反应条件如下：95℃变性2分钟，95℃15秒、60℃45秒，进行40个循环扩增。
PCR反应液通常按如下组成配制(终浓度)：1×PCR buffer、0.3～0.5μM的引物、0.1～0.3μM的荧光探针、1～5U的DNA聚合酶、0.2～0.4mM的dNTPs，通常取2μL的模板，反应总体积通常为20～50μL。
本发明建立了利用TaqMan荧光定量PCR技术检测DAB2IP基因的方法，并经检测肿瘤病人临床样本，表明该方法切实可行。由于本方法采用了PCR扩增技术，使得DAB2IP基因检测的灵敏度大大提高，而且由于荧光探针的应用，使得其特异性亦大大提高，降低了常规PCR扩增的假阳性率，使得我们可以在极少的样本中获得准确、详实的样本信息。
本发明采用了目前较先进的特异性荧光探针杂交定量PCR检测技术，在保持高灵敏度的前提下尽量减少假阳性干扰。在实时荧光定量PCR检测技术出现之前，人们对PCR模板的定量不论是直接PCR还是竞争性PCR，基本上都要通过PCR产物电泳，再将电泳结果经计算机图像处理，根据电泳条带的亮度来确定最终PCR产物量的多少，或将带标记的PCR产物以ELISA的方式进行检测，再由此推测起始模板的量，但这些方法实际上都属于半定量水平，因为即使PCR条件已最优化，电泳及后续步骤的操作的不稳定性仍会给结果分析带来影响，从而影响定量这一目的。对于一些使用管家基因进行半定量分析的方法，由于引物间扩增效率不一致，导致管家基因和目的基因的PCR扩增产物比例不能真实的反应目的基因表达量的变化。随着实时荧光定量PCR技术的出现，人们可以真正地做到对PCR模板的精确定量，这种定量不仅保持了常规PCR的高灵敏性，而且由于特异性荧光探针杂交技术的应用，使得被检测基因的特异性大大提高。
本发明的有益效果主要体现在：采用本发明方法，DAB2IP基因的检测灵敏度高，特异性好，降低了常规PCR扩增的假阳性率；可实现对DAB2IP基因快速、准确、特异检测和分析，也可加入标准品进行定量检测，同时还可以加入管家基因(如β-actin基因等)进行相对定量检测。
(四)附图说明
图1为实时荧光定量PCR标准品检测：DAB2IP基因实时荧光定量PCR标准品检测结果，从左至右分别为105、104、103、102、101copies/μL标准品；
图2为实时荧光定量PCR标准曲线：标准曲线为Y＝-4.022×1gX+35.12；Y：对应的CT值；X：DAB2IP基因的拷贝数。
图3为5例阳性临床样本荧光定量PCR检测结果，CT值为16.18，16.59，27.02，31.93，32.15，对应拷贝数为5.26×106copies/μL，4.24×106copies/μL，1.1×103copies/μL，0.1copies/μL和0.05copies/μL。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：特异性引物、荧光探针
1、材料：
RNA提取试剂，逆转录试剂，PCR反应试剂均购自大连宝生物工程有限公司；Taq DNA聚合酶购自美国Promega公司，MX3000P型定量PCR仪为美国Agilent-Stratagene公司产品。
2、引物及探针设计与合成：
以DAB2IP基因序列(注册号为NM 032552.2)为模板，使用PrimerExpressTM(V2.0，美国ABI公司)软件分析TaqMan引物和探针位点，从中选择最佳组合。
检测用PCR引物和探针序列如下：
上游引物：5′-TGTGAAGTGGACCCAAGCAA-3′
下游引物：5′-ACGCAGTAGGAGTTGATGATTTTG-3′
荧光探针：5′-FAM-CCCGAGCACCAGGGCAACCTC-TAMRA-3′
其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。
均由大连宝生物工程有限公司合成。
实施例2：荧光定量PCR法检测DAB2IP基因
1、临床样本检测：
5例临床肿瘤组织标本，采用RNA提取试剂RNAi Plus(大连宝生物，D19108A)提取总RNA，分别取1.0ug进行逆转录反应，2×RT buffer，10.0μL；dNTP(10mM)，1μL；Oligo dT(10uM)，1μL；RNA inhibitor，0.5μL；RTase，1μL；总RNA 1μg，水补足至20μL。逆转录条件：30℃，10分钟；42℃，30分钟；95℃，5分钟后取1ul cDNA做模板，用检测用上下游引物在Agilent-Stratagene MX3000P定量PCR仪上进行PCR扩增。
PCR反应液组成如下：
2×PCR buffer 10.0μL
检测用上游引物(10μM) 1μL
检测用下游引物(10μM) 1μL
检测用荧光探针(10μM) 0.5μL
DNA聚合酶(5U/μL) 0.2μL
dNTPs(各250mM) 1.60μL
(dATP、dTTP、dCTP、dGTP物质的量比1∶1∶1∶1)
模板DNA(50ng/μL) 1μL
水补足至20μL。
PCR反应条件为：95℃预变性2分钟，95℃15秒、60℃45秒进行40个循环扩增。
构建以不含有标准品序列的质粒片段为阴性对照于相同条件下进行PCR检测，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性。
同时在相同条件下以不同浓度标准品(TGCGAAGTGGATCCCAGCAAGTGCTCG GCCGCTGACCTCCCAGAGCACCAGGGCAACCTCAGATGTGCTGCGAGCTGGCCTTCTGCAAGATCATCAACTCCTACTGTGT。)进行检测，并绘制标准曲线。
待测样本的测定结果经仪器处理根据标准曲线计算出检测样本中DAB2IP基因的拷贝数。
以非人源性细胞为待测样品，按照上述方法进行检测，检测结果均为阴性，说明本发明方法特异性强。
2、样品检测结果
标准品检测结果参见图1，标准曲线参见图2。
5例患者样本检出含有DAB2IP基因的不同拷贝数，检测结果参见图3：5例临床样本荧光定量PCR检测结果，CT值为16.18，16.59，27.02，31.93，32.15，对应拷贝数为5.26×106copies/μL，4.24×106copies/μL，1.1×103copies/μL，0.1copies/μL和0.05copies/μL。
由以上检测结果可知：DAB2IP具有抑癌基因活性，表达降低可致相应癌基因活跃复制，诱发肿瘤的增殖，浸润及转移。
本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江大学
<120> 一种DAB2IP基因的实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 1
