WO2022075403A1 - １種以上のｈｌａ遺伝子用プライマー - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to one or more HLA gene primers and the like.
- HLA Human leukocyte antigen
- HLA class I molecules There are two groups of HLA class I molecules, classical (class Ia) molecules and non-classical (class Ib) molecules.
- the HLA class Ia molecules HLA-A, HLA-B, and HLA-C are expressed in almost all human cells.
- HLA-E, HLA-F, and HLA-G which are HLA class Ib molecules
- the distribution of expressed tissues is often limited, and their functions are not limited to the presentation of antigen peptides. ..
- the HLA-G molecule is predominantly expressed in the placenta and presents antigenic peptides similar to HLA class Ia molecules, but the receptors that receive the presentation are natural killer cell receptors and regulate the function of natural killer cells. .. Natural killer cells are crucial in cancer immunotherapy.
- the HLA class I genes have high sequence homology with each other and are parallel to each other on the short arm of chromosome 6.
- the HLA class Ia gene has a very high degree of polymorphism, whereas the HLA class Ib gene has a relatively poor polymorphism.
- the entire HLA gene region is highly polymorphic, the intergenic region is also rich in polymorphism as compared with the general genomic region. Therefore, it is difficult to design a PCR primer capable of comprehensively amplifying the HLA allele with the human genome reference sequence (genome assembly version hg38) alone.
- HLA alleles are defined by a combination of gene full-length polymorphisms. Sanger-type sequencers and next-generation sequencers cannot sequence the entire gene length at one time because the determinable sequence length is short. In particular, since the HLA class Ib gene is relatively poor in polymorphism, the probability that a polymorphic site is present in the determined sequence is low, and therefore the HLA allele derived from the mother and the HLA allele derived from the father cannot be phased. (Non-Patent Document 1). In addition, since there is no established HLA allele typing method for the HLA class Ib gene and the kit is not commercially available, there are few reports on typing results. Therefore, the HLA class Ib gene HLA allele information registered in the IMGT / HLA database is limited.
- Non-Patent Document 2 Nilsson et al. Reported one type of primer set capable of amplifying the entire length of the HLA-G gene including the untranslated region (Non-Patent Document 2).
- Non-Patent Document 3 Alizadeh et al. Have reported a long-range PCR primer set targeting the HLA-F gene, but the primers are designed in the untranslated region.
- Non-Patent Document 4 Wang et al. Have reported a long-range PCR primer set targeting the HLA-E gene, but cannot amplify the full length of the HLA-E gene including the untranslated region. Lucas et al. Also reported the sequence results of the full length of the HLA-E gene using long-range PCR, but designed primers for the untranslated region and amplified the region including the untranslated region that affects gene expression. Not possible (Non-Patent Document 5).
- an object of the present invention is to provide one or more primers capable of detecting or amplifying the HLA allele of the HLA-E, HLA-F or HLA-G gene in a highly comprehensive manner. It is also an object of the present invention to provide one or more primers capable of detecting or amplifying the HLA allele of the gene in a highly comprehensive manner and amplifying the entire length of the gene including the untranslated region of the gene. Is.
- the present inventors can detect or amplify the HLA alleles of the HLA-E, HLA-F or HLA-G genes in a highly comprehensive manner, and the full length of the gene including the untranslated region of the gene.
- one or more HLA gene primers found by the present inventors can highly cover and amplify a large number of HLA allele groups including presumed novel HLA alleles, unlike the prior art. It has actually been confirmed that there is (Table 6). Based on such findings, the present inventors have succeeded in providing one or more kinds of primers for HLA genes, and have completed the present invention.
- a second primer containing, a primer; (2) One or more HLA-E gene primers, One or more HLA-E gene primers may have (2a) a first primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 5 or a complementary base sequence thereof, and / or (2b) the base sequence of SEQ ID NO: 7 or a complementary base sequence thereof.
- One or more HLA-F gene primers include (3a) a first primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 9 or its complementary base sequence, and / or (3b) the base sequence of SEQ ID NO: 11 or its complementary base sequence.
- a primer, which is a second primer containing is a second primer containing.
- the primer for one or more HLA genes is a primer set for HLA gene amplification selected from the group consisting of the following (1') to (3').
- the primer set for HLA-G gene amplification is (1a) a first primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 1 or its complementary base sequence, and (1b) a second primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 3 or its complementary base sequence.
- the HLA-E gene amplification primer includes (2a) the first primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 5 or its complementary base sequence, and (2b) the second primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 7 or its complementary base sequence. Including, Primer Set; and (3') Primer for HLA-F Gene Amplification.
- the HLA-F gene amplification primer includes (3a) the first primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 9 or its complementary base sequence, and (3b) the second primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 11 or its complementary base sequence. Including, primer set.
- the first primer containing the base sequence of (1a) SEQ ID NO: 1 or its complementary base sequence is (1a') the first primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 2 or its complementary base sequence.
- the second primer containing the base sequence of (1b) SEQ ID NO: 3 or its complementary base sequence is the second primer containing the base sequence of (1b') SEQ ID NO: 4 or its complementary base sequence.
- (2a) The first primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 5 or its complementary base sequence is (2a') the first primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 6 or its complementary base sequence.
- the second primer containing the base sequence of (2b) SEQ ID NO: 7 or its complementary base sequence is the second primer containing the base sequence of (2b') SEQ ID NO: 8 or its complementary base sequence.
- the first primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 9 or its complementary base sequence is (3a') the first primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 10 or its complementary base sequence.
