CN105803087A - 一种检测融合基因MLL-ENL mRNA表达的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因技术领域,具体公开了一种检测融合基因MLL‑ENL mRNA表达的试剂盒及其应用。所述的试剂盒包含MLL‑ENL反应液以及ABL反应液;所述的MLL‑ENL反应液中包含如SEQ ID NO:1所示的正向引物、如SEQ ID NO:2所示的反向引物以及如SEQ ID NO:3所示的MLL‑ENL的寡核苷酸探针;所述的ABL反应液中包含如SEQ ID NO:4所示的正向引物、如SEQ ID NO:5所示的反向引物、如SEQ ID NO:6所示的ABL的寡核苷酸探针。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性,通过本发明的试剂盒实现对外周血或骨髓样本中融合基因MLL‑ENL mRNA进行定量检测。
Description
技术领域
本发明涉及基因技术领域,具体涉及一种检测融合基因MLL-ENL mRNA表达的试剂盒及其应用。
背景技术
11q23染色体易位是急性髓系白血病(Acute Myelogenous Leukemia,AML)常见的核型改变,分子学研究表明,在30余种11q23易位相关的基因融合中,均涉及到MLL基因重排,此类异常是位于11q23的混合系白血病(Mixedlineage leukemia,MLL)基因发生重排。MLL基因位于11号染色体长臂2区3带(11q23),是目前血液系统恶性疾病中常累及的基因之一,在急性淋巴细胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia,ALL)和AML中均有发生,特别是AML-M1,M2,M4,M5。该基因易位重排在AML中的发生率为5%~8%,在ALL中的发生率为7%~10%,在婴幼儿白血病中的发生率为60%~70%。此类型中常见的MLL-ENL 基因融合是由 t(11;19)(q23;p13.3)染色体易位而形成的,其编码的蛋白产物能够遗传性的指导淋巴系祖细胞转化成为髓系细胞,这表明该融合蛋白具有影响造血谱系的能力。t(11;19)(q23;p13.3)易位引起MLL基因(lysine(K) methyl transferase 2A,也称为KMT2A基因)和ENL基因(myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia; translocated to, 1 也称为MLLT1基因)的融合MLL基因的断裂位点位于第9、10 外显子之间,ENL基因的断裂位点为第2个外显子上游,目前最为常见的融合方式为MLL第10个外显子与ENL第2个外显字融合形成的MLL-ENL基因。MLL-ENL蛋白调控的靶基因有HOXA9/MEIS1和转录因子EYA1、SIX1和SIX4 。其中EYA蛋白已知能与SIX蛋白家族成员形成异二聚体,提示了EYA1/SIX1很可能是急性白血病中MLL融合蛋白介导的一种新的致病通路。研究人员进一步通过造血细胞转化实验证明了EYA1与SIX1协同作用能使造血祖细胞在体外永生化。常见于小于1岁的婴幼儿,中位存期为17.6月。目前常用的实验室检测方法主要包括染色体核型分析、FISH、PCR检测等。
Real-TimePCR技术是今年来发展迅速的一种核酸检测技术,使用一种带有核电偶联装置(CCD)的PCR扩增仪,通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光,收集检测荧光信号,并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。