CN106399582B

CN106399582B - 一种检测与结直肠癌靶向用药西妥昔单抗治疗敏感性相关基因的多态性的试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN106399582B
Application number: CN201611182675.8A
Authority: CN
Inventors: 眭飞; 欧阳华芳
Original assignee: Shanghai Xingyuan Ruimin Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: Shanghai Xingyuan Ruimin Biological Engineering Co Ltd
Priority date: 2016-12-20
Filing date: 2016-12-20
Publication date: 2019-12-24
Anticipated expiration: 2036-12-20
Also published as: CN106399582A

Abstract

本发明公开了一种检测与结直肠癌靶向用药西妥昔单抗治疗敏感性相关基因的多态性的试剂盒，该试剂盒中含有检测FCGR2A基因4541T位点和FCGR3A基因5872G位点的探针和引物，所述探针和引物能与FCGR2A基因4541T位点和FCGR3A基因5872G位点前后的基因序列特异性结合并扩增出包含FCGR2A基因4541T位点和FCGR3A基因5872G位点的基因序列。本发明是基于Taqman分型方法检测基因多态性的试剂盒，该试剂盒能准确、快速、简便的检测结直肠癌靶向用药西妥昔单抗治疗敏感性相关基因位点FCGR2A基因4541T和FCGR3A基因5872G多态性。

Description

一种检测与结直肠癌靶向用药西妥昔单抗治疗敏感性相关基因的多态性的试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测与结直肠癌靶向用药西妥昔单抗治疗敏感性相关基因多态性的试剂盒及其应用。

背景技术

FCGR2A基因编码的蛋白是巨噬细胞和中性粒细胞表面的免疫球蛋白Fc受体，参与吞噬和清除免疫复合体的生物学过程。人类FCGR2A基因位于1q23，含有6个外显子，编码317个氨基酸，编码蛋白为35KD。研究发现，表达于免疫系统细胞的球蛋白Fc区段受体与自身抗体或者自身免疫病中免疫复合物触发的致病过程相关，也与某些免疫治疗的有效性相关。此外，研究报道FCGR2A基因多态性与多种疾病相关，例如4541T（rs1801274）多态性与淋巴瘤、疟疾、系统性红斑狼疮等疾病相关。

FCGR3A编码免疫球蛋白G的Fc段受体，参与抗体依赖的反应中抗原-抗体复合物的清除。人类FCGR3A基因位于1q23，含有6个外显子，编码290个氨基酸，编码蛋白为33KD。研究发现，表达于免疫系统细胞的球蛋白Fc区段受体与自身抗体或者自身免疫病中免疫复合物触发的致病过程相关，也与某些免疫治疗的有效性相关。此外，研究报道FCGR3A基因多态性与多种疾病相关，例如5872G（rs396991）与艾滋病的易感性和进程、克罗恩氏病和风湿性关节炎等疾病相关。

研究报道FCGR2A基因和FCGR3A基因多态性与多种疾病相关，并且可以采用不同的基因分型方法来检测。溶解曲线法及质谱分型是针对大样本多位点的高通量分型方法，而Taqman探针法是中通量分型的金标准，具有灵敏性高、花费相对较少的优点。Taqman探针法是在PCR上下游引物间选取一段序列作为探针，并在探针上标记荧光基团和淬灭基团，该探针可与模板结合，在延伸反应中，当引物合成至探针与模板结合处时，Taq酶的5’外切酶活性可以降解探针5’端，使荧光基团和淬灭基团分离，释放荧光。相对于传统的限制性片段长度多态性聚合酶链式反应（PCR-RFLP），Taqman探针法具有灵敏性更高、操作更简单的优势，且通量更高。