- the second primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 11 or its complementary base sequence is the second primer containing the base sequence of (3b') SEQ ID NO: 12 or its complementary base sequence, [1] or [2]. ]
- One or more HLA gene primers. [4] A method for detecting the HLA gene.
- a reagent for detecting an HLA gene which comprises one or more HLA gene primers according to any one of [1] to [3].
- HLA gene detection kit containing the following (a) and (b): (A) Primer for one or more HLA genes according to any one of [1] to [3]; and (b) polymerase.
- the HLA allele of the HLA-E, HLA-F or HLA-G gene can be detected or amplified in a highly comprehensive manner. Further, according to the present invention, it is possible to amplify the total length of the gene including the untranslated region of the HLA-E, HLA-F or HLA-G gene.
- FIG. 1 is a diagram showing the results of PCR amplification of HLA-E, HLA-F and HLA-G genes.
- L Molecular weight marker
- D Genomic DNA extracted from a cell line (Daudi) established from an African population is used as a template
- A Genomic DNA extracted from a cell line (AKIBA) established from a Japanese population As a template
- L7 Genomic DNA extracted from human peripheral blood mononuclear cells derived from Hispanic Americans is used as a template
- N Genomic DNA is not used (negative control).
- the present invention provides one or more HLA gene primers selected from the group consisting of the following (1) to (3).
- (1) Primer for one or more HLA-G genes (1a) A first primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 1 or its complementary base sequence, and / or (1b) a second primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 3 or its complementary base sequence;
- Second Primer for one or more HLA-E genes (2a) A first primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 5 or its complementary base sequence, and / or (2b) a second primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 7 or its complementary base sequence; and (3) one or more.
- HLA-F gene primer (3a) A first primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 9 or its complementary base sequence, and / or (3b) a second primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 11 or its complementary base sequence.
- the one or more primers of the present invention are not particularly limited as long as they can be annealed to the target site of the HLA gene selected from the group consisting of the HLA-G gene, the HLA-E gene, and the HLA-F gene.
- the target site of the HLA gene selected from the group consisting of the HLA-G gene, the HLA-E gene, and the HLA-F gene.
- any primer containing natural nucleic acid or artificial nucleic acid can be used, but from the viewpoint of versatility and cost, DNA primers are preferable.
- the one or more primers of the present invention may be one HLA gene primer.
- such one or more primers of the present invention have excellent coverage of HLA alleles and are therefore useful as targets for sequencing primers or RNA-induced nucleases (eg, Cas9).
- one primer is the following primer from the viewpoint of targeting a region within the HLA gene.
- Primer for one HLA-F gene (3a) A first primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 9, or (3b) a second primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 11.
- one primer is used from the viewpoint of targeting the untranslated region upstream of the gene, which is particularly important for gene expression.
- a first primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 1 (2a) a first primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 5, or (3a) a first primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 9. May be good.
- one or more primers of the present invention may be a primer set containing two or more primers.
- a primer set is useful as a primer set for gene amplification because it has excellent coverage of HLA alleles.
- primer set containing two or more kinds of primers When one or more kinds of primers of the present invention are a primer set containing two or more kinds of primers, the following primer set containing at least one specific primer having excellent coverage of HLA allele may be used.
- Primer set containing two or more types of primers for HLA-G genes (1a) A primer set containing a first primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 1 or a complementary base sequence thereof, and (1b) a primer set containing a base sequence of SEQ ID NO: 3 or a second primer containing the complementary base sequence thereof, or (1a) sequence.
- the number of primers required for gene amplification varies depending on the type of gene amplification method. For example, in PCR, the number of primers required for gene amplification is two. On the other hand, in LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) (eg, see International Publication No. 00/28082), the number of primers required for gene amplification is 4 or 6. Therefore, if amplification by a gene amplification method that requires more than two primers is intended, the primer set may include additional primers.
- LAMP Loop-mediated isothermal amplification
- the one or more primers of the present invention may be the following primer set containing two specific primers.
- Primer set for HLA-F gene amplification (3a) A primer set containing a first primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 9 or its complementary base sequence, and (3b) a second primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 11 or its complementary base sequence.
- the primer sets (1') to (3') above two types of specific primers are used. These two specific primers are set to produce a large size amplification product of 4500 bp or more (Example). Therefore, the primer sets (1') to (3') are preferably used in gene amplification methods capable of easily producing large-sized amplification products. Examples of such gene amplification methods include PCR, SDA (STRAND Displacement Amplification), Hybrid Capture, LCR (Ligase Chain Reaction), and Clearase Invader.
- the HLA allele of the target gene can be amplified more highly than the primer set containing one specific primer. Moreover, the total length of the gene including the untranslated region of the above gene can be amplified.
- a primer containing SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 or 11 or a complementary base sequence thereof may have an additional base added to its 5'end or 3'end.
- a base may be a complementary base to the corresponding base at the target site.
- the number of complementary bases is not particularly limited, and may be, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5.
- primers containing SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9 or 11 or their complementary base sequences can anneal well to the target site by themselves and thus at their 5'end or 3'end. No additional base may be added.
- the primer may be chemically modified (eg, modified with an amino group), or a linker may be added.
- the first and second primers with additional base added to the 5'end or 3'end may be:
- the first primer containing the base sequence of (1a) SEQ ID NO: 1 or its complementary base sequence may be the first primer containing the base sequence of (1a') SEQ ID NO: 2 or its complementary base sequence.
