CN102586401A - 一种检测人结直肠癌braf基因突变的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测基因突变的方法和试剂盒，具体涉及一种检测BRAF基因突变的方法和试剂盒。其特征在于，所述试剂盒包括用于对BRAF基因第15号外显子密码子V600E进行基因分型的特异性探针，所述第15号外显子密码子V600E的特异性探针包含V600E密码子的核苷酸序列。本发明的试剂盒采用常规PCR扩增结合Cold-PCR富集扩增产物的技术和高分辨熔解曲线分析技术，完成对样本基因分型的判断。

Description

一种检测人结直肠癌BRAF基因突变的方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术和医学领域，具体涉及一种检测BRAF基因突变的方法和试剂盒。

背景技术

结肠癌是人类常见的恶性肿瘤之一。近年来研究发现结肠癌的发生途径除经典的“腺瘤-癌”途径外，还存在“畸形隐窝灶-增生性息肉-锯齿状腺瘤-癌”途径，即锯齿状腺瘤途径。该途径由有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activedprotein kinases，MAPK)/细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulatedkinases，ERK)信号通路调控，BRAF基因是其重要的调控因子。

BRAF基因全名为鼠类肉瘤滤过性毒菌(v-raf)致癌同源体B1，定位于人染色体7q34，其具有功能的编码区由2510对碱基组成，编码MAPK通路中的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，BRAF蛋白位于MAPK/ERK途径的入口处，将信号从RAS转导至MEK1/2，从而参与调控细胞内多种生物学事件。在结直肠癌(CRC)中，BRAF突变率约为15％左右，这些突变主要发生于外显子15上的激活区，其中约92％位于第1799位核苷酸上(T突变为A)，导致其编码的谷氨酸由缬氨酸取代(V600E)。

有研究发现，在结肠癌EGFR靶向药物的临床治疗中，KRAS基因突变会使肺癌患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂产生耐药；使结直肠癌患者对抗EGFR抗体类药物(西妥西单抗、帕尼单抗)产生耐药。但是在KRAS野生型患者中使用抗EGFR单抗治疗，部分没有KRAS基因突变的患者也会对EGFR靶向药物产生耐药性，研究证明这主要是由于KRAS下游的BRAF基因V600E突变造成的。进一步研究显示，KRAS下游基因BRAF突变状况与西妥昔单抗和帕尼单抗的耐药有关：在KRAS野生型的患者中，有5％左右的BRAF基因突变，BRAF基因突变的患者对西妥昔单抗和帕尼单抗治疗均无反应，并且无进展生存(PFS)和总生存(OS)均较BRAF野生型的患者短。Lambrechts等在2009年ASCO会议上报道BRAF的突变率为5％，与KRAS基因突变具有排他性；BRAF野生型与客观疗效及生存获益明显相关。CAIRO-2研究中，BRAF野生型患者的PFS与OS均优于BRAF基因突变型患者。提示BRAF野生型患者可从抗EGFR单抗治疗中获益。

美国国家癌症综合网络(NCCN)在2010年版的结肠癌病理评估原则4-3中指出肿瘤患者接受EGFR靶向药物治疗之前，必须进行KRAS基因突变检测，根据检测结果决定是否使用EGFR靶向药物作为临床治疗措施。同时NCCN新增了针对KRAS基因检测无突变的患者，在诊断检测中推荐加入BRAF基因状态检测的评估原则，并指出对于KRAS基因野生型但同时具有BRAF V600E突变的患者，似乎抗EGFR抗体靶向治疗无效，已知BRAF突变的患者似乎不能从抗EGFR抗体靶向的治疗中获益。因此BRAF基因突变检测能提高肿瘤临床治疗的针对性，降低治疗费用，节省宝贵的治疗时间。

