CN101565742B

CN101565742B - 引物特异荧光pcr检测egfr突变的试剂盒

Info

Publication number: CN101565742B
Application number: CN 200810027672
Authority: CN
Inventors: 吴荃; 李明; 程钢; 何蕴韶
Original assignee: Daan Gene Co Ltd Zhongshan University
Current assignee: Guangzhou Da'an Gene Co ltd
Priority date: 2008-04-25
Filing date: 2008-04-25
Publication date: 2011-09-21
Anticipated expiration: 2028-04-25
Also published as: CN101565742A

Abstract

本发明提供了一种引物特异荧光PCR检测EGFR突变的试剂盒，特别涉及肿瘤组织以及肿瘤患者外周血清中EGFR基因突变的诊断。本试剂盒针对分子靶向抗癌药物疗效相关的特定突变位点，设计特异性的寡核苷酸引物序列和探针序列，对每一个待测样品，分别用野生型PCR体系和突变型PCR体系进行荧光PCR检测，通过两次反应Ct值差值(ΔCt)的大小，判断样品是否存在EGFR19外显子和21外显子的突变。本发明可对EGFR的特定位点是否存在突变进行检测，可用于分子靶向抗肿瘤新药的疗效预测和肿瘤患者临床个体化用药方案的指导。

Description

引物特异荧光PCR检测EGFR突变的试剂盒

技术领域

本发明涉及实时荧光PCR检测试剂盒，特别涉及以引物特异的实时定量荧光PCR技术检测表皮生长因子受体(Epithelium Growth Factor Recptor，EGFR)常见突变的试剂盒。

背景技术

由阿斯利康公司研制的吉非替尼(gefitinib，易瑞沙)EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)，是一种新型的肿瘤靶向治疗药物，有效地切断表皮生长因子受体向细胞内发出信号，从而阻碍肿瘤的发生发展。美国、日本和中国学者近几年的研究表明，EGFR的体细胞突变与NSCLC患者对吉非替尼的敏感性相关。对EGFR突变的肿瘤，Gefitinib的有效率高达80％-90％，而对没有EGFR突变的肿瘤Gefitinib绝大部分没有效果。EGFR蛋白酪氨酸激酶功能区由EGFR外显子18-24编码，迄今为止发现的EGFR突变主要发生在酪氨酸激酶域ATP结合域附近，约90％的突变为外显子19的碱基缺失和21外显子在第858为密码子的碱基替换突变。

目前国内外主要采用基因测序技术检测肿瘤组织中EGFR突变，但是测序方法步骤繁琐、周期长、对操作人员要求高，难以在临床上广泛开展。更重要的是由于测序方法本身的限制灵敏度不高，只能检测出突变基因占总基因15％~20％以上的突变，而肿瘤组织是一个异质性的组织，EGFR突变又是一种杂合性的突变-即肿瘤细胞的含有EGFR基因的两条DNA中只有一条发生突变，如果突变细胞在手术切除的肿瘤组织中的比例小于20％，则普通的测序方法无法检出。

实时荧光定量PCR技术是上世纪90年代中期基于传统的PCR技术发展起来的。与传统的(终点检测)PCR技术相比，实时定量检测方法不仅实现了低拷贝数靶多核苷酸的定量分析，而且还具有特异性和精确度更强、自动化程度更高以及污染的可能性更小等优点。扩增阻碍突变系统(amplification refractory mutation system，ARMS)，是进行根据PCR扩增引物与模板的匹配程度不同来区分单一位点突变型与野生型序列间差异的一种PCR方法。该方法设计扩增引物的3’端的最后一个碱基与突变型碱基对应，相应野生型模板就不能有效扩增。在这种定性的ARMS基础上，结合TaqMan定量技术，又发展了一种TaqMAMA方法(Taqmanmismatch amplification mutation assay)，该技术进一步将非特异扩增时引物与模板之间的引物不匹配程度从3’端的最后一个碱基扩展到了倒数第二个，由此得以成功地辨别单一位点突变[Warren E.Glaab et al，Mutation Research，430：1-12(1999)]。本发明主要就基于以上技术检测EGFR外显子中的常见突变。