- the second primer containing the base sequence of (1b) SEQ ID NO: 3 or its complementary base sequence may be the second primer containing the base sequence of (1b') SEQ ID NO: 4 or its complementary base sequence.
- the first primer containing the base sequence of (2a) SEQ ID NO: 5 or its complementary base sequence may be the first primer containing the base sequence of (2a') SEQ ID NO: 6 or its complementary base sequence.
- the second primer containing the (2b) base sequence of SEQ ID NO: 7 or its complementary base sequence may be the second primer containing the base sequence of (2b') SEQ ID NO: 8 or its complementary base sequence.
- the first primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 9 or its complementary base sequence may be the first primer containing the base sequence of (3a') SEQ ID NO: 10 or its complementary base sequence.
- the second primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 11 or its complementary base sequence may be the second primer containing the base sequence of (3b') SEQ ID NO: 12 or its complementary base sequence.
- the primer containing SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 or 12, or their complementary base sequence may have an additional base added to its 5'end or 3'end.
- a base may be a complementary base to the base at the target site.
- the number of complementary bases is not particularly limited, and may be, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5. When such a base is added to the primer, it can be annealed more stably to the target site, and the detection or amplification efficiency can be improved.
- primers containing SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10 or 12 or their complementary base sequences are themselves very well able to anneal to the target site and thus have their 5'end or 3'. No additional base may be added to the end.
- the primer may be chemically modified (eg, modified with an amino group), or a linker may be added.
- Primers containing SEQ ID NOs: 1 to 12 or their complementary base sequences have functional portions such as labeled portions that enable identification at the 5'end (eg, non-complementary base-containing base sequences such as barcode sequences). May be added. Examples of such a functional portion include Universal Sequence (PacBio) and Adapter Overhang Nucleotide Sequence (Illumina).
- the primers as described above used in the present invention can be designed to have a specific number of bases (nucleotide length).
- the number of such bases may be, for example, 15 or more, preferably 16 or more, more preferably 17 or more, still more preferably 18 or more, and particularly preferably 20 or more.
- the number of such bases may also be, for example, 50 or less, preferably 45 or less, more preferably 40 or less, still more preferably 35 or less, and particularly preferably 30 or less. More specifically, the number of such bases is, for example, 15 to 50, preferably 16 to 45, more preferably 17 to 40, even more preferably 18 to 35, and particularly preferably 20 to 30. May be.
- the present invention also provides a method for detecting an HLA gene.
- the method of the present invention is selected from the group consisting of the HLA-G gene, the HLA-E gene, and the HLA-F gene in a sample obtained from a human subject using one or more primers of the present invention. Includes detecting HLA genes in more than one species.
- any sample containing the target of one or more primers of the present invention can be used. Therefore, the sample obtained from a human subject is not particularly limited as long as it contains a genome and / or a transcript of the target HLA gene, and is prepared from, for example, a sample taken from a human or a sample taken from a human. Examples include cell samples. Preferably, a genome-containing sample is used as the sample. As the genome-containing sample, a minimally invasive sample is preferable. Such samples include hair, saliva, blood (eg, whole blood, plasma or serum), mucosa (eg, oral mucosa, nasal mucosa).
- blood eg, whole blood, plasma or serum
- mucosa eg, oral mucosa, nasal mucosa
- genomic DNA or a transcript of the HLA gene may be extracted from the sample. Such extraction can be performed by any method.
- the extracted genomic DNA or transcript of the HLA gene can be subjected to the appropriate gene amplification method (eg, PCR, or LAMP) depending on the size of the intended amplification product.
- the sample may be directly subjected to gene amplification (eg, direct PCR).
- the method of the present invention is useful, for example, for transplantation, selection of cancer therapeutic agents / treatment methods (eg, cancer vaccines), or HLA testing for determining disease risk.
- cancer therapeutic agents / treatment methods eg, cancer vaccines
- HLA testing for determining disease risk.
- the present invention also provides a reagent for detecting an HLA gene, which comprises one or more primers of the present invention. According to the reagent of the present invention, the method of the present invention can be easily carried out.
- the reagent of the present invention can contain one or more primers of the present invention in the form of powder (eg, lyophilized) or solution.
- the solution is preferably an aqueous solution.
- the aqueous solution include water (eg, sterile distilled water) and a buffer solution.
- the buffer solution include TE (Tris-EDTA) buffer solution, hydrochloric acid-potassium chloride buffer solution, glycine-hydrochloride buffer solution, citrate buffer solution, acetate buffer solution, citrate-phosphate buffer solution, and phosphate buffer solution.
- Tris-hydrochloride buffer glycine-sodium hydroxide buffer, carbonate-dicarbonate buffer, borate buffer, tartrate buffer.
- the concentration of the primer in the solution varies depending on factors such as the use of the primer and the dilution ratio when the primer is used, for example, 0. It may be 1 to 100 mM, preferably 1 to 10 mM.
- the solution may contain other components such as stabilizers.
- the present invention also provides a kit for detecting an HLA gene, which comprises (a) one or more primers of the present invention, and (b) a polymerase. According to the kit of the present invention, the method of the present invention can be easily performed.
- an appropriate polymerase can be used according to the type of gene amplification method.
- the use of a thermostable polymerase is preferable, and in the case of LAMP, the use of a chain-substituted polymerase is preferable.
- the polymerase DNA polymerase is preferable.
- the kit of the present invention may contain additional components in addition to (a) and (b).