发明内容

本发明旨在提供一种检测与结直肠癌靶向用药西妥昔单抗治疗敏感性相关基因的多态性的试剂盒，该试剂盒可用于制备与结直肠癌靶向用药西妥昔单抗治疗敏感性相关的基因多态性的试剂。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述检测与结直肠癌靶向用药西妥昔单抗治疗敏感性相关的基因多态性试剂盒中含有检测FCGR2A基因4541T位点和/或FCGR3A基因5872G位点的探针和引物，所述探针和引物能与FCRG2A基因4541T位点和FCGR3A基因5872G位点前后的基因序列特异性结合并扩增出包含FCRG2A基因4541T位点和/或FCGR3A基因5872G位点的基因序列。

优选的，所述探针和引物是与FCRG2A基因4541T位点和/或FCGR3A基因5872G位点前后500bp的基因序列特异性结合并能扩增出包含FCRG2A基因4541T位点和/或FCGR3A基因5872G位点的基因序列。

优选的，所述检测与结直肠癌靶向用药西妥昔单抗治疗敏感性相关基因的多态性的试剂盒中含有如下探针：

FCGR2A：FAM-TCCAAACGGGAGAATT-MGB(SEQ ID NO.1);

VIC-TGGGATCCAAATGG-MGB(SEQ ID NO.2);

FCGR3A：FAM-AGGGGGCTTGTTG-MGB (SEQ ID NO.3);

VIC-CAGGGGGCTTTTTG-MGB (SEQ ID NO.4);

该试剂盒中还含有如下引物：

FCGR2A-F：5’-TTTGCTTGTGGGATGGAGAAG-3’ (SEQ ID NO.5)

FCGR2A-R：5’-TGAGGTGCCACAGCTGGAA-3’ (SEQ ID NO.6)

FCGR3A-F：5’- CTCAAAGACAGCGGCTCCTACTT -3’ (SEQ ID NO.7)

FCGR3A-R：5’- GGTGATGTTCACAGTCTCTGAAGACA -3’ (SEQ ID NO.8)

其中，FAM吸收波长485-505nm，发射波长515-530nm；VIC吸收波长515-535nm，发射波长540-560nm；MGB为淬灭基团。所述与结直肠癌靶向用药西妥昔单抗治疗敏感性相关基因为FCGR2A基因4541T和FCGR3A基因5872G。

所述试剂盒中每条引物浓度为900nM，每个探针浓度为250nM。

试剂盒中还包括探针型PCR反应液（2X）和无核酸酶无菌纯水。

所述探针、引物及包含两者的试剂盒均可用于制备检测与结直肠癌靶向用药西妥昔单抗治疗敏感性相关基因多态性的试剂。

FCRG2A基因4541T位点用于制备检测与结直肠癌靶向用药西妥昔单抗治疗敏感性的制剂中的应用。

FCGR3A基因5872G位点用于制备检测与结直肠癌靶向用药西妥昔单抗治疗敏感性的制剂中的应用。

FCGR2A基因4541T和FCGR3A基因5872G可能通过增加病人的无进展生存期而具有更好的对西妥昔单抗的药物应答，从而与结直肠癌的靶向用药西妥昔单抗的治疗敏感性相关，之前并无相关报道。

FCGR2A基因4541T位点位于FCGR2A基因内部，在中国汉族人群中，其最小等位基因频率（Minor Allele Frequency,MAF）为33.5%；FCGR3A基因5872G位点位于FCGR3A基因内部，在中国汉族人群中，其最小等位基因频率为32.89%。目前，还没有FCGR2A基因4541T和FCGR3A基因5872G多态性与西妥昔单抗治疗敏感性相关的检测试剂盒产品面世，因此，探索检测与结直肠癌靶向用药西妥昔单抗的治疗敏感性相关基因的多态性的方法和产品显得意义深远。

有益效果：本发明的试剂盒能准确、快速、简便的检测与结直肠癌靶向用药西妥昔单抗治疗敏感性相关的基因位点（FCGR2A基因4541T和FCGR3A基因5872G的多态性）。