目前文献中用荧光PCR方法检测EGFR突变基本上都是采用Taqman-MGB探针技术，MGB可以提高探针的Tm值，使探针设计更短，具有更好的淬灭效果，可以实现单点突变的检测。但是，一方面Taqman-MGB探针的设计对模板序列要求严格，难以保证在所有突变位置有合适的探针序列；另一方面，利用Taqman探针的特异性来检测突变需要针对每一个突变类型设计一对野生型和突变型探针，如EGFR外显子19的缺失突变据文献报道就有20种以上，如果要检测其中10种突变就需要20个荧光探针，而Taqman-MGB探针价格昂贵，多重探针的使用会大大增加检测成本。采用引物特异的荧光PCR方法则可以避免这两方面的问题，引物的设计更加简单，而且合成成本低廉，对同一位置的不同突变类型可以采用多重引物一个探针进行检测，既体现了荧光PCR方法简便，灵敏度高和特异性好的优点，有达到了降低检测费用的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测EGFR基因突变的实时荧光PCR试剂盒，可用于临床样品中EGFR基因常见突变检测。

为了完成上述任务，本发明的具体技术路线为：

(1)针对EGFR19外显子、21外显子突变位点设计的分别能够与野生型和突变型模板的上游或下游寡核苷酸引物，分别与EGFR 19外显子、21外显子野生型和突变型保守序列结合的下游或上游寡核苷酸引物和寡核苷酸探针。

(2)配制适宜于PCR扩增的反应体系。核酸扩增反应体系包括19外显子野生型检测体系(A)、19外显子突变型检测体系(B)、21外显子突变型检测体系(C)，每个检测体系中都包括耐热DNA聚合酶、dNTP、UNG酶、能够与双链靶多聚核苷酸的第二条链结合的反向引物、能够与靶多聚核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针、含有镁离子的缓冲液。

(3)从待测样本中提取DNA，加入前述的三个反应体系中，在荧光定量PCR以上进行PCR检测。

(4)确定样本在野生型检测体系、19外显子突变型检测体系、21外显子突变型检测体系的Ct值，分别标记为CtA，CtB和CtC，如果CtB-CtA＜阈值，则该标本EGFR外显子19有缺失突变，如果CtC-CtA＜阈值，则该标本EGFR外显子21有缺失突变，否则为野生型。

本发明提供的EGFR基因突变检测试剂盒包括以下组分：(1)野生型PCR反应液、19外显子突变PCR反应液、21外显子突变PCR反应液、酶系、阴性质控品、野生型质控品、19突变型质控品、21突变型质控品，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。其中酶系包含耐热DNA聚合酶、dNTPs、UNG酶和纯化水。

根据本发明一个优选的实施方案，其中试剂盒的野生型PCR反应液由PCR缓冲液、19型正向引物、19野生型反向引物、19型荧光探针和纯化水组成，其特征在于用于靶多核苷酸扩增的19型正向引物、19野生型反向引物和19型荧光探针的序列分别是：

19型正向引物(EGFR19-F)：5’-TCACAATTGCCAGTTAACGTCTTC-3’(SEQ ID NO：1)

19野生型反向引物(EGFR19-W-R)：5’-GCTTTCGGAGATGTTGCTTCTCT-3’(SEQ ID NO：2)

19型荧光探针(EGFR19-P)：5’X-TCTCACCTTCTGGGATCCAGAGTCCC-Y 3’(SEQ ID NO：3)，

其中X/Y表示荧光标记检测体系，分别为荧光发生基团和荧光淬灭基团。

根据本发明一个优选的实施方案，其中试剂盒的19外显子突变型PCR反应液由PCR缓冲液、19型正向引物、19突变型反向引物、19型荧光探针和纯化水组成，19突变型反向引物又包括19突变型1反向引物、19突变型2反向引物、19突变型3反向引物、19突变型4反向引物、19突变型5反向引物、19突变型6反向引物、19突变型7反向引物，其特征在于用于靶多核苷酸扩增的19型正向引物、19突变型反向引物和19型荧光探针的序列分别是：

19型正向引物(EGFR19-F)：5’TCACAATTGCCAGTTAACGTCTTC 3’(SEQ ID NO：1)

