CN106011308A

CN106011308A - 丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒、寡核苷酸及其应用

Info

Publication number: CN106011308A
Application number: CN201610086072.1A
Authority: CN
Inventors: 张太松; 刘学锋; 朱丽敏; 吕娜
Original assignee: Wallace & Samuel Gallery (hongkong) Ltd
Current assignee: Wallace & Samuel Gallery (hongkong) Ltd; Leadway HK Ltd
Priority date: 2016-02-15
Filing date: 2016-02-15
Publication date: 2016-10-12
Anticipated expiration: 2036-02-15
Also published as: CN106011308B

Abstract

本发明提供了丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒、引物及其应用，采用荧光PCR技术，对血液样品中可能存在的HCV RNA病毒并对HCV 1b、HCV 2a、HCV 6a、HCV 3a、HCV 3b、HCV 1a、HCV 4和HCV 5的HCV基因型进行鉴定。本发明可检测的丙型肝炎病毒亚型范围广，检测灵敏度高，降低了丙型肝炎基因型检测的漏检率。

Description

丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒、寡核苷酸及其应用

技术领域

本发明属于医学检验领域，具体涉及一种高敏感性HCV基因分型检测的引物、试剂盒及其应用。

背景技术

丙型肝炎是一种由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)引起的以肝脏损害为主的传染性疾病，可通过输血、静脉注射毒品、性传播、母婴传播等传染，HCV是慢性肝病的主要病原之一。丙型肝炎分布较广，容易演变为慢性、肝硬化、肝癌，严重危害患者的健康和生命。

丙型肝炎病毒是一种球形带脂蛋白包膜的病毒，病毒颗粒直径约为55-65nm，为单股正链RNA病毒，基因组全长约9.6kDa；根据丙型肝炎病毒在NS5B区域的差异性，分成不同的基因型，如1、2、3、4、5、6型等，不同亚型的HCV感染，其临床表现、肝病的严重程度及慢性化病程均有差异，抗病毒质粒的效果也不同。临床检测HCV基因亚型有助于判断治疗的程度，可作为指定个性化抗病毒治疗方案的参考指标之一。

目前HCV基因型分型方法包括：(1)核苷酸序列分析法，通过PCR扩增出目标基因，再进行核苷酸序列测定。(2)型特异性引物扩增法，根据核苷酸片段某区域内序列变异的特点，设计一系列型特异性引物进行扩增，不容的型被扩增出长短不一的片段，然后进行分型。(3)型特异性探针杂交法，设计出多个具有型特异性的探针，并使之呈线状平行固定在杂交膜上，然后把PCR扩增产物标记生物素，继续拧反向杂交后分型。(4)限制性片段长度多态性，根据DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小分型。(5)遗传发育关系进化树法。

发明内容

本发明的目的在于提供用于丙型肝炎病毒基因分型检测的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括：用于检测HCV的探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:1～3；用于检测HCV 1b的探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:4～6；用于检测HCV 2a的探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:7～9；用于检测HCV 6a的探针和引物，其碱基序列分别为SEQ IDNO.:10～12；用于检测HCV 3a的探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:13～15；用于检测HCV 3b的探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:16～18；用于检测HCV 1a的探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:22～24；用于检测HCV 4的探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:25～27；用于检测HCV 5的探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:28～30。

进一步地，还包括1b-RT引物，其碱基序列为SEQ ID NO.:31；2a-RT引物，其碱基序列为SEQ ID NO.:32；6a-RT引物，其碱基序列为SEQ ID NO.:33；3a-RT引物，其碱基序列为SEQ ID NO.:34；3b-RT引物，其碱基序列为SEQ ID NO.:35；1a-RT引物，其碱基序列为SEQID NO.:36；4-RT引物，其碱基序列为SEQ ID NO.:37；5-RT引物，其碱基序列为SEQ ID NO.:38。

进一步地，还包括内标探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:19～21。

本发明还提供了丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒，包括HCV RNA/1b/3a RT-PCR反应液、HCV2a/6a/3b RT-PCR反应液、HCV1a/4/5RT-PCR反应液和酶混合液，其特征在于，所述HCV RNA/1b/3a RT-PCR反应液包括检测HCV RNA的探针和引物，其碱基序列分别为SEQID NO.:1～3，检测HCV 1b亚型的探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:4～6，检测HCV3a亚型的探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:13～15；HCV2a/6a/3b RT-PCR反应液包括检测HCV2a的探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:7～9，检测HCV6a亚型的探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:10～12，检测HCV3b亚型的探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:16～18；HCV1a/4/5RT-PCR反应液包括检测HCV1a的探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:22～24，检测HCV 4亚型的探针和引物，其碱基序列分别为SEQID NO.:25～27，检测HCV5亚型的探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:28～30。

进一步地，所述寡核苷酸还包括1b-RT引物，其碱基序列为SEQ ID NO.:31；2a-RT引物，其碱基序列为SEQ ID NO.:32；6a-RT引物，其碱基序列为SEQ ID NO.:33；3a-RT引物，其碱基序列为SEQ ID NO.:34；3b-RT引物，其碱基序列为SEQ ID NO.:35；1a-RT引物，其碱基序列为SEQ ID NO.:36；4-RT引物，其碱基序列为SEQ ID NO.:37；5-RT引物，其碱基序列为SEQ ID NO.:38。

进一步地，包括内参基因的内标模板，和检测所述内参基因的内标探针和引物，所述内标探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:19～21，所述内标模板为SEQ ID NO.:39。

进一步地，所述酶混合液包括RT Ace、rTaq和RNase。

根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、BSA、HCV分型阳性对照和HCV分型阴性对照。

进一步地，所述HCV分型阳性对照来源于临床收集的HCV1b阳性感染的血清样本，用生理盐水适当稀释，经灭活处理的HCV1b阳性血清；所述HCV分型阴性对照来源于临床收集的HCV阴性血清，经灭活处理的HCV阴性血清。

本发明还提供了所述试剂盒在制备对丙型肝炎病毒进行基因分型的试剂中的应用。

本发明的有益效果：本发明检测的丙型肝炎病毒的亚型范围广，检测灵敏度高，降低了丙型肝炎的漏检率。

附图说明

图1临床样本的HCV RNA检测结果图。

图2临床样本的HCV1b检测结果图。

图3临床样本的HCV2a检测结果图。

图4临床样本的HCV6a检测结果图。

图5临床样本的HCV3a检测结果图。

图6临床样本的HCV3b检测结果图。

图7临床样本的HCV1a检测结果图。

图8临床样本的HCV4检测结果图。

图9临床样本的HCV5检测结果图。

图10灵敏度实验结果图。

图11同时使用反向引物和RT引物扩增的示意图。

图12在HCV RNA/1b/3a体系中，使用RT引物和不使用RT引物的实验结果图。

图13在HCV2a/6a/3b体系中，使用RT引物和不使用RT引物的实验结果图。

图14在HCV1a/4/5体系中，使用RT引物和不使用RT引物的实验结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

丙型肝炎病毒基因分型检测的引物和探针的设计和制备包括：根据HCV的5’UTR区域设计了检测HCV RNA病毒的引物和探针。根据1b、2a、6a、3a、3b、1a、4、5亚型的NS5B区域，分别针对上述各亚型在NS5B区域设计了引物和探针，并针对上述各亚型分别设计了各自对应的RT引物。本发明采用植源性的外源基因作为内参基因，使用外源性的基因作为检测的内参基因，避免了由于扩增人血清中的内参基因导致HCV或者HCV基因型别扩增效率降低，从而不影响检测靶标的扩增。

丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒包括HCV RNA/1b/3a RT-PCR反应液、HCV2a/6a/3b RT-PCR反应液、HCV1a/4/5RT-PCR反应液和酶混合液，其中HCV RNA/1b/3a RT-PCR反应液包括检测HCV RNA的探针和引物，检测HCV 1b亚型的探针和引物，检测HCV3a亚型的探针和引物；HCV2a/6a/3b RT-PCR反应液包括检测HCV2a的探针和引物，检测HCV6a亚型的探针和引物，检测HCV3b亚型的探针和引物；HCV1a/4/5RT-PCR反应液包括检测HCV1a的探针和引物，检测HCV 4亚型的探针和引物，检测HCV5亚型的探针和引物，其中：

检测HCV的探针碱基序列为：

HCV P：TCTGCGGAACCGGTGAGTACACCG(SEQ ID NO.:1所示)

检测HCV的扩增引物碱基序列为：

HCV FP：TCCCGGGAGAGCCATAGTG(SEQ ID NO.:2所示)

HCV RP：ACCCAACACTACTCGGCTAG(SEQ ID NO.:3所示)

检测HCV 1b亚型的探针碱基序列为：

CT1bP：TGGAAGGCGACAACC(SEQ ID NO.:4所示)

检测HCV 1b亚型的扩增引物碱基序列为：

CT1bFP：CGAGCGGTCGCAACCT(SEQ ID NO.:5所示)

CT1bRP：TCATTGCCATAGAGGGGCC(SEQ ID NO.:6所示)

检测HCV 2a亚型的探针碱基序列为：

CT2aP：AGCCACCCGCGTCA(SEQ ID NO.:7所示)

检测HCV 2a亚型的扩增引物碱基序列为：

CT2aFP：CAGCCATAATTGARAGGTTACACG(SEQ ID NO.:8所示)

CT2aRP：CCCCAAGTTTTCTGAGGGC(SEQ ID NO.:9所示)

检测HCV 6a亚型的探针碱基序列为：

CT6aP：CTCAATAGGGTAGGRGCTT(SEQ ID NO.:10所示)

检测HCV 6a亚型的扩增引物碱基序列为：

CT6aFP1：ACTCCACGGATACTCTCCAGTTG(SEQ ID NO.:11所示)

CT6aRP2：GACAGCTCTGGCTCGATGTCT(SEQ ID NO.:12所示)

检测HCV 3a亚型的探碱基序列为：

CT3aP：ATCGCTGGGGTGACC(SEQ ID NO.:13所示)

检测HCV 3a亚型的扩增引物碱基序列为：

CT3aFP：TCTGCGGAACCGGTGAGTAC(SEQ ID NO.:14所示)

CT3aRP：AATTTCTGGGTATTGAGCGGGT(SEQ ID NO.:15所示)

检测HCV 3b亚型的探针碱基序列为：

CT3bTP：ACCCATCTTTCCTTGTCT(SEQ ID NO.:16所示)

检测HCV 3b亚型的扩增引物碱基序列为：

CT3bFP：ACCTGTTACATCAAGGCCACTGC(SEQ ID NO.:17所示)

CT3bRP：CACAGCTTTCAGATATCACCACCA(SEQ ID NO.:18所示)

检测HCV 1a亚型的探针碱基序列为：

CT1aP：ACTGGAGTGTGTCTTGC(SEQ ID NO.:22所示)

检测HCV 1a亚型的扩增引物碱基序列为：

CT1aFP：ATCATGCTCCTCCAACGTGTC(SEQ ID NO.:23所示)

CT1aRP：GGGCAAACATRATTATGTTGCC(SEQ ID NO.:24所示)

检测HCV 4亚型的探针碱基序列为：

CT4P：ACTTCGAYATGTACGGAGTCA(SEQ ID NO.:25所示)

检测HCV 4亚型的扩增引物碱基序列为：

CT4FP：AGCCAGGARGCCCTTGARAAAG(SEQ ID NO.:26所示)

CT4RP：GCGCTYAAGCCRTGGAGTCTTTG(SEQ ID NO.:27所示)

检测HCV 5亚型的探针碱基序列为：

CT5P：CTCCTGTAGAGCTGCAAA(SEQ ID NO.:28所示)

检测HCV 5亚型的扩增引物碱基序列为：

CT5FP：GGCAACACCATGACGTGCTA(SEQ ID NO.:29所示)

CT5RP：CTGGCTCTCGCARATGGCCA(SEQ ID NO.:30所示)

在另一个实施方案中，所述HCV RNA/1b/3a RT-PCR反应液还可以包括HCV 1b亚型和HCV 3a亚型的RT引物。HCV2a/6a/3b RT-PCR反应液还可以包括HCV2a亚型、HCV 6a亚型和HCV 3b亚型的RT引物。HCV1a/4/5RT-PCR反应液中还可以包括HCV1a亚型、HCV 4亚型和HCV5亚型的RT引物。其中对应的RT引物碱基序列为：

HCV 1b亚型的RT引物的碱基序列为：

1b-RT Primer：GGTGACAGGARCCATCCTG(SEQ ID NO.:31所示)

HCV 2a亚型的RT引物的碱基序列为：

2a-RT Primer：CCACGGGAGATGAGGGACGC(SEQ ID NO.:32所示)

HCV 6a亚型的RT引物的碱基序列为：

6a-RT Primer：TGGAGTGAGTTTTAGTTTGGT(SEQ ID NO.:33所示)

HCV 3a亚型的RT引物的碱基序列为：

3a-RT Primer：GCACTCGCAAGCACCCTATC(SEQ ID NO.:34所示)

HCV 3b亚型的RT引物的碱基序列为：

3b-RT Primer：TATCTGGTCATAGCCTCCGTGAA(SEQ ID NO.:35所示)

HCV 1a亚型的RT引物的碱基序列为：

1a-RT Primer：TTGAATGATTGGAGGTAGATCCA(SEQ ID NO.:36所示)

HCV 4亚型的RT引物的碱基序列为：

4-RT Primer：TTGAGTTCGTGTGGAGARTATCC(SEQ ID NO.:37所示)

HCV 5亚型的RT引物的碱基序列为：

5-RT Primer：GAGTACCTGGTCATAGCCTC(SEQ ID NO.:38所示)

所述的酶混合液包括RT Ace、rTaq、Rnasin。在另一个实施方案中，所述酶混合液还可以包括anti-Taq。

所述丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒还可以包括内参基因的内标模板，和检测所述内参基因的探针和引物，所述内参基因选自植源性的外源基因，HCV分型的内标模板含TE稀释的外源性DNA片段制备的蛋白包裹RNA(假病毒)。其中：

内标的探针碱基序列为：

IC-P：CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC(SEQ ID NO.:19所示)

内标的扩增引物碱基序列为：

IC-FP：GTAGCTGCGATGTCTCTGCGTAT(SEQ ID NO.:20所示)

IC-RP：AGCTCAGGAGATGACTGCAGTCTA(SEQ ID NO.:21所示)

所述内标模板碱基序列为：

GTAGCTGCGATGTCTCTGCGTATTGTATTATCCAAGCTTCCCGTTCTCAGCCTCTAGCTTCATGTTAGACTGCAGTCATCTCCTGAGCT(SEQ ID NO.:39所示)。

所述的丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒还可以包括PCR缓冲液、MgCl₂、dNTP和BSA，以及HCV分型阳性对照品、HCV分型阴性对照品。其中所述HCV分型阳性对照来源于临床收集的HCV1b阳性感染的血清样本，用生理盐水适当稀释，经灭活处理的HCV1b阳性血清。HCV分型阴性对照来源于临床收集的HCV阴性血清，经灭活处理的HCV阴性血清。

丙型肝炎病毒基因分型检测中所述的探针标记，可以根据需要选择合适的5’端的荧光报告基团和3’端的淬灭基团。表1所述探针和引物序列是其中的一个方案。

表1：

实施例1病毒RNA的提取

在1.5ml离心管中加入300μl的裂解液，再加入100μl标本，旋涡振荡数秒混合均匀，室温静置10分钟。每管加入320μl无水乙醇，温和地翻转离心管3-5次混合均匀。取一个核酸纯化柱放入到2ml离心管中，将上述混合液加入到核酸纯化柱中，盖上管盖，12000rpm离心30秒。弃2ml离心管中的滤液，并将2ml离心管在纸巾上倒扣拍击一次，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入500μl洗涤液1,盖上管盖，12000rpm离心30秒。弃2ml离心管中的滤液，并将2ml离心管在纸巾上倒扣拍击一次，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入600μl洗涤液2，盖上管盖，14000rpm离心1分钟。弃2ml离心管中的滤液，并将2ml离心管在纸巾上倒扣拍击一次，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，14000rpm离心1分钟。弃2ml离心管，将核酸纯化柱置于一个洁净的1.5ml离心管中，在纯化柱的膜中央加入50μl TE，盖上管盖，室温静置1分钟，12000rpm离心30秒。详细见艾康生物技术(杭州)有限公司的核酸纯化试剂盒(离心柱法)(浙杭食药监械(准)字2014第1400038号)说明书。

实施例2：荧光PCR反应步骤

HCV基因分型反应溶液的配制体系：

HCV RNA/1b/3a反应体系：

HCV2a/6a/3b反应体系:

HCV1a/4/5反应体系：

所述探针和引物选自表1中的探针和引物。

酶混合液的配制体系：

原料	μl/pcs
		RT Ace(100U/μl)	0.1
rTaq(5U/μl)	0.4
		RNase(40U/μl)	0.05
anti-Taq(1μg/μl)	0.05

从试剂盒中取出HCV RNA/1b/3aRRT-PCR反应液、HCV2a/6a/3bRRT-PCR反应液、HCV1a/4/5RT-PCR反应液，在室温下融化并振荡混匀后，2000rpm离心10sec。计算需准备样本数n份[n＝样本数+2管对照]。

每测试反应体系配制如下：

按n人份计算上述各试剂的用量，加入一适当容积的离心管中，混匀。按20μl量分装到PCR薄壁管中，然后转移到样本处理区。

计算上述各试剂的使用量，加入一适当体积的离心管中，充分混匀后，按20μl量分装到PCR反应管中，转移至样本处理区。对应的反应管中分别加入20μl的实施例1中样本处理上清液，盖紧反应管，转移至检测区。

将各反应管按一定顺序放入PCR仪上，按以下程序进行PCR扩增，扩增程序如下：

其中步骤1为逆转录，包括RP及RT-Primer逆转录。步骤2为预扩增，步骤3为q-PCR检测。

检测时选择FAM、VIC、Texas Red、Cy5，各通道结果解释如下：

2.1如果检测样本无典型S型曲线或者Ct值＞32，则判样本为HCV RNA、1b、2a、3a、3b、6a阴性。

2.2如果检测样本呈典型S型曲线且Ct＜32，则根据下表标判断样本的亚型。

实施例3：临床样本检测

按实施例2和3的方法检测96例HCV阳性样本。采用测序法作为对照试剂。具体的RT-PCR检测结果如图1至图9所示。其中图1为HCV RNA的检测结果，图2是HCV1b的检测结果，图3是HCV2a的检测结果，图4是HCV6a检测结果，图5是HCV3a检测结果，图6是HCV3b检测结果，图7是HCV1a检测结果，图8是HCV4检测结果，图9是HCV5检测结果。结果显示96例HCV阳性样本检测结果同测序法完全一致。

实施例4：HCV基因分型试剂盒灵敏度检测结果

按照实施例1和2的试剂盒和方法测定HCV 1a/1b/2a/3a/3b/4/5/6a样本，按照HCVRNA标定浓度，参考标定浓度梯度对以上样本血清进行梯度稀释至约为1×10³IU/ml，如图10所示，测试以上稀释样本结果均为阳性。因此试剂盒的灵敏度为1×10³IU/ml。

实施例5：使用和不使用RT–Primer的对照试验

本发明中设计了针对各种亚型的特异性扩增引物和探针(SEQ ID NO.:1至SEQ IDNO.:18和SEQ ID NO.:22至SEQ ID NO.:30)和RT引物(SEQ ID NO.:31至SEQ ID NO.:38)，如图11所示，A为需要扩增的目标序列。在逆转录阶段，特异性扩增引物和RT-Primer引物均可以做为特异性引物进行逆转录。在预扩增阶段，配合正向引物，RP和RT-Primer均可以扩增出靶标序列，由于增加了RT Primer可以避免由于RP不完全匹配或者扩增效率低造成的漏检风险。

按照实施例1和2的试剂盒和方法，对照组为每管不加相应的RT引物，实验组为每管均有对应的RT引物。对照组的实验结果以1b-C、3a-C、HCV2a-C、6a-C、3b-C、HCV1a-C、4-C、5-C表示，实验组的实验结果以1b、3a、HCV2a、6a、3b、HCV1a、4、5表示。对照组和实验组分别扩增相应的阳性样本，结果如图12至图14所示。从结果中可以明显看出，增加RT引物的实验组的Ct值相比于没有RT引物的对照组，Ct值提前1-3个，且荧光值不变或者显著提高。

本发明所述的特异性逆转录引物和RT引物采用了兼并碱基，这大大减少了漏检的风险。实验结果表明，其检测准确率明显高于特异性逆转录引物和RT引物中没有采用兼并碱基的检测结果。

Claims

1.用于丙型肝炎病毒基因分型检测的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包括：用于检测HCV的探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:1～3；用于检测HCV 1b的探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:4～6；用于检测HCV 2a的探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:7～9；用于检测HCV 6a的探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:10～12；用于检测HCV 3a的探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:13～15；用于检测HCV3b的探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:16～18；用于检测HCV 1a的探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:22～24；用于检测HCV 4的探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:25～27；用于检测HCV5的探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:28～30。

2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，还包括1b-RT引物，其碱基序列为SEQID NO.:31；2a-RT引物，其碱基序列为SEQ ID NO.:32；6a-RT引物，其碱基序列为SEQ IDNO.:33；3a-RT引物，其碱基序列为SEQ ID NO.:34；3b-RT引物，其碱基序列为SEQ ID NO.:35；1a-RT引物，其碱基序列为SEQ ID NO.:36；4-RT引物，其碱基序列为SEQ ID NO.:37；5-RT引物，其碱基序列为SEQ ID NO.:38。

3.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，还包括内标探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:19～21。

4.丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒，包括HCV RNA/1b/3a RT-PCR反应液、HCV2a/6a/3b RT-PCR反应液、HCV1a/4/5RT-PCR反应液和酶混合液，其特征在于，所述HCV RNA/1b/3aRT-PCR反应液包括检测HCV RNA的探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:1～3，检测HCV 1b亚型的探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:4～6，检测HCV3a亚型的探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:13～15；HCV2a/6a/3b RT-PCR反应液包括检测HCV2a的探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:7～9，检测HCV6a亚型的探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:10～12，检测HCV3b亚型的探针和引物，其碱基序列分别为SEQ IDNO.:16～18；HCV1a/4/5RT-PCR反应液包括检测HCV1a的探针和引物，其碱基序列分别为SEQID NO.:22～24，检测HCV 4亚型的探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:25～27，检测HCV5亚型的探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:28～30。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述寡核苷酸还包括1b-RT引物，其碱基序列为SEQ ID NO.:31；2a-RT引物，其碱基序列为SEQ ID NO.:32；6a-RT引物，其碱基序列为SEQ ID NO.:33；3a-RT引物，其碱基序列为SEQ ID NO.:34；3b-RT引物，其碱基序列为SEQID NO.:35；1a-RT引物，其碱基序列为SEQ ID NO.:36；4-RT引物，其碱基序列为SEQ IDNO.:37；5-RT引物，其碱基序列为SEQ ID NO.:38。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，包括内参基因的内标模板，和检测所述内参基因的内标探针和引物，所述内标探针和引物，其碱基序列分别为SEQ ID NO.:19～21，所述内标模板为SEQ ID NO.:39。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述酶混合液包括RT Ace、rTaq和RNase。

8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR缓冲液、MgCl₂、dNTP、BSA、HCV分型阳性对照和HCV分型阴性对照。

9.权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述HCV分型阳性对照来源于临床收集的HCV1b阳性感染的血清样本，用生理盐水适当稀释，经灭活处理的HCV1b阳性血清；所述HCV分型阴性对照来源于临床收集的HCV阴性血清，经灭活处理的HCV阴性血清。

10.权利要求4至9之一所述的试剂盒在制备对丙型肝炎病毒进行基因分型的试剂中的应用。