附图说明

图1为实施例中FCGR2A 4541T位点方法验证的荧光散点图；

图2为实施例中FCGR3A 5872G位点方法验证的荧光散点图；

图3为实施例中FCGR2A 4541T位点实验样本的荧光散点图；

图4为实施例中FCGR3A 5872G位点实验样本的荧光散点图。

具体实施方式

实施例1

1. 设计Taqman探针及引物

1.1 查找FCGR2A基因4541T位点前后500bp序列

在PUBMED GENE数据库中搜索FCGR2A，选择NG_012066.1，在Fasta sequence中可以获得此多态位点前、后500bp的序列（SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10）,用于寻找合适的探针和引物。

GTGCCAGGCTTTCTGGAGTGAATGGCTATAACATGAGCCATGAGAAGAAACGAGGCAAACCTCAGCTCTTAGGAATGCCCAGGAGCTTAGGGAACCTCTGCATCAATGAGGGAGCTCTGCTTCACTGCCATCTTTAGTCTGGGGCCTACATTTCAAAGTGAAACAACAGCCTGACTACCTATTACCTGGGACGTGAGGGCTCCAAGCTCTGGCCCCTACTTGTTGGTCAATACTTAGCCAGGCTTCCACCCCACTCCTCTTTGCTCCAGTGCCCAATTTTGCTGCTATGGGCTTTCTCAGACCTCCATGTAGGCCCATGTGACCTCAGCCCTTGTCCATCCCCTCTTCTCCCCTCCCTACATCTTGGCAGACTCCCCATACCTTGGACAGTGATGGTCACAGGCTTGGATGAGAACAGCGTGTAGCCTATGTTTCCTGTGCAGTGGTAATCACCACTGTGACTGTGGTTTGCTTGTGGGATGGAGAAGGTGGGATCCAAA（SEQ ID NO.9）；

Y（Y是指FCGR2A基因4541T位点）

GGGAGAATTTCTGGGATTTTCCATTCTGGAAGAATGTGACCTTGACCAGAGGCTTGTCCTTCCAGCTGTGGCACCTCAGCATGATGGTTTCTCCCTCCTGGAACTCCAGGTGAGGGGTCTGGAGCACCAGCCATTCTGAAAGACACAAATATGATAAGAAAAAGTTGTAAGGATAGATTCCAAGGGTTTTTCAGTCTCAGAGGTACGTTACTCACAGAACTTGACATGATGTCTGGCAGACAGAAATGAAGATGCTTCATGACAGATGTGAGCATTCTCTTATAGGCAATATATGGTATTATATCTGTGGGACTTCTAAAAGCAGAAGTTTTCAGAGGTTTCAAAGATGCAGAGCAGATATTTAAAACAATTCTGAGGAATTTAAAATACTACGTTTGAGTAGAGAAATGAGCGCATTTCAGTAACTGTAGAGGCTACTCGACAGGGCCTGAAGCCGTCAGTTTTTGTGGTCTGGGGATTACTAATTTAATGGTAAATTT（SEQ ID NO.10）。

在PUBMED SNP数据库中搜索FCGR3A，选择rs396991，进入Gene View，选择NM_001127593.1，在Fasta sequence中可以获得此多态位点前、后500bp的序列（SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12），用于寻找合适的探针和引物。

CTGCAGATATGCTCATCGTTGCTTCTCACTTACCTCATTGCTTAGTCCCTCTGCTCTAACCCTGTGTGTTGATCACATGTGTGTGTGTCCCTCTTCCCCATTAGACAAAGGTCTTGGTATGACTTCAGTTCTCTTGCAGGGCCCCATCAGCTCTTCCCCAAAGGGAGCTATGCAGGGTTGACTCCCAATCTGGCTTTCCCTTATGTCTCAGGATCTGGGTGGTACGTGGCCCCTTCACAAAGCTCTGCACTGAGAGCTGAGGCCTCCCGGGCCTGGGGTGTCTGTGTCTTTCAGGCTGGCTGTTGCTCCAGGCCCCTCGGTGGGTGTTCAAGGAGGAAGACCCTATTCACCTGAGGTGTCACAGCTGGAAGAACACTGCTCTGCATAAGGTCACATATTTACAGAATGGCAAAGGCAGGAAGTATTTTCATCATAATTCTGACTTCTACATTCCAAAAGCCACACTCAAAGACAGCGGCTCCTACTTCTGCAGGGGGCTT（SEQ ID NO.11）；