- additional components include deoxynucleoside triphosphate (dNTP) mixtures, reaction buffers, molecular weight markers, controls (eg, preparations of amplification products of various HLA alleles).
- dNTP deoxynucleoside triphosphate
- reaction buffers e.g., reaction buffer
- molecular weight markers e.g, preparations of amplification products of various HLA alleles.
- controls eg, preparations of amplification products of various HLA alleles.
- each component may be provided in a form isolated from each other, eg, in a form housed in a different container (eg, tube), but in a premixed form. (Eg, PreMix) and the like may be provided.
- the detection may be in real time (eg, real-time PCR).
- examples of the method enabling real-time detection include an intercalator method and a fluorescent substance-labeled probe method. Therefore, if real-time detection is intended, the kit of the present invention may further include a fluorescent substance or a fluorescent substance labeled probe as an additional component.
- the fluorescent substance include a fluorescent substance used in the intercalator method (eg, SYBR (registered trademark) Green I).
- Examples of the fluorescent substance-labeled probe include a probe in which a fluorescent substance is bound to one of the 5'ends or 3'ends and a quencher is bound to the other of the 5'ends or 3'ends (eg, TaqMan (registered). Trademark) probe).
- HLA-E HLA-E
- HLA-F HLA-G
- HLA allele calling was performed using HLAHD 1.2.1 for the FASTQ files of each sample created (Table 2, Table 3, Table 4).
- the PCR amplification product was purified using Sera-Mag Select (Cytiva) and eluted with 25 ⁇ L of Buffer EB (QIAGEN).
- the purified PCR amplification product was electrophoresed using a Genometric DNA screen system (Agilent Technologies Co., Ltd.), and the status of PCR amplification was confirmed (Fig. 1).
- PCR amplification was performed using the primer set shown in Table 5, and using SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0, the setting of the measuring instrument, reaction conditions, and the amount of reagent added were procedure & Checklist provided by PacBio. It was carried out according to Part Number 101-791-700 version 02 basically.
- HLA allele typing was performed on the consensus sequence obtained by the Sequence system using the IMGT / HLA database as a reference sequence.
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Abstract
本発明は、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－ＦまたはＨＬＡ－Ｇ遺伝子のＨＬＡアレルを高度に網羅して検出または増幅可能である１種以上のプライマーを提供する。より具体的には、本発明は、下記（１）～（３）からなる群より選ばれる１種以上のＨＬＡ遺伝子用プライマーを提供する： （１）１種以上のＨＬＡ－Ｇ遺伝子用プライマー （１ａ）配列番号１の塩基配列等を含む第１プライマー、および／または（１ｂ）配列番号３の塩基配列等を含む第２プライマー； （２）１種以上のＨＬＡ－Ｅ遺伝子用プライマー （２ａ）配列番号５の塩基配列等を含む第１プライマー、および／または（２ｂ）配列番号７の塩基配列等を含む第２プライマー；ならびに （３）１種以上のＨＬＡ－Ｆ遺伝子用プライマー （３ａ）配列番号９の塩基配列等を含む第１プライマー、および／または（３ｂ）配列番号１１の塩基配列等を含む第２プライマー。
Description
本発明は、１種以上のＨＬＡ遺伝子用プライマーなどに関する。
ヒト白血球抗原（Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ；ＨＬＡ）は、免疫応答性を制御する重要な分子であり、各種の疾患感受性と関連する。ＨＬＡは、クラスＩ分子とクラスＩＩ分子とに大別される。ＨＬＡクラスＩ分子は、Ｔ細胞への抗原ペプチドの提示機能に加え、ナチュラルキラー細胞やＴ細胞、ミエロイド細胞上の免疫受容体のリガンドとしても機能している。
ＨＬＡクラスＩ分子には、古典的（クラスＩａ）分子と非古典的（クラスＩｂ）分子の２つのグループが存在する。ＨＬＡクラスＩａ分子であるＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃは、ほぼすべてのヒト細胞で発現している。一方、ＨＬＡクラスＩｂ分子であるＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇについては、発現している組織の分布は限定的であることも多く、機能も抗原ペプチドの提示に限らず多岐にわたっている。例えば、ＨＬＡ－Ｇ分子は主に胎盤に発現しＨＬＡクラスＩａ分子と同様に抗原ペプチドを提示するが、提示を受ける受容体はナチュラルキラー細胞の受容体であり、ナチュラルキラー細胞の機能を調節する。ナチュラルキラー細胞は、がん免疫療法において極めて重要である。