一步法Real-Time RT-PCR技术是Real-Time PCR的一种(Yuqi Z,Min Y,Johann WM,et al.2002. Quantification of humanImmunodeficiency Virus Type 1 Proviral DNA by Using TaqMan Technology. J CliMicrobiol.40(2):675-678; Drosten C, Seifried E,Roth WK,et al. 2001. TaqMan 5-nuclease human immunodeficiency virus type 1 PCR assay with phage-packagedcompetitive internal control for high-throughput blood donor screening. JClin Microbiol, 39:4302-4308; Schuurman R, Descamps D, Weverling GJ, et al.Multicenter comparison of three commercial methods for quantification ofhuman immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma. J Clin Microbiol. 1996Dec;34(12):3016-22; Christopherson C, Kidane Y, Conway B, et al. PCR-Basedassay to quantify human immunodeficiency virus type 1 DNA in peripheral bloodmononuclear cells. J Clin Microbiol. 2000 Feb;38(2):630-4.),它是一种直接快速检测RNA的方法,与检测DNA的Real-Time PCR相比,不同之处在于前者在反应体系中增加了逆转录酶,同时多了一个逆转录反应步骤;相同之处在于两者在反应体系中均有一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针,探针结构完整时,荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团,呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在,扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断,荧光报告基团与淬灭基团相互解离,阻断了二者间荧光共振能量转移效应,荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行,荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是,为了克服现有技术中的上述问题,提供一种检测融合基因MLL-ENL mRNA表达的试剂盒及其应用。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性,通过本发明的试剂盒实现对外周血或骨髓样本中融合基因MLL-ENL mRNA进行定量检测,检测急性髓系白血病(AML) 及急性淋巴细胞白血病(ALL)等血液系统肿瘤中融合基因MLL-ENLmRNA的表达水平。
本发明所要解决的上述技术问题通过以下技术方案予以实现:
一种检测融合基因MLL-ENL mRNA表达的试剂盒,包含MLL-ENL反应液以及ABL反应液;
所述的MLL-ENL反应液中包含如SEQ ID NO:1所示的正向引物、如SEQ ID NO:2所示的反向引物以及如SEQ ID NO:3所示的MLL-ENL的寡核苷酸探针;
所述的ABL反应液中包含如SEQ ID NO:4所示的正向引物、如SEQ ID NO:5所示的反向引物、如SEQ ID NO:6所示的ABL的寡核苷酸探针。
SEQ ID NO:1~6所述的序列如下所示:
SEQ ID NO:1 5’-CCAGGGTGGTTTGCTTTCTC-3’;
SEQ ID NO:2 5’-GGGCTTCTTGCGCAGTTG-3’;
SEQ ID NO:3 5’- ATGTAGAGTGCACCGTCCAGGTGA -3’;
SEQ ID NO:4 5’-GACGTCTGGGCATTTGGAGTA-3’;
SEQ ID NO:5 5’-TCATACACCTGGGACAGGTCAA-3’;
SEQ ID NO:6 5’-ATGGCATGTCCCCTTACCCGGGA -3’。
优选地,SEQ ID NO:3的5’含有荧光报告基团,3’含有荧光淬灭基团,序列为5’-X-ATGTAGAGTGCACCGTCCAGGTGA -Y-3’,其中X表示的是荧光报告基团,Y表示的是荧光淬灭基团;