19突变型1反向引物(EGFR19-M1-R)：5’-TGGCTTTCGGAGATGTTTTGAT-3’(SEQ ID NO：4)

19突变型2反向引物(EGFR19-M2-R)：5’-TGGCTTTCGGAGATGTCTTGAT-3’(SEQ ID NO：5)

19突变型3反向引物(EGFR19-M3-R)：5’-TGTTGGCTTTCGGAGATTTGAT-3’(SEQ ID NO：6)

19突变型4反向引物(EGFR19-M4-R)：5’-TTGGCTTTCGGAGGTTCCTT-3’(SEQ ID NO：7)

19突变型5反向引物(EGFR19-M5-R)：5’-CCTTGTTGGCTTTCGATTCCT-3’(SEQ ID NO：8)

19突变型6反向引物(EGFR19-M6-R)：5’-GTTGGCTTTCGGAACCTTGAT-3’(SEQ ID NO：9)

19突变型7反向引物(EGFR19-M7-R)：5’-CTTGTTGGCTTTCGGTTCCTT-3’(SEQ ID NO：10)

根据本发明一个优选的实施方案，其中试剂盒的21外显子突变型PCR反应液由PCR缓冲液、21型正向引物、21突变型反向引物、21型荧光探针和纯化水组成，其特征在于用于靶多核苷酸扩增的21型正向引物、21突变型反向引物和21型荧光探针的序列分别是：

21型正向引物(EGFR21-F)：5’-GGAGGACCGTCGCTTGG-3’(SEQ ID NO：11)

21突变型反向引物(EGFR21-M-R)：5’-GCACCCAGCAGTTTGGCTC-3’(SEQ ID NO：12)

21型荧光探针(EGFR21-P)：5’X-TCTCACCTTCTGGGATCCAGAGTCCC-Y 3’(SEQ ID NO：13)

根据本发明的一个优选实施方案，试剂盒中的阴性质控品为生理盐水，野生型质控品、19突变型质控品和21突变型质控品分别为测序检测结果为EGFR野生型、外显子19突变型和21突变型的组织、血液或者细胞系提取的DNA。

根据本发明的一个优选实施方案，其中试剂盒的待检样品是从各种途径获取的含有肿瘤DNA的临床样品，包括手术切除的癌组织、肺石蜡包埋的肿瘤组织、穿刺组织、血清和胸水等。

根据本发明的一个优选实施方案，其中试剂盒所检测的EGFR21外显子突变指的是在EGFR酪氨酸激酶区的21外显子上的L858R点突变，EGFR19外显子突变指的是在EGFR酪氨酸激酶区的19外显子出现的常见缺失突变和复合突变等，如Del E746-A750(1)，Del E746-A750(2)，Del E746-T751，Del L747-T751insP，Del L747-S752insS，Del L747-S752ins V1，DelL747-S752等。

根据本发明的一个优选实施方案，其中试剂盒用于判定检测方法有效性的标准是：每次检测都使用野生型PCR反应液、突变型PCR反应液分别检测野生型质控品和突变型质控品，然后根据两次荧光PCR所得出的ΔCt值作为质量控制标准，对于野生型质控品ΔCt值应大于阈值，对于突变型质控品ΔCt值应小于阈值。

根据本发明的一个优选实施方案，试剂盒按照下述标准判定被检序列是野生型或者突变型：1)在ΔCt大于阈值的情况下，则该样品即可判定野生型；2)在ΔCt小于阈值的情况下，则该样品即可判定为突变型。

根据本发明的一个优选实施方案，试剂盒检测结果的阈值可以根据不同标本类型或者不同的灵敏度及特异性要求设为3-9之间的任意值，优选使用5-7之间的任意值。

根据本发明的一个优选实施方案，可以根据所扩增序列的特殊情况，例如CG碱基含量高和/或重复序列多等，在试剂盒的PCR缓冲液中加入甜菜碱、甲酰胺和二甲基亚砜等PCR反应添加剂。

