CN1814791A - 实时定量PCR检测人P190bcr/ab1转录本试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人P190^bcr/abl融合基因转录本快速定量检测的实时定量PCR(RQ－PCR)试剂盒，该试剂盒通过实时定量PCR检测技术检测cDNA标本，可以对标本中P190^bcr/abl融合基因转录本的拷贝数进行精确定量。该试剂盒可以用于临床及科研中检测急、慢性白血病患者骨髓、外周血等标本中P190^bcr/abl的表达，用以明确诊断、指导治疗、预后判断和随访。

Description

实时定量PCR检测人P190bcr/abl转录本试剂盒

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种新的P190^bcr/abl转录本快速定量PCR检测试剂盒，使P190^bcr/abl转录本的测定更为快速、方便，并且能够精确定量。

背景技术

白血病包括急性和慢性白血病是威胁人类生命的主要疾病之一，目前呈逐年上升趋势。染色体易位所致的相关融合基因形成是引起白血病发生的一个重要分子基础，在白血病患者的诊断、预后判断、疗效判断和微小残留病(MRD)检测中具有十分重要的意义。t(9；22)易位导致bcr/abl融合基因形成，可见于95％以上的慢性粒细胞白血病(CML)、1～5％的成人急性髓系白血病(AML)和20～40％的成人急性淋巴细胞白血病(ALL)中。bcr/abl融合基因主要有两种形式：P210^bcr/abl和P190^bcr/abl。

P190^bcr/abl转录本检测主要通过聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)，该技术的基本原理是在待扩增的片段两端分别设计一个互补的寡核苷酸引物，在耐热DNA聚合酶的作用下，在体外以dNTPs为原料、以待测核酸为模板反复扩增，可以使微量目的核酸扩增上百万倍，再将产物在琼脂糖凝胶上电泳，以溴乙锭染色，在凝胶成像仪上观察结果，PCR技术已被广泛应用于各种感染性疾病和恶性肿瘤的分子诊断。目前PCR方法主要有定性和定量检测两种：定性检测主要应用巢式PCR，其优点是非常灵敏，但其缺点是仅能显示阳性、阴性结果，无具体数值，不能观察其动态变化和根据数值进行预后判断，且操作繁琐；定量方法为竞争性PCR，是在定性PCR的基础上，以不同稀释度的内参(修饰的对照核酸)与标本共同扩增，以内参的稀释度及结果作标准曲线，判断标本中目的核酸的量；虽然竞争性PCR能够准确定量，但是操作更为繁琐，难以在临床上常规开展。

随着技术的发展，又产生了实时定量PCR(real-time quantitative PCR，RQ-PCR)。TaqMan探针RQ-PCR技术及相应检测仪器如PE5700、PE7700的推出有效地克服定性PCR和竞争性定量PCR的不足，能快速、简便、特异地对P190^bcr/abl转录本进行精确定量。

发明内容

本发明试剂盒包含：PCR缓冲液、dNTPs、MgCl₂、特异性TaqMan探针、特异性引物、Taq酶、标准品和对照品。

特异性引物分上游引物和下游引物：

上游引物序列为：5’-GCAGATCTGGCCCAACGAT-3’，

下游引物序列为：5’-TCCAACGAGCGGCTTCAC-3’，

特异性探针序列为：5’-FAM-CGGCCAGTA GCATCTGACTTTGAGCCT-TAMRA-3’

标准品中所含P190^bcr/abl序列为：

CGCTCTCCCT CGCAGAACTC GCAACAGTCC TTCGACAGCA GCAGTCCCCC

CACGCCGCAG TGCCATAAGC GGCACCGGCA CTGCCCGGTT GTCGTGTCCG

AGGCCACCAT CGTGGGCGTC CGCAAGACCG GGCAGATCTG GCCCAACGAT

GGCGAGGGCG CCTTCCATGG AGACGCAGAA GCCCTTCAGC GGCCAGTAGC

ATCTGACTTT GAGCCTCAGG GTCTGAGTGA AGCCGCTCGT TGGAACTCCA

AGGAAAACCT TCTCGCTGGA CCCAGTGAAA ATGACCCCAA CCTTTTCGTT

GCACTGTATG ATTTTGTGGC CAGTGGAGAT AACACTCTAA GCATAACTAA

AGGTGAAAAG CTCCGGGTCT TAGGCTATAA TCACAATGGG GAATGGTGTG

AAGCCCAAAC CAAAAA

对照品分为阳性对照和阴性对照，阳性对照为有P190^bcr/abl的ALL患者的cDNA样品，阴性对照为正常人cDNA样品。

本试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。

本发明建立了利用TaqMan实时定量PCR技术检测P190^bcr/abl表达的方法，并经检测患者和正常对照标本，表明该方法切实可行。由于本方法采用的是先进的TaqMan荧光探针杂交定量PCR技术，可以对检测标本进行精确定量；并且由于使用的是互补探针，使得PCR扩增的特异性大为提高，降低了定性PCR扩增的假阳性率；此外，由于本方法采用的是闭管操作，不需电泳及凝胶成像等PCR后处理，使定性和竞争性定量PCR的后处理操作所引起的污染大为减少，并且使检测时间缩短工作更为简便。

本发明试剂盒使用方法：

每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。标准品用无菌去离子水稀释为10⁸～10²拷贝/μl。

扩增检测：在荧光定量PCR仪上进行，总体积25μl，其中μl无菌双蒸水、2.5μl PCR缓冲液、4μl MgCl₂、特异性引物各1μl、1μl TaqMan探针、1U Taq DNA聚合酶和1μl检测样品(标准品、待测cDNA、阳性对照或阴性对照)。反应条件为：95℃预变性5min，然后94℃15s、60℃1min共45个循环，根据所获得的标准曲线，计算得到待测标本中P190^bcr/abl转录本的量(拷贝数/μl)。

附图说明

图1为实时定量PCR标准品重复检测3次的荧光扩增曲线(10⁸～10²拷贝/μl)。

图2为实时定量PCR标准曲线。

具体实施方式

本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

实施例1

荧光定量PCR法检测P190^bcr/abl的表达

一、材料

Trizol试剂购自美国Gibco公司，MMLV逆转录酶、RNAsin购自美国Invitrogen公司，dNTPs、Taq DNA聚合酶购自美国MBI公司，PE5700荧光定量PCR仪为美国Perkin Elmer公司产品。

二、引物及探针设计与合成

以P190^bcr/abl全长cDNA序列(Genbank登录号X06418)为模板，使用Primer Express2.0软件(美国PE公司)设计RQ-PCR的引物和TaqMan探针序列，并应用Primer Premier5.0软件(美国PremierBiosoft公司)对所设计的序列进行评价，从中选择最佳组合。RQ-PCR上游引物序列为：5’-GCAGATCTGGCCCAACGAT-3’，

下游引物序列为：5’-TCCAACGAGCGGCTTCAC-3’，

TaqMan探针序列为：5’-FAM-CGGCCAGTA GCATCTGACTTTGAGCCT-TAMRA-3’，引物和探针均由上海博亚公司合成。

标准品PCR上游引物序列为：5’-CGCTCTCCCTCGCAGAACT-3’，

下游引物序列为：5’-TTTTGGTTTGGGCTTCACAC-3’，均由上海生工公司合成。

三、检测标准品制备：

取1例P190^bcr/abl阳性ALL患者骨髓标本经Ficoll液分离单个核细胞，RPMI1640无菌洗涤2次，离心收集细胞加入Trizol试剂提取总RNA，取2μg总RNA，在40μl反应体系中用六随机引物和MMLV对其进行逆转录后，用标准品PCR上下游引物在PE5700型PCR仪上进行PCR扩增，条件为95℃预变性5min，然后94℃30秒、58℃30秒、72℃60秒共扩增30个循环，最后于72℃延伸5分钟后置4℃保存。

PCR产物经凝胶电泳分离纯化，用T-A克隆法克隆入pMD18-T载体，并将阳性克隆经测序鉴定。标准品即为携带阳性克隆的pMD18-T载体，全长3108bp，测定其含量并稀释至10⁹拷贝/μl，置-20℃保存。

实施例2

荧光定量PCR法检测P190^bcr/abl转录本的应用

一、标本检测：

经形态学和细胞遗传学确诊的19例CML和2例ALL患者骨髓标本，应用Ficoll液分离单个核细胞(BMNC)，经PBS洗涤后离心收集细胞用加入Trizol提取总RNA，取2μg总RNA，在40μl反应体系中用六随机引物和MMLV对其进行逆转录后，用RQ-PCR上下游引物在PE5700型PCR仪上进行PCR扩增，条件为95℃预变性5min，然后94℃15秒、60℃1分钟共扩增45个循环。同时加标准品检测作标准曲线。测定结果经仪器处理根据标准曲线计算出检测标本的P190^bcr/abl表达量。

二、结果：

(一)标准曲线：

标准品检测结果参见图1，标准曲线参见图2。

(二)样品检测：

19例患者骨髓MNC标本检测结果如下：

病例	性别	年龄(岁)	诊断	e1a2
						CT	定量(拷贝数/μl)
				123456789101112131415161718192021	女男男男女男男男女女女男女男男男男男男女男			404154372231333910474928423935287028263316	CMLCMLCMLCMLCMLCMLCMLCMLCMLCMLCMLCMLCMLCMLCMLCMLCMLCMLCMLALLALL	34.8--37.236.6-37.7-36.638.0----37.8-36.236.636.628.229.39	107.5419.8541.6413.6330.6110.8212.6840.8628.8930.3912733.875671.46

本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.一种实时定量PCR检测人P190^bcr/abl融合基因转录本的快速定量检测试剂盒，其特征在于：PCR缓冲液、dNTPs、MgCl₂、特异性TaqMan探针、特异性引物、Taq酶、标准品和对照品。

2.根据权利1，反应体系为1×PCR缓冲液、0.3μM特异性引物、0.2mM dNTPs、4.0mMMgCl₂、0.2μM TaqMan探针、1U Taq酶。

3.根据权利1所述的试剂盒，其特征是：上下游特异性引物序列为5’-GCAGATCTGGCCCAACGAT-3’和5’-TCCAACGAGCGGCTTCAC-3’。

4.根据权利1所述的试剂盒，其特征是：特异性探针为荧光标记探针，其序列为5’-FAM-CGGCCAGTA GCATCTGACTTTGAGCCT-TAMRA-3’。

5.根据权利1所述的试剂盒，其特征是：标准品浓度为10⁹拷贝/μl，所含P190^bcr/abl序列为：

CGCTCTCCCT  CGCAGAACTC  GCAACAGTCC  TTCGACAGCA  GCAGTCCCCC

CACGCCGCAG  TGCCATAAGC  GGCACCGGCA  CTGCCCGGTT  GTCGTGTCCG

AGGCCACCAT  CGTGGGCGTC  CGCAAGACCG  GGCAGATCTG  GCCCAACGAT

GGCGAGGGCG  CCTTCCATGG  AGACGCAGAA  GCCCTTCAGC  GGCCAGTAGC

ATCTGACTTT  GAGCCTCAGG  GTCTGAGTGA  AGCCGCTCGT  TGGAACTCCA

AGGAAAACCT  TCTCGCTGGA  CCCAGTGAAA  ATGACCCCAA  CCTTTTCGTT

GCACTGTATG  ATTTTGTGGC  CAGTGGAGAT  AACACTCTAA  GCATAACTAA

AGGTGAAAAG  CTCCGGGTCT  TAGGCTATAA  TCACAATGGG  GAATGGTGTG

AAGCCCAAAC CAAAAA

6.根据权利1所述的试剂盒，其特征是：对照品分阴性对照和阳性对照，其中阴性对照为无P190^bcr/ab1的正常cDNA样品，阳性对照为有P190^bcr/ab1的ALL患者的cDNA样品。

7.根据权利1所述的试剂盒，其特征是：利用该试剂盒所设计的引物及探针进行的PCR进行P190^bcr/abl的定性和定量检测。

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