所述的SEQ ID NO:6的5’含有荧光报告基团,3’含有荧光淬灭基团,序列为5’-X-ATGGCATGTCCCCTTACCCGGGA -Y-3’, 其中X表示的是荧光报告基团,Y表示的是荧光淬灭基团。
优选地,所述的MLL-ENL反应液中引物和探针所用的浓度均为2~10pmol/人份。
优选地,所述的ABL反应液中引物和探针所用的浓度均为2~10pmol/人份。
优选地,所述的MLL-ENL反应液以及ABL反应液中还包含PCR缓冲液,所述的PCR缓冲液包含10mmol/L的Tris-HCl缓冲液、50mmol/L的KCl溶液和3.0mmol/L的 MgCl2溶液。
优选地,所述的试剂盒还包含RNA提取试剂、一步法PCR酶系、MLL-ENL阳性定量参考品1-5、ABL阳性定量参考品1-4和DEPC水;
进一步优选地,所述的RNA提取试剂包含5×的红细胞裂解液、RNA提取液-Trizol试剂、氯仿、异丙醇和DEPC乙醇;
进一步优选地,所述的一步法PCR酶系包含逆转录酶、热启动Taq酶、RNA酶抑制剂、dNTPs以及酶稀释液;
进一步优选地,所述的MLL-ENL阳性定量参考品1-5包含浓度为1×103拷贝/5μL~1×107拷贝/5μL 的MLL-ENL目的片段的重组质粒;所述的ABL阳性定量参考品1-4包含浓度为1×103拷贝/5μL~1×106拷贝/5μL 的ABL目的片段的重组质粒。
优选地,所述的试剂盒,还包含分隔并集中包装上述试剂的试剂管的包装盒。
上述试剂盒用于非诊断目的检测融合基因MLL-ENL mRNA表达中的应用。
上述试剂盒用于非诊断目的检测融合基因MLL-ENL mRNA表达的方法,其特征在于,包含标本采集、核酸提取、PCR检测以及结果分析与判定;所述的PCR检测方法为:50℃逆转录15min,1个循环;95℃ 15min,1个循环;最后94℃ 15s,55℃ 45s,40个循环。
优选地,所述的标本采集于外周血或骨髓。
进一步优选地,所述的方法,包含如下步骤:
(1)标本采集
标本采集:抽取受检者静脉血或骨髓3~5ml,注入含乙二胺四乙酸二钠或枸橼酸钠抗凝剂的采血管,立即轻缓颠倒采血管混合5~10次,使抗凝剂与静脉血或骨髓充分混匀,密闭待用;
(2)核酸提取
(a)先将5×的红细胞裂解液用无菌纯化水稀释得到1×的红细胞裂解液;(b)取5mL洁净离心管加入抗凝血2mL;(c)向离心管中加入2mL 1×的红细胞裂解液,盖紧管盖,漩涡振荡15s以充分混匀,室温放置3min;(d)室温下6000rpm离心5min,去上清,保留沉淀;(e)重复步骤(c)和(d),尽可能吸除残存液体;(f)向离心管中加入1mL RNA提取液-Trizol试剂,盖紧管盖,漩涡振荡15s以充分混匀,再将其转移至1.5mL离心管并静置5min;(g)继续向离心管中加入200μL氯仿,盖紧管盖,用力上下振摇15s,15~30℃静置3min,4℃条件下12000rpm离心15min,离心后得到酚-氯仿下层、中间层及无色水相上层;(h)小心吸取400μL上层水相转移到另一洁净离心管中,加入500μL异丙醇,盖紧管盖,上下颠倒3次,15-30℃条件下静置10min,然后4℃条件下12000rpm离心10min离心后可见白色胶状RNA沉淀,去上清;(i)加入向离心管中加入1mL 75%的DEPC乙醇洗涤RNA沉淀,混匀,4℃条件下12000rpm离心5min,小心吸去大部分DEPC乙醇,短暂离心,再吸去剩余DEPC乙醇,打开离心管盖将沉淀在室温空气中干燥5min以使痕量乙醇挥发;(j)用50μL DEPC水溶解沉淀,室温静置2min,RNA溶液可立即进行PCR或存于-70±10℃备用;
(3)PCR检测
(a)配置体系
MLL-ENL反应体系:将3μL反应酶系和17μL MLL-ENL反应液充分混合,然后分装20μL至若干PCR反应管;
ABL反应体系:将3μL反应酶系和17μL ABL反应液充分混合,然后分装20μL至若干PCR反应管;
(b)加样、扩增
往上述装有MLL-ENL反应体系的不同的反应管中分别加入提取后的待测核酸5μL、阴性对照品-DEPC水5μL和MLL-ENL阳性定量参考品5μL,往上述装有ABL反应体系的不同的反应管中分别加入提取后的待测核酸5μL、阴性对照品-DEPC水5μL和ABL阳性定量参考品5μL,各自盖紧反应管盖,8000rpm离心数秒后转移至PCR扩增仪进行扩增,扩增完成后收集荧光信号,并保存检测数据文件;