但是，尽管BRAF基因突变的意义已得到重视和临床应用，目前全球范围内仍缺乏标准化的检测方法。

传统的直接测序方法一直是公认的“金标准”，但是这种方法的灵敏度低，要求突变率达到20％-30％时才能检出，因此需要显微切割或选择性组织抽提来富集突变细胞。且费用高、通量低、检测周期长，临床应用局限性大。

限制性片段多态性分析(RFLP)虽然具有较高的灵敏度，但所检测的突变位点必须具有限制性内切酶的酶切位点，实际设计和操作复杂。

高效变性液相(dHPLC)的灵敏度在5％-10％之间，但只能区分杂合型样本，当检测纯合型样本时，需要掺入野生型样本混合成杂合型来检测，带来额外的检测费用、延长了检测周期。

上面的几种检测方法由于自身的缺陷，在临床应用方面局限性较大，至今仍然只是作为一种检测方法，而非成品试剂盒。

高分辨率熔解(High-resolution melting，简称HRM)分析是一门新兴的技术。它仅仅通过PCR之后的熔解曲线分析，就能检测PCR片段的微小序列差异，从而应用在突变扫描、序列配对和基因分型等多个方面。HRM既可以对未知突变进行筛查、扫描，也可以对已知突变进行分析。相对于传统的突变分析而言，操作步骤大大简化，时间和成本也降低了不少。而且样品经PCR扩增后直接进行HRM分析，无需转移，真正实现了闭管操作，降低了污染的风险。

现有技术中，采用高分辨率熔解分析BRAF基因突变的报道有：

1、Martin Pichler等人采用HRM方法从野生型DNA样本背景中检测出1％的BRAF基因突变。在与DNA测序法、实时等位基因特异性PCR(eal-timeallele-specific PCR)、高效变性液相色谱法等方法比较后，证明HRM方法比DNA测序和高效变性液相色谱法的敏感度更高，与实时等位基因特异性P CR的灵敏度一致。通过对60例石蜡包埋的结直肠癌组织标本进行HRM法检测并用DNA测序法进行验证，HRM检测结果与DNA测序法一致。结论是，HRM分析是检测BRAF基因V600E突变的有效手段。该方法有高灵敏度，高通量的特点，可以用于临床石蜡包埋组织标本的检测。(参考：Martin Pichler，MarijaBalic，Journal of Molecular Diagnostics 2009，v080100)

2、苏州为真生物医药有限公司销售一种BRAF基因突变试剂盒，采用高分辨率熔点曲线分析，可在配有HRM模块的荧光定量PCR仪器(如LightCylcer480等)上分析，用于检测B RAG基因的热点突变区V600E(1799T＞A)。试剂盒可用于新鲜或酒精固定、石蜡包埋的手术标本，也可用于微量的穿刺或活检标本、血液标本、粪便标本等非手术标本的检测。

现有的试剂盒虽然采用了HRM的方法，但是在实际中，往往需要后续的PCR富集和DNA测序来对检出的突变进行基因分型，因此对突变位点的准确识别可以将与肿瘤的预后和靶向治疗疗效密切相关的突变与其他突变有效的区分开来，有利于临床分析和科学研究。

发明内容

本发明目的是提供一种含有特异性探针的检测人结直肠癌BRAF基因突变的试剂盒，弥补HRM检测只能进行突变筛查的缺点，实现基因分型，通过对检测试剂以及检测条件的优化，使该试剂盒的操作简单快速、检测结果更为稳定、检测成本也更低。

为达到上述目的，本发明采用的技术方法是：一种检测人结直肠癌BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包括用于对BRAF基因第15号外显子的密码子600进行基因分型的特异性探针，所述的特异性探针包含密码子600的核苷酸序列，所述BRAF基因具有SEQ ID No：1的连续核苷酸序列。所述的特异性探针为SEQ ID No.2。