Y（Y是指FCGR3A基因5872G位点）

TTGGGAGTAAAAATGTGTCTTCAGAGACTGTGAACATCACCATCACTCAAGGTGAGACATGTGCCACCCTGGAATGCCCAGGGACGCCTGTGTGTGGAACCTGCAATCACACTGGGAAGTTGAGTTGGGAGGAGATTCCTGATTCTTACACGCACTTCTTCATATGTGGTTCCCTCCTGGTGATCACCAGGAGGTCCCCAAAAGTCCCTGATTGCAGGGTAGGTTTGCAGCTCTGTTTCAGTCCATTCTTTTGGGGTAGCTAGGAGGTGTCATTCACTCTGCAGCATGATGGCAGGAGCAGAAGCCACATCTCCTCCCCAATAAATACCTCTGTCTTTCCTTACGCTAATCACACCCACGGTGTCATATGTTCCTATCGTGCTGGCCTCCTTCTTATCCAAGCCTTTTAGCCACGATCCAAACTGGCAGGAGCCCCTCATCCCCTCACAGAAAGAGCCCAGAACCTGGGTTCTGGCCCTGCAGCTAATTAACCATCTGAC（SEQ ID NO.12）。

1.2 利用Primer Express 3.0进行探针和引物的设计

（1）探针设计原则：

1.确保G-C含量在20-80%之间。

2.探针5’端的第一个碱基不能是G。

3.用Primer Express软件计算出来的探针Tm值应当在68-70℃之间。

4.探针要尽可能地短，但是不要短于13个碱基。

5.避免同一碱基重复过多，特别是G，不可超过4个及以上。

6.尽量使含C多于含G的探针。如果C少于G，则使用互补链上的探针。

7.如果是SNP，多态位点尽量位于探针中央。

（2）引物设计原则：

1.在探针确定以后再选择引物。

2.引物要尽可能地接近探针，但是不要重叠。

3.保持G-C含量在20-80%之间。

4.避免同一碱基重复过多。特别是G，不可超过4个及以上。

5.用Primer Express软件计算出来的Tm值应当在58-60℃之间。

6.在3’端的5个碱基中，G和C碱基加起来不要超过2个。

（3）Primer Express 3.0操作方法

进入Primer Express 3.0软件，File/New/选择Taqman MGB Allelic。粘贴SNP位点前后500bp序列，标定SNP位置并选择变异类型。然后选择引物/探针查找，软件即开始查找合适的引物和探针。若没有匹配的探针和引物，则可手动设计。

确定FCGR2A基因4541T位点Taqman探针和引物如下：

探针（AB（Applied Biosystems）公司）：

Probe1（C）：FAM-TCCAAACGGGAGAATT-MGB（SEQ ID NO.1）;

Probe2（T）：VIC-TGGGATCCAAATGG-MGB（SEQ ID NO.2）;

FAM吸收波长485-505nm，发射波长515-530nm；VIC吸收波长515-535nm，发射波长540-560nm；MGB为淬灭基团。

引物（博尚生物）：

FCGR2A-F：5’-TTTGCTTGTGGGATGGAGAAG-3’（SEQ ID NO.5）；

FCGR2A-R：5’-TGAGGTGCCACAGCTGGAA-3’（SEQ ID NO.6）;

确定FCGR3A基因5872G位点Taqman探针和引物如下:

探针（AB（Applied Biosystems）公司）：

Probe3（G）：FAM-AGGGGGCTTGTTG-MGB（SEQ ID NO.3）;

Probe4（T）：VIC-CAGGGGGCTTTTTG-MGB（SEQ ID NO.4）;