(c)结果分析
按对应顺序设置MLL-ENL的5个阳性定量参考品,Task中设为Standard,Quantity中设为对应的拷贝数,然后根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值,使“Standard curve”窗口下的标准曲线图达到最佳,即R2值≥0.97,最后到“Report”窗口下记录仪器自动分析计算出的MLL-ENL未知标本的拷贝数,将该结果导出,然后重新按对应顺序设置ABL的4个阳性定量参考品,步骤同前,将ABL未知标本的拷贝数导出;
(4)结果判定
如果增长曲线不呈S型曲线或Ct值为空白,则判所检测的基因表达量小于检测限度;
如果增长曲线呈S型曲线且ABL的Ct值<35,则样品的MLL-ENL/ABL表达量为MLL-ENL-Qty/ ABL-Qty。
优选地,所述的MLL-ENL阳性定量参考品1-5为均含有浓度为1×103拷贝/5μL~1×107拷贝/5μL 的MLL-ENL目的片段的重组质粒;所述的ABL阳性定量参考品1-4为均含有浓度为1×103拷贝/5μL~1×106拷贝/5μL 的ABL目的片段的重组质粒。
优选地,所述标本在2~8℃条件下保存不应超过48小时;或者保存在-20±5℃待测,保存期为1个月;或者使用红细胞裂解液处理全血或骨髓,获得有核细胞沉淀后加入1mlRNA提取液,振荡混匀,于-70±10℃保存1个月;避免反复冻融。
特别值得说明的是,为了确保本发明的基因mRNA检测方法的准确性,另外使用携带有MLL-ENL基因(cDNA)序列的重组质粒作为DNA阳性定量参考品。借助这些额外标准品,使用本发明的试剂盒在相同条件下进行平行检测并制作所谓的外标定量标准曲线,以进一步验证本发明试剂盒的检测精密度和准确性,并作为生产本发明试剂盒附加的质量控制标准。
与基于扩增反应完成后进行单一终点检测的传统PCR试剂盒不同,Real-TimeqPCR试剂盒可以在扩增反应的进程中随时监测扩增产物的产生,从而大大提高了定量检测的准确性和精密度。众所周知,Real-Time qPCR是在PCR扩增体系中,同时加入引物和5’、3’末端分别标记有荧光报告基团(例如6-FAM amidite 羧基荧光素6)和荧光淬灭基团(例如6-羧基四甲基若丹明)的特异性寡核苷酸探针。如果探针没有与靶序列互补结合,其序列保持完整,报告基团发射的荧光信号将被淬灭基团吸收,所以没有荧光信号产生;而当PCR扩增反应进行时,DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性将降解荧光探针,导致荧光报告基团与荧光淬灭基团分离,因而荧光监测系统可接收并记录到荧光信号。每扩增一条DNA链即有一个荧光分子产生,从而实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步,实时地监测整个PCR反应进程,并可借助标准曲线对未知靶多核苷酸(模板)进行定量分析。
利用已知起始拷贝数的标准品制作标准曲线,其中以靶多核苷酸起始拷贝数的对数为横坐标,并以如上测得的Ct值为纵坐标。获得未知量靶多核苷酸的Ct值后,即可从基于平行实验得到的数据制作的标准曲线上得知其起始拷贝数的对数,然后计算出该靶多核苷酸的起始拷贝数(当扩增循环达到Ct值即初始进入指数扩增期时,Ct值得重现性极好,即同一靶多核苷酸在不同时间扩增或同一时间在不同管内扩增所得到的Ct值总是恒定的)。也就是说,基于上述的扩增反应结果推算出靶多核苷酸的量(起始拷贝数)。具体实现包括:(1)确定样品中的靶多核苷酸经扩增后所产生的荧光达到基线以上的固定阈值时所需的阈循环次数;(2)将已确定的样品中靶多核苷酸的阈循环次数与标准溶液中已知量靶多核苷酸的阈循环次数相比较,从而计算出样品中靶多核苷酸的量。
与现有技术相比,本发明具有的有益效果为:
1)本发明使用适当的核酸分析软件分别对已知的融合基因MLL-ENL基因的核苷酸序列进行同源性比较,在找到同源区段的基础上,进一步使用适当的引物设计软件选择并设计寡核苷酸引物和探针,由于所设计的引物和探针均具有互补于MLL-ENL基因的序列,而且与其他病原体的核苷酸序列没有同源性,也不包括任何常见的核酸内切酶的酶切位点,所以避免了融合基因MLL-ENL检测的假阴性和假阳性,提高了检测的可靠性和准确度,同时设置了内参ABL基因作为相对定量标准,用于整个反应体系的质量控制,在本试剂盒中可作为内参对起始细胞量进行校正;