所述的特异性探针3’端经封闭处理、无法延伸。

所述的试剂盒还包括PCR缓冲液、dNTP、Taq DNA聚合酶、特异性引物对、SYTO 9荧光染料、水和野生型对照，其中特异性引物选自：

所述反应体系，每20μl PCR反应体系终浓度组成为：2μl PCR缓冲液(10×)、0.6-1.0μl氯化镁溶液、1.6μl dNTP、0.1-0.3μl Taq DNA聚合酶、100-200nM正向引物和20-40nM反向引物、100-200nM特异性探针，2-5μl SYTO9荧光染料，其余为水。

上述技术方案中，所述DNA聚合酶具有热启动特征，活力为5个单位每微升；所述DNA荧光染料为饱和荧光染料SYTO 9，浓度为50μM。

上述技术方案中，10×的PCR缓冲液(数字10表示使用时稀释的倍数)，由Tris·Cl，KCl，(NH₄)₂SO₄，15mM MgCl₂组成，pH 8.7。

上述技术方案中，所述的mM和μM是摩尔浓度的单位，指的是每升溶液中所含溶质的摩尔数。

上述技术方案中，所述的SYTO 9是高灵敏度的DNA荧光染料，可与双链DNA结合，在高浓度的情况下对P CR反应仍没有抑制作用。

上述试剂盒可以测定人源的基因组DNA，样品没有限制如，体液(包括血液、腹水)、组织细胞(肿瘤组织)等，通过提取和纯化这些样品可制备基因组DNA。

上述技术方案中，从基因组DNA中，扩增含BRAF第15号外显子600密码子基因的DNA片段，以获得用于测定熔解曲线，设计的引物位于人BRAF基因外显子15中，具体序列为SEQ ID No：1。

上述技术方案中，通过扩增含BRAF基因600密码子的DNA片段获得的样品，特别适于用作测定材料。例如，可按PCR方法，使用引物进行扩增，此引物经合理设计以便仅扩增含BRAF基因600密码子的部分。本发明特异性引物为本发明的发明点之一，该引物本领域技术人员可经常规制备引物的方法制备。待扩增区的碱基长度不受限制，但推荐小于150个碱基的片段。当按本发明所述制备引物时，可获得适宜的测定样品，其作为扩增的DNA片段，并具有特异性长度。

本发明的另一个目的在于一种检测BRAF因第15号外显子突变和基因分型的方法，其特征在与所述方法包括以下步骤：

1)按照常规方法采集待分析的基因组DNA；

2)对上述基因组DNA进行BRAF基因15外显子的PCR扩增，再将得到的PCR扩增产物用Cold-PCR进行富集；反应完成后，将扩增产物再进行变复性；

3)对上述扩增产物进行熔解曲线分析，运行熔解曲线，记录出峰温度，运行Genescan自动分析程序，通过与野生型对照进行对比，软件自动区分野生型和突变型。在通过Genescan软件确定样本基因发生突变后，比较样本和阳性对照的熔解曲线中的小探针结合序列的出峰温度，如果两者的出峰温度一致，则表明样本在BRAF基因第15号外显子600密码子处出发生突变；如果两者的出峰温度不一致，则表明样本在BRAF第15号外显子600密码子以外的位点发生基因突变。

在本发明的检测BRAF基因突变的试剂盒中，将待测样本稀释到同一浓度，同时做野生型对照，加入试剂盒中，进行一次PCR反应，运行熔解曲线，用Genescan软件进行数据分析，即可区分野生型和突变型，并对检出的突变进行基因分型。本发明适用于BRAF基因第15号外显子的第600个密码子(V600E)的突变检测和基因分型。

其中，步骤2)中，所述的引物对可以是下表序列：

其中，步骤2)中，所述的特性探针序列为SEQ ID No：2。

每20μl的PCR扩增体系包括：基因组DNA溶液、2μl PCR缓冲液(10×)、0.6-1.0μl氯化镁溶液、1.6μl dNTP、0.1-0.3μl Taq DNA聚合酶、100-200nM正向引物和20-40nM反向引物、100-200nM特异性探针，2-5μlSYTO 9荧光染料，其余为水，