本发明所述的EGFR基因突变检测试剂盒，针对用测序方法步骤繁琐、操作复杂、灵敏度低的缺点，采用引物特异的荧光PCR方法，分别针对TK区的每个外显子的设计野生型与突变型引物以及公用探针，利用荧光PCR方法灵敏、特异的优点，一次PCR操作即可检出多种常见突变，灵敏度至少可以达到1％。

本发明与现有的测序技术相比，具有下列优点：

(1)灵敏度更高，可以检出1％的突变模板，高于测序方法20％的灵敏度。

(2)全封闭反应，提取基因组DNA后，直接用PCR检测判断结果，避免了用PCR产物测序造成的污染；

(3)检测速度快，整个过程仅需4~5小时；

(4)操作简单，可控性强，可进行大批量样品检测，有利于临床操作。

附图说明

图1显示试剂盒质控品的扩增曲线，其中图1A显示野生型质控品的扩增曲线，图1B显示EGFR19突变型质控品的扩增曲线，图1C显示EGFR21突变型质控品的扩增曲线。

图2显示试剂盒检测EGFR 19外显子突变型的肺癌组织标本的扩增曲线。

图3显示试剂盒检测EGFR 21外显子突变型的肺癌组织标本的扩增曲线。

图4显示DNA提取失败的肺癌组织标本的扩增曲线，其中图4A中反应液A、B均无扩增曲线，说明DNA提取失败。图4B中B管无特异性增长曲线且CtA＞23，说明DNA浓度太低，不能用于PCR检测

具体实施方式

下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。

实施例1：EGFR基因突变检测试剂盒及其使用

(1)试剂盒的组成

PCR反应液A1管(820μl/管)、PCR反应液B1管(820μl/管)、PCR反应液C1管(820μl/管)、酶系1管(240μl/管)、野生型质控品1管(30ul/管)、19突变型标准品1管(30μl/管)、19突变型标准品1管(30μl/管)，阴性对照1管(30μl/管)。PCR反应液A包括19型正向引物、19野生型反向引物、19型荧光探针、PCR缓冲液、纯化水；PCR反应液B中包括19型正向引物、19突变型1-7反向引物、19型荧光探针、PCR缓冲液、纯化水；PCR反应液C中包括21型正向引物、21突变型反向引物、21型荧光探针、PCR缓冲液、纯化水；Taq酶系中包括UNG酶、dNTPs、Taq酶。

(2)核酸提取

取10-50mg新鲜组织或石蜡包埋组织样本或者200-500μl外周血清，建议使用Qiagen或者Roch DNA提取试剂盒提取基因组DNA，提取过程按照试剂盒说明书进行，最后收集到100μlDNA溶液。

(3)PCR检测

按比例取相应量的PCR反应液、Taq酶系(PCR反应液A和PCR反应液B 41μl/人份+Taq酶系4μl/人份)，充分混匀后按45μl/管分装至PCR反应管中，备用。向准备好PCR反应液A和B的PCR反应管中，分别加入处理后的同一个样品的DNA提取液5μl，并盖紧管盖，3000rpm离心2分钟，荧光定量PCR上机。PCR循环条件是：50℃3分钟→94度3分钟→(预扩增步骤)94度30秒，60度45秒，10个循环→94度15秒，60度(读荧光)60秒，进行30个循环；或40℃30分钟→94度30秒，60度(读荧光)45秒，进行40个循环(参见附图1)。选择荧光定量PCR仪上FAM/TAMRA通道进行荧光信号检测。

(4)结果分析

根据扩增曲线设置Baseline的start值、stop值以及Threshold的Value值(start值可以在1～10、stop值可以在5～20、Value值可以在0.01～0.2范围选择)，在Analysis菜单下选择Analyze自动分析结果。

(5)结果判定

A.对野生型质控品，A管有特异性增长曲线，B管和C管无特异性增长曲线(图1A)；对E19突变型质控品，A管和B管有特异性增长曲线，C管无特异性增长曲线(图1B)；对E21突变型质控品，A管和C管有特异性增长曲线，B管无特异性增长曲线。同时满足上述条件本次实验有效(图1C)。

B.每个样品均要同时进行A、B和C三管的检测，其Ct值分别记为Ct_A、Ct_B、Ct_C。试剂盒检测的最适DNA浓度范围为10ng/反应-500ng/反应，对应的Ct_A值范围约为12-20(对应的循环数为22-30)。

