CN112301129A - Bcr-abl融合基因检测试剂盒和bcr-abl融合基因检测方法 - Google Patents

Bcr-abl融合基因检测试剂盒和bcr-abl融合基因检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出一种BCR‑ABL融合基因检测试剂盒和BCR‑ABL融合基因检测方法。所述BCR‑ABL融合基因检测试剂盒包括多种引物和多种探针；所述BCR‑ABL融合基因检测方法包括：以所得样本的RNA为模板，利用多种所述引物和多种所述探针对所述RNA进行微滴式数字PCR扩增；计算BCR‑ABL融合基因与ABL基因拷贝数比值，得到BCR‑ABL融合基因的突变比例。本发明可有效检测3种类型的BCR‑ABL融合基因0.001％的低频突变，特异性强，灵敏度高，检测周期短，结果严谨可靠，实用性强，为慢粒白血病患者诊断以及临床监测提供科学依据。

Description

BCR-ABL融合基因检测试剂盒和BCR-ABL融合基因检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及BCR-ABL融合基因检测试剂盒和BCR-ABL融合基因检测方法。
背景技术
费城染色体(Ph)是1960年首次发现的人第9号染色体与22号染色体之间的平衡易位产生的微小染色体。该易位导致位于人类9号染色体中长臂ABL基因(位置q34)与22号染色体上长臂BCR基因(位置q11)发生并列性易位而产生新的融合基因BCR-ABL，位于变短的22号染色体长臂。BCR-ABL融合基因有3个主要形式，根据他们编码蛋白长度分别命名为BCR-ABL p190、 BCR-ABL p210与BCR-ABL p230。BCR-ABL融合基因中ABL段携带细胞恶变的主要信息，而BCR段的断裂位点主要影响疾病表型。BCR-ABL p210融合形式可见于90％以上的慢粒白血病患者(Chronic myelogenous leukemia，CML) 以及1/3的Ph阳性的成人前体B细胞急性淋巴细胞白血病(precursor B-acute lymphoblastic leukemia，BALL)患者；p190蛋白可见于2/3的BALL患者、3％的非典型CML患者和慢性粒细胞单核细胞白血病(chronic myelo-monocytic leukemia，CMML)患者；而p230蛋白主要见于Ph阳性的慢性中性粒细胞白血病(chronic neutrophilic leukemia，CNL)患者。
BCR-ABL是一种抗细胞凋亡的基因，具有酪氨酸激酶活性，可过度激活 Ras-Raf-MAPK信号通路、PI3K-AKT-mTOR信号通路以及JAK-STAT信号通路，导致细胞过度增殖并使细胞调控发生紊乱。此外，BCR-ABL还抑制DNA 修复，引起基因组不稳定性，导致慢性粒细胞性白血病患者恶化。BCR-ABL 形成于慢性粒细胞白血病前期，因此，检测BCR-ABL对于CML辅助诊断，靶向用药指导与微小残留病(Minimal residual disease，MRD)监测等具有重要的临床指导意义。
目前，临床上BCR-ABL融合基因或Ph阳性染色体检测方法主要包括逆转录后直接测序法、逆转录后普通PCR、常规染色体检测、荧光原位杂交技术 (FISH)以及以荧光定量PCR等。常规染色体检测是基础的临床辅助诊断CML 方法，而FISH是常规染色体检测的进步，第三代FISH在Ph+染色体隐匿核型、变异核型、基因序列缺失的检测中有一定优势，但是上述方法都不能用于白血病患者治疗后Ph阳性微残检测。逆转录后普通PCR或直接测序法是最直接的BCR-ABL融合基因检测方法，但检测灵敏度低，常用于初诊患者。qPCR技术检测成本较低，但其在定量检测中依赖标准参考品，且易受到引物扩增效率影响导致检测灵敏度与准确性不够高，无法实现对微小残留病有效监测。
综上所述，现有的BCR-ABL融合基因或Ph阳性染色体检测方法的检测准确性与灵敏度不高。
发明内容
本发明提供了一种BCR-ABL融合基因检测试剂盒和BCR-ABL融合基因检测方法，旨在提高对BCR-ABL融合基因或Ph阳性染色体的检测准确性与灵敏度。
为实现上述目的，第一方面，本发明提出一种BCR-ABL融合基因检测试剂盒，包括：
引物一，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
引物二，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
引物三，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
引物四，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
引物五，核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
引物六，核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
引物七，核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
引物八，核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
探针一，包括如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列一和分别连接所述核苷酸序列一5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；
探针二，包括如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列二和分别连接所述核苷酸序列二5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；
探针三，包括如SEQ ID No.11所示的核苷酸序列三和分别连接所述核苷酸序列三5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；以及
探针四，包括如SEQ ID No.12所示的核苷酸序列四和分别连接所述核苷酸序列四5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团。
可选地，所述核苷酸序列一的5’端连接FAM荧光基团，所述核苷酸序列一的3’端连接MGB荧光基团；所述核苷酸序列二的5’端连接FAM荧光基团，所述核苷酸序列二的3’端连接MGB荧光基团；所述核苷酸序列三的5’端连接FAM荧光基团，所述核苷酸序列三的3’端连接MGB荧光基团；所述核苷酸序列四的5’端连接HEX荧光基团，所述核苷酸序列四的3’端连接MGB荧光基团。
第二方面，本发明还提出一种BCR-ABL融合基因检测方法，包括以下步骤：
(1)获得待测样品RNA；
(2)利用引物一、引物二、引物七、引物八、探针一和探针四；或引物三、引物四、引物七、引物八、探针二和探针四；或引物五、引物六、引物七、引物八、探针三和探针四，以步骤(1)中获取的所述RNA为模板，进行数字PCR扩增，并收集荧光信号；
(3)分析步骤(2)中的荧光信号的强度的比值，计算BCR-ABL融合基因与ABL基因拷贝数比值，即得到BCR-ABL融合基因的突变比例；
其中，所述引物一的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述引物二的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述引物三的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述引物四的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述引物五的核苷酸序列如 SEQ ID No.5所示；所述引物六的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；所述引物七的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；所述引物八的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；所述探针一包括如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列一和分别连接所述核苷酸序列一5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述探针二包括如 SEQ IDNo.10所示的核苷酸序列二和分别连接所述核苷酸序列二5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述探针三包括如SEQ ID No.11所示的核苷酸序列三和分别连接所述核苷酸序列三5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述探针四包括如SEQ ID No.12所示的核苷酸序列四和分别连接所述核苷酸序列四5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团。
可选地，所述核苷酸序列一的5’端连接FAM荧光基团，所述核苷酸序列一的3’端连接MGB淬灭基团；所述核苷酸序列二的5’端连接FAM荧光基团，所述核苷酸序列二的3’端连接MGB淬灭基团；所述核苷酸序列三的5’端连接FAM荧光基团，所述核苷酸序列三的3’端连接MGB淬灭基团；所述核苷酸序列四的5’端连接HEX荧光基团，所述核苷酸序列四的3’端连接MGB淬灭基团。
本发明提出的BCR-ABL融合基因检测试剂盒和BCR-ABL融合基因检测方法基于数字PCR平台，将核酸分子分散到大量微反应单元，对微反应内靶序列进行PCR扩增与荧光检测，利用泊松分布统计模型估算拷贝数，不依赖于标准曲线与标准品，直接检测样品中核酸原始拷贝数，避免PCR效率对检测结果的影响；可有效检测3种类型BCR-ABL融合基因0.001％的低频突变，具有特异性强，灵敏度高，检测周期短的优势，检测结果严谨可靠，实用性强，为慢粒白血病患者诊断以及临床监测提供科学依据；同时，本发明将现有BCR-ABL融合基因检测灵敏度提高到10倍以上，实现MR 5.0的稳定监测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为BCR-ABL p190融合基因退火温度梯度检测结果图；
图2为BCR-ABL p210融合基因退火温度梯度检测结果图。
图3为BCR-ABL p230融合基因退火温度梯度检测结果图；
图4为ABL基因退火温度梯度检测结果图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。
本发明提出一种BCR-ABL融合基因检测试剂盒，所述BCR-ABL融合基因检测试剂盒包括引物一、引物二、引物三、引物四、引物五、引物六、引物七、引物八、探针一、探针二、探针三以及探针四；所述引物一的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述引物二的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述引物三的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述引物四的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述引物五的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述引物六的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述引物七的核苷酸序列如SEQ ID No.7 所示，所述引物八的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，所述探针一包括如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列一和分别连接所述核苷酸序列一5’端的荧光基团和 3’端的淬灭基团，所述探针二包括如SEQID No.10所示的核苷酸序列二和分别连接所述核苷酸序列二5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团，所述探针三包括如SEQ ID No.11所示的核苷酸序列三和分别连接所述核苷酸序列三5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团，所述探针包括如SEQ ID No.12所示的核苷酸序列四和分别连接所述核苷酸序列四5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团。
本发明通过Primer Premier 5.0软件设计多种所述引物和多种所述探针的序列。请参阅表1，所述引物一为检测BCR-ABL p190突变位点的上游引物， SEQ ID No.1的5’端位于BCR基因序列下游的1152bp处；所述引物二为检测 BCR-ABL p190突变位点的下游引物，SEQ ID No.2的5’端位于ABL基因序列下游的145bp处；所述引物三为检测BCR-ABL p210突变位点的上游引物， SEQ ID No.3的5’端位于BCR基因序列下游的2685bp处；所述引物四为检测 BCR-ABL p210突变位点的下游引物，SEQ ID No.4的5’端位于ABL基因序列下游的130bp处；所述引物五为检测BCR-ABL p230突变位点的上游引物， SEQ ID No.5的5’端位于BCR基因序列下游的3248bp处；所述引物六为检测 BCR-ABL p230突变位点的下游引物，SEQID No.6的5’端位于ABL基因序列下游的130bp处；所述引物七为检测ABL基因的上游引物，SEQ ID No.7 的5’端位于BCR基因序列下游的960bp处；所述引物八为检测ABL基因的下游引物，SEQ ID No.8的5’端位于ABL基因序列下游的1053bp处；所述探针一为检测BCR-ABLp190突变位点的探针，SEQ ID No.9的5’端位于ABL 基因序列下游的1209bp处；所述探针二为检测BCR-ABL p210突变位点的探针，SEQ ID No.10的5’端位于ABL基因序列下游的83bp处；所述探针三为检测BCR-ABL p230突变位点的探针，SEQ ID No.11的5’端位于ABL基因序列下游的83bp处；所述探针四为检测ABL基因的探针，SEQ ID No.12的5’端位于BCR基因序列下游的1023bp处。
表1检测BCR-ABL融合基因、ABL基因的引物与探针序列
Figure RE-GDA0002840338170000061
附注：引物和探针委托生物工程(上海)股份有限公司合成，纯化方式为HPLC。引物和探针进行溶解稀释使用ΜltraPureTM DNase/RNase-Free Distilled Water(Invitrogen，货号10977-015)，引物和探针母液浓度均为100 pmol/μl，可以根据具体情况对引物和Taqman探针进行稀释，-20℃冰箱避光保存。
可选地，所述核苷酸序列一的5’端连接FAM荧光基团，所述核苷酸序列一的3’端连接MGB淬灭基团；所述核苷酸序列二的5’端连接FAM荧光基团，所述核苷酸序列二的3’端连接MGB淬灭基团；所述核苷酸序列三的5’端连接FAM荧光基团，所述核苷酸序列三的3’端连接MGB淬灭基团；所述核苷酸序列四的5’端连接HEX荧光基团，所述核苷酸序列四的3’端连接MGB淬灭基团。即，ABL基因的检测探针的5’端采用HEX荧光基团标记，而3种 BCR-ABL融合基因的检测探针的5’端采用FAM荧光基团标记，ABL基因的检测探针和3种BCR-ABL融合基因的检测探针的3’端标记的淬灭基团均为 MGB。
本发明还提出一种BCR-ABL融合基因检测方法，包括以下步骤：
(1)获得待测样品RNA；
(2)利用引物一、引物二、引物七、引物八、探针一和探针四；或引物三、引物四、引物七、引物八、探针二和探针四；或引物五、引物六、引物七、引物八、探针三和探针四，以步骤(1)中获取的所述RNA为模板，进行数字PCR扩增，并收集荧光信号；
(3)分析步骤(2)中的荧光信号的强度的比值，计算BCR-ABL融合基因与ABL基因拷贝数比值，即得到BCR-ABL融合基因的突变比例；
其中，所述引物一的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述引物二的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述引物三的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述引物四的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述引物五的核苷酸序列如 SEQ ID No.5所示；所述引物六的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；所述引物七的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；所述引物八的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；所述探针一包括如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列一和分别连接所述核苷酸序列一5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述探针二包括如 SEQ IDNo.10所示的核苷酸序列二和分别连接所述核苷酸序列二5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述探针三包括如SEQ ID No.11所示的核苷酸序列三和分别连接所述核苷酸序列三5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述探针四包括如SEQ ID No.12所示的核苷酸序列四和分别连接所述核苷酸序列四 5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团。
可选地，所述核苷酸序列一的5’端连接FAM荧光基团，所述核苷酸序列一的3’端连接MGB淬灭基团；所述核苷酸序列二的5’端连接FAM荧光基团，所述核苷酸序列二的3’端连接MGB淬灭基团；所述核苷酸序列三的5’端连接FAM荧光基团，所述核苷酸序列三的3’端连接MGB淬灭基团；所述核苷酸序列四的5’端连接HEX荧光基团，所述核苷酸序列四的3’端连接MGB淬灭基团。
所述BCR-ABL融合基因检测方法的具体步骤如下：
a)利用EDTA抗凝血管采集5ml患者外周血样本，1500rpm离心所述样本20min；
b)吸取所述样本的中间白细胞层，并转移到新离心管中，利用血液总 RNA提取试剂盒(天根，DP433)提取所述样本中白细胞的总RNA；
c)利用真空浓缩仪1500rpm，将所述总RNA常温浓缩30min；
d)利用去除基因组DNA试剂盒去除所述总RNA中的基因组DNA；
e)请参阅表2，按照表2中的数字PCR检测体系配置数字PCR的反应混合液，向微液滴生成芯片油相孔加入70μl微液滴生成油，样本孔中加入25μl PCR反应液；
f)盖上微液滴生成芯片密封垫，放入数字PCR仪中，请参阅表3，按照表3中数字PCR扩增程序进行PCR程序扩增；
g)PCR扩增完后，DropX-2000数字PCR系统收集芯片信号并判读结果， BCR-ABL融合基因使用FAM通道，ABL基因使用HEX通道检测。设置阈值，阈值设置在阴性微滴和阳性微滴分开的区域。点击“比例”显示各反应 BCR-ABL/ABL融合基因的比例(％IS)值；
h)根据BCR-ABL融合基因拷贝数与ABL基因拷贝数的比例判断 BCR-ABL基因的阳性与阴性，同时利用BCR-ABL/ABL的比值进行CML治疗效果的监测。
表2数字PCR检测体系
组成成分 体积
2*dPCR Mix 12.5μl
Primer Mix 2.5μl
RNA模板 5-10μl
无菌水 补水至25μl
附注：Primer Mix配制比例是BCR-ABL融合基因与ABL基因的正向与反向引物均加2μl，探针加1μl，加无菌水90μl。
表3数字PCR扩增程序
Figure RE-GDA0002840338170000081
Figure RE-GDA0002840338170000091
实施例一：BCR-ABL融合基因与ABL基因的引物与探针设计
在本实施例中，通过NCBI网站搜集BCR-ABL p190、BCR-ABL p210和 BCR-ABL p230的融合基因与ABL基因的序列，以e13/14a2、e1a2、e19a2的全长cDNA和ABL的cDNA为模板，设计检测BCR-ABL融合基因和ABL 基因的多种引物和多种探针。其中，多种所述引物和多种所述探针的组合成四个引物及探针组合，四个所述引物及探针组合的序列请参阅表1。接着利用 AlleleID 6分析软件与ABI Primer Express分析软件对四个所述引物及探针组合进行评分和优化。优化后，多种所述引物的Tm值为60℃，多种所述探针的Tm值为70℃，这样设置可以避免发夹结构与二聚体的产生。
本实施例接着通过退火温度梯度筛选实验，来验证四个所述引物及探针组合的特异性。具体地，利用三份BCR-ABL融合基因突变型(BCR-ABL p190、 BCR-ABL p210和BCR-ABLp230)的临床样本和ABL野生型样本来进行退火温度梯度的筛选，三份所述BCR-ABL融合基因突变型的突变比例均为2％。请参阅图1至图4，实验结果显示，四个所述引物及探针组合在60℃～64℃退火时均有荧光信号，空白对照(图中右侧样本)在60℃退火时无非特异性扩增，证明四个所述引物及探针组合具有特异性。
实例二：BCR-ABL融合基因与ABL基因阴性样本检测。
本发明接着对多种所述引物和多种所述探针检测阴性样本的准确性进行验证。具体地，用无血清培养基培养不包含三种BCR-ABL融合基因突变的 HEK293F细胞，培养一段时间后，收集到九份HEK293F细胞，每份细胞约含有107个细胞。利用所述BCR-ABL融合基因检测方法，本实施例利用双位点引物与探针对所述HEK293F细胞进行空白限测试，所述双位点引物与探针的组合请参阅表4，空白限检测结果请参阅表5。表5的检测结果表明，所述HEK293F细胞的九份样本确实均为BCR-ABL融合基因阴性样本，这说明本发明提出的多种所述引物和多种所述探针检测阴性样本的准确性高，不会产生假阳性的检测结果。
表4 BCR-ABL融合基因与ABL引物及探针组合
Figure RE-GDA0002840338170000101
表5 BCR-ABL融合基因与ABL空白限检测结果
Figure RE-GDA0002840338170000102
实例二、BCR-ABL融合基因阳性样本检测。
本发明接着对突变标准品进行检测，来验证提出的多种所述引物和多种所述探针检测BCR-ABL融合基因突变标准品的准确性。所述突变标准品的突变比例为10％，通过等比稀释依次得到突变比例为10％、1％、0.1％、0.01％、 0.001％的样本。利用所述BCR-ABL融合基因检测方法对所述突变标准品进行检测(引物及探针组合对请参阅表4)，检测实验包括三个技术性重复。请参阅表6，检测结果显示，本发明提出的多种所述引物和多种所述探针检测所述突变标准品的值与所述突变标准品的理论突变比例非常接近，说明本发明提出的所述引物和多种所述探针可以实现对BCR-ABL融合基因的稳定有效地检测，并具有极高的检测灵敏度。
表6 BCR-ABL融合基因阳性样本检测
Figure RE-GDA0002840338170000103
Figure RE-GDA0002840338170000111
实施例三、临床样本中BCR-ABL融合基因的检测
本发明进一步比较所述BCR-ABL融合基因检测方法与现有技术(qPCR) 检测BCR-ABL融合基因的灵敏度的高低。本发明选取多个具有BCR-ABL融合基因突变的临床样本，分别用所述BCR-ABL融合基因检测方法和qPCR检测方法对其进行检测。所述临床样本来自本公司样本库，为20份Ph阳性CML 患者外周血样本。检测所述临床样本的引物和探针组合请参阅表4。
请参阅表7，检测结果表明，虽然qPCR检测与所述BCR-ABL融合基因检测方法均能够检测到阳性样本，但是对于7份BCR-ABL融合基因低频突变样本，所述BCR-ABL融合基因检测方法能够检测到，qPCR检测方法不能检测到。这证实相比qPCR检测方法，所述BCR-ABL融合基因检测方法检测 BCR-ABL融合基因突变的灵敏度更高。
表7临床样本中BCR-ABL融合基因的检测结果
Figure RE-GDA0002840338170000112
Figure RE-GDA0002840338170000121
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司
上海荻硕贝肯医学检验所有限公司
上海荻硕贝肯生物科技有限公司
上海荻硕贝肯基因科技有限公司
<120> BCR-ABL融合基因检测试剂盒和BCR-ABL融合基因检测方法
<130>
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
cacgccgcag tgccata 17
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
tccaacgagc ggcttcac 18
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
tccgctgacc aatcaataag ga 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
cactcagacc ctgaggctca a 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
tggaggaggt gggcatctac 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
cactcagacc ctgaggctca a 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
cgggaacctc ctggactacc 20
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
catggctgac gagatctgag tg 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
catcgtgggc gtccgcaaga 20
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
cccttcagcg gccagtagca tctga 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
cccttcagcg gccagtagca tctga 25
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
cagcagcacc acggcgttca cc 22

Claims (4)

1.一种BCR-ABL融合基因检测试剂盒，其特征在于，包括：
引物一，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
引物二，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
引物三，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
引物四，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
引物五，核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
引物六，核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
引物七，核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
引物八，核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
探针一，包括如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列一和分别连接所述核苷酸序列一5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；
探针二，包括如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列二和分别连接所述核苷酸序列二5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；
探针三，包括如SEQ ID No.11所示的核苷酸序列三和分别连接所述核苷酸序列三5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；以及
探针四，包括如SEQ ID No.12所示的核苷酸序列四和分别连接所述核苷酸序列四5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团。
2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述核苷酸序列一的5’端连接FAM荧光基团，所述核苷酸序列一的3’端连接MGB荧光基团；所述核苷酸序列二的5’端连接FAM荧光基团，所述核苷酸序列二的3’端连接MGB荧光基团；所述核苷酸序列三的5’端连接FAM荧光基团，所述核苷酸序列三的3’端连接MGB荧光基团；所述核苷酸序列四的5’端连接HEX荧光基团，所述核苷酸序列四的3’端连接MGB荧光基团。
3.一种BCR-ABL融合基因检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)获得待测样品RNA；
(2)利用引物一、引物二、引物七、引物八、探针一和探针四；或引物三、引物四、引物七、引物八、探针二和探针四；或引物五、引物六、引物七、引物八、探针三和探针四，以步骤(1)中获取的所述RNA为模板，进行数字PCR扩增，并收集荧光信号；
(3)分析步骤(2)中的荧光信号的强度的比值，计算BCR-ABL融合基因与ABL基因拷贝数比值，即得到BCR-ABL融合基因的突变比例；
其中，所述引物一的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述引物二的核苷酸序列如SEQID No.2所示；所述引物三的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述引物四的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述引物五的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；所述引物六的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；所述引物七的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；所述引物八的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；所述探针一包括如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列一和分别连接所述核苷酸序列一5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述探针二包括如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列二和分别连接所述核苷酸序列二5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述探针三包括如SEQ ID No.11所示的核苷酸序列三和分别连接所述核苷酸序列三5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述探针四包括如SEQ ID No.12所示的核苷酸序列四和分别连接所述核苷酸序列四5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团。
4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述核苷酸序列一的5’端连接FAM荧光基团，所述核苷酸序列一的3’端连接MGB淬灭基团；所述核苷酸序列二的5’端连接FAM荧光基团，所述核苷酸序列二的3’端连接MGB淬灭基团；所述核苷酸序列三的5’端连接FAM荧光基团，所述核苷酸序列三的3’端连接MGB淬灭基团；所述核苷酸序列四的5’端连接HEX荧光基团，所述核苷酸序列四的3’端连接MGB淬灭基团。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113789389A (zh) * 2021-11-18 2021-12-14 广东永诺医疗科技有限公司 人白血病bcr-abl融合突变一步法检测试剂盒
CN113943816A (zh) * 2021-12-03 2022-01-18 郑州思勤生物科技有限公司 核酸组合物、试剂盒以及其用途
CN114457165A (zh) * 2022-04-13 2022-05-10 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 一种用于检测hla-a02基因的引物探针组、试剂盒及检测方法
CN117385039A (zh) * 2023-11-07 2024-01-12 上海市第一人民医院 Nap1l1::mllt10融合基因、引物探针组合物、试剂盒及应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1814791A (zh) * 2005-02-02 2006-08-09 镇江市第一人民医院 实时定量PCR检测人P190bcr/ab1转录本试剂盒
CN102827937A (zh) * 2012-09-06 2012-12-19 上海源奇生物医药科技有限公司 一种检测白血病相关融合基因的引物和探针、及其试剂盒
CN104561331A (zh) * 2015-01-21 2015-04-29 苏州云泰生物医药科技有限公司 一种检测白血病相关融合基因的引物和探针、及其试剂盒
CN105838792A (zh) * 2016-04-22 2016-08-10 上海荻硕贝肯生物科技有限公司 用于定性检测白血病融合基因的引物、探针、试剂盒及方法
WO2020006098A2 (en) * 2018-06-26 2020-01-02 Children's National Medical Center Tumor-associated markers for detection of minimal residual disease using digital droplet pcr

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1814791A (zh) * 2005-02-02 2006-08-09 镇江市第一人民医院 实时定量PCR检测人P190bcr/ab1转录本试剂盒
CN102827937A (zh) * 2012-09-06 2012-12-19 上海源奇生物医药科技有限公司 一种检测白血病相关融合基因的引物和探针、及其试剂盒
CN104561331A (zh) * 2015-01-21 2015-04-29 苏州云泰生物医药科技有限公司 一种检测白血病相关融合基因的引物和探针、及其试剂盒
CN105838792A (zh) * 2016-04-22 2016-08-10 上海荻硕贝肯生物科技有限公司 用于定性检测白血病融合基因的引物、探针、试剂盒及方法
WO2020006098A2 (en) * 2018-06-26 2020-01-02 Children's National Medical Center Tumor-associated markers for detection of minimal residual disease using digital droplet pcr

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GEORG-NIKOLAUS FRANKE ET AL: "Comparison of Real-Time Quantitative PCR and Digital Droplet PCR for BCR-ABL1 Monitoring in Patients with Chronic Myeloid Leukemia", 《THE JOURNAL OF MOLECULAR DIAGNOSTICS》 *
JACQUELINE MAIER ET AL: "Optimized Digital Droplet PCR for BCR-ABL", 《THE JOURNAL OF MOLECULAR DIAGNOSTICS》 *
NICOLETTA COCCARO ET AL: "Droplet Digital PCR Is a Robust Tool for Monitoring Minimal Residual Disease in Adult Philadelphia-Positive Acute Lymphoblastic Leukemia", 《THE JOURNAL OF MOLECULAR DIAGNOSTICS》 *
SHAOGUANG LI ET AL: "The P190, P210, and P230 Forms of the Oncogene Induce a Similar Chronic Myeloid Leukemia–like Syndrome in Mice but Have Different Lymphoid Leukemogenic Activity", 《J. EXP. MED.》 *
SUNILA TASHFEEN ET AL: "Real Time Polymerase Chain Reaction in Diagnosis of Chronic Myeloid Leukemia", 《JOURNAL OF THE COLLEGE OF PHYSICIANS AND SURGEONS PAKISTAN》 *
Z. ZHENG ET AL: "Simultaneous detection of 45 fusion genes in leukemia by dual-color fluorescence real-time PCR", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF LABORATORY HEMATOLOGY》 *
林江 等: "应用实时定量PCR技术检测慢性粒细胞白血病患者bcr/abl P190融合基因转录本", 《江苏医药》 *
王文军: "数字PCR较荧光定量PCR可更敏感监测慢性粒细胞白血病患者BCR/ABL（P210）微小残留病及疾病进展", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（硕士） 医药卫生科技辑》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113789389A (zh) * 2021-11-18 2021-12-14 广东永诺医疗科技有限公司 人白血病bcr-abl融合突变一步法检测试剂盒
CN113943816A (zh) * 2021-12-03 2022-01-18 郑州思勤生物科技有限公司 核酸组合物、试剂盒以及其用途
CN114457165A (zh) * 2022-04-13 2022-05-10 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 一种用于检测hla-a02基因的引物探针组、试剂盒及检测方法
CN117385039A (zh) * 2023-11-07 2024-01-12 上海市第一人民医院 Nap1l1::mllt10融合基因、引物探针组合物、试剂盒及应用

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