PCR扩增的过程为：95℃15分钟，95℃15秒，60℃15秒，72℃15秒，进行20个循环。

Cold-PCR富集的过程为：82℃15秒，60℃15秒，72℃15秒，15个循环，72℃2分钟。

反应完成后，将PCR产物再进行变复性，95℃30秒，50℃1分钟。

上述技术方案中，步骤2)中加入的基因组DNA溶液的体积根据提取液中DNA浓度而调整，使加入的DNA量达到10ng。

上述技术方案中，步骤3)中，PCR扩增产物样本在LightCycler 480仪中进行熔解曲线分析。仪器以0.2℃/s的速度从72℃升温到95℃，获得样品的熔解曲线。

本发明的主要原理是：

1)采用HRM技术在PCR反应前加入饱和荧光染料，在一定温度范围内将PCR扩增产物进行变性，使DNA双链逐渐解链，此时荧光染料分子逐渐从DNA双链上脱落，荧光信号下降。第15号外显子的600位密码子发生突变后，经过特异性引物扩增的PCR产物的熔解温度(Tm值)会发生改变，LightCycler 480通过光学检测荧光信号并绘制温度熔解曲线，根据曲线准确区分野生型和突变型。

2)COLD-PCR是一项新的低丰度突变富集技术，它与常规PCR的最大区别是在PCR过程中采用了关键变性温度(Tc)，这个Tc比标准的变性温度低，因此在Tc温度的情况下，只有异源双链会变性解链并随后与引物配对扩增，而变性温度较高的同源双链则不会解链，从而也不能扩增。数个循环后，突变型基因组得到了优势扩增，在总基因组中所占比例增加，得到了突变富集的目的。由于起始的模板量较少，我们选择采用了常规PCR与COLD-PCR结合的技术路线，先使用的标准变性温度，进行20个循环的常规PCR；紧接着，采用的关键变性温度，进行15个循环的COLD-PCR。

3)特异性探针结合HRM技术，在突变筛查基础上可以进行基因分型。特异性探针包含了BRAF密码子600的序列，且与扩增产物互补。在PCR体系中，我们调整了反向引物的浓度，其浓度为正向引物的五分之一，这样的不对称PCR可以大量扩增出正向引物的PCR产物，而只扩增少量反向引物产物。在熔解初期，特异性探针与大量单链正向引物产物互补配对，由此在熔解过程中，随着温度的升高会先后出现两段荧熔解曲线，一段是由特异性探针引起的，另一段则是常规的双链PCR产物引起的。当常规的双链PCR产物的熔解曲线显示为突变型时，我们可以通过特异性探针的熔解曲线来确定突变是否发生在密码子V600E上，或是发生在其他位置的新突变。

因此，本发明通过上述优化的引物，根据PCR方法扩增所需DNA片段。光学检测荧光信号变化产生温度熔解曲线证实，它们显示不同的熔解曲线。根据在上述方法中获得的熔解曲线，可测定BRAF第15号外显子的突变情况。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1、本发明提供的BRAF密码子V600E突变检测试剂盒，采用的是一种生物学的检测方法，与现有检测试剂盒相比，具有显著的进步，如本发明试剂盒对于样本没有特殊的限制，无论是体液还是细胞均可作为本发明的检测样本，使得检测方便快捷。

2、本发明设计的特异性引物对待扩增区的碱基长度无严格要求，通过本发明特异性引物可获得本发明所述的PCR产物并进行高分辨率熔解曲线分析。

3、本发明在PCR反应体系中添加了特异性的探针，通过不对称PCR反应，可将已知的突变频率最高的密码子突变与扩增片段内的其他突变位点有效区分，基因分型更为精确。

4、本发明与现有技术相比引入了COLD-PCR富集技术，操作简便，检测成本低廉，且检测结果准确，灵敏度高达0.1％-0.05％，具有很好的临场应用价值和市场价值。