引物（博尚生物）：

FCGR3A-F：5’- CTCAAAGACAGCGGCTCCTACTT -3’（SEQ ID NO.7）；

FCGR3A-R：5’- GGTGATGTTCACAGTCTCTGAAGACA -3’（SEQ ID NO.8）。

2. SNP检测

2.1 PCR扩增体系及程序

FCGR2A扩增体系（Takara390A）：

Premix Ex Taq (probe qPCR) 2x 10ul

FCGR2A-F primer (10 umol) 0.4ul

FCGR2A-R primer (10 umol) 0.4ul

Probe 1 (10 umol) 0.8ul

Probe 2 (10 umol) 0.8ul

gDNA 2ul

ddH₂O 6.4ul

FCGR3A扩增体系（Takara390A）

Premix Ex Taq (probe qPCR) 2x 10ul

FCGR3A-F primer (10 umol) 0.4ul

FCGR3A-R primer (10 umol) 0.4ul

Probe 3 (10 umol) 0.8ul

Probe 4 (10 umol) 0.8ul

gDNA 2ul

ddH₂O 6.4ul

程序（Roche LightCycler 480Ⅱ）；

95℃ 30s

[95℃ 5s

60℃ 20s]40循环

扩增产物1（FCGR2A）：112bp

TGAGGTGCCACAGCTGGAAGGACAAGCCTCTGGTCAAGGTCACATTCTTCCAGAATGGAAAATCCCAGAAATTCTCCCATTTGGATCCCACCTTCTCCATCCCACAAGCAAA（SEQ ID NO.13）；

扩增产物2（FCGR3A）：78bp

CTCAAAGACAGCGGCTCCTACTTCTGCAGGGGGCTTTTTGGGAGTAAAAATGTGTCTTCAGAGACTGTGAACATCACC（SEQ ID NO.14）。

2.2 实验方法准确性验证

对已知FCGR2A 4541T位点基因型的6个样本用本检测方法进行检测，其中A6/B6为CC基因型，C6/D6为CT基因型，E6/F6为TT基因型已通过质谱分型确认，G6为阴性对照。实验结果如图1所示，A6/B6FAM荧光强度（465-510nm）远大于VIC荧光强度（533-580nm），说明其为CC基因型；C6/D6FAM与VIC荧光强度相当，说明其为CT基因型；E6/F6VIC荧光强度远大于FAM荧光强度，说明其为TT基因型；G6为阴性对照。我们所建立的Taqman探针法检测出的对应样本的基因型与已知基因型完全一致，表明我们的Taqman SNP检测方法成功建立。

对已知FCGR3A 5872G位点基因型的6个样本用本方法进行检测，其中其中A6/B6为GG基因型，C6/D6为GT基因型，E6/F6为TT基因型已通过质谱分型确认，G6为阴性对照。实验结果如图2所示，A6/B6FAM荧光强度（465-510nm）远大于VIC荧光强度（533-580nm），说明其为GG基因型；C6/D6FAM与VIC荧光强度相当，说明其为GT基因型；E6/F6VIC荧光强度远大于FAM荧光强度，说明其为TT基因型；G6为阴性对照。我们所建立的Taqman探针法检测出的对应样本的基因型与已知基因型完全一致，表明我们的Taqman SNP检测方法成功建立。

2.3 实验样品SNP检测

根据上述已建立的Taqman探针法检测FCGR2A基因4541T多态性的方法，我们对20个实验样本进行了分型实验。A10、A6、A32已知为TT、TC、CC基因型作为实验过程的参照。实验结果如表1及图3所示，其中A32、A6、A10分别为CC、TC、TT 基因型，说明实验过程无误；所检测20例样本有14例为CC基因型，4例为TC基因型，2例为TT基因型；三种基因型在图3中呈组内分布集中，组间分布差异明显。更进一步说明我们成功建立Taqman探针法对FCGR2A基因4541T多态性的检测方法。实验样本结果如表1所示：