C.对同一样品，如果B管呈特异性增长曲线，且Ct_B-Ct_A＜6(图2)，则该标本EGFR外显子19有缺失突变，否则为野生型。

D.对同一样品，如果C管呈特异性增长曲线，且Ct_C-Ct_A＜6(图3)，则该标本EGFR外显子21有L858R的点突变，否则为野生型。

E.如果A，B，C管均无特异性增长曲线(参见附图4A)或者B，C管无特异性增长曲线且CtA＞23(循环数为33)(参见附图4B)，则该样本检测无效，需重新检测或者提取DNA。

序列表

Claims

1.一种采用引物特异的实时荧光聚合酶链反应技术检测EGFR突变的试剂盒，该试剂盒包括：野生型PCR反应液、19外显子突变PCR反应液、21外显子突变PCR反应液、酶系、阴性质控品、野生型质控品、19突变型质控品、21突变型质控品和分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。其中19外显子突变型PCR反应液由PCR缓冲液、19型正向引物、19突变型反向引物、19型荧光探针和纯化水组成，19突变型反向引物又包括19突变型1反向引物、19突变型2反向引物、19突变型3反向引物、19突变型4反向引物、19突变型5反向引物、19突变型6反向引物、19突变型7反向引物，用于靶多核苷酸扩增的19型正向引物、19突变型反向引物、19型荧光探针的序列分别是：

19型正向引物：5′-TCACAATTGCCAGTTAACGTCTTC-3′

19突变型1反向引物：5′-TGGCTTTCGGAGATGTTTTGAT-3′

19突变型2反向引物：5′-TGGCTTTCGGAGATGTCTTGAT-3′

19突变型3反向引物：5′-TGTTGGCTTTCGGAGATTTGAT-3′

19突变型4反向引物：5′-TTGGCTTTCGGAGGTTCCTT-3′

19突变型5反向引物：5′-CCTTGTTGGCTTTCGATTCCT-3′

19突变型6反向引物：5′-GTTGGCTTTCGGAACCTTGAT-3′

19突变型7反向引物：5′-CTTGTTGGCTTTCGGTTCCTT-3′

19型荧光探针：5’X-TCTCACCTTCTGGGATCCAGAGTCCC-Y 3’，其中X/Y表示荧光标记检测体系，分别为荧光发生基团和荧光淬灭基团；21外显子突变PCR反应液由PCR缓冲液、21型正向引物、21突变型反向引物、21型荧光探针和纯化水组成，用于靶多核苷酸扩增的21型正向引物、21突变型反向引物、21型荧光探针的序列分别是：

21型正向引物：5′-GGAGGACCGTCGCTTGG-3′

21突变型反向引物：5′-GCACCCAGCAGTTTGGCTC-3′

21型荧光探针：5’X-TCTCACCTTCTGGGATCCAGAGTCCC-Y 3’，其中X/Y表示荧光标记检测体系，分别为荧光发生基团和荧光淬灭基团；野生型PCR反应液由PCR缓冲液、19型正向引物、19野生型反向引物、19型荧光探针和纯化水组成，用于靶多核苷酸扩增的19型正向引物、19野生型反向引物、19型荧光探针的序列分别是：

19型正向引物：5′-TCACAATTGCCAGTTAACGTCTTC-3′

19野生型反向引物：5′-GCTTTCGGAGATGTTGCTTCTCT-3′

19型荧光探针：5’X-TCTCACCTTCTGGGATCCAGAGTCCC-Y 3′，其中X/Y表示荧光标记检测体系，分别为荧光发生基团和荧光淬灭基团。

2.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于酶系中包含Taq酶、dNTP和UNG酶。

3.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于阴性质控品为生理盐水，野生型质控品、19突变型质控品和21突变型质控品分别为测序检测结果为EGFR野生型、外显子19突变型和21突变型的组织、血液或者细胞系提取的DNA。

4.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于每个样品野生型和突变型体系荧光PCR测得的_ΔCt值是指同一样品在突变型PCR体系扩增的Ct值减去其在野生型PCR体系扩增的Ct值的差值。