附图

图1实施例二中BRAF V600E野生型、纯合突变以及杂合突变三种基因型的熔解曲线；

图2实施例三中试剂盒的灵敏度测试

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：样本的选择和基因组DNA的提取

收集的基因组DNA分别来源于全血、细胞、新鲜组织以及石蜡固定组织，提取方法参照试剂盒提供的操作手册，同时做了部分优化。

健康人全血基因组DNA作为实验的野生型对照，使用康为世纪的BloodGen Mini Kit提取；

来源于colo201细胞株的基因组DNA作为实验的BRAF基因第15号外显子V600E纯合突变型(1799T＞A)对照，

来源于HT29细胞株的基因组DNA作为实验的BRAF基因第15号外显子V600E杂合突变型(1799T＞A)对照，使用康为世纪的DNA FlexGenDNA Kit提取；

而新鲜组织和石蜡组织均来源小鼠，用于评估HRM方法对固定组织的适应性，使用康为世纪的DNA TissueGen DNA Kit提取。

细胞株     组织来源    突变情况    基因型    氨基酸

colo201    结直肠癌    1799T＞A    纯合子    V600E

HT29       结直肠癌    1799T＞A    杂合子    V600E

基因组DNA全部符合实验室质控要求：OD260/280介于1.8-2.0；电泳结果显示，除石蜡固定组织外，其余基因组DNA片段都是10kb以上的大片段，而石蜡固定组织的基因组DNA存在部分降解，片段大小分布在1000-23kb之间。

DNA溶液浓度调整至10ng每微升，-20℃保存备用。

实施例二：突变位点的识别

采用HRM技术对已知BRAF基因第15号外显子V600E密码子基因型的样本进行检测。

1.特异性引物和探针如下：

SEQ ID No：3，Forward primer：

5’-ACAACTGTTCAAACTGATGGGACC-3’

SEQ ID No：4，Reverse primer：

5’-TCCTTTACTTACTACACCTCAGATAT-3’

SEQ ID No：2，特异性探针：5’-TCTAGCTACAGTGAAATCTCGAT-3’

2.通过PCR扩增V600E密码子附近部分片段；制备混合液：加入之前制备的基因组DNA溶液1μl、2μl PCR缓冲液(10×)、1.6μl dNTP、0.1μlTaq DNA聚合酶、正向引物0.4μl和反向引物各0.08μl、SYTO 9荧光染料2μl，加PCR级别的纯水使反应体积为20μl。反应在95℃15分钟，95℃15秒，60℃15秒，72℃15秒，进行20个循环，82℃15秒，60℃15秒，72℃15秒，进行15个循环，72℃2分钟；反应完成后，将PCR产物再进行变复性，95℃30秒，50℃1分钟。

3.通过将样本在LightCycler 480仪中进行熔解曲线分析。仪器以0.2℃/s的速度从72℃升温到95℃，获得样品的熔解曲线，如图1所示，图1为V600E密码子分型数据图；根据样品的熔解曲线，区分基因型。

上述实施例结果验证：

实验可有效识别BRAF基因第15号外显子V600E的纯合突变和杂合突变样本。

实施例三：试剂盒敏感性验证

将纯合突变型的colo201基因组和全血中提取的野生型基因组按一定比例混合，使纯合突变型基因组占总DNA量的0.05％。上述混合基因组DNA与野生型基因组DNA浓度调整为10ng每微升。

1.特异性引物和探针如下：

SEQ ID No：3，Forward primer：

5’-ACAACTGTTCAAACTGATGGGACC-3’

SEQ ID No：4，Reverse primer：

5’-TCCTTTACTTACTACACCTCAGATAT-3’

SEQ ID No：2，特异性探针：5’-TCTAGCTACAGTGAAATCTCGAT-3’

