CN104195255B - 一种检测融合基因AML1-ETO mRNA表达的试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种检测融合基因AML1‑ETO mRNA表达的试剂盒，采用TaqMan荧光探针技术，选取融合基因AML1‑ETO及内参基因ABL为靶区域，分别设计特异性引物及荧光探针，其中荧光探针5’端标记荧光发射基团FAM，3’端标记非荧光淬灭基团BHQ1，利用荧光PCR检测仪可在FAM通道检测荧光信号，由于内参基因ABL在细胞中的表达相对恒定，在本试剂盒中可作为内参对起始细胞量进行校正，用于整个核酸提取和反应体系的质量控制。本发明还提出了上述检测融合基因AML1‑ETO mRNA表达的试剂盒的检测方法。本发明具有很高的灵敏度和特异性，有利于诊断、评价患者疗效、预后及对微小残留病变复发的监测。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测融合基因AML1-ETO mRNA表达的试剂盒，特别是涉及以一步法Real-Time qPCR技术实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应技术快速、定量检测融合基因AML1-ETO mRNA的试剂盒，本发明还提出了上述检测融合基因AML1-ETO mRNA表达的试剂盒的检测方法。
背景技术
AML1-ETO基因融合是由t(8；21)(q22；q22)染色体易位而形成的，其编码的蛋白产物为一种多功能蛋白质，可通过影响细胞内许多信号传导系统和靶分子而参与细胞的分化与增值、细胞凋亡以及自我更新等过程，在t(8；21)(q22；q22)染色体易位阳性的急性髓系白血病(AML)特别是AML-M2型白血病的发生发展中起着非常重要的作用。(t(8；21)(q22；q22)易位)占AML的20％-40％，特别是在儿童FAB-M2中多见。t(8；21)(q22；q22)易位引起AML1基因(acute myeloblastic leukemia one gene)和ETO基因(eight twenty one gene，也称为MTG8基因)的融合。AML1基因断裂点在第5、6外显子之间，ETO断裂点在第2外显子的上游，AML1第5外显子和ETO第2外显子融合形成AML1/ETO基因，目前尚未发现AML1/ETO其他断裂点引起的转录本。t(8；21)(q22；q22)阳性是预后好的标志，其完全缓解(CR)率可达90％，5年长期无病生存率(event-free survival,EFS)可达50％-70％。目前常用的实验室检测方法主要包括染色体核型分析、FISH、PCR检测等。
Real-TimePCR技术是今年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有核电偶联装置(CCD)的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。一步法Real-Time RT-PCR技术是Real-Time PCR的一种(Yuqi Z,Min Y,Johann WM,et al.2002.Quantification of humanImmunodeficiency Virus Type 1Proviral DNA by Using TaqMan Technology.J CliMicrobiol.40(2)：675-678；Drosten C,Seifried E,Roth WK,et al.2001.TaqMan 5-nucleasehuman immunodeficiency virus type 1PCR assay with phage-packaged competitive internalcontrol for high-throughput blood donor screening.J Clin Microbiol,39:4302-4308；SchuurmanR,Descamps D,Weverling GJ,et al.Multicenter comparison of three commercial methods forquantification of human immunodeficiency virus type 1RNA in plasma.J Clin Microbiol.1996Dec；34(12):3016-22；Christopherson C,Kidane Y,Conway B,et al.PCR-Based assay toquantify human immunodeficiency virus type 1DNA in peripheral blood mononuclear cells.JClin Microbiol.2000Feb；38(2):630-4.)，它是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的Real-Time PCR相比，不同之处在于前者在反应体系中增加了逆转录酶，同时多了一个逆转录反应步骤；相同之处在于两者在反应体系中均有一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针，探针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。
发明内容
本发明的第一个目的在于提出一种检测融合基因AML1-ETO mRNA表达的试剂盒，本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒实现对外周血或骨髓样本中融合基因AML1-ETO mRNA进行定量检测，检测急性髓系白血病(AML)等血液系统肿瘤中融合基因AML1-ETO mRNA的表达水平，以有利于评价患者化疗效果、预后及对微小残留病变复发的监测。
本发明的第二个目的在于提出上述检测融合基因AML1-ETO mRNA表达的试剂盒的检测方法。
为解决上述技术问题，本发明的第一个目的通过以下技术方案予以实现：
一种检测融合基因AML1-ETO mRNA表达的试剂盒，包括：(a)RNA提取试剂、AML1-ETO反应液、ABL反应液、一步法PCR酶系、AML1-ETO阳性定量参考品1-5、ABL阳性定量参考品1-4和DEPC水；(b)分隔并集中包装上述试剂的试剂管的包装盒；
所述的RNA提取试剂包括5×的红细胞裂解液、RNA提取液-Trizol试剂、氯仿、异丙醇和DEPC乙醇；
所述的AML1-ETO反应液包括正向引物、反向引物、AML1-ETO的寡核苷酸探针、PCR反应缓冲液，其中AML1-ETO反应液中正向和反向引物分别是：
5’-GGATGGGCCCCGAGAAC-3’(SEQ ID NO:1)；
5’-GTCAGCCTAGATTGCGTCTTCA-3’(SEQ ID NO:2)；
AML1-ETO的寡核苷酸探针是：5’-X-TCGAAATCGTACTGAGAAGCACTCCA-Y-3’(SEQ ID NO:3)，其中X表示的是荧光报告基团，Y表示的是荧光淬灭基团；
所述的ABL反应液包括正向引物、反向引物、ABL的寡核苷酸探针、PCR反应缓冲液，其中ABL反应液中正向和反向引物分别是：
5’-GACGTCTGGGCATTTGGAGTA-3’(SEQ ID NO:4)
5’-TCATACACCTGGGACAGGTCAA-3’(SEQ ID NO:5)
ABL的寡核苷酸探针是:5’-X-ATGGCATGTCCCCTTACCCGGGA-Y-3’(SEQ IDNO:6)，其中X表示的是荧光报告基团，Y表示的是荧光淬灭基团；
所述的AML1-ETO阳性定量参考品1-5为均含有浓度为1×103拷贝/5μL～1×107拷贝/5μL的AML1-ETO目的片段的重组质粒；所述的ABL阳性定量参考品1-4为均含有浓度为1×103拷贝/5μL～1×106拷贝/5μL的ABL目的片段的重组质粒。
本发明是使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物和探针，用分子筛和快速蛋白质液相层析法(FPLC)纯化后进行氨解处理；同样合成所需的探针序列，氨解处理后分别在其5’端标记作为荧光发生基团(报告基团)的6-FAM amidite，并在其3’端标记借助活性连接臂偶联上作为荧光淬灭或抑制基团的BHQ1，以FPLC层析法纯化荧光标记的探针，然后，使用变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶(20％)电泳法和分光光度法物理鉴定所合成的引物和探针。
本试剂盒采用TaqMan荧光探针技术，选取融合基因AML1-ETO及内参基因ABL为靶区域，分别设计特异性引物及荧光探针，其中荧光探针5’端标记荧光发射基团FAM，3’端标记非荧光淬灭基团BHQ1，利用荧光PCR检测仪可在FAM通道检测荧光信号。由于内参基因ABL在细胞中的表达相对恒定，在本试剂盒中可作为内参对起始细胞量进行校正，用于整个核酸提取和反应体系的质量控制。通过简单易操作的核酸提取系统，结合Real-Time PCR检测系统运行一步法RT-PCR扩增程序，本试剂盒实现了检测的高特异、高灵敏和高效率。
进一步地，所述的AML1-ETO反应液和ABL反应液中的PCR缓冲液包含10mmol/L的Tris-HCl缓冲液、50mmol/L的KCl溶液和3.0mmol/L的MgCl2溶液。
进一步地，所述一步法PCR酶系包括逆转录酶、热启动Taq酶、RNA酶抑制剂、dNTPs以及酶稀释液，其中逆转录酶的用量为1.5～3.5U/人份、热启动Taq酶的用量为3～7U/人份、RNA酶抑制剂的用量为15～25U/人份、dNTPs浓度为0.20mmol/L、酶稀释液为一般市售的酶稀释液。
进一步地，应用于靶多核苷酸扩增的所述的AML1-ETO反应液中引物和探针所用的浓度均为2～10pmol/人份，优选引物浓度为5pmol/人份、探针浓度为3pmol/人份。
进一步地，所述的ABL反应液中引物和探针所用的浓度均为2～10pmol/人份，优选引物浓度为5pmol/人份、探针浓度为3pmol/人份。
进一步地，所述试剂盒的待检样本是外周血或骨髓。
本发明提供的一步法Real-Time qPCR试剂盒可以检测出融合基因AML1-ETO的灵敏度为250拷贝/5uL，说明本试剂盒具有非常好的灵敏度。
本发明针对融合基因AML1-ETO基因设计特异性引物和探针，检测的线性范围为5×108拷贝/5uL～5×102拷贝/5uL。
本发明的第二个目的通过以下技术方案予以实现：
一种检测融合基因AML1-ETO mRNA表达的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
(1)标本采集
标本采集：抽取受检者静脉血或骨髓3～5ml，注入含乙二胺四乙酸二钠或枸橼酸钠抗凝剂的采血管，立即轻缓颠倒采血管混合5～10次，使抗凝剂与静脉血或骨髓充分混匀，密闭待用；
(2)核酸提取
(a)先将5×的红细胞裂解液用无菌纯化水稀释得到1×的红细胞裂解液；(b)取5mL洁净离心管加入抗凝血2mL；(c)向离心管中加入2mL 1×的红细胞裂解液，盖紧管盖，漩涡振荡15s以充分混匀，室温放置3min；(d)室温下6000rpm离心5min，去上清，保留沉淀；(e)重复步骤(c)和(d)，尽可能吸除残存液体；(f)向离心管中加入1mL RNA提取液-Trizol试剂，盖紧管盖，漩涡振荡15s以充分混匀，再将其转移至1.5mL离心管并静置5min；(g)继续向离心管中加入200μL氯仿，盖紧管盖，用力上下振摇15s，15～30℃静置3min，4℃条件下12000rpm离心15min，离心后得到酚-氯仿下层、中间层及无色水相上层；(h)小心吸取400μL上层水相转移到另一洁净离心管中，加入500μL异丙醇，盖紧管盖，上下颠倒3次，15-30℃条件下静置10min，然后4℃条件下12000rpm离心10min离心后可见白色胶状RNA沉淀，去上清；(i)加入向离心管中加入1mL 75％的DEPC乙醇洗涤RNA沉淀，混匀，4℃条件下12000rpm离心5min，小心吸去大部分DEPC乙醇，短暂离心，再吸去剩余DEPC乙醇，打开离心管盖将沉淀在室温空气中干燥5min以使痕量乙醇挥发；(j)用50μL DEPC水溶解沉淀，室温静置2min，RNA溶液可立即进行PCR或存于-70±10℃备用；
(3)PCR检测
(a)配置体系
AML1-ETO反应体系：将3μL反应酶系和17μL AML1-ETO反应液充分混合，然后分装20μL至若干PCR反应管；
ABL反应体系：将3μL反应酶系和17μL ABL反应液充分混合，然后分装20μL至若干PCR反应管；
(b)加样、扩增
往上述装有AML1-ETO反应体系的不同的反应管中分别加入提取后的待测核酸5μL、阴性对照品-DEPC水5μL和AML1-ETO阳性定量参考品5μL，往上述装有ABL反应体系的不同的反应管中分别加入提取后的待测核酸5μL、阴性对照品-DEPC水5μL和ABL阳性定量参考品5μL，各自盖紧反应管盖，8000rpm离心数秒后转移至PCR扩增仪进行扩增，扩增完成后收集荧光信号，并保存检测数据文件；
扩增时ABI7300/7500荧光PCR扩增仪参数设置如下：
Reporter Dyel：FAM
Quencher Dye：none
Passive Reference：none
LightCycler480荧光PCR扩增仪的参数设置如下：
“Customizes”模块中选择FAM(483-533)滤片；
扩增的温度参数统一设置如下：扩增的反应温度和时间为：50℃15min，1个循环；95℃15min，1个循环；之后94℃15s，55℃45s，40～50个循环；
(c)结果分析
按对应顺序设置AML1-ETO的5个阳性定量参考品，Task中设为Standard，Quantity中设为对应的拷贝数，然后根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整，start值可以在1～10、stop值可以在5～20、Threshold值可以在5K～50K范围选择)，使“Standard curve”窗口下的标准曲线图达到最佳，即R2值(correlation数值)≥0.97，最后到“Report”窗口下记录仪器自动分析计算出的AML1-ETO未知标本的拷贝数(AML1-ETO-Qty)，将该结果导出，然后重新按对应顺序设置ABL的4个阳性定量参考品，步骤同前，将ABL未知标本的拷贝数(ABL-Qty)导出；
(4)结果判定
如果增长曲线不呈S型曲线或Ct值为空白，则判所检测的基因表达量小于检测限度；
如果增长曲线呈S型曲线且ABL的Ct值＜35，则样品的AML1-ETO/ABL表达量为AML1-ETO-Qty/ABL-Qty。
进一步地，所述的AML1-ETO阳性定量参考品1-5为均含有浓度为1×103拷贝/5μL～1×107拷贝/5μL的AML1-ETO目的片段的重组质粒；所述的ABL阳性定量参考品1-4为均含有浓度为1×103拷贝/5μL～1×106拷贝/5μL的ABL目的片段的重组质粒。
进一步地，所述标本在2～8℃条件下保存不应超过48小时；或者保存在-20±5℃待测，保存期为1个月；或者使用红细胞裂解液处理全血或骨髓，获得有核细胞沉淀后加入1ml RNA提取液，振荡混匀，于-70±10℃保存1个月；避免反复冻融；标本的运输条件为0℃左右。
进一步地，扩增的反应温度和时间为：50℃15min一个循环，95℃15min一个循环；94℃15s，55℃45s 40个循环，荧光检测选择在55℃45s这一环节。
特别值得说明的是，为了确保本发明的基因mRNA检测方法的准确性，另外使用携带有AML1-ETO基因(cDNA)序列的重组质粒作为DNA阳性定量参考品。借助这些额外标准品，使用本发明的试剂盒在相同条件下进行平行检测并制作所谓的外标定量标准曲线，以进一步验证本发明试剂盒的检测精密度和准确性，并作为生产本发明试剂盒附加的质量控制标准。
与基于扩增反应完成后进行单一终点检测的传统PCR试剂盒不同，Real-Time qPCR试剂盒可以在扩增反应的进程中随时监测扩增产物的产生，从而大大提高了定量检测的准确性和精密度。众所周知，Real-Time qPCR是在PCR扩增体系中，同时加入引物和5’、3’末端分别标记有荧光报告基团(例如6-FAM amidite羧基荧光素6)和荧光淬灭基团(例如6-羧基四甲基若丹明)的特异性寡核苷酸探针。如果探针没有与靶序列互补结合，其序列保持完整，报告基团发射的荧光信号将被淬灭基团吸收，所以没有荧光信号产生；而当PCR扩增反应进行时，DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性将降解荧光探针，导致荧光报告基团与荧光淬灭基团分离，因而荧光监测系统可接收并记录到荧光信号。每扩增一条DNA链即有一个荧光分子产生，从而实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，实时地监测整个PCR反应进程，并可借助标准曲线对未知靶多核苷酸(模板)进行定量分析。
利用已知起始拷贝数的标准品制作标准曲线，其中以靶多核苷酸起始拷贝数的对数为横坐标，并以如上测得的Ct值为纵坐标。获得未知量靶多核苷酸的Ct值后，即可从基于平行实验得到的数据制作的标准曲线上得知其起始拷贝数的对数，然后计算出该靶多核苷酸的起始拷贝数(当扩增循环达到Ct值即初始进入指数扩增期时，Ct值得重现性极好，即同一靶多核苷酸在不同时间扩增或同一时间在不同管内扩增所得到的Ct值总是恒定的)。也就是说，基于上述的扩增反应结果推算出靶多核苷酸的量(起始拷贝数)。具体实现包括：(1)确定样品中的靶多核苷酸经扩增后所产生的荧光达到基线以上的固定阈值时所需的阈循环次数；(2)将已确定的样品中靶多核苷酸的阈循环次数与标准溶液中已知量靶多核苷酸的阈循环次数相比较，从而计算出样品中靶多核苷酸的量。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
1)本发明使用适当的核酸分析软件分别对已知的融合基因AML1-ETO基因的核苷酸序列进行同源性比较，在找到同源区段的基础上，进一步使用适当的引物设计软件选择并设计寡核苷酸引物和探针，由于所设计的引物和探针均具有互补于AML1-ETO基因的序列，而且与其他病原体的核苷酸序列没有同源性，也不包括任何常见的核酸内切酶的酶切位点，所以避免了融合基因AML1-ETO检测的假阴性和假阳性，提高了检测的可靠性和准确度，同时设置了内参ABL基因作为相对定量标准，用于整个反应体系的质量控制，在本试剂盒中可作为内参对起始细胞量进行校正；
2)适宜于一步法Real-Time qPCR扩增的逆转录酶、热启动Taq酶、2’-脱氧核苷三磷酸、RNA酶抑制剂(RNasin)、能够与双链靶多聚核苷酸的第一条链结合的正向引物、能够与双链靶多聚核苷酸的第二条链结合的反向引物、能够与靶多聚核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针、能够与内标核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和淬灭基团的检测内标的寡核苷酸探针、含有镁离子的缓冲液；
3)通过检测急性髓系白血病(AML)等血液系统肿瘤中融合基因AML1-ETO的mRNA表达水平，有利于评价患者化疗效果、预后及对微小残留病变复发的监测；
4)全封闭反应，提取RNA以后，直接用于Real-Time qPCR检测，避免了污染发生；
5)由于内参基因ABL在细胞中的表达相对恒定，因此，本试剂盒中选择ABL作为内参对起始细胞量进行校正，用于整个核酸提取和反应体系的质量控制；
6)同时使用携带有AML1-ETO基因和内参ABL基因序列的重组质粒作为阳性定量参考品，使用本发明的试剂盒在相同条件下进行相对定量的平行检测，从而可确保检测结果的可靠性。
附图说明
图1为AML1-ETO阳性定量参考品1-5、阴性质控品的检测结果；
图2为ABL阳性定量参考品1-4、阴性质控品的检测结果；
图3为AML1-ETO基因的特异性实验结果；
图4为8份白血病患者的样本的检测结果。
具体实施方式
为让本领域的技术人员更加清晰直观的了解本发明，下面将结合附图，对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种Real-Time qPCR检测融合基因AML1-ETO mRNA表达的试剂盒，包括：(a)RNA提取试剂、AML1-ETO反应液、ABL反应液、一步法PCR酶系、AML1-ETO阳性定量参考品1-5、ABL阳性定量参考品1-4和DEPC水；(b)分隔并集中包装上述试剂的试剂管的包装盒；
所述的RNA提取试剂包括5×的红细胞裂解液、RNA提取液-Trizol试剂、氯仿、异丙醇和DEPC乙醇；
所述的AML1-ETO反应液包括正向引物、反向引物、AML1-ETO的寡核苷酸探针、PCR反应缓冲液，其中AML1-ETO反应液中正向和反向引物分别是：
5’-GGATGGGCCCCGAGAAC-3’(SEQ ID NO:1)；
5’-GTCAGCCTAGATTGCGTCTTCA-3’(SEQ ID NO:2)；
AML1-ETO的寡核苷酸探针是：5’-X-TCGAAATCGTACTGAGAAGCACTCCA-Y-3’(SEQ ID NO:3)，其中X表示的是荧光报告基团，Y表示的是荧光淬灭基团；
所述的ABL反应液包括正向引物、反向引物、ABL的寡核苷酸探针、PCR反应缓冲液，其中ABL反应液中正向和反向引物分别是：
5’-GACGTCTGGGCATTTGGAGTA-3’(SEQ ID NO:4)
5’-TCATACACCTGGGACAGGTCAA-3’(SEQ ID NO:5)
ABL的寡核苷酸探针是:5’-X-ATGGCATGTCCCCTTACCCGGGA-Y-3’(SEQ IDNO:6)，其中X表示的是荧光报告基团，Y表示的是荧光淬灭基团；
所述的AML1-ETO阳性定量参考品1-5为均含有浓度为1×103拷贝/5μL～1×107拷贝/5μL的AML1-ETO目的片段的重组质粒；所述的ABL阳性定量参考品1-4为均含有浓度为1×103拷贝/5μL～1×106拷贝/5μL的ABL目的片段的重组质粒。
所述的AML1-ETO反应液和ABL反应液中的PCR缓冲液包含10mmol/L的Tris-HCl缓冲液、50mmol/L的KCl溶液和3.0mmol/L的MgCl2溶液。
一步法PCR酶系包括逆转录酶、热启动Taq酶、RNA酶抑制剂、dNTPs以及酶稀释液，逆转录酶的用量为1.5～3.5U/人份、热启动Taq酶的用量为3～7U/人份、RNA酶抑制剂的用量为15～25U/人份、dNTPs浓度为0.20mmol/L、酶稀释液为一般市售的酶稀释液。
所述的AML1-ETO反应液中引物和探针所用的浓度均为2～10pmol/人份，优选引物浓度为5pmol/人份、探针浓度为3pmol/人份。
所述的ABL反应液中引物和探针所用的浓度均为2～10pmol/人份，优选引物浓度为5pmol/人份、探针浓度为3pmol/人份；所述试剂盒的待检样本是外周血或骨髓。
实施例2
一种检测融合基因AML1-ETO mRNA表达的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
(1)标本采集
标本采集：抽取受检者静脉血或骨髓3～5ml，注入含乙二胺四乙酸二钠或枸橼酸钠抗凝剂的采血管，立即轻缓颠倒采血管混合5～10次，使抗凝剂与静脉血或骨髓充分混匀，密闭待用；标本立即用于测试，如不能立即进行测试，标本在2～8℃条件下保存不应超过48小时；或者保存在-20±5℃待测，保存期为1个月；或者使用红细胞裂解液处理全血或骨髓，获得有核细胞沉淀后加入1ml RNA提取液，振荡混匀，于-70±10℃保存1个月；避免反复冻融；标本的运输条件为0℃左右；
(2)核酸提取
(a)将5×浓度的红细胞裂解液稀释得到1×的红细胞裂解液待用；(b)取5mL洁净离心管加入抗凝血2mL；(c)向离心管中加入2mL 1×的红细胞裂解液，盖紧管盖，漩涡振荡15s以充分混匀，室温放置3min；(d)室温下6000rpm离心5min，去上清，保留沉淀；(e)重复步骤(c)和(d)，尽可能吸除残存液体；(f)向离心管中加入1mL RNA提取液，盖紧管盖，漩涡振荡15s以充分混匀，再将其转移至1.5mL离心管并静置5min；(g)继续向离心管中加入200μL氯仿，盖紧管盖，用力上下振摇15s(小心液体泄漏，有腐蚀性)，15～30℃静置3min，4℃条件下12000rpm离心15min，离心后得到酚-氯仿下层、中间层及无色水相上层；(h)小心吸取400μL上层水相转移到另一洁净离心管中，加入500μL异丙醇，盖紧管盖，上下颠倒3次，15-30℃条件下静置10min，然后4℃条件下12000rpm离心10min(注意固定离心管方向)，离心前通常看不见RNA沉淀，离心后可见白色胶状RNA沉淀，去上清；(i)加入向离心管中加入1mL 75％的DEPC乙醇洗涤RNA沉淀，混匀，4℃条件下12000rpm离心5min(注意固定离心管方向)，小心吸去大部分DEPC乙醇，短暂离心，再吸去剩余DEPC乙醇，打开离心管盖将沉淀在室温空气中干燥5min以使痕量乙醇挥发；(j)用50μL DEPC水溶解沉淀，室温静置2min，RNA溶液可立即进行PCR或存于-70±10℃备用；
(3)PCR检测
(a)配置体系
AML1-ETO反应体系：将3μL反应酶系和17μL AML1-ETO反应液充分混合，然后分装20μL至若干PCR反应管；
ABL反应体系：将3μL反应酶系和17μL ABL反应液充分混合，然后分装20μL至若干PCR反应管；
(b)加样、扩增
往上述装有AML1-ETO反应体系的不同的反应管中分别加入提取后的待测核酸5μL、阴性对照品-DEPC水5μL和AML1-ETO阳性定量参考品5μL，往上述装有ABL反应体系的不同的反应管中分别加入提取后的待测核酸5μL、阴性对照品-DEPC水5μL和ABL阳性定量参考品5μL，各自盖紧反应管盖，8000rpm离心数秒后转移至PCR扩增仪进行扩增，扩增完成后收集荧光信号，并保存检测数据文件；
扩增时ABI7300/7500荧光PCR扩增仪参数设置如下：
Reporter Dyel：FAM
Quencher Dye：none
Passive Reference：none
LightCycler480荧光PCR扩增仪的参数设置如下：
“Customizes”模块中选择FAM(483-533)滤片；
扩增的温度参数统一设置如下：扩增的反应温度和时间为：50℃15min一个循环，95℃15min一个循环；94℃15s，55℃45s进行40个循环，荧光检测选择在55℃45s这一环节。
(c)结果分析
按对应顺序设置AML1-ETO的5个阳性定量参考品，Task中设为Standard，Quantity中设为对应的拷贝数，然后根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整，start值可以在1～10、stop值可以在5～20、Threshold值可以在5K～50K范围选择)，使“Standard curve”窗口下的标准曲线图达到最佳，即R2值(correlation数值)≥0.97，最后到“Report”窗口下记录仪器自动分析计算出的AML1-ETO未知标本的拷贝数(AML1-ETO-Qty)，将该结果导出，然后重新按对应顺序设置ABL的4个阳性定量参考品，步骤同前，将ABL未知标本的拷贝数(ABL-Qty)导出；
(4)结果判定
如果增长曲线不呈S型曲线或Ct值为空白，则判所检测的基因表达量小于检测限度；
如果增长曲线呈S型曲线且ABL的Ct值＜35，则样品的AML1-ETO/ABL表达量为AML1-ETO-Qty/ABL-Qty。
融合基因AML1-ETO试剂盒中阳性定量参考品及阴性质控品包括AML1-ETO阳性定量参考品1-5，ABL阳性定量参考品1-4和阴性质控品，用于质量控制。
以下要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行：
阴性质控品：AML1-ETO及ABL无荧光信号增长，无明显S型扩增曲线。
阳性定量参考品：AML1-ETO及ABL有荧光信号增长，曲线呈S型曲线，Ct值＜37，且R2≥0.97。
未知标本的ABL的Ct值必须＜35。
检测结果：
如图1所示，AML1-ETO阳性定量参考品1-5有荧光信号增长，曲线成S型曲线，Ct值＜37，且R2≥0.97；可明确判定为阳性，阴性质控品的AML1-ETO无荧光信号增长，无明显S型扩增曲线，可明确判定为阴性，检测结果均符合质量控制判断标准。
如图2所示，ABL阳性定量参考品1-4有荧光信号增长，曲线成S型曲线，Ct值＜37，且R2≥0.97；可明确判定为阳性，阴性质控品的ABL无荧光信号增长，无明显S型扩增曲线，可明确判定为阴性，检测结果均符合质量控制判断标准。
即从图1和图2可知：阴性质控品的AML1-ETO及ABL均无荧光信号增长；AML1-ETO阳性定量参考品1-5FAM检测通路有荧光信号增长，曲线呈S型曲线，Ct值＜37，且R2≥0.97；ABL阳性定量参考品1-4FAM检测通路有荧光信号增长，曲线呈S型曲线，Ct值＜37，且R2≥0.97；结果显示均符合试剂盒的质控要求，即本发明的试剂盒对待检标本的检测结果是有效的。
另外如图3所示，为AML1-ETO基因的特异性实验结果；针对8例包括再生障碍性贫血、巨幼细胞遗传性贫血等其他非白血病患者样品进行Real-Time qPCR检测分析，检测结果显示荧光扩增曲线无明显指数增长，均可明确判定为阴性。
如图4所示，为8份白血病患者的样本的检测结果；8个样品的Ct值分别是25.52、26.19、26.60、31.61、30.71、30.19、30.90、30.14，结合扩增曲线有明显指数增长期，均能够判定为阳性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种检测融合基因AML1-ETO mRNA表达的试剂盒，其特征在于包括：(a)RNA提取试剂、AML1-ETO反应液、ABL反应液、一步法PCR酶系、AML1-ETO阳性定量参考品1-5、ABL阳性定量参考品1-4和DEPC水；(b)分隔并集中包装上述试剂的试剂管的包装盒；
所述的RNA提取试剂包括5×的红细胞裂解液、RNA提取液-Trizol试剂、氯仿、异丙醇和DEPC乙醇；
所述的AML1-ETO反应液包括正向引物、反向引物、AML1-ETO的寡核苷酸探针、PCR反应缓冲液，其中AML1-ETO反应液中正向和反向引物分别是：
5’-GGATGGGCCCCGAGAAC-3’(SEQ ID NO:1)；
5’-GTCAGCCTAGATTGCGTCTTCA-3’(SEQ ID NO:2)；
AML1-ETO的寡核苷酸探针是：5’-X-TCGAAATCGTACTGAGAAGCACTCCA-Y-3’(SEQID NO:3)，其中X表示的是荧光报告基团，Y表示的是荧光淬灭基团；
所述的ABL反应液包括正向引物、反向引物、ABL的寡核苷酸探针、PCR反应缓冲液，其中ABL反应液中正向和反向引物分别是：
5’-GACGTCTGGGCATTTGGAGTA-3’(SEQ ID NO:4)
5’-TCATACACCTGGGACAGGTCAA-3’(SEQ ID NO:5)
ABL的寡核苷酸探针是:5’-X-ATGGCATGTCCCCTTACCCGGGA-Y-3’(SEQ ID NO:6)，其中X表示的是荧光报告基团，Y表示的是荧光淬灭基团；
所述的AML1-ETO阳性定量参考品1-5为均含有浓度为1×103拷贝/5μL～1×107拷贝/5μL的AML1-ETO目的片段的重组质粒；所述的ABL阳性定量参考品1-4为均含有浓度为1×103拷贝/5μL～1×106拷贝/5μL的ABL目的片段的重组质粒。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的AML1-ETO反应液和ABL反应液中的PCR缓冲液包含10mmol/L的Tris-HCl缓冲液、50mmol/L的KCl溶液和3.0mmol/L的MgCl2溶液。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述一步法PCR酶系包括逆转录酶、热启动Taq酶、RNA酶抑制剂、dNTPs以及酶稀释液。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的AML1-ETO反应液中引物和探针所用的浓度均为2～10pmol/人份。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的ABL反应液中引物和探针所用的浓度均为2～10pmol/人份。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的待检样本是外周血或骨髓。
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