表1

根据上述已建立的Taqman探针法检测FCGR3A基因5872G多态性的方法，我们对20个实验样本进行了分型实验。B5、B83、B28已知为TT、TG、GG基因型作为实验过程的参照。实验结果如表2及图4所示，其中B5、B83、B28分别为TT、TG、GG基因型，说明实验过程无误；所检测20例样本有5例为TT基因型，7例为TG基因型，8例为TT基因型；三种基因型在图4中呈组内分布集中，组间分布差异明显。更进一步说明我们成功建立Taqman探针法对FCGR3A基因5872G多态性的检测方法。实验样本结果如表2所示：

表2

采用本发明所述试剂盒能迅速快捷的检测FCGR2A 4541T和FCGR3A 5872G多态性，且灵敏度高。

我们收集了200例对结直肠癌靶向用药西妥昔单抗敏感的患者和189例对结直肠癌靶向用药西妥昔单抗不敏感的患者。对FCGR2A 4541T和FCGR3A 5872G进行基因分型实验，发现这两个位点与西妥昔单抗治疗敏感性相关（FCGR2A 4541T：p<0.001,OR=0.397,95%CI:0.28-0.61；FCGR3A 5872G：p<0.001, OR=0.23, 95%CI: 0.18-0.47）。此结果表明携带FCGR2A 4541T的患者比携带C等位基因的患者使用西妥昔单抗治疗的敏感性好，携带FCGR3A 5872G的患者比携带T等位基因的患者使用西妥昔单抗治疗的敏感性好。因此，FCGR2A 4541T和FCGR3A 5872G对西妥昔单抗治疗结直肠癌具有一定的临床指导意义。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海杏园瑞民生物工程有限公司

<120> 一种检测与结直肠癌靶向用药西妥昔单抗治疗敏感性相关基因的多态性的试

剂盒及其应用

<130>

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tccaaacggg agaatt 16

<210> 2

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgggatccaa atgg 14

<210> 3

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agggggcttg ttg 13

<210> 4

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cagggggctt tttg 14

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tttgcttgtg ggatggagaa g 21

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgaggtgcca cagctggaa 19

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctcaaagaca gcggctccta ctt 23

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggtgatgttc acagtctctg aagaca 26

<210> 9

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gtgccaggct ttctggagtg aatggctata acatgagcca tgagaagaaa cgaggcaaac 60

ctcagctctt aggaatgccc aggagcttag ggaacctctg catcaatgag ggagctctgc 120

ttcactgcca tctttagtct ggggcctaca tttcaaagtg aaacaacagc ctgactacct 180

attacctggg acgtgagggc tccaagctct ggcccctact tgttggtcaa tacttagcca 240

ggcttccacc ccactcctct ttgctccagt gcccaatttt gctgctatgg gctttctcag 300

acctccatgt aggcccatgt gacctcagcc cttgtccatc ccctcttctc ccctccctac 360

atcttggcag actccccata ccttggacag tgatggtcac aggcttggat gagaacagcg 420

tgtagcctat gtttcctgtg cagtggtaat caccactgtg actgtggttt gcttgtggga 480

tggagaaggt gggatccaaa 500

<210> 10

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gggagaattt ctgggatttt ccattctgga agaatgtgac cttgaccaga ggcttgtcct 60

tccagctgtg gcacctcagc atgatggttt ctccctcctg gaactccagg tgaggggtct 120

ggagcaccag ccattctgaa agacacaaat atgataagaa aaagttgtaa ggatagattc 180

caagggtttt tcagtctcag aggtacgtta ctcacagaac ttgacatgat gtctggcaga 240

cagaaatgaa gatgcttcat gacagatgtg agcattctct tataggcaat atatggtatt 300

atatctgtgg gacttctaaa agcagaagtt ttcagaggtt tcaaagatgc agagcagata 360

tttaaaacaa ttctgaggaa tttaaaatac tacgtttgag tagagaaatg agcgcatttc 420

agtaactgta gaggctactc gacagggcct gaagccgtca gtttttgtgg tctggggatt 480

actaatttaa tggtaaattt 500

<210> 11

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ctgcagatat gctcatcgtt gcttctcact tacctcattg cttagtccct ctgctctaac 60