2)适宜于一步法Real-Time qPCR扩增的逆转录酶、热启动Taq酶、2’-脱氧核苷三磷酸、RNA酶抑制剂(RNasin)、能够与双链靶多聚核苷酸的第一条链结合的正向引物、能够与双链靶多聚核苷酸的第二条链结合的反向引物、能够与靶多聚核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针、能够与内标核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和淬灭基团的检测内标的寡核苷酸探针、含有镁离子的缓冲液;
3)通过检测急性髓系白血病(AML)及急性淋巴细胞白血病(ALL)等血液系统肿瘤中融合基因MLL-ENL的mRNA表达水平,有利于评价患者化疗效果、预后及对微小残留病变复发的监测;
4)全封闭反应,提取RNA以后,直接用于Real-Time qPCR检测,避免了污染发生;
5)由于内参基因ABL在细胞中的表达相对恒定,因此,本试剂盒中选择ABL作为内参对起始细胞量进行校正,用于整个核酸提取和反应体系的质量控制;
6)同时使用携带有MLL-ENL基因和内参ABL基因序列的重组质粒作为阳性定量参考品,使用本发明的试剂盒在相同条件下进行相对定量的平行检测,从而可确保检测结果的可靠性。
附图说明
图1为MLL-ENL阳性定量参考品1-5、阴性质控品的检测结果。
图2为ABL阳性定量参考品1-4、阴性质控品的检测结果。
图3为MLL-ENL基因的特异性实验结果。
图4为8份白血病患者的样本的检测结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步解释本发明,但实施例对本发明不做任何形式的限定。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。其中,所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
一种检测融合基因MLL-ENL mRNA表达的试剂盒,包括:(a)RNA提取试剂、MLL-ENL反应液、ABL反应液、一步法PCR酶系、MLL-ENL阳性定量参考品1-5、ABL阳性定量参考品1-4和DEPC水;(b)分隔并集中包装上述试剂的试剂管的包装盒;
所述的RNA提取试剂包括5×的红细胞裂解液、RNA提取液-Trizol试剂、氯仿、异丙醇和DEPC乙醇;
所述的MLL-ENL反应液包括正向引物、反向引物、MLL-ENL的寡核苷酸探针、PCR反应缓冲液,其中MLL-ENL反应液中正向和反向引物分别是:
5’- CCAGGGTGGTTTGCTTTCTC -3’(SEQ ID NO:1);
5’- GGGCTTCTTGCGCAGTTG -3’(SEQ ID NO:2);
MLL-ENL的寡核苷酸探针是:5’-ATGTAGAGTGCACCGTCCAGGTGA-3’ (SEQ ID NO:3);或者是5’含有荧光报告基团,3’含有荧光淬灭基团的SEQ ID NO:3序列(5’-X-ATGGCATGTCCCCTTACCCGGGA -Y-3’),其中X表示的是荧光报告基团,Y表示的是荧光淬灭基团。
所述的ABL反应液包括正向引物、反向引物、ABL的寡核苷酸探针、PCR反应缓冲液,其中ABL反应液中正向和反向引物分别是:
5’-GACGTCTGGGCATTTGGAGTA-3’(SEQ ID NO:4)
5’-TCATACACCTGGGACAGGTCAA-3’(SEQ ID NO:5)
ABL的寡核苷酸探针是:5’-ATGGCATGTCCCCTTACCCGGGA-3’(SEQ ID NO:6);或者是5’含有荧光报告基团,3’含有荧光淬灭基团的SEQ ID NO:6序列(5’-X-ATGGCATGTCCCCTTACCCGGGA -Y-3’),其中X表示的是荧光报告基团,Y表示的是荧光淬灭基团。
所述的MLL-ENL阳性定量参考品1-5为均含有浓度为1×103拷贝/5μL~1×107拷贝/5μL 的MLL-ENL目的片段的重组质粒;所述的ABL阳性定量参考品1-4为均含有浓度为1×103拷贝/5μL~1×106拷贝/5μL 的ABL目的片段的重组质粒。