2.通过PCR扩增V600E密码子附近部分片段；制备混合液：加入之前制备的基因组DNA溶液1μl、2μl PCR缓冲液(10×)、1.6μl dNTP、0.1μlTaq DNA聚合酶、正向引物0.4μl和反向引物各0.08μl、SYTO 9荧光染料2μl，加PCR级别的纯水使反应体积为20μl。反应在95℃15分钟，95℃15秒，60℃15秒，72℃15秒，进行20个循环，82℃15秒，60℃15秒，72℃15秒，进行15个循环，72℃2分钟；反应完成后，将PCR产物再进行变复性，95℃30秒，50℃1分钟。

3.通过将样本在LightCycler 480仪中进行熔解曲线分析。仪器以0.2℃/s的速度从72℃升温到95℃，获得样品的熔解曲线，如图2所示，图2为V600E密码子分型数据图；根据样品的熔解曲线，区分基因型。

上述实施例结果分析：

按实施例2中提到的分型方法，试剂盒可以明确检测出含0.05％纯合突变的样本。具体基因型如图3所示，本实施例说明传统的PCR-HRM技术在引入COLD-PCR之后，试剂盒的敏感性大为提高，最高可达0.05％。

实施例四：检测试剂盒

本发明试剂盒由以下试剂组成，来源如下，本发明试剂盒供10人份检测应用，-20℃保存：

组分	体积(μl)	来源
			PCR缓冲液(10×)	25	Qiagen
dNTP混合液(每种碱基2.5mM)	20	Takara
			MgCl2(25mM)	10	Qiagen
FO引物(10μM)	6	自制
			RE引物(2μM)	6	自制
特异性探针(10μM)	6	自制
			Taq DNA聚合酶(5U/μl)	1.5	Qiagen
SYTO 9饱和荧光染料(50μM)	25	Invitrogen

Claims (10)

1.一种检测人结直肠癌BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括用于对BRAF基因第15号外显子的密码子600进行基因分型的特异性探针，所述的特异性探针包含密码子600的核苷酸序列，所述BRAF基因第15号外显子具有SEQ ID No：1的连续核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的一种检测人结直肠癌BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于：特异性探针为SEQ ID No.2。

3.根据权利要求1所述的一种检测人结直肠癌BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于：特异性探针3’端经封闭处理、无法延伸。

4.根据权利要求1所述的检测人结直肠癌BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于：试剂盒还包括PCR缓冲液、dNTP、DNA聚合酶、特异性引物对、SYTO 9荧光染料、水和野生型对照，其中特异性引物选自：

5.根据权利要求1所述的检测人结直肠癌BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于：每20μl PCR反应体系终浓度组成为：2μl 10×PCR缓冲液、0.6-1.0μl氯化镁溶液、1.6μl dNTP、0.1-0.3μl Taq DNA聚合酶、100-200nM正向引物和20-40nM反向引物、100-200nM特异性探针，2-5μl SYTO 9荧光染料，其余为水。

6.一种检测人结直肠癌BRAF基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)按照常规方法采集待分析的基因组DNA；

2)对上述基因组DNA进行BRAF基因15号外显子的PCR扩增，再通过Cold-PCR富集扩增产物；反应完成后，将扩增产物再进行变性熔解；

3)根据高分辨率熔解曲线法对扩增后的BRAF基因进行突变位点检测。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤2中PCR扩增的过程为95℃15分钟，95℃15秒，60℃15秒，72℃15秒，进行20个循环。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤2中Cold-PCR富集过程为82℃15秒，60℃15秒，72℃15秒，进行15个循环；72℃2分钟；反应完成后，将扩增产物再进行变复性，90℃30秒，50℃1分钟。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤2中加入的DNA提取液的体积根据提取液中DNA浓度而调整，使加入的DNA量达到10ng。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤3中，P CR扩增产物样本在LightCycler 480仪中进行熔解曲线分析，仪器以0.2℃/s的速度从72℃升温到95℃，获得样品的熔解曲线。

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