tgtgaagtgg acccaagcaa 20
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 2
acgcagtagg agttgatgat tttg 24
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 3
cccgagcacc agggcaacct c 21
<210> 4
<211> 109
<212> DNA
<213> Human astrovirus
<400> 4
tgcgaagtgg atcccagcaa gtgctcggcc gctgacctcc cagagcacca gggcaacctc 60
agatgtgctg cgagctggcc ttctgcaaga tcatcaactc ctactgtgt 109
Claims (5)
1.一种DAB2IP基因的实时荧光PCR检测试剂盒，包括特异性引物和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其特征在于所述特异性引物和荧光探针序列如下：
上游引物：5′-TGTGAAGTGGACCCAAGCAA-3′
下游引物：5′-ACGCAGTAGGAGTTGATGATTTTG-3′
荧光探针：5′-FAM-CCCGAGCACCAGGGCAACCTC-TAMRA-3′
其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。
2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括DAB2IP基因标准品，所述标准品序列如下：TGCGAAGTGGATCCCAGCAAGTGCTCGGCCGCTGACCTCCCAGAGCACCAGGGCAACCTCAGATGTGCTGCGAGCTGGCCTTCTGCAAGATCATCAACTCCTACTGTGT。
3.一种非诊断目的的DAB2IP基因的荧光定量PCR检测方法，所述方法包括：
(1)提取待测样本DNA；
(2)取特异性扩增引物及特异性探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，分别加入阴性对照品或待测样品DNA配成PCR反应体系，于同等条件下进行PCR扩增反应，反应管置于定量荧光PCR仪进行荧光检测；
所述特异性引物和荧光探针序列如下：
上游引物：5′-TGTGAAGTGGACCCAAGCAA-3′
下游引物：5′-ACGCAGTAGGAGTTGATGATTTTG-3′
荧光探针：5′-FAM-CCCGAGCACCAGGGCAACCTC-TAMRA-3′
其中FAM为荧光报告基团，TAMARA为荧光淬灭基团；
(3)选择荧光检测模式FAM荧光对应波长，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法同时以梯度浓度的标准品DNA溶液在与样品DNA相同条件下进行PCR扩增反应，以标准品DNA溶液拷贝浓度的对数值为横坐标、标准品Ct值为纵坐标绘制标准曲线，根据样品DNA测得的Ct值，对照标准曲线，获得样品DNA的拷贝浓度；所述标准品序列如下：TGCGAAGTGGATCCCAGCAAGTGCTCGGCCGCTGACCTCCCAGAGCACCAGGGCAACCTCAGATGTGCTGCGAGCTGGCCTTCTGCAAGATCATCAACTCCTACTGTGT。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述PCR反应条件如下：95℃变性2分钟，95℃15秒、60℃45秒，进行40个循环扩增。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010105404501A CN102002524B (zh) | 2010-11-11 | 2010-11-11 | 一种dab2ip基因的实时荧光pcr检测试剂盒及检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010105404501A CN102002524B (zh) | 2010-11-11 | 2010-11-11 | 一种dab2ip基因的实时荧光pcr检测试剂盒及检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102002524A CN102002524A (zh) | 2011-04-06 |
| CN102002524B true CN102002524B (zh) | 2012-06-06 |
Family
ID=43810226
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2010105404501A Expired - Fee Related CN102002524B (zh) | 2010-11-11 | 2010-11-11 | 一种dab2ip基因的实时荧光pcr检测试剂盒及检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102002524B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104774810A (zh) * | 2014-01-09 | 2015-07-15 | 中国科学院福建物质结构研究所 | 一种抗人dab2ip的单克隆抗体及其细胞株 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007132166A2 (en) * | 2006-05-03 | 2007-11-22 | The Chinese University Of Hong Kong | New fetal methylation markers |
| CN101292046A (zh) * | 2005-09-14 | 2008-10-22 | 人类遗传标记控股有限公司 | 健康状态的测定法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080032943A1 (en) * | 2005-11-04 | 2008-02-07 | Johji Inazawa | Method for detecting cancer and a method for suppressing cancer |
-
2010