所述的MLL-ENL反应液和ABL反应液中的PCR缓冲液包含10mmol/L的Tris-HCl缓冲液、50mmol/L的KCl溶液和3.0mmol/L的 MgCl2溶液。
一步法PCR酶系包括逆转录酶、热启动Taq酶、RNA酶抑制剂、dNTPs以及酶稀释液,逆转录酶的用量为1.5~3.5U/人份、热启动Taq酶的用量为3~7U/人份、RNA酶抑制剂的用量为15~25U/人份、dNTPs浓度为0.20mmol/L、酶稀释液为一般市售的酶稀释液。
所述的MLL-ENL反应液中引物和探针所用的浓度均为2~10pmol/人份,优选引物浓度为5pmol/人份、探针浓度为3pmol/人份。
所述的ABL反应液中引物和探针所用的浓度均为2~10pmol/人份,优选引物浓度为5pmol/人份、探针浓度为3pmol/人份;所述试剂盒的待检样本是外周血或骨髓。
实施例2
一种检测融合基因MLL-ENL mRNA表达的试剂盒的检测方法,包括以下步骤:
(1)标本采集
标本采集:抽取受检者静脉血或骨髓3~5ml,注入含乙二胺四乙酸二钠或枸橼酸钠抗凝剂的采血管,立即轻缓颠倒采血管混合5~10次,使抗凝剂与静脉血或骨髓充分混匀,密闭待用;标本立即用于测试,如不能立即进行测试,标本在2~8℃条件下保存不应超过48小时;或者保存在-20±5℃待测,保存期为1个月;或者使用红细胞裂解液处理全血或骨髓,获得有核细胞沉淀后加入1ml RNA提取液,振荡混匀,于-70±10℃保存1个月;避免反复冻融;标本的运输条件为0℃左右;
(2)核酸提取
(a)将5×浓度的红细胞裂解液稀释得到1×的红细胞裂解液待用;(b)取5mL洁净离心管加入抗凝血2mL;(c)向离心管中加入2mL 1×的红细胞裂解液,盖紧管盖,漩涡振荡15s以充分混匀,室温放置3min;(d)室温下6000rpm离心5min,去上清,保留沉淀;(e)重复步骤(c)和(d),尽可能吸除残存液体;(f)向离心管中加入1mL RNA提取液,盖紧管盖,漩涡振荡15s以充分混匀,再将其转移至1.5mL离心管并静置5min;(g)继续向离心管中加入200μL氯仿,盖紧管盖,用力上下振摇15s(小心液体泄漏,有腐蚀性),15~30℃静置3min,4℃条件下12000rpm离心15min,离心后得到酚-氯仿下层、中间层及无色水相上层;(h)小心吸取400μL上层水相转移到另一洁净离心管中,加入500μL异丙醇,盖紧管盖,上下颠倒3次,15-30℃条件下静置10min,然后4℃条件下12000rpm离心10min(注意固定离心管方向),离心前通常看不见RNA沉淀,离心后可见白色胶状RNA沉淀,去上清;(i)加入向离心管中加入1mL 75%的DEPC乙醇洗涤RNA沉淀,混匀,4℃条件下12000rpm离心5min(注意固定离心管方向),小心吸去大部分DEPC乙醇,短暂离心,再吸去剩余DEPC乙醇,打开离心管盖将沉淀在室温空气中干燥5min以使痕量乙醇挥发;(j)用50μL DEPC水溶解沉淀,室温静置2min,RNA溶液可立即进行PCR或存于-70±10℃备用;
(3)PCR检测
(a)配置体系
MLL-ENL反应体系:将3μL反应酶系和17μL MLL-ENL反应液充分混合,然后分装20μL至若干PCR反应管;
ABL反应体系:将3μL反应酶系和17μL ABL反应液充分混合,然后分装20μL至若干PCR反应管;
(b)加样、扩增
往上述装有MLL-ENL反应体系的不同的反应管中分别加入提取后的待测核酸5μL、阴性对照品-DEPC水5μL和MLL-ENL阳性定量参考品5μL,往上述装有ABL反应体系的不同的反应管中分别加入提取后的待测核酸5μL、阴性对照品-DEPC水5μL和ABL阳性定量参考品5μL,各自盖紧反应管盖,8000rpm离心数秒后转移至PCR扩增仪进行扩增,扩增完成后收集荧光信号,并保存检测数据文件;
扩增时ABI7300/7500荧光PCR扩增仪参数设置如下:
Reporter Dyel:FAM
Quencher Dye:none
Passive Reference:none
LightCycler480荧光PCR扩增仪的参数设置如下:
“Customizes”模块中选择FAM(483-533)滤片;
扩增的温度参数统一设置如下:扩增的反应温度和时间为:50℃ 15min一个循环,95℃15min一个循环;94℃ 15s,55℃ 45s进行40个循环,荧光检测选择在55℃ 45s这一环节。
