CN109913544A - 一种用于辅助诊断结核性胸膜炎的实时荧光定量pcr试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于辅助诊断结核性胸膜炎的实时荧光定量PCR试剂盒及其应用。所述的试剂盒中含有用检测结核杆菌特异性小RNA片段(包括Mtb‑ms‑1和Mtb‑ms‑2)的引物和探针，其中Mtb‑ms‑1的序列如SEQ ID NO.1所示，Mtb‑ms‑2的序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过提取胸膜炎患者少量胸水的总RNA，将其中结核杆菌特异性小RNA片段逆转录为互补的cDNA，应用特异引物探针进行实时荧光定量聚合酶链反应检测，其诊断的敏感性、特异性均较高，能够显著地区分结核性胸膜炎和对照组，优于结核杆菌培养、抗酸涂片染色、DNA检测等诊断方法。

Description

一种用于辅助诊断结核性胸膜炎的实时荧光定量PCR试剂盒 及其应用

技术领域

本发明涉及一种基于实时荧光定量聚合酶链反应法检测结核性胸膜炎患者胸水中结核杆菌编码的特异性小RNA片段的试剂盒，并应用于结核性胸膜炎的辅助诊断。本发明属于医药技术领域。

背景技术

结核病是世界范围内发病率最高、影响最大的感染性疾病之一，其中约1/4为肺外结核。结核性胸膜炎是发病率第二的肺外结核，仅次于淋巴结核，是渗出性胸膜炎的最常见病因。结核性胸膜炎的传统确诊手段包括结核杆菌培养、抗酸涂片染色、胸膜活检等，诊断的敏感性低，消耗时间长，常导致治疗时机的延误。近年来，针对结核杆菌核酸的分子检测技术，尤其是结核杆菌DNA的聚合酶链反应(PCR)检测，能够在耐热DNA聚合酶作用下直接扩增结核杆菌特异的基因片段，具有较高的诊断特异性和敏感性。然而，大型meta分析表明，MTB/RIF聚合酶链反应法等结核杆菌核酸检测在结核性胸膜炎中阳性率较低(22.7％～51.4％)，这是因为结核性胸膜炎属于少菌性感染(paucibacillaryinfection)，胸水中结核杆菌数量少。而且，MTB/RIF技术由于价格昂贵等原因，在世界范围很多地区难以得到推广。

研究显示，针对非编码性小RNA(non-coding small RNA)的检测，包括真核生物的microRNA等，是疾病的优秀生物标志物，其检测敏感性、特异性相当高。近年研究证明，细菌能够编码特异性的、长约20-30个核苷酸的小RNA片段，在体内表达、分泌，并具有生物学功能，具有作为感染性疾病诊断标志物的潜力。然而目前，胸水中结核杆菌编码的特异性小RNA的检测及其用于辅助结核性胸膜炎诊断的应用尚未见报道。

发明内容

本发明克服了结核性胸膜炎现有实验室诊断方法诊断敏感性低、耗时长、成本高的缺陷，提供了一种敏感、特异、快速的分子生物学检测方法，其诊断结核性胸膜炎的敏感性优于传统的结核杆菌检测和结核杆菌DNA检测等方法，因此能够作为结核性胸膜炎的新的诊断方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

一方面，本发明提出了一种作为辅助诊断结核性胸膜炎的生物标志物，所述的生物标志物为结核杆菌特异性小RNA片段，包括Mtb-ms-1和Mtb-ms-2，其中Mtb-ms-1的序列如SEQ ID NO.1所示，Mtb-ms-2的序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步的，本发明还提出了所述的生物标志物在制备辅助诊断结核性胸膜炎的试剂中的应用。

另一方面，本发明提出了一种用于检测所述的生物标志物的引物对和探针组合，其中，优选的，用于检测Mtb-ms-1的引物对序列如SEQ ID NO.3和4所示，探针序列如SEQ IDNO.5所示；用于检测Mtb-ms-2的引物对序列如SEQ ID NO.6和7所示，探针序列如SEQ IDNO.8所示。

进一步的，本发明还提出了所述的引物对和探针组合在制备辅助诊断结核性胸膜炎的试剂中的应用。

再一方面，本发明提出了一种用于辅助诊断结核性胸膜炎的实时荧光定量PCR试剂盒，所述的试剂盒中含有用于检测所述的生物标志物的引物对和探针组合，所述的生物标志物为结核杆菌特异性小RNA片段，包括Mtb-ms-1和Mtb-ms-2，其中，Mtb-ms-1的序列如SEQ ID NO.1所示，Mtb-ms-2的序列如SEQ ID NO.2所示。