- 2010-11-11 CN CN2010105404501A patent/CN102002524B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101292046A (zh) * | 2005-09-14 | 2008-10-22 | 人类遗传标记控股有限公司 | 健康状态的测定法 |
| WO2007132166A2 (en) * | 2006-05-03 | 2007-11-22 | The Chinese University Of Hong Kong | New fetal methylation markers |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Chen H. et al.Accession No AF367051.《NCBI》.2002, * |
| Hong Chen et al.Epigenetic Regulation of a Novel Tumor Suppressor Gene (hDAB2IP) in Prostate Cancer Cell Lines.《The Journal of Biological Chemstry》.2003,第278卷(第5期),3121-3130. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102002524A (zh) | 2011-04-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cankovic et al. | The role of MGMT testing in clinical practice: a report of the association for molecular pathology | |
| Kidd et al. | GeneChip, geNorm, and gastrointestinal tumors: novel reference genes for real-time PCR | |
| CN107488726B (zh) | 一种肾癌预后评估生物标志物及其检测试剂和应用 | |
| EP3464593A1 (en) | Molecular tagging methods and sequencing libraries | |
| CA2869295A1 (en) | Methods using dna methylation for identifying a cell or a mixture of cells for prognosis and diagnosis of diseases, and for cell remediation therapies | |
| CN109112216A (zh) | 三重qPCR检测DNA甲基化的试剂盒和方法 | |
| CN109055555B (zh) | 一种肺癌早期转移诊断标志物及其试剂盒和应用 | |
| CN103667514A (zh) | 一种人白介素28b基因多态性荧光pcr检测试剂盒 | |
| CN111321227A (zh) | 白血病mef2d基因及znf384基因的多重荧光rt-pcr检测方法 | |
| Zhu et al. | Relationship between let-7a and gastric mucosa cancerization and its significance | |
| CN104830852A (zh) | 一种检测hla-b*15:02等位基因的多重实时荧光pcr方法 | |
| Snider et al. | Human disease characterization: real-time quantitative PCR analysis of gene expression | |
| CN109628600A (zh) | 一种用于早期乳腺癌诊断的生物标志物 | |
| US20130274127A1 (en) | Gene expression markers for prediction of response to phosphoinositide 3-kinase inhibitors | |
| CN104131113A (zh) | 一种miRNA检测试剂盒及其应用 | |
| CN102002524B (zh) | 一种dab2ip基因的实时荧光pcr检测试剂盒及检测方法 | |
| CN102827935B (zh) | 定量检测FIP1L1-PDGFRA融合基因mRNA水平的试剂盒 | |
| CN110396542A (zh) | 一种LncRNA标记物及其在糖尿病中的应用 | |
| EP4015635A1 (en) | Colorectal cancer diagnostic marker, method for assisting diagnosis of colorectal cancer, method for collecting data for diagnosis of colorectal cancer, colorectal cancer diagnostic kit, therapeutic agent for colorectal cancer, method for treating colorectal cancer, and method for diagnosing colorectal cancer | |
| CN103589786B (zh) | 检测RRM1 mRNA相对表达量的方法、试剂盒及引物和探针 | |
| CN106811537A (zh) | 一种检测表皮生长因子受体基因t790m低频突变引物及其应用 | |
| Zhou et al. | A digital PCR based assay to detect all ALK fusion species | |
| KR102548873B1 (ko) | 대장암 및 진행 선종의 선별 검사 방법 및 그 응용 | |
| EP4379064A1 (en) | Diagnostic methods and diagnostic assay comprising detection of lncrnas | |
| CN105969895A (zh) | 一种使用逆转录pcr检测hla-b*5801基因表达的检测方法及试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120606 Termination date: 20151111 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |