CN104561331A - 一种检测白血病相关融合基因的引物和探针、及其试剂盒 - Google Patents

一种检测白血病相关融合基因的引物和探针、及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因型的检测，具体讲，涉及一种检测白血病相关融合基因的引物和探针、及其试剂盒。本发明中检测白血病相关融合基因的引物和探针的核苷酸序列如SEQ？ID？NO:1～72所示。本发明试剂盒的阴性符合率和阳性符合率均为100％，最低检出量达到1000拷贝/反应，并且精密度高。

Description

一种检测白血病相关融合基因的引物和探针、及其试剂盒
技术领域
本发明涉及基因型的检测，具体讲，涉及一种检测白血病相关融合基因的引物和探针、及其试剂盒。
背景技术
白血病(Leukemia)是造血系统的恶性肿瘤，其特征是骨髓、淋巴结等造血系统中一种或多种血细胞发生恶性增殖，并浸润体内各组织脏器，导致正常造血组织细胞受抑制，产生各种症状。白血病临床上常以发热、出血、贫血，肝、脾、淋巴结肿大为特点。白血病一般按自然病程和细胞发育程度可分为急性白血病(AL)和慢性白血病(CL)，根据白血病细胞的形态和生化特征，又可分为急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性非淋巴细胞白血病(ANLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、慢性粒－单核细胞白血病(CMML)等。
白血病是国内十大高发恶性肿瘤之一，其发病率为2.76/10万人口，我国估计有5万以上患者，且白血病患者的数量正逐年增加。白血病的发病率虽然在肿瘤发病率中排第6位，但在儿童和青少年恶性肿瘤的发病率和死亡率中均占第1位。
近年临床研究表明，大部分白血病和淋巴瘤存在某些染色体畸变，如易位、缺失、插入等。这些染色体易位畸变时大部分情况下会产生新的融合基因，这些融合基因可作为用于诊断不同类型白血病和淋巴瘤的分子标志。不同类型的白血病化疗和放疗的方案是不同的。所以，对这些分子标记进行检测分析有利于治疗方案的确定和分析预后。因此，世界卫生组织2000年发布的白血病和淋巴瘤诊断标准已将染色体易位后融合基因检测作为最重要的指标之一。
目前对白血病的检查主要有，血象检查，骨髓涂片检查，血液生化检查等，但这些都没有对融合基因进行检查，获得的结果误差范围也比较大。目前检测融合基因的方法主要包括荧光原位杂交技术(FISH)，PCR和基因芯片等。但这些方法存在着准确性差、操作复杂等缺陷，临床应用困难。
为了帮助临床医生们准确及时检测白血病融合基因、辅助确定相关化疗方案及复发检测，本发明从中国国情出发，开发了白血病相关融合基因检测试剂盒，该试剂盒能定性检测人骨髓标本中的白血病相关融合基因22种的RNA量，从而指导白血病临床诊断和用药。
发明内容
本发明涉及一种检测白血病相关融合基因的引物和探针、试剂盒。
为了完成本发明的目的，采用的技术方案为：
一种检测白血病相关融合基因的引物和探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1～72所示。
其中：
(1)用于检测SIL-TAIL融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:1所示的上游引物，由SEQ ID NO:2所示的下游引物R1，由SEQ ID NO:68所示的下游引物R2，由SEQ ID NO:3所示的探针，其中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的5’端有HEX标记，3’端有BH1标记；
(2)用于检测E2A-HLF融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:4所示的上游引物，由SEQ ID NO:5所示的下游引物，由SEQ ID NO:6所示的探针，其中SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列的5’端有Cy5标记，3’端有BH2标记；
(3)用于检测BCR-ABL融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:7所示的上游引物F1，由SEQ IDNO:8所示的上游引物F2，由SEQ ID NO:9所示的上游引物F3，由SEQ ID NO:10所示的下游引物，由SEQID NO:11所示的探针，其中SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列的5’端有FAM标记，3’端有BH1标记；
(4)用于检测E2A-PBX1融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:4所示的上游引物,由SEQ ID NO:12所示的下游引物，由SEQ ID NO:6所示的探针，其中SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列的5’端有Cy5标记，3’端有BH2标记；
(5)用于检测MLL-AF4融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:17所示的上游引物F1，由SEQ IDNO:18所示的上游引物F2，由SEQ ID NO:13所示的下游引物R1，由SEQ ID NO:67所示的下游引物R2；由SEQ ID NO:22所示的探针P1，其中SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列的5’端有HEX标记，3’端有BH1标记，由SEQ ID NO:23所示的探针P2，其中SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列的5’端有HEX标记，3’端有BH1标记；
(6)用于检测TEL-AML1融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:14所示的上游引物，由SEQ IDNO:15所示的下游引物，由SEQ ID NO:16所示的探针，其中SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列的5’端有FAM标记，3’端有BH1标记；
(7)用于检测MLL-AF9融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:17所示的上游引物F1，由SEQ IDNO:18所示的上游引物F2，由SEQ ID NO:19所示的下游引物R1，由SEQ ID NO:20所示的下游引物R2，由SEQ ID NO:21所示的下游引物R3，由SEQ ID NO:22所示的探针P1，其中SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列的5’端有HEX标记，3’端有BH1标记，由SEQ ID NO:23所示的探针P2，其中SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列的5’端有HEX标记，3’端有BH1标记；
(8)用于检测AML1-ETO融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:24所示的上游引物，由SEQ IDNO:25所示的下游引物，由SEQ ID NO:26所示的探针，其中SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列的5’端有FAM标记，3’端有BH1标记；
(9)用于检测PML-RARa融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:27所示的上游引物F1，由SEQID NO:28所示的上游引物F2，由SEQ ID NO:29所示的上游引物F3，由SEQ ID NO:30所示的下游引物，由SEQ ID NO:31所示的探针，其中SEQ ID NO:31所示的核苷酸序列的5’端有Cy5标记，3’端有BH2标记；
(10)用于检测CBF-MYH融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:32所示的上游引物，由SEQ IDNO:33所示的下游引物R1，由SEQ ID NO:34所示的下游引物R2，由SEQ ID NO:35所示的下游引物R3，由SEQ ID NO:36所示的探针，其中SEQ ID NO:36所示的核苷酸序列的5’端有FAM标记，3’端有BH1标记；
(11)用于检测DEK-CAN融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:37所示的上游引物，由SEQ IDNO:38所示的下游引物，由SEQ ID NO:39所示的探针，其中SEQ ID NO:39所示的核苷酸序列的5’端有Cy5标记，3’端有BH2标记；
(12)用于检测NPM-MLF融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:40所示的上游引物，由SEQ IDNO:41所示的下游引物，由SEQ ID NO:42所示的探针，其中SEQ ID NO:42所示的核苷酸序列的5’端有Cy5标记，3’端有BH2标记；
(13)用于检测FIPIL1-PDGFRA融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:43所示的上游引物F1，由SEQ ID NO:44所示的上游引物F2，由SEQ ID NO:45所示的上游引物F3，由SEQ ID NO:46所示的上游引物F4，由SEQ ID NO:47所示的上游引物F5，由SEQ ID NO:48所示的下游引物，由SEQ ID NO:49所示的探针，其中SEQ ID NO:49所示的核苷酸序列的5’端有HEX标记，3’端有BH1标记；
(14)用于检测TEL-PDGFRB融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:50所示的上游引物，由SEQID NO:51所示的下游引物，由SEQ ID NO:52所示的探针，其中SEQ ID NO:52所示的核苷酸序列的5’端有FAM标记，3’端有BH1标记；
(15)用于检测AML1-MDS1融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:53所示的上游引物，由SEQID NO:54所示的下游引物R1，由SEQ ID NO:57所示的探针，其中SEQ ID NO:57所示的核苷酸序列的5’端有Cy5标记，3’端有BH2标记；
(16)用于检测MLL-AF6融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:17所示的上游引物F1，由SEQ IDNO:18所示的上游引物F2，由SEQ ID NO:58所示的下游引物，由SEQ ID NO:22所示的探针P1，其中SEQID NO:22所示的核苷酸序列的5’端有HEX标记，3’端有BH1标记，由SEQ ID NO:23所示的探针P2，其中SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列的5’端有HEX标记，3’端有BH1标记；
(17)用于检测MLL-AF10融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:17所示的上游引物F1，由SEQID NO:18所示的上游引物F2，由SEQ ID NO:59所示的下游引物R1，由SEQ ID NO:60所示的下游引物R2，由SEQ ID NO:61所示的下游引物R3，由SEQ ID NO:22所示的探针P1，其中SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列的5’端有HEX标记，3’端有BH1标记，由SEQ ID NO:23所示的探针P2，其中SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列的5’端有HEX标记，3’端有BH1标记；
(18)用于检测MLL-ELL融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:17所示的上游引物F1，由SEQ IDNO:18所示的上游引物F2，由SEQ ID NO:62所示的下游引物，由SEQ ID NO:22所示的探针P1，其中SEQID NO:22所示的核苷酸序列的5’端有HEX标记，3’端有BH1标记，由SEQ ID NO:23所示的探针P2，其中SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列的5’端有HEX标记，3’端有BH1标记；
(19)用于检测MLL-ENL融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:17所示的上游引物F1，由SEQID NO:18所示的上游引物F2，由SEQ ID NO:63所示的下游引物R1，由SEQ ID NO:64所示的下游引物R2，由SEQ ID NO:22所示的探针P1，其中SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列的5’端有HEX标记，3’端有BH1标记，由SEQ ID NO:23所示的探针P2，其中SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列的5’端有HEX标记，3’端有BH1标记；
(20)用于检测PLZF-RARa融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:65所示的上游引物，由SEQ IDNO:30所示的下游引物，由SEQ ID NO:69所示的探针，其中SEQ ID NO:69所示的核苷酸序列的5’端有FAM标记，3’端有BH1标记；
(21)用于检测STAT5B-RARa融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:66所示的上游引物，由SEQID NO:30所示的下游引物，由SEQ ID NO:69所示的探针，其中SEQ ID NO:69所示的核苷酸序列的5’端有FAM标记，3’端有BH1标记；
(22)用于检测AML1-MTG16融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:53所示的上游引物F1，由SEQ ID NO:56所示的上游引物F2，由SEQ ID NO:55所示的下游引物，由SEQ ID NO:57所示的探针，其中SEQ ID NO:57所示的核苷酸序列的5’端有Cy5标记，3’端有BH2标记。
一种检测白血病相关融合基因的引物和探针的试剂盒，包括核酸扩增试剂，所述的核酸扩增试剂包括：
表1：
其中：试剂盒的内参融合基因为：由SEQ ID NO:70所示的上游引物，由SEQ ID NO:71所示的下游引物，由SEQ ID NO:72所示的探针，其中SEQ ID NO:72所示的核苷酸序列的5’端有Cy5标记，3’端有BH2标记。
进一步优选的，试剂盒还包括对照品，所述对照品有阴性对照和阳性对照组成，所述的阴性对照为工艺用水，所述的阳性对照为质粒DNA混合液。
进一步优选的，试剂盒中RT-PCR反应液的具体组成为：
(1)检测BCR-ABL、SIL-TAL1、E2A-HLF融合基因的RT-PCR反应液1中含有：50μmol/L的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7～10各0.1μl；50μmol/L的SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:11各0.05μl；
(2)检测TEL-AML1、MLL-AF4、E2A-PBX1融合基因的RT-PCR反应液2中含有：50μmol/L的SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:12～15、SEQ ID NO:17～18、SEQ ID NO:67各0.1μl；50μmol/L的SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22～23各0.05μl；
(3)检测AML1-ETO、MLL-AF9、PML-RARa融合基因的RT-PCR反应液3中含有：50μmol/L的SEQ IDNO:17～21、SEQ ID NO:24～25、SEQ ID NO:27～30各0.1μl；50μmol/L的SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:31各0.05μl；
(4)检测MLL-AF6、MLL-AF10、MLL-ELL、MLL-ENL、PLZF、STAT5B、NPM-MLF融合基因的RT-PCR反应液4中含有：50μmol/L的SEQ ID NO:40～41、SEQ ID NO:58～64、SEQ ID NO:17～18、SEQ IDNO:65～66、SEQ ID NO:30各0.1μl；50μmol/L的SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:22～23、SEQ ID NO:69各0.05μl；
(5)检测TEL-PDGFRB、FIP1L1-PDGFRA、AML1-MDS1、AML1-MTG16融合基因的RT-PCR反应液5中含有：50μmol/L的SEQ ID NO:43～48、SEQ ID NO:50～51、SEQ ID NO:53～56各0.1μl；50μmol/L的SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:57各0.05μl；
(6)检测CBF-MYH、DEK-CAN、内参融合基因的RT-PCR反应液6中含有：50μmol/L的SEQ ID NO:32～35、SEQ ID NO:37～38、SEQ ID NO:70～71各0.1μl；50μmol/L的SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:72各0.05μl。
进一步优选的，试剂盒的具体组成为：
表2：
进一步优选的，白血病阳性对照中含有18种质粒混合液，所述质粒DNA为：
表3：
编号 质粒DNA 核苷酸序列
1 BCR-ABL-210质粒DNA SEQ ID NO:73
2 SIL-TAL1-S1bT3质粒DNA SEQ ID NO:74
3 E2A-HLF-E12H4质粒DNA SEQ ID NO:75
4 TEL-AML1-T5A2质粒DNA SEQ ID NO:76
5 MLL-AF4-M8A7质粒DNA SEQ ID NO:77
6 E2A-PBX1质粒DNA SEQ ID NO:78
7 AML1-ETO质粒DNA SEQ ID NO:79
8 MLL-AF9-M10A5质粒DNA SEQ ID NO:80
9 PML-RARA-L质粒DNA SEQ ID NO:81
10 PLZF-RARA质粒DNA SEQ ID NO:82
11 MLL-AF6-M8A2质粒DNA SEQ ID NO:83
12 NPM-MLF质粒DNA SEQ ID NO:84
13 TEL-PDGFRB质粒DNA SEQ ID NO:85
14 FIP1L1-PDGFRA-F13P12质粒DNA SEQ ID NO:86
15 AML1-MDS/EVII质粒DNA SEQ ID NO:87
16 CBFB-MYH11-A质粒DNA SEQ ID NO:88
17 DEK-CAN质粒DNA SEQ ID NO:89
18 内参质粒DNA SEQ ID NO:90
下面对本发明的内容做进一步的解释和说明：
在工艺设计中，本发明对PCR扩增体系做了优化，接着又对实验样本的用量、反应体积以及抽提方法进行优化，保证在抽取病人样本最少的前提下，最大程度地对白血病病人骨髓中相关融合基因的转录本进行检测。
本发明还对试剂盒进行了稳定性试验，包括常规稳定性、开盖稳定性和运输稳定性试验，根据实验结果确定了试剂盒的有效期。本发明的试剂盒可以辅助进行临床确诊、治疗方案确定、疗效评价及预后判断：近两年白血病分子特征的研究取得了明显进展，尤其是对染色体易位形成融合基因，有一些已作为诊断不同类型白血病的分子生物学特异性标志和确定诊断的唯一依据，如急性早幼粒细胞白血病APL：PML/RARA，t(15；17)(q21；q22)；急性髓细胞白血病AML-M4Eo：CBFB/MYH11,inv(16)(p13；q22)；慢性粒细胞白血病CML或部分急性淋巴细胞白血病ALL：BCR/ABL，t(9；22)(q34；q11)；AML-M2：AML1/ETO，t(8；21)(q22；q22)；ALL-L3：MYC/IgH，t(8；14)(q24；q32)；AML-M4/M5：11q23MLL异常等，因此对这些融合基因的检测有助于临床对白血病病人的确诊，确定合适的化疗方案，从而进行疗效评价并有助于临床医生获得对患者预后判断的信息。
本发明的试剂盒还可辅助进行复发检测：经过化疗或移植，大部分病人可以得到临床缓解，但由于最小残余病灶(MRD)的存在，所有的病人都面临着复发的风险，本试剂盒可以对MRD进行有效的监测，有助于临床医生在分子生物学水平对复发进行早期的干预性治疗，延后复发，使病人获得一个长期的无病生存期。
本发明的试剂盒中包括BCR-ABL、SIL-TAL1、E2A-HLF、TEL-AML1、MLL-AF4、TEL-AML1、E2A-PBX1、AML1-ETO、MLL-AF9、PML-RARa、MLL-AF6、MLL-AF10、MLL-ELL、MLL-ENL、PLZF、STAT5B、NPM-MLF、TEL-PDGFRB、FIP1L1-PDGFRA、AML1-MDS1、CBF-MYH、DEK-CAN共22种阳性质粒的准确性质控品样本，其阳性符合率为100％。
具体的：本发明的试剂盒中：
1.检测SIL-TAL1融合基因的引物和探针的序列为：
表4：
2.检测E2A-HLF融合基因的引物和探针的序列为：
表5：
SEQ ID NO 名称 序列 碱基数 修饰
4 E2A-F AGGTTTCACCGGCCCCAT 18
5 E2A-HLF-R TGGCTGCCATGTTGTTCTTT 20
6 E2A-P ACTGGGCGGGCGGCACGCAGG 21 5‘-Cy5,3'-BH2
3.检测BCR-ABL融合基因的引物和探针的序列为：
表6：
SEQ ID NO 名称 序列 碱基数 修饰
7 BCR-ABL-F1 CTggCCCAACgATggCgA 18
8 BCR-ABL-F2 TCCgCTgACCATCAATAAggA 21
9 BCR-ABL-F3 TggAggAggTgggCATCTAC 20
10 BCR-ABL-R CACTCAgACCCTgAggCTCAA 21
11 BCR-ABL-P CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGA 25 5‘-FAM,3'-BH1
4.检测TEL-AML1融合基因的的引物和探针的序列为:
表7：
SEQ ID NO 名称 序列 碱基数 修饰
14 TEL-AML1-F CTCTGTCTCCCCGCCTGAA 19
15 TEL-AML1-R CGGCTCGTGCTGGCAT 16
16 TEL-AML1-P TCCCAATGGGCATGGCGTGC 20 5‘-FAM,3'-BH1
5.MLL-AF4融合基因的的引物和探针的序列为:
表8：
SEQ ID NO 名称 序列 碱基数 修饰
17 MLL-F1 CGCCTCAGCCACCTACTAC 19
18 MLL-F2 GAGAATGCAGGCACTTTGA 19
13 MLL-AF4-R GAAAGGAAACTTGGATGGCTCA 22
67 MLL-AF4-R1 GAGCATGGATGACGTTCCTT 20
22 MLL-P1 CGCCAAGAAAAGAAGTTCCCAAAACC 26 5‘-HEX,3'-BH1
23 MLL-P2 CCTCAGCACTCTCTCCAATGGCAATA 26 5‘-HEX,3'-BH1
6.E2A-PBX1融合基因的的引物和探针的序列为:
表9：
SEQ ID NO 名称 序列 碱基数 修饰
4 E2A-F AGGTTTCACCGGCCCCAT 18
12 E2A-PBX1-R GGGCTCCTCGGATACTCAAAA 21
6 E2A-P ACTGGGCGGGCGGCACGCAGG 21 5‘-Cy5,3'-BH2
7.检测AML1-ETO融合基因的的引物和探针的序列为:
表10：
8.MLL-AF9融合基因的的引物和探针的序列为:
表11：
9.PML-RARa融合基因的的引物和探针的序列为:
表12：
SEQ ID NO 名称 序列 碱基数 修饰
27 PML-RARa-F1 TCTTCCTGCCCAACAGCAA 19
28 PML-RARa-F2 ACCTGGATGGACCGCCTAG 19
29 PML-RARa-F3 CCGATGGCTTCGACGAGTT 19
30 RARa-R GCTTGTAGATGCGGGGTAGAG 21
31 RARa-P AGTGCCCAGCCCTCCCTCGC 20 5‘-Cy5,3'-BH2
10.检测MLL-AF6融合基因的的引物和探针的序列为:
表13：
SEQ ID NO 名称 序列 碱基数 修饰
17 MLL-F1 CGCCTCAGCCACCTACTAC 19
18 MLL-F2 GAGAATGCAGGCACTTTGA 19
58 AF6-R CACTCCATGGAACTCCAA 18
22 MLL-P1 CGCCAAGAAAAGAAGTTCCCAAAACC 26 5‘-HEX,3'-BH1
23 MLL-P2 CCTCAGCACTCTCTCCAATGGCAATA 26 5‘-HEX,3'-BH1
11.检测MLL-AF10融合基因的的引物和探针的序列为:
表14：
SEQ ID NO 名称 序列 碱基数 修饰
17 MLL-F1 CGCCTCAGCCACCTACTAC 19
18 MLL-F2 GAGAATGCAGGCACTTTGA 19
59 AF10-R1 CATCCTTATGGGGACAAA 18
60 AF10-R2 CTTCCAAGCGCTTCAATGAT 20
61 AF10-R3 GCGGCTATTGTCTCCAAGA 19
22 MLL-P1 CGCCAAGAAAAGAAGTTCCCAAAACC 26 5‘-HEX,3'-BH1
23 MLL-P2 CCTCAGCACTCTCTCCAATGGCAATA 26 5‘-HEX,3'-BH1
12.检测MLL-ELL融合基因的的引物和探针的序列为:
表15：
SEQ ID NO 名称 序列 碱基数 修饰
17 MLL-F1 CGCCTCAGCCACCTACTAC 19
18 MLL-F2 GAGAATGCAGGCACTTTGA 19
62 ELL-R AAATCGGATAGATGGCCTC 19
22 MLL-P1 CGCCAAGAAAAGAAGTTCCCAAAACC 26 5‘-HEX,3'-BH1
23 MLL-P2 CCTCAGCACTCTCTCCAATGGCAATA 26 5‘-HEX,3'-BH1
13.检测MLL-ENL融合基因的的引物和探针的序列为:
表16：
SEQ ID NO 名称 序列 碱基数 修饰
17 MLL-F1 CGCCTCAGCCACCTACTAC 19
18 MLL-F2 GAGAATGCAGGCACTTTGA 19
63 ENL-R1 CCCAGCTCTAACCTCACCTG 20
64 ENL-R2 AGCTGGAGTCTGAGCTGGAG 20
22 MLL-P1 CGCCAAGAAAAGAAGTTCCCAAAACC 26 5‘-HEX,3'-BH1
23 MLL-P2 CCTCAGCACTCTCTCCAATGGCAATA 26 5‘-HEX,3'-BH1
14.检测PLZF-RARa融合基因的的引物和探针的序列为:
表17：
SEQ ID NO 名称 序列 碱基数 修饰
65 PLZF-F1 GGATAGTTTGCGGCTGAGAA 20
30 RARa-R GCTTGTAGATGCGGGGTAGAG 21
69 RARa-P-F AGTGCCCAGCCCTCCCTCGC 20 5‘-FAM,3'-BH1
15.检测STAT5B-RARa融合基因的的引物和探针的序列为:
表18：
SEQ ID NO 名称 序列 碱基数 修饰
66 STAT5B-F TAACAAGCCAGATGGGACCT 20
30 RARa-R GCTTGTAGATGCGGGGTAGAG 21
69 RARa-P-F AGTGCCCAGCCCTCCCTCGC 20 5‘-FAM,3'-BH1
16.检测NPM-MLF融合基因的的引物和探针的序列为:
表19：
SEQ ID NO 名称 序列 碱基数 修饰
40 NPM-MLF-F GGAGGAAGATGCAGAGTCAGA 21
41 NPM-MLF-R TTTCTCGGTGTGCAAGAATG 20
42 NPM-MLF-P GAGGTGGTAGCAAGGTTCCA 20 5‘-Cy5,3'-BH2
17.检测TEL-PDGFRB融合基因的的引物和探针的序列为:
表20：
SEQ ID NO 名称 序列 碱基数 修饰
50 TEL-PDGFRB-F ACACAGCCGGAGGTCATACT 20
51 PDGFRB-R GGATCTCGTAACGTGGCTTC 20
52 PDGFRB-P ATCATCTCCCTTATCATCCTCATC 24 5‘-FAM,3'-BH1
18.FIP1L1-PDGFRA融合基因的的引物和探针的序列为:
表21：
19.AML1-MDS1融合基因的的引物和探针的序列为:
表22：
SEQ ID NO 名称 序列 碱基数 修饰
53 AML1-MDS1-F GGGAAAAGCTTCACTCTGACC 21
54 AML1-MDS1-R1 TCTGGCATTTCTTCCAAAGG 20
57 AML1-MDS1-P CCTACCACAGAGCCATCAAAATCAC 25 5‘-Cy5,3'-BH2
20.检测CBF-MYH融合基因的的引物和探针的序列为:
表23：
SEQ ID NO 名称 序列 碱基数 修饰
32 CBF-MYH-F CATTAGCACAACAGGCCTTTGA 22
33 CBF-MYH-R1 AGGGCCCGCTTGGACTT 17
34 CBF-MYH-R2 CCTCGTTAAGCATCCCTGTGA 21
35 CBF-MYH-R3 CTCTTTCTCCAGCGTCTGCTTAT 23
36 CBF-MYH-P TCGCGTGTCCTTCTCCGAGCCT 22 5‘-FAM,3'-BH1
21.DEK-CAN融合基因的的引物和探针的序列为：
表24：
SEQ ID NO 名称 序列 碱基数 修饰
37 DEK-CAN-F GGAAGAAGTCACAATGAAACA 21
38 DEK-CAN-R CATCATTCACATCTTGGACAGCA 23
39 DEK-CAN-P TTGCAAAAAGGAAATTCGGCGCC 23 5‘-HEX,3'-BH1
22.AML1-MTG16融合基因的引物和探针的序列为：
表25：
SEQ ID NO 名称 序列 碱基数 修饰
53 AML1-MDS1-F GGGAAAAGCTTCACTCTGACC 21
55 AML1-MDS1-R2 GCCTTAGCTTTCCTGTCC 18
56 AML1-MDS1-R3 CATTGATGGCTGTTGGTGAG 20
57 AML1-MDS1-P CCTACCACAGAGCCATCAAAATCAC 25 5‘-Cy5,3'-BH2
23.内参的引物和探针的序列为：
表26：
SEQ ID NO 名称 序列 碱基数 修饰
70 内参-F TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT 31
71 内参-R GATGTAGTTGCTTGGGACCCA 21
72 内参-P CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT 28 5‘-Cy5,3'-BH2
本发明试剂盒检测包括上述22种相关融合基因阴性的外周血细胞裂解物，22种相关融合基因阴性的细胞株裂解物特异性质控品样本，其阴性符合率为100％。
本发明的试剂盒能从抗凝骨髓提取的RNA转录cDNA中检测相关融合基因，最低检出量达到1000拷贝/反应。
本发明的试剂盒对各精密度质控品，在相应的反应液中重复做10次，均能检出，且其实验数据CV值≦5％。
本发明的试剂盒中的引物和探针的设计过程中，对部分融合基因的同源区域的引物或探针进行了合并使用，从而减少了引物和探针的合成数量，降低了试剂盒的成本。
本发明的具体实施例方式仅对本发明的内容作出解释和说明，并不限制本发明的内容。所用试剂均为市售试剂，所用仪器为实验室常规仪器。
具体实施方式
实施例1
1.试剂盒的组成：
表27：
其中：
PCR反应液1中含有：0.1μl 50μmol/L SIL-TAIL-F，0.1μl 50μmol/L SIL-TAIL-R，0.1μl 50μmol/LSIL-TAIL-R1，0.05μl 50μmol/L SIL-TAIL-P，0.1μl 50μmol/L E2A-F，0.1μl 50μmol/L E2A-HLF-R,0.05μl 50μmol/L E2A-P,0.1μl 50μmol/L BCR-ABL-F1，0.1μl 50μmol/L BCR-ABL-F2，0.1μl 50μmol/L BCR-ABL-F3，0.1μl 50μmol/L BCR-ABL-R，0.05μl 50μmol/L BCR-ABL-P；
PCR反应液2中含有：0.1μl 50μmol/L E2A-F，0.1μl 50μmol/L E2A-PBX1-R，0.05μl 50μmol/L E2A-P，0.1μl 50μmol/L MLL-F1，0.1μl 50μmol/L MLL-F2，0.1μl 50μmol/L MLL-AF4-R,0.1μl 50μmol/LMLL-AF4-R1，0.05μl 50μmol/L MLL-P1，0.05μl 50μmol/L MLL-P2，0.1μl 50μmol/L TEL-AML1-F，0.1μl50μmol/L TEL-AML1-R，0.05μl 50μmol/L TEL-AML1-P；
PCR反应液3中含有：0.1μl 50μmol/L MLL-F1，0.1μl 50μmol/L MLL-F2，0.1μl 50μmol/L MLL-AF9-R1，0.1μl 50μmol/L MLL-AF9-R2，0.1μl 50μmol/L MLL-AF9-R3，0.05μl 50μmol/L MLL-P1,0.05μl 50μmol/LMLL-P2,0.1μl 50μmol/L AML1-ETO-F，0.1μl 50μmol/L AML1-ETO-R，0.05μl 50μmol/L AML1-ETO-P，0.1μl 50μmol/L PML-RARa-F1，0.1μl 50μmol/L PML-RARa-F2，0.1μl 50μmol/L PML-RARa-F3，0.1μl 50μmol/L RARa-R，0.05μl 50μmol/L RARa-P；
PCR反应液4中含有：0.1μl 50μmol/L NPM-MLF-F，0.1μl 50μmol/L NPM-MLF-R，0.05μl 50μmol/LNPM-MLF-P，0.1μl 50μmol/L MLL-F1，0.1μl 50μmol/L MLL-F2，0.1μl 50μmol/L AF6-R,0.1μl 50μmol/LAF10-R1,0.1μl 50μmol/L AF10-R2，0.1μl 50μmol/L AF10-R3，0.1μl 50μmol/L ELL-R，0.1μl 50μmol/LENL-R1，0.1μl 50μmol/L ENL-R2，0.05μl 50μmol/L MLL-P1，0.05μl 50μmol/L MLL-P2，0.1μl 50μmol/LPLZF-F1，0.1μl 50μmol/L STAT5B-F，0.1μl 50μmol/L RARa-R,0.05μl 50μmol/L RARA-P-F；
PCR反应液5中含有：0.1μl 50μmol/L FIP1L1-PDGFRA-F1，0.1μl 50μmol/L FIP1L1-PDGFRA-F2，0.1μl50μmol/L FIP1L1-PDGFRA-F3，0.1μl 50μmol/L FIP1L1-PDGFRA-F4，0.1μl 50μmol/L FIP1L1-PDGFRA-F5，0.1μl 50μmol/L FIP1L1-PDGFRA-R1，0.05μl 50μmol/L FIP1L1-PDGFRA-P，0.1μl 50μmol/LTEL-PDGFRB-F，0.1μl 50μmol/L TEL-PDGFRB-R，0.05μl 50μmol/L TEL-PDGFRB-P，0.1μl 50μmol/LAML1-MDS1-F，0.1μl 50μmol/L AML1-MDS1-R1，0.1μl 50μmol/L AML1-MDS1-R2，0.1μl 50μmol/LAML1-MDS1-R3，0.05μl 50μmol/L AML1-MDS1-P；
PCR反应液6中含有：0.1μl 50μmol/L CBF-MYH-F，0.1μl 50μmol/L CBF-MYH-R1，0.1μl 50μmol/LCBF-MYH-R2，0.1μl 50μmol/L CBF-MYH-R3，0.05μl 50μmol/L CBF-MYH-P，0.1μl 50μmol/L DEK-CAN-F，0.1μl 50μmol/L DEK-CAN-R，0.05μl 50μmol/L DEK-CAN-P，0.1μl 50μmol/L内参-F，0.1μl 50μmol/L内参-R，0.05μl 50μmol/L内参-P；
MIX 3中含有：5U/μl的Taq酶1.2μl、5×buffer 30μl、1U/μl的UNG酶0.3μl、20～200μM的dNTP 0.6μl,30μl的5×buffer(包含375mM的KCl、250mM的Tris-HCl、50mM的DTT)、MgCl21.0～4.0mM。
白血病阳性对照中含有：含18种质粒DNA混合液。
表28：
质粒名称 质粒浓度 体积(μl)
BCR-ABL-210质粒DNA 20ng/ml 55ul
SIL-TAL1-S1bT3质粒DNA 20ng/ml 55ul
E2A-HLF-E12H4质粒DNA 20ng/ml 55ul
TEL-AML1-T5A2质粒DNA 20ng/ml 55ul
MLL-AF4-M8A7质粒DNA 20ng/ml 55ul
E2A-PBX1质粒DNA 20ng/ml 55ul
AML1-ETO质粒DNA 20ng/ml 55ul
MLL-AF9-M10A5质粒DNA 20ng/ml 55ul
PML-RARA-L质粒DNA 20ng/ml 55ul
PLZF-RARA质粒DNA 20ng/ml 55ul
MLL-AF6-M8A2质粒DNA 20ng/ml 55ul
NPM-MLF质粒DNA 20ng/ml 55ul
TEL-PDGFRB质粒DNA 20ng/ml 55ul
FIP1L1-PDGFRA-F13P12质粒DNA 20ng/ml 55ul
AML1-MDS/EVII质粒DNA 20ng/ml 55ul
CBFB-MYH11-A质粒DNA 20ng/ml 55ul
DEK-CAN质粒DNA 20ng/ml 55ul
内参质粒DNA 20ng/ml 55ul
2.使用方法：
2.1.仪器：适用于BIO-RAD CFX96等具有FAM,CY5和HEX/VIC同步荧光检测系统的荧光PCR仪。
2.2 样本：
本发明的试剂盒适用于抗凝骨髓样本。
样本保存：取抗凝骨髓样本200μl，用600ul Trizol混匀，保存时限4℃不超过24小时。长期保存在-20℃，储存年限在5年以内，且反复冻融次数不超过10次。
样本运输：保存在Trizol骨髓抗凝样本4℃，低温运输。
抽提RNA要求：使用Rneasy Mini kit试剂盒抽提。或者采用Trizol方法抽提。提取完的RNA建议立即进行检测，否则短期于-20℃以下保存，长期于-80℃保存。
样本要求：样本所提取的RNA需经公司配套“人体组织RNA质量检测试剂盒”检测后，内参PCR反应液CT值≤30，方可适用。
2.3 检验方法
2.3.1 样本处理
采用Rneasy Mini kit试剂盒提取RNA核酸，取保存在Trizol里的标本400ul，加入400μl氯仿，混匀，室温放置5分钟。15000rpm离心10分钟，离心后吸取无色上清液，加入等体积的buffer RLT，混匀，余下具体步骤参见Rneasy Mini kit说明书。阴性对照与标本同时处理。
或者用Trizol方法抽提RNA，具体步骤如下：
①取保存在Trizol里的标本400μl，加入400ul氯仿，混匀，室温放置5分钟。15000rpm离心10分钟，离心后吸取无色上清液；
②在上述上清中加入等体积预冷的异丙醇，颠倒混匀后室温放置10分钟。15000rpm离心10分钟，吸弃上清；
③在上述离心管中，加入300ul预冷的70％乙醇，15000rpm离心5分钟，吸弃上清。室温10分钟，使乙醇挥发。
加入50ul DEPC-ddH2O混匀溶解，以此作为相关PCR反应的模板。
2.3.2 样本浓度确定：
将上述处理好的样本，用苏州云泰生物医药科技有限公司配套“人体组织RNA质量检测试剂盒”进行检测，实验步骤具体参阅该试剂盒说明书。只有当样本RNA在“人体组织RNA质量检测试剂盒”的内参PCR反应液中，其检测CT值≤30时，则该样本RNA的转录产物cDNA进入下列融合基因的相关检测。
2.3.3.扩增试剂准备：
从试剂盒中取出各种反应液及MIX3，室温融化并振荡混匀后，短暂离心数秒，各PCR反应液体系1人份均按如下配制：7ul PCR反应液+13ulMIX3(PCR管数应为样本数、1个阴性对照及1个白血病阳性对照之和)。
将上述配制好的PCR预混液，分别按每管20μl的量，分装于各PCR管内。
cDNA液的配制：经苏州云泰生物医药科技有限公司的“人体组织RNA质量检测试剂盒”转录，并经过内参基因检测后的剩余cDNA中加入阴性对照40ul混合。
2.3.4 加样：
从样本(包括阴性对照、阳性对照)cDNA液中分别取5ul，加至装有上述相应PCR预混液的PCR管中，盖紧管盖、将其移至检测区。具体见表29：
表29：
2.3.5 PCR扩增：
2.3.5.1 扩增条件设定：
表30：
反应体系为25ul。
2.3.5.2 检测通道设定
表31：
2.3.5.3 参比荧光设定
表32：
机型 参比荧光设定
BIO-RAD CFX96 /
3.检测：
(1)基线的确定：软件默认设定3-15个循环的平均荧光信号为基线。在实验中，一般选择曲线波动较小，
较稳定的那段作为基线，用户可根据实际情况自行酌情调整。起点要避开开始几个循环由于高温导致的信号增高，设在信号已经降到背景高度且能维持平稳的地方，终点要避免覆盖信号已经开始有明显增长的地方。依据实验曲线走势的不同，一般start值可选择在3-12之间；stop值选择以起点与终点之间最好能间隔8个循环以上为原则，以更好满足统计基线标准偏差的数学要求。
(2)阈值的确定：在阴性对照无扩增的情况下，阈值设定在无扩增曲线样本的最高点，即高于无扩增增长曲线(即在结果分析“Component”栏中无柺点出现)的最高点，且阴性对照未检出为原则，确定起始阈值。
3.1 有效性判定：试剂盒相关组份必须符合下列要求，否则视为实验无效。
表33：
3.2 结果判定：
先分析样本在PCR反应液6中的CY5通道(即内参基因)，CT值是否≤30，对符合上述要求的样本再进行下列相关融合基因的分析。因不同反应液、不同荧光通道检测不同的融合基因，因此，每个样本在分析中，必须逐一对不同的反应液、同一反应液中的不同通道分别分析，即必须逐一将样本、阳性对照、阴性对照同时分析其在各个反应液中的三种荧光扩增曲线。
表34：判定标准：
实施例2：
取不同白血病确诊病人样本1～15，采用实施例1的试剂盒和检测方法进行检测，检测结果如表35所示：
表35：
本发明的检测结果与确诊结果和测序结果一致。

Claims (8)

1.一种检测白血病相关融合基因的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:1～72所示。
2.根据权利要求1所述的检测白血病相关融合基因的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针的核苷酸序列为：
(1)用于检测SIL-TAIL融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:1所示的上游引物，由SEQ ID NO:2所示的下游引物R1，由SEQ ID NO:68所示的下游引物R2，由SEQ ID NO:3所示的探针，其中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的5’端有HEX标记，3’端有BH1标记；
(2)用于检测E2A-HLF融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:4所示的上游引物，由SEQ ID NO:5所示的下游引物，由SEQ ID NO:6所示的探针，其中SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列的5’端有Cy5标记，3’端有BH2标记；
(3)用于检测BCR-ABL融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:7所示的上游引物F1，由SEQ ID NO:8所示的上游引物F2，由SEQ ID NO:9所示的上游引物F3，由SEQ ID NO:10所示的下游引物，由SEQ IDNO:11所示的探针，其中SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列的5’端有FAM标记，3’端有BH1标记；
(4)用于检测E2A-PBX1融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:4所示的上游引物,由SEQ ID NO:12所示的下游引物，由SEQ ID NO:6所示的探针，其中SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列的5’端有Cy5标记，3’端有BH2标记；
(5)用于检测MLL-AF4融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:17所示的上游引物F1，由SEQ ID NO:18所示的上游引物F2，由SEQ ID NO:13所示的下游引物R1，由SEQ ID NO:67所示的下游引物R2；由SEQID NO:22所示的探针P1，其中SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列的5’端有HEX标记，3’端有BH1标记，由SEQ ID NO:23所示的探针P2，其中SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列的5’端有HEX标记，3’端有BH1标记；
(6)用于检测TEL-AML1融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:14所示的上游引物，由SEQ ID NO:15所示的下游引物，由SEQ ID NO:16所示的探针，其中SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列的5’端有FAM标记，3’端有BH1标记；
(7)用于检测MLL-AF9融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:17所示的上游引物F1，由SEQ ID NO:18所示的上游引物F2，由SEQ ID NO:19所示的下游引物R1，由SEQ ID NO:20所示的下游引物R2，由SEQ ID NO:21所示的下游引物R3，由SEQ ID NO:22所示的探针P1，其中SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列的5’端有HEX标记，3’端有BH1标记，由SEQ ID NO:23所示的探针P2，其中SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列的5’端有HEX标记，3’端有BH1标记；
(8)用于检测AML1-ETO融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:24所示的上游引物，由SEQ ID NO:25所示的下游引物，由SEQ ID NO:26所示的探针，其中SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列的5’端有FAM标记，3’端有BH1标记；
(9)用于检测PML-RARa融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:27所示的上游引物F1，由SEQ IDNO:28所示的上游引物F2，由SEQ ID NO:29所示的上游引物F3，由SEQ ID NO:30所示的下游引物，由SEQ ID NO:31所示的探针，其中SEQ ID NO:31所示的核苷酸序列的5’端有Cy5标记，3’端有BH2标记；(10)用于检测CBF-MYH融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:32所示的上游引物，由SEQ ID NO:33所示的下游引物R1，由SEQ ID NO:34所示的下游引物R2，由SEQ ID NO:35所示的下游引物R3，由SEQID NO:36所示的探针，其中SEQ ID NO:36所示的核苷酸序列的5’端有FAM标记，3’端有BH1标记；
(11)用于检测DEK-CAN融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:37所示的上游引物，由SEQ ID NO:38所示的下游引物，由SEQ ID NO:39所示的探针，其中SEQ ID NO:39所示的核苷酸序列的5’端有Cy5标记，3’端有BH2标记；
(12)用于检测NPM-MLF融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:40所示的上游引物，由SEQ ID NO:41所示的下游引物，由SEQ ID NO:42所示的探针，其中SEQ ID NO:42所示的核苷酸序列的5’端有Cy5标记，3’端有BH2标记；
(13)用于检测FIPIL1-PDGFRA融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:43所示的上游引物F1，由SEQID NO:44所示的上游引物F2，由SEQ ID NO:45所示的上游引物F3，由SEQ ID NO:46所示的上游引物F4，由SEQ ID NO:47所示的上游引物F5，由SEQ ID NO:48所示的下游引物，由SEQ ID NO:49所示的探针，其中SEQ ID NO:49所示的核苷酸序列的5’端有HEX标记，3’端有BH1标记；
(14)用于检测TEL-PDGFRB融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:50所示的上游引物，由SEQ IDNO:51所示的下游引物，由SEQ ID NO:52所示的探针，其中SEQ ID NO:52所示的核苷酸序列的5’端有FAM标记，3’端有BH1标记；
(15)用于检测AML1-MDS1融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:53所示的上游引物，由SEQ IDNO:54所示的下游引物R1，由SEQ ID NO:57所示的探针，其中SEQ ID NO:57所示的核苷酸序列的5’端有Cy5标记，3’端有BH2标记；
(16)用于检测MLL-AF6融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:17所示的上游引物F1，由SEQ ID NO:18所示的上游引物F2，由SEQ ID NO:58所示的下游引物，由SEQ ID NO:22所示的探针P1，其中SEQ IDNO:22所示的核苷酸序列的5’端有HEX标记，3’端有BH1标记，由SEQ ID NO:23所示的探针P2，其中SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列的5’端有HEX标记，3’端有BH1标记；
(17)用于检测MLL-AF10融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:17所示的上游引物F1，由SEQ IDNO:18所示的上游引物F2，由SEQ ID NO:59所示的下游引物R1，由SEQ ID NO:60所示的下游引物R2，由SEQ ID NO:61所示的下游引物R3，由SEQ ID NO:22所示的探针P1，其中SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列的5’端有HEX标记，3’端有BH1标记，由SEQ ID NO:23所示的探针P2，其中SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列的5’端有HEX标记，3’端有BH1标记；
(18)用于检测MLL-ELL融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:17所示的上游引物F1，由SEQ IDNO:18所示的上游引物F2，由SEQ ID NO:62所示的下游引物，由SEQ ID NO:22所示的探针P1，其中SEQID NO:22所示的核苷酸序列的5’端有HEX标记，3’端有BH1标记，由SEQ ID NO:23所示的探针P2，其中SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列的5’端有HEX标记，3’端有BH1标记；
(19)用于检测MLL-ENL融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:17所示的上游引物F1，由SEQ IDNO:18所示的上游引物F2，由SEQ ID NO:63所示的下游引物R1，由SEQ ID NO:64所示的下游引物R2，由SEQ ID NO:22所示的探针P1，其中SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列的5’端有HEX标记，3’端有BH1标记，由SEQ ID NO:23所示的探针P2，其中SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列的5’端有HEX标记，3’端有BH1标记；
(20)用于检测PLZF-RARa融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:65所示的上游引物，由SEQ ID NO:30所示的下游引物，由SEQ ID NO:69所示的探针，其中SEQ ID NO:69所示的核苷酸序列的5’端有FAM标记，3’端有BH1标记；
(21)用于检测STAT5B-RARa融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:66所示的上游引物，由SEQ IDNO:30所示的下游引物，由SEQ ID NO:69所示的探针，其中SEQ ID NO:69所示的核苷酸序列的5’端有FAM标记，3’端有BH1标记；
(22)用于检测AML1-MTG16融合基因的引物和探针为：由SEQ ID NO:53所示的上游引物F1，由SEQID NO:56所示的上游引物F2，由SEQ ID NO:55所示的下游引物，由SEQ ID NO:57所示的探针，其中SEQID NO:57所示的核苷酸序列的5’端有Cy5标记，3’端有BH2标记。
3.一种含有权利要求1或2任一权利要求所述检测白血病相关融合基因的引物和探针的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括核酸扩增试剂，所述的核酸扩增试剂包括：
4.根据权利要求3所述的检测白血病相关融合基因的引物和探针的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的内参融合基因为：由SEQ ID NO:70所示的上游引物，由SEQ ID NO:71所示的下游引物，由SEQ ID NO:72所示的探针，其中SEQ ID NO:72所示的核苷酸序列的5’端有Cy5标记，3’端有BH2标记。
5.根据权利要求3所述的检测白血病相关融合基因的引物和探针的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括对照品，所述对照品有阴性对照和阳性对照组成，所述的阴性对照为工艺用水，所述的阳性对照为质粒DNA混合液。
6.根据权利要求3所述的检测白血病相关融合基因的引物和探针的试剂盒，其特征在于，
(1)检测BCR-ABL、SIL-TAL1、E2A-HLF融合基因的RT-PCR反应液1中含有：50μmol/L的SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7～10各0.1μl；50μmol/L的SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:11各0.05μl；
(2)检测TEL-AML1、MLL-AF4、E2A-PBX1融合基因的RT-PCR反应液2中含有：50μmol/L的SEQID NO:4、SEQ ID NO:12～15、SEQ ID NO:17～18、SEQ ID NO:67各0.1μl；50μmol/L的SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22～23各0.05μl；
(3)检测AML1-ETO、MLL-AF9、PML-RARa融合基因的RT-PCR反应液3中含有：50μmol/L的SEQID NO:17～21、SEQ ID NO:24～25、SEQ ID NO:27～30各0.1μl；50μmol/L的SEQ ID NO:22、SEQID NO:23、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:31各0.05μl；
(4)检测MLL-AF6、MLL-AF10、MLL-ELL、MLL-ENL、PLZF、STAT5B、NPM-MLF融合基因的RT-PCR反应液4中含有：50μmol/L的SEQ ID NO:40～41、SEQ ID NO:58～64、SEQ ID NO:17～18、SEQ ID NO:65～66、SEQ ID NO:30各0.1μl；50μmol/L的SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:22～23、SEQ ID NO:69各0.05μl；
(5)检测TEL-PDGFRB、FIP1L1-PDGFRA、AML1-MDS1、AML1-MTG16融合基因的RT-PCR反应液5中含有：50μmol/L的SEQ ID NO:43～48、SEQ ID NO:50～51、SEQ ID NO:53～56各0.1μl；50μmol/L的SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:57各0.05μl；
(6)检测CBF-MYH、DEK-CAN、内参融合基因的RT-PCR反应液6中含有：50μmol/L的SEQ IDNO:32～35、SEQ ID NO:37～38、SEQ ID NO:70～71各0.1μl；50μmol/L的SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:72各0.05μl。