其中，优选的，用于检测Mtb-ms-1的引物对序列如SEQ ID NO.3和4所示，探针序列如SEQ ID NO.5所示；用于检测Mtb-ms-2的引物对序列如SEQ ID NO.6和7所示，探针序列如SEQ ID NO.8所示。

其中，优选的，使用所述的实时荧光定量PCR试剂盒用于结核性胸膜炎的辅助诊断时，实时荧光定量PCR检测的体系为20μl，包括：ddH₂O 14.5μl，PCR缓冲液2μl，25mmol/lMgCl₂ 1.2μl，10mmol/L dNTP 0.4μl，耐热DNA聚合酶rTaq 0.3μl，用于检测所述的生物标志物的引物对0.4μl，探针0.2μl，cDNA模板1μl；

实时荧光定量PCR检测条件为：95℃5min，再95℃15s后60℃1min进行40个循环，读取Ct值。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明通过对胸水中结核杆菌编码的特异性小RNA片段进行荧光定量聚合酶链反应检测，应用于诊断结核性胸膜炎具有较高的敏感性和特异性，并能够应用于与非结核性感染性胸膜炎、肿瘤性胸膜炎的鉴别诊断。

附图说明

图1是基于结核杆菌特异性小RNA片段检测辅助诊断结核性胸膜炎的方法流程图。

图2是结核杆菌特异性小RNA片段Mtb-ms-1和Mtb-ms-2在结核性胸膜炎患者和对照组胸水中的表达的散点图，包括临床确诊的58例结核性胸膜炎、61例非结核感染性胸膜炎以及53例肿瘤性胸膜炎。每个点代表独立样本胸水中小RNA表达的绝对浓度(单位fmol/l)。TP：结核性胸膜炎；IP：非结核感染性胸膜炎；CP：肿瘤性胸膜炎；UD：undetectable，未检出。***P<0.0001。图中横线表示中位数和四分位数间距。

图3是应用结核杆菌特异小RNA片段Mtb-ms-1和Mtb-ms-2在结核性胸膜炎患者(n＝58)和非结核感染性胸膜炎(n＝61)、肿瘤性胸膜炎(n＝53)中的绝对浓度绘制的受试者工作特征曲线(ROC)。TP：结核性胸膜炎；IP：非结核感染性胸膜炎；CP：肿瘤性胸膜炎；AUC：area under the curve，曲线下面积。A-B是以Mtb-ms-1的绝对浓度绘制的ROC曲线，分别用于区分结核性胸膜炎和非结核感染性胸膜炎、结核性胸膜炎和肿瘤性胸膜炎。C-D是以Mtb-ms-2的绝对浓度绘制的ROC曲线，分别用于区分结核性胸膜炎和非结核感染性胸膜炎、结核性胸膜炎和肿瘤性胸膜炎。E-F是联用Mtb-ms-1和Mtb-ms-2两种指标绘制的ROC曲线，分别用于区分结核性胸膜炎和非结核感染性胸膜炎、结核性胸膜炎和肿瘤性胸膜炎。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1用于辅助诊断结核性胸膜炎的实时荧光定量PCR方法的建立

1、方法的建立

(1)胸水总RNA提取：

采集500μl胸水，加入1.5ml TRIzol LS试剂振匀，再加入0.3ml氯仿振匀，静置10分钟后16000g，20℃，20min离心，吸取上清，加入1.5倍上清体积的异丙醇，-20℃静置1小时。静置后16000g，4℃，20min离心，加入去除RNA酶的75％无水乙醇1ml，再16000g，4℃，20min洗涤1次，沉淀室温风干，溶于20μl除RNA水用于进一步检测。

(2)逆转录结核杆菌特异性小RNA片段：

配置逆转录体系10μl，包括除RNA水3.5μl，逆转录buffer 2μl，10mmol/l dNTP 1μl，逆转录引物1μl，逆转录酶AMV 0.5μl，RNA原液2μl。上机设置：16℃30min，42℃30min，85℃5min，4℃静置，获得cDNA。

(3)实时荧光定量聚合酶链反应法(RT-qPCR)检测：

使用Applied Biosystems 7500 Sequence Detection System进行RT-qPCR检测，20μl体系包括：ddH2O 14.5μl，PCR缓冲液2μl，25mmol/l MgCl₂ 1.2μl，10mmol/l dNTP 0.4μl，耐热DNA聚合酶Taq 0.3μl，用于检测所述的生物标志物Mtb-ms-1或Mtb-ms-2的引物对0.4μl，探针0.2μl，cDNA模板1μl。Mtb-ms-1的序列如SEQ ID NO.1所示，Mtb-ms-2的序列如SEQ ID NO.2所示。

PCR引物及探针序列如下表1所示：

表1引物及探针序列

上机设置：95℃5min hold，再95℃15s后60℃1min进行40个循环，读取Ct值，每个检测设三副平行孔。进一步，使用序列与目的RNA相同的合成单链RNA进行标准曲线检测，用已知浓度的标准品10倍等比梯度稀释，相同条件下进行RT-qPCR检测用于绝对浓度计算。

方法流程图如图1所示。

2、诊断效果

为了验证其诊断效果，我们在临床确诊的58例结核性胸膜炎、61例非结核感染性胸膜炎以及53例肿瘤性胸膜炎的胸水中，采用上述已建立的方法进行了结核杆菌特异性小RNA片段Mtb-ms-1和Mtb-ms-2的检测和比较。

结果证明：结核性胸膜炎组中两个结核杆菌小RNA片段Mtb-ms-1和Mtb-ms-2表达水平显著高于非结核感染性胸膜炎和肿瘤性胸膜炎组(P<0.0001)(见图2)；两种小RNA在结核性胸膜炎中表达阳性率分别为87.9％和75.9％，显著高于传统结核杆菌检测方法在结核性胸膜炎的检测阳性率；应用受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristiccurve，ROC)的统计学方法，我们发现联用Mtb-ms-1和Mtb-ms-2作为指标，其曲线下面积分别为0.83和0.81(见图3)，证明Mtb-ms-1和Mtb-ms-2能够较显著地区分结核性胸膜炎和非结核感染性胸膜炎和肿瘤性胸膜炎对照组。

序列表

<110> 哈尔滨医科大学

<120> 一种用于辅助诊断结核性胸膜炎的实时荧光定量PCR试剂盒及其应用

<130> KLPI190019

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 26

<212> RNA

<213> tubercle bacillus

<400> 1

acgauguaua cggacugacg ccugcc 26

<210> 2

<211> 31

<212> RNA

<213> tubercle bacillus

<400> 2

ccuggcucag gacgaacgcu ggcggcgugc u 31

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

aatctcgcac gatgtatacg gact 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 4

tatggttgtt cacgactgct tcac 24

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 5

catccctatc caaccataca gacggcaggc 30

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 6

actatctacc tggctcagga cgaa 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 7

tatggttgtt cacgactgct tcac 24

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 8

catccctatc caaccataca gacagcacgc 30

Claims (8)

1.一种作为辅助诊断结核性胸膜炎的生物标志物，其特征在于，所述的生物标志物为结核杆菌特异性小RNA片段，包括Mtb-ms-1和Mtb-ms-2，其中Mtb-ms-1的序列如SEQ IDNO.1所示，Mtb-ms-2的序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述的生物标志物在制备辅助诊断结核性胸膜炎的试剂中的应用。

3.用于检测权利要求1中所述的生物标志物的引物对和探针组合。

4.如权利要求4所述的引物对和探针组合，其特征在于，用于检测Mtb-ms-1的引物对序列如SEQ ID NO.3和4所示，探针序列如SEQ ID NO.5所示；用于检测Mtb-ms-2的引物对序列如SEQ ID NO.6和7所示，探针序列如SEQ ID NO.8所示。

5.权利要求3或4所述的引物对和探针组合在制备辅助诊断结核性胸膜炎的试剂中的应用。

6.一种用于辅助诊断结核性胸膜炎的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有用于检测权利要求1中所述的生物标志物的引物对和探针组合，所述的生物标志物为结核杆菌特异性小RNA片段，包括Mtb-ms-1和Mtb-ms-2，其中Mtb-ms-1的序列如SEQID NO.1所示，Mtb-ms-2的序列如SEQ ID NO.2所示。

7.如权利要求6所述的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，用于检测Mtb-ms-1的引物对序列如SEQ ID NO.3和4所示，探针序列如SEQ ID NO.5所示；用于检测Mtb-ms-2的引物对序列如SEQ ID NO.6和7所示，探针序列如SEQ ID NO.8所示。

8.如权利要求6或7所述的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，用于结核性胸膜炎的辅助诊断时，实时荧光定量PCR检测的体系为20μl，包括：ddH₂O14.5μl，PCR缓冲液2μl，25mmol/l MgCl₂ 1.2μl，10mmol/L dNTP0.4μl，耐热DNA聚合酶Taq0.3μl，用于检测所述的生物标志物的引物对0.4μl，探针0.2μl，cDNA模板1μl；

实时荧光定量PCR检测条件为：95℃5min，再95℃15s后60℃1min进行40个循环，读取Ct值。