(c)结果分析
按对应顺序设置MLL-ENL的5个阳性定量参考品,Task中设为Standard,Quantity中设为对应的拷贝数,然后根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整,start值可以在1~10、stop值可以在5~20、Threshold值可以在5K~50K范围选择),使“Standard curve”窗口下的标准曲线图达到最佳,即R2值(correlation数值)≥0.97,最后到“Report”窗口下记录仪器自动分析计算出的MLL-ENL未知标本的拷贝数(MLL-ENL-Qty),将该结果导出,然后重新按对应顺序设置ABL的4个阳性定量参考品,步骤同前,将ABL未知标本的拷贝数(ABL-Qty)导出;
(4)结果判定
如果增长曲线不呈S型曲线或Ct值为空白,则判所检测的基因表达量小于检测限度;
如果增长曲线呈S型曲线且ABL的Ct值<35,则样品的MLL-ENL/ABL表达量为MLL-ENL-Qty/ ABL-Qty。
融合基因MLL-ENL试剂盒中阳性定量参考品及阴性质控品包括MLL-ENL阳性定量参考品1-5,ABL阳性定量参考品1-4和阴性质控品,用于质量控制。
以下要求需在同一次实验中同时满足,否则,本次实验无效,需重新进行:
阴性质控品:MLL-ENL及ABL无荧光信号增长,无明显S型扩增曲线。
阳性定量参考品:MLL-ENL及ABL有荧光信号增长,曲线呈S型曲线,Ct值<37,且R2≥0.97。
未知标本的ABL的Ct值必须<35。
检测结果:
如图1所示,MLL-ENL阳性定量参考品1-5有荧光信号增长,曲线成S型曲线,Ct值<37,且R2≥0.97;可明确判定为阳性,阴性质控品的MLL-ENL无荧光信号增长,无明显S型扩增曲线,可明确判定为阴性,检测结果均符合质量控制判断标准。
如图2所示,ABL阳性定量参考品1-4有荧光信号增长,曲线成S型曲线,Ct值<37,且R2≥0.97;可明确判定为阳性,阴性质控品的ABL无荧光信号增长,无明显S型扩增曲线,可明确判定为阴性,检测结果均符合质量控制判断标准。
即从图1和图2可知:阴性质控品的MLL-ENL及ABL均无荧光信号增长;MLL-ENL阳性定量参考品1-5 FAM检测通路有荧光信号增长,曲线呈S型曲线,Ct值<37,且R2≥0.97;ABL阳性定量参考品1-4 FAM检测通路有荧光信号增长,曲线呈S型曲线,Ct值<37,且R2≥0.97;结果显示均符合试剂盒的质控要求,即本发明的试剂盒对待检标本的检测结果是有效的。
另外如图3所示,为MLL-ENL基因的特异性实验结果和8份白血病患者的样本的检测结果;针对8例包括再生障碍性贫血、巨幼细胞遗传性贫血等其他非白血病患者样品进行Real-Time qPCR检测分析,检测结果显示荧光扩增曲线无明显指数增长,均可明确判定为阴性。
如图4所示,为8个样品的Ct值分别是23.11、23.37、23.47、24.33、24.55、25.32、26.03、26.74,结合扩增曲线有明显指数增长期,均能够判定为阳性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护
范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州蓝吉生物技术有限公司
<120> 一种检测融合基因MLL-ENL mRNA表达的试剂盒及其应用
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccagggtggt ttgctttctc 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gggcttcttg cgcagttg 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgtagagtg caccgtccag gtga 24
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<212> DNA
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gacgtctggg catttggagt a 21
<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tcatacacct gggacaggtc aa 22
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atggcatgtc cccttacccg gga 23
Claims (10)
1.一种检测融合基因MLL-ENL mRNA表达的试剂盒,其特征在于,包含MLL-ENL反应液以及ABL反应液;
所述的MLL-ENL反应液中包含如SEQ ID NO:1所示的正向引物、如SEQ ID NO:2所示的反向引物以及如SEQ ID NO:3所示的MLL-ENL的寡核苷酸探针;
所述的ABL反应液中包含如SEQ ID NO:4所示的正向引物、如SEQ ID NO:5所示的反向引物、如SEQ ID NO:6所示的ABL的寡核苷酸探针。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,SEQ ID NO:3的5’含有荧光报告基团,3’含有荧光淬灭基团;所述的SEQ ID NO:6的5’含有荧光报告基团,3’含有荧光淬灭基团。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述的MLL-ENL反应液中引物和探针所用的浓度均为2~10pmol/人份。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述的ABL反应液中引物和探针所用的浓度均为2~10pmol/人份。
5.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述的MLL-ENL反应液以及ABL反应液中还包含PCR缓冲液,所述的PCR缓冲液包含10mmol/L的Tris-HCl缓冲液、50mmol/L的KCl溶液和3.0mmol/L的 MgCl2溶液。
6.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,还包含RNA提取试剂、一步法PCR酶系、MLL-ENL阳性定量参考品1-5、ABL阳性定量参考品1-4和DEPC水;优选地,所述的RNA提取试剂包含5×的红细胞裂解液、RNA提取液-Trizol试剂、氯仿、异丙醇和DEPC乙醇;优选地,所述的一步法PCR酶系包含逆转录酶、热启动Taq酶、RNA酶抑制剂、dNTPs以及酶稀释液;优选地,所述的MLL-ENL阳性定量参考品1-5包含浓度为1×103拷贝/5μL~1×107拷贝/5μL 的MLL-ENL目的片段的重组质粒;所述的ABL阳性定量参考品1-4包含浓度为1×103拷贝/5μL~1×106拷贝/5μL 的ABL目的片段的重组质粒。
7.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,还包含分隔并集中包装上述试剂的试剂管的包装盒。
8.权利要求1~7任一项所述的试剂盒用于非诊断目的检测融合基因MLL-ENLmRNA表达中的应用。
9.权利要求1~7任一项所述的试剂盒用于非诊断目的检测融合基因MLL-ENLmRNA表达的方法,其特征在于,包含标本采集、核酸提取、PCR检测以及结果分析与判定;所述的PCR检测方法为:50℃逆转录15min,1个循环;95℃ 15min,1个循环;最后94℃ 15s,55℃ 45s,40个循环。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述的标本采集于外周血或骨髓。
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- 2016-04-29 CN CN201610277750.2A patent/CN105803087A/zh active Pending
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谢小冬主编: "《现代生物技术概论》", 31 January 2007, 军事医学科学出版社 * |
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