ＨＬＡクラスＩ遺伝子群は互いに配列相同性が高く、６番染色体短腕上に縦列している。ＨＬＡクラスＩａ遺伝子に非常に高度な多型性が認められるのに対し、ＨＬＡクラスＩｂ遺伝子の多型性は比較的乏しい。一方、ＨＬＡ遺伝子領域全体が高度に多型性に富むことから、一般的なゲノム領域と比べ遺伝子間領域も多型性に富んでいる。そのため、ヒトゲノムリファレンス配列（ゲノムアセンブリバージョンｈｇ３８）だけでは、ＨＬＡアレルを網羅的に遺伝子全長増幅可能なＰＣＲプライマーを設計することは難しい。
ＨＬＡアレルは、遺伝子全長の多型の組み合わせにより規定される。サンガー型シーケンサーや次世代シーケンサーは、決定可能な配列長が短いため遺伝子全長を一度にシーケンスすることができない。特にＨＬＡクラスＩｂ遺伝子は多型性が比較的乏しいことから、決定した配列内に多型部位が存在する確率が低いため、母親由来と父親由来のＨＬＡアレルを相化（フェージング）することができない（非特許文献１）。また、ＨＬＡクラスＩｂ遺伝子は、確立したＨＬＡアレルタイピング方法がなく、キットが市販されていないため、タイピング結果に関する報告事例は少ない。そのため、ＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベースに登録されているＨＬＡクラスＩｂ遺伝子ＨＬＡアレル情報は、限定的である。
Ｎｉｌｓｓｏｎらは、非翻訳領域も含むＨＬＡ－Ｇ遺伝子全長を増幅可能な１種類のプライマーセットを報告している（非特許文献２）。
Ａｌｉｚａｄｅｈらは、ＨＬＡ－Ｆ遺伝子をターゲットとしたロングレンジＰＣＲプライマーセットを報告しているが、プライマーを非翻訳領域に設計している（非特許文献３）。
Ｗａｎｇらは、ＨＬＡ－Ｅ遺伝子をターゲットとしたロングレンジＰＣＲプライマーセットを報告しているが、非翻訳領域を含むＨＬＡ－Ｅ遺伝子全長を増幅することはできない（非特許文献４）。Ｌｕｃａｓらも、ロングレンジＰＣＲを用いたＨＬＡ－Ｅ遺伝子全長のシーケンス結果を報告しているが、非翻訳領域にプライマーを設計しており、遺伝子発現に影響する非翻訳領域を含めた領域を増幅できない（非特許文献５）。
Ｓｕｚｕｋｉ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８ Ｏｃｔ ４；９：２２９４．
Ｎｉｌｓｓｏｎ ＬＬ ｅｔ ａｌ．，ＨＬＡ．２０１８；９２：１４４－１５３．
Ａｌｉｚａｄｅｈ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０２０；８１（５）：２０２－２０５．
Ｗａｎｇ Ｓ－Ｘ ｅｔ ａｌ．，ＨＬＡ．２０１７；８９：３２７－３３０．
Ｌｕｃａｓ ＪＡＭ ｅｔ ａｌ．，ＨＬＡ．２０２０；９５：５６１－５７２．
ＨＬＡ－Ｅ遺伝子及びＨＬＡ－Ｆ遺伝子については、非翻訳領域を含む遺伝子全長を増幅可能なプライマーは報告されていない。
先行技術に開示されているＨＬＡ－Ｇ遺伝子プライマーについては、実施例に示すように、全ゲノムシーケンスデータを用いた解析により検討した結果、サンプルによってはプライマー結合部位にミスマッチが存在することが確認され、ＰＣＲ増幅が認められない、または均一な増幅に影響が生じる可能性が高いことが示唆された。
また、先行技術では、ＨＬＡクラスＩｂ遺伝子の翻訳領域を中心として設計された一対のプライマーを用いるＰＣＲにより、ＨＬＡクラスＩｂ遺伝子の配列が解析されているが、このような方法では、遺伝子発現に重要である非翻訳領域の領域における多型性を解析することができない。
先行技術に開示されているＨＬＡ－Ｇ遺伝子プライマーについては、実施例に示すように、全ゲノムシーケンスデータを用いた解析により検討した結果、サンプルによってはプライマー結合部位にミスマッチが存在することが確認され、ＰＣＲ増幅が認められない、または均一な増幅に影響が生じる可能性が高いことが示唆された。
また、先行技術では、ＨＬＡクラスＩｂ遺伝子の翻訳領域を中心として設計された一対のプライマーを用いるＰＣＲにより、ＨＬＡクラスＩｂ遺伝子の配列が解析されているが、このような方法では、遺伝子発現に重要である非翻訳領域の領域における多型性を解析することができない。
したがって、本発明の目的は、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－ＦまたはＨＬＡ－Ｇ遺伝子のＨＬＡアレルを高度に網羅して検出または増幅可能である１種以上のプライマーを提供することである。本発明の目的はまた、上記遺伝子のＨＬＡアレルを高度に網羅して検出または増幅可能であり、かつ上記遺伝子の非翻訳領域を含む遺伝子全長を増幅可能である１種以上のプライマーを提供することである。
本発明者らは、鋭意検討した結果、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－ＦまたはＨＬＡ－Ｇ遺伝子のＨＬＡアレルを高度に網羅して検出または増幅可能であり、しかも上記遺伝子の非翻訳領域を含む遺伝子全長も増幅可能である１種以上のＨＬＡ遺伝子用プライマーを見出した。実際、本発明者らにより見出された１種以上のＨＬＡ遺伝子用プライマーは、先行技術とは異なり、新規と推定されるＨＬＡアレルを含む多数のＨＬＡアレル群を高度に網羅して増幅可能であることが実際に確認されている（表６）。かかる知見に基づき、本発明者らは、１種以上のＨＬＡ遺伝子用プライマーを提供することに成功し、もって本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕下記（１）～（３）からなる群より選ばれる１種以上のＨＬＡ遺伝子用プライマー：
（１）１種以上のＨＬＡ－Ｇ遺伝子用プライマーであって、
１種以上のＨＬＡ－Ｇ遺伝子用プライマーが、（１ａ）配列番号１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および／または（１ｂ）配列番号３の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーである、プライマー；
（２）１種以上のＨＬＡ－Ｅ遺伝子用プライマーであって、
１種以上のＨＬＡ－Ｅ遺伝子用プライマーが、（２ａ）配列番号５の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および／または（２ｂ）配列番号７の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーである、プライマー；ならびに
（３）１種以上のＨＬＡ－Ｆ遺伝子用プライマーであって、
１種以上のＨＬＡ－Ｆ遺伝子用プライマーが、（３ａ）配列番号９の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および／または（３ｂ）配列番号１１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーである、プライマー。
〔２〕前記１種以上のＨＬＡ遺伝子用プライマーが、下記（１’）～（３’）からなる群より選ばれるＨＬＡ遺伝子増幅用プライマーセットである、〔１〕の１種以上のＨＬＡ遺伝子用プライマー：
（１’）ＨＬＡ－Ｇ遺伝子増幅用プライマーセットであって、
ＨＬＡ－Ｇ遺伝子増幅用プライマーセットが、（１ａ）配列番号１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および（１ｂ）配列番号３の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーを含む、プライマーセット；
（２’）ＨＬＡ－Ｅ遺伝子増幅用プライマーであって、
ＨＬＡ－Ｅ遺伝子増幅用プライマーが、（２ａ）配列番号５の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および（２ｂ）配列番号７の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーを含む、プライマーセット；ならびに
（３’）ＨＬＡ－Ｆ遺伝子増幅用プライマーであって、
ＨＬＡ－Ｆ遺伝子増幅用プライマーが、（３ａ）配列番号９の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および（３ｂ）配列番号１１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーを含む、プライマーセット。
〔３〕（１ａ）配列番号１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマーが、（１ａ’）配列番号２の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマーであり、
（１ｂ）配列番号３の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーが、（１ｂ’）配列番号４の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーであり、
（２ａ）配列番号５の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマーが、（２ａ’）配列番号６の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマーであり、
（２ｂ）配列番号７の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーが、（２ｂ’）配列番号８の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーであり、
（３ａ）配列番号９の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマーが、（３ａ’）配列番号１０の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマーであり、
（３ｂ）配列番号１１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーが、（３ｂ’）配列番号１２の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーである、〔１〕または〔２〕の１種以上のＨＬＡ遺伝子用プライマー。
〔４〕ＨＬＡ遺伝子の検出方法であって、
〔１〕～〔３〕のいずれかの１種以上のＨＬＡ遺伝子用プライマーを用いて、ヒト被験体から得られた試料において１種以上のＨＬＡ遺伝子を検出することを含み、
１種以上のＨＬＡ遺伝子が、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子、ＨＬＡ－Ｅ遺伝子、およびＨＬＡ－Ｆ遺伝子からなる群より選ばれる、方法。
〔５〕１種以上のＨＬＡ遺伝子の検出が、１種以上のＨＬＡ遺伝子の増幅により行われる、〔４〕の方法。
〔６〕〔１〕～〔３〕のいずれかの１種以上のＨＬＡ遺伝子用プライマーを含む、ＨＬＡ遺伝子の検出試薬。
〔７〕下記（ａ）および（ｂ）を含む、ＨＬＡ遺伝子の検出キット：
（ａ）〔１〕～〔３〕のいずれかの１種以上のＨＬＡ遺伝子用プライマー；ならびに
（ｂ）ポリメラーゼ。
〔１〕下記（１）～（３）からなる群より選ばれる１種以上のＨＬＡ遺伝子用プライマー：
（１）１種以上のＨＬＡ－Ｇ遺伝子用プライマーであって、
１種以上のＨＬＡ－Ｇ遺伝子用プライマーが、（１ａ）配列番号１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および／または（１ｂ）配列番号３の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーである、プライマー；
（２）１種以上のＨＬＡ－Ｅ遺伝子用プライマーであって、
１種以上のＨＬＡ－Ｅ遺伝子用プライマーが、（２ａ）配列番号５の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および／または（２ｂ）配列番号７の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーである、プライマー；ならびに
（３）１種以上のＨＬＡ－Ｆ遺伝子用プライマーであって、
１種以上のＨＬＡ－Ｆ遺伝子用プライマーが、（３ａ）配列番号９の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および／または（３ｂ）配列番号１１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーである、プライマー。
〔２〕前記１種以上のＨＬＡ遺伝子用プライマーが、下記（１’）～（３’）からなる群より選ばれるＨＬＡ遺伝子増幅用プライマーセットである、〔１〕の１種以上のＨＬＡ遺伝子用プライマー：
（１’）ＨＬＡ－Ｇ遺伝子増幅用プライマーセットであって、
ＨＬＡ－Ｇ遺伝子増幅用プライマーセットが、（１ａ）配列番号１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および（１ｂ）配列番号３の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーを含む、プライマーセット；
（２’）ＨＬＡ－Ｅ遺伝子増幅用プライマーであって、
ＨＬＡ－Ｅ遺伝子増幅用プライマーが、（２ａ）配列番号５の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および（２ｂ）配列番号７の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーを含む、プライマーセット；ならびに
（３’）ＨＬＡ－Ｆ遺伝子増幅用プライマーであって、
ＨＬＡ－Ｆ遺伝子増幅用プライマーが、（３ａ）配列番号９の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および（３ｂ）配列番号１１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーを含む、プライマーセット。
〔３〕（１ａ）配列番号１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマーが、（１ａ’）配列番号２の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマーであり、
（１ｂ）配列番号３の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーが、（１ｂ’）配列番号４の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーであり、
（２ａ）配列番号５の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマーが、（２ａ’）配列番号６の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマーであり、
（２ｂ）配列番号７の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーが、（２ｂ’）配列番号８の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーであり、
（３ａ）配列番号９の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマーが、（３ａ’）配列番号１０の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマーであり、