cctgtgtgtt gatcacatgt gtgtgtgtcc ctcttcccca ttagacaaag gtcttggtat 120

gacttcagtt ctcttgcagg gccccatcag ctcttcccca aagggagcta tgcagggttg 180

actcccaatc tggctttccc ttatgtctca ggatctgggt ggtacgtggc cccttcacaa 240

agctctgcac tgagagctga ggcctcccgg gcctggggtg tctgtgtctt tcaggctggc 300

tgttgctcca ggcccctcgg tgggtgttca aggaggaaga ccctattcac ctgaggtgtc 360

acagctggaa gaacactgct ctgcataagg tcacatattt acagaatggc aaaggcagga 420

agtattttca tcataattct gacttctaca ttccaaaagc cacactcaaa gacagcggct 480

cctacttctg cagggggctt 500

<210> 12

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ttgggagtaa aaatgtgtct tcagagactg tgaacatcac catcactcaa ggtgagacat 60

gtgccaccct ggaatgccca gggacgcctg tgtgtggaac ctgcaatcac actgggaagt 120

tgagttggga ggagattcct gattcttaca cgcacttctt catatgtggt tccctcctgg 180

tgatcaccag gaggtcccca aaagtccctg attgcagggt aggtttgcag ctctgtttca 240

gtccattctt ttggggtagc taggaggtgt cattcactct gcagcatgat ggcaggagca 300

gaagccacat ctcctcccca ataaatacct ctgtctttcc ttacgctaat cacacccacg 360

gtgtcatatg ttcctatcgt gctggcctcc ttcttatcca agccttttag ccacgatcca 420

aactggcagg agcccctcat cccctcacag aaagagccca gaacctgggt tctggccctg 480

cagctaatta accatctgac 500

<210> 13

<211> 112

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tgaggtgcca cagctggaag gacaagcctc tggtcaaggt cacattcttc cagaatggaa 60

aatcccagaa attctcccat ttggatccca ccttctccat cccacaagca aa 112

<210> 14

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ctcaaagaca gcggctccta cttctgcagg gggctttttg ggagtaaaaa tgtgtcttca 60

gagactgtga acatcacc 78

Claims

1.一种检测与结直肠癌靶向用药西妥昔单抗治疗敏感性相关基因的多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有与结直肠癌靶向用药西妥昔单抗治疗敏感性相关基因的探针和引物，所述与结直肠癌靶向用药西妥昔单抗治疗敏感性相关基因为FCGR2A基因4541T位点、FCGR3A基因5872G位点；所述探针为：

FCGR2A：FAM-TCCAAACGGGAGAATT-MGB；

VIC-TGGGATCCAAATGG-MGB；

FCGR3A：FAM-AGGGGGCTTGTTG-MGB；

VIC-CAGGGGGCTTTTTG-MGB；

其中，FAM吸收波长485-505nm，发射波长515-530nm；VIC吸收波长515-535nm，发射波长540-560nm；MGB为淬灭基团；

所述引物为：

FCGR2A-F：5’-TTTGCTTGTGGGATGGAGAAG-3’

FCGR2A-R：5’-TGAGGTGCCACAGCTGGAA-3’

FCGR3A-F：5’- CTCAAAGACAGCGGCTCCTACTT -3’

FCGR3A-R：5’- GGTGATGTTCACAGTCTCTGAAGACA -3’。

2.权利要求1中所述的检测与结直肠癌靶向用药西妥昔单抗治疗敏感性相关基因的多态性的试剂盒，其特征在于，试剂盒中引物浓度为900nM，探针浓度为250nM。

3.权利要求1中所述的检测与结直肠癌靶向用药西妥昔单抗治疗敏感性相关基因的多态性的试剂盒，其特征在于，试剂盒中还包括探针型PCR反应液和无核酸酶无菌纯水。

4.权利要求1至3中任意一项试剂盒在制备检测与结直肠癌靶向用药西妥昔单抗治疗敏感性相关基因多态性产品中的应用。