7.根据权利要求3所述的检测白血病相关融合基因的引物和探针的试剂盒，其特征在于，
8.根据权利要求7所述的检测白血病相关融合基因的引物和探针的试剂盒，其特征在于，所述的白血病阳性对照中含有18种质粒混合液，所述质粒DNA如下：BCR-ABL-210质粒DNA、SIL-TAL1-S1bT3质粒DNA、E2A-HLF-E12H4质粒DNA、TEL-AML1-T5A2质粒DNA、MLL-AF4-M8A7质粒DNA、E2A-PBX1质粒DNA、AML1-ETO质粒DNA、MLL-AF9-M10A5质粒DNA、PML-RARA-L质粒DNA、PLZF-RARA质粒DNA、MLL-AF6-M8A2质粒DNA、NPM-MLF质粒DNA、TEL-PDGFRB质粒DNA、FIP1L1-PDGFRA-F13P12质粒DNA、AML1-MDS/EVII质粒DNA、CBFB-MYH11-A质粒DNA、DEK-CAN质粒DNA、内参质粒DNA。
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Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105803087A (zh) * 2016-04-29 2016-07-27 广州蓝吉生物技术有限公司 一种检测融合基因MLL-ENL mRNA表达的试剂盒及其应用
CN107345244A (zh) * 2016-10-12 2017-11-14 深圳市儿童医院 检测白血病tel‑aml1融合基因的方法、引物及试剂盒
CN108676848A (zh) * 2018-05-31 2018-10-19 上海科医联创医学检验所有限公司 用于检测融合基因的混合基因、标准质粒、试剂盒及其制备方法
CN110724741A (zh) * 2019-07-24 2020-01-24 艾普拜生物科技(苏州)有限公司 一种检测微小残留白血病相关融合基因的引物、探针及其试剂盒
CN111118123A (zh) * 2020-02-09 2020-05-08 苏州健雄职业技术学院 一种高灵敏度的dek／can融合基因检测试剂盒
CN112280866A (zh) * 2020-11-24 2021-01-29 福州艾迪康医学检验所有限公司 荧光定量pcr技术筛查急性早幼粒细胞白血病相关14种融合基因的方法、引物及探针
CN112301129A (zh) * 2020-11-05 2021-02-02 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 Bcr-abl融合基因检测试剂盒和bcr-abl融合基因检测方法
CN113943816A (zh) * 2021-12-03 2022-01-18 郑州思勤生物科技有限公司 核酸组合物、试剂盒以及其用途
WO2022041424A1 (zh) * 2020-08-26 2022-03-03 苏州卫生职业技术学院 一种检测pml-rara融合基因的lamp引物组、试剂盒及检测方法
CN115992228A (zh) * 2022-07-19 2023-04-21 领航基因科技（杭州）有限公司 检测急性髓系白血病相关的融合基因的引物和探针及其应用、试剂盒

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102827937A (zh) * 2012-09-06 2012-12-19 上海源奇生物医药科技有限公司 一种检测白血病相关融合基因的引物和探针、及其试剂盒
CN103937891A (zh) * 2014-04-16 2014-07-23 苏州大学 一种检测白血病融合基因的多重pcr试剂盒
CN104178557A (zh) * 2013-05-28 2014-12-03 上海生物芯片有限公司 白血病融合基因的检测方法及其引物、探针和基因芯片

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102827937A (zh) * 2012-09-06 2012-12-19 上海源奇生物医药科技有限公司 一种检测白血病相关融合基因的引物和探针、及其试剂盒
CN104178557A (zh) * 2013-05-28 2014-12-03 上海生物芯片有限公司 白血病融合基因的检测方法及其引物、探针和基因芯片
CN103937891A (zh) * 2014-04-16 2014-07-23 苏州大学 一种检测白血病融合基因的多重pcr试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J GABERT ET AL.: "Standardization and quality control studies of ‘real-time’ quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia – A Europe Against Cancer Program", 《LEUKEMIA》, vol. 17, 9 October 2003 (2003-10-09), pages 2318 - 2357, XP 002402743 *
SALIL VANIAWALA ET AL.: "Rare e14a3 (b3a3) BCR-ABL fusion in chronic myeloid leukemia in India: The threats and challenges in monitoring minimal residual disease (MRD)", 《ANALYTICAL CELLULAR PATHOLOGY》, vol. 36, 31 December 2013 (2013-12-31), pages 85 - 92 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105803087A (zh) * 2016-04-29 2016-07-27 广州蓝吉生物技术有限公司 一种检测融合基因MLL-ENL mRNA表达的试剂盒及其应用
CN107345244A (zh) * 2016-10-12 2017-11-14 深圳市儿童医院 检测白血病tel‑aml1融合基因的方法、引物及试剂盒
CN108676848A (zh) * 2018-05-31 2018-10-19 上海科医联创医学检验所有限公司 用于检测融合基因的混合基因、标准质粒、试剂盒及其制备方法
CN108676848B (zh) * 2018-05-31 2022-04-22 上海科医联创医学检验所有限公司 用于检测融合基因的混合基因、标准质粒、试剂盒及其制备方法
CN110724741A (zh) * 2019-07-24 2020-01-24 艾普拜生物科技(苏州)有限公司 一种检测微小残留白血病相关融合基因的引物、探针及其试剂盒
CN110724741B (zh) * 2019-07-24 2020-05-19 艾普拜生物科技(苏州)有限公司 一种检测微小残留白血病相关融合基因的引物、探针及其试剂盒
CN111118123A (zh) * 2020-02-09 2020-05-08 苏州健雄职业技术学院 一种高灵敏度的dek／can融合基因检测试剂盒
WO2022041424A1 (zh) * 2020-08-26 2022-03-03 苏州卫生职业技术学院 一种检测pml-rara融合基因的lamp引物组、试剂盒及检测方法
CN112301129A (zh) * 2020-11-05 2021-02-02 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 Bcr-abl融合基因检测试剂盒和bcr-abl融合基因检测方法
CN112280866A (zh) * 2020-11-24 2021-01-29 福州艾迪康医学检验所有限公司 荧光定量pcr技术筛查急性早幼粒细胞白血病相关14种融合基因的方法、引物及探针
CN113943816A (zh) * 2021-12-03 2022-01-18 郑州思勤生物科技有限公司 核酸组合物、试剂盒以及其用途
CN115992228A (zh) * 2022-07-19 2023-04-21 领航基因科技（杭州）有限公司 检测急性髓系白血病相关的融合基因的引物和探针及其应用、试剂盒

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