（３ｂ）配列番号１１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーが、（３ｂ’）配列番号１２の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーである、〔１〕または〔２〕の１種以上のＨＬＡ遺伝子用プライマー。
〔４〕ＨＬＡ遺伝子の検出方法であって、
〔１〕～〔３〕のいずれかの１種以上のＨＬＡ遺伝子用プライマーを用いて、ヒト被験体から得られた試料において１種以上のＨＬＡ遺伝子を検出することを含み、
１種以上のＨＬＡ遺伝子が、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子、ＨＬＡ－Ｅ遺伝子、およびＨＬＡ－Ｆ遺伝子からなる群より選ばれる、方法。
〔５〕１種以上のＨＬＡ遺伝子の検出が、１種以上のＨＬＡ遺伝子の増幅により行われる、〔４〕の方法。
〔６〕〔１〕～〔３〕のいずれかの１種以上のＨＬＡ遺伝子用プライマーを含む、ＨＬＡ遺伝子の検出試薬。
〔７〕下記（ａ）および（ｂ）を含む、ＨＬＡ遺伝子の検出キット：
（ａ）〔１〕～〔３〕のいずれかの１種以上のＨＬＡ遺伝子用プライマー；ならびに
（ｂ）ポリメラーゼ。
本発明によれば、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－ＦまたはＨＬＡ－Ｇ遺伝子のＨＬＡアレルを高度に網羅して検出または増幅可能である。また、本発明によれば、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－ＦまたはＨＬＡ－Ｇ遺伝子の非翻訳領域を含む遺伝子全長を増幅可能である。
本発明は、下記（１）～（３）からなる群より選ばれる１種以上のＨＬＡ遺伝子用プライマーを提供する。
（１）１種以上のＨＬＡ－Ｇ遺伝子用プライマー：
（１ａ）配列番号１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および／または（１ｂ）配列番号３の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマー；
（２）１種以上のＨＬＡ－Ｅ遺伝子用プライマー：
（２ａ）配列番号５の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および／または（２ｂ）配列番号７の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマー；ならびに
（３）１種以上のＨＬＡ－Ｆ遺伝子用プライマー：
（３ａ）配列番号９の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および／または（３ｂ）配列番号１１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマー。
（１）１種以上のＨＬＡ－Ｇ遺伝子用プライマー：
（１ａ）配列番号１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および／または（１ｂ）配列番号３の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマー；
（２）１種以上のＨＬＡ－Ｅ遺伝子用プライマー：
（２ａ）配列番号５の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および／または（２ｂ）配列番号７の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマー；ならびに
（３）１種以上のＨＬＡ－Ｆ遺伝子用プライマー：
（３ａ）配列番号９の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および／または（３ｂ）配列番号１１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマー。
本発明の１種以上のプライマーは、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子、ＨＬＡ－Ｅ遺伝子、およびＨＬＡ－Ｆ遺伝子からなる群より選ばれるＨＬＡ遺伝子の標的部位にアニーリングできる限り、特に限定されない。例えば、本発明の１種以上のプライマーとしては、天然核酸または人工核酸を含む任意のプライマーを使用できるが、汎用性およびコスト等の観点からは、ＤＮＡプライマーが好ましい。
一実施形態では、本発明の１種以上のプライマーは、１種のＨＬＡ遺伝子用プライマーであってもよい。例えば、このような本発明の１種以上のプライマーは、ＨＬＡアレルの網羅性に優れるので、シーケンシング用プライマーまたはＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例、Ｃａｓ９）の標的として有用である。
本発明の１種以上のプライマーがシーケンシング用プライマーまたはＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの標的である場合、ＨＬＡ遺伝子内の領域を対象とする観点から、１種のプライマーは、下記プライマーである。
（１）１種のＨＬＡ－Ｇ遺伝子用プライマー：
（１ａ）配列番号１の塩基配列を含む第１プライマー、または（１ｂ）配列番号３の塩基配列を含む第２プライマー；
（２）１種のＨＬＡ－Ｅ遺伝子用プライマー：
（２ａ）配列番号５の塩基配列を含む第１プライマー、または（２ｂ）配列番号７の塩基配列を含む第２プライマー；ならびに
（３）１種のＨＬＡ－Ｆ遺伝子用プライマー：
（３ａ）配列番号９の塩基配列を含む第１プライマー、または（３ｂ）配列番号１１の塩基配列を含む第２プライマー。
（１）１種のＨＬＡ－Ｇ遺伝子用プライマー：
（１ａ）配列番号１の塩基配列を含む第１プライマー、または（１ｂ）配列番号３の塩基配列を含む第２プライマー；
（２）１種のＨＬＡ－Ｅ遺伝子用プライマー：
（２ａ）配列番号５の塩基配列を含む第１プライマー、または（２ｂ）配列番号７の塩基配列を含む第２プライマー；ならびに
（３）１種のＨＬＡ－Ｆ遺伝子用プライマー：
（３ａ）配列番号９の塩基配列を含む第１プライマー、または（３ｂ）配列番号１１の塩基配列を含む第２プライマー。
また、本発明の１種以上のプライマーがシーケンシング用プライマーまたはＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの標的である場合、遺伝子発現に特に重要である遺伝子上流の非翻訳領域を対象とする観点から、１種のプライマーは、（１ａ）配列番号１の塩基配列を含む第１プライマー、（２ａ）配列番号５の塩基配列を含む第１プライマー、または（３ａ）配列番号９の塩基配列を含む第１プライマーであってもよい。
別の実施形態では、本発明の１種以上のプライマーは、２種以上のプライマーを含むプライマーセットであってもよい。例えば、このようなプライマーセットは、ＨＬＡアレルの網羅性に優れるので、遺伝子増幅用プライマーセットとして有用である。
本発明の１種以上のプライマーは、２種以上のプライマーを含むプライマーセットである場合、ＨＬＡアレルの網羅性に優れる少なくとも１種の特定プライマーを含む下記プライマーセットであってもよい。
（１）２種以上のＨＬＡ－Ｇ遺伝子用プライマーを含むプライマーセット：
（１ａ）配列番号１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および（１ｂ）配列番号３の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーを含むプライマーセット、あるいは
（１ａ）配列番号１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、または（１ｂ）配列番号３の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーより選択されるプライマー、および当該選択されるプライマーとの組合せにおいてＨＬＡ－Ｇ遺伝子を増幅可能な別のプライマーを含むプライマーセット；
（２）２種以上のＨＬＡ－Ｅ遺伝子用プライマーを含むプライマーセット：
（２ａ）配列番号５の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および（２ｂ）配列番号７の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーを含むプライマーセット、あるいは
あるいは
（２ａ）配列番号５の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、または（２ｂ）配列番号７の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーより選択されるプライマー、および当該選択されるプライマーとの組合せにおいてＨＬＡ－Ｅ遺伝子を増幅可能な別のプライマーを含むプライマーセット；あるいは
（３）２種以上のＨＬＡ－Ｆ遺伝子用プライマー：
（３ａ）配列番号９の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および（３ｂ）配列番号１１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーを含むプライマーセット、あるいは
（３ａ）配列番号９の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、または（３ｂ）配列番号１１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーより選択されるプライマー、および当該選択されるプライマーとの組合せにおいてＨＬＡ－Ｆ遺伝子を増幅可能な別のプライマーを含むプライマーセット。
（１）２種以上のＨＬＡ－Ｇ遺伝子用プライマーを含むプライマーセット：
（１ａ）配列番号１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および（１ｂ）配列番号３の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーを含むプライマーセット、あるいは
（１ａ）配列番号１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、または（１ｂ）配列番号３の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーより選択されるプライマー、および当該選択されるプライマーとの組合せにおいてＨＬＡ－Ｇ遺伝子を増幅可能な別のプライマーを含むプライマーセット；
（２）２種以上のＨＬＡ－Ｅ遺伝子用プライマーを含むプライマーセット：
（２ａ）配列番号５の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および（２ｂ）配列番号７の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーを含むプライマーセット、あるいは
あるいは
（２ａ）配列番号５の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、または（２ｂ）配列番号７の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーより選択されるプライマー、および当該選択されるプライマーとの組合せにおいてＨＬＡ－Ｅ遺伝子を増幅可能な別のプライマーを含むプライマーセット；あるいは
（３）２種以上のＨＬＡ－Ｆ遺伝子用プライマー：
（３ａ）配列番号９の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および（３ｂ）配列番号１１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーを含むプライマーセット、あるいは
（３ａ）配列番号９の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、または（３ｂ）配列番号１１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーより選択されるプライマー、および当該選択されるプライマーとの組合せにおいてＨＬＡ－Ｆ遺伝子を増幅可能な別のプライマーを含むプライマーセット。
遺伝子増幅に必要とされるプライマーの数は、遺伝子増幅法の種類に応じて変動する。例えば、ＰＣＲでは、遺伝子増幅に必要とされるプライマーの数は、２個である。一方、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（例、国際公開第００／２８０８２号参照）では、遺伝子増幅に必要とされるプライマーの数は、４個または６個である。したがって、２個を超えるプライマーが必要な遺伝子増幅法による増幅が意図される場合、プライマーセットは、追加のプライマーを含んでいてもよい。
好ましくは、本発明の１種以上のプライマーは、２種の特定プライマーを含む下記プライマーセットであってもよい。
（１’）ＨＬＡ－Ｇ遺伝子増幅用プライマーセット：
（１ａ）配列番号１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および（１ｂ）配列番号３の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーを含むプライマーセット；
（２’）ＨＬＡ－Ｅ遺伝子増幅用プライマーセット：
（２ａ）配列番号５の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および（２ｂ）配列番号７の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーを含むプライマーセット；あるいは
（３’）ＨＬＡ－Ｆ遺伝子増幅用プライマーセット：
（３ａ）配列番号９の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および（３ｂ）配列番号１１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーを含むプライマーセット。
（１’）ＨＬＡ－Ｇ遺伝子増幅用プライマーセット：
（１ａ）配列番号１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および（１ｂ）配列番号３の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーを含むプライマーセット；
（２’）ＨＬＡ－Ｅ遺伝子増幅用プライマーセット：
（２ａ）配列番号５の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および（２ｂ）配列番号７の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーを含むプライマーセット；あるいは
（３’）ＨＬＡ－Ｆ遺伝子増幅用プライマーセット：
（３ａ）配列番号９の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および（３ｂ）配列番号１１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーを含むプライマーセット。
上記（１’）～（３’）のプライマーセットでは、２種の特定プライマーが使用される。この２種の特定プライマーは、４５００ｂｐ以上の大きなサイズの増幅産物を生成するように設定されている（実施例）。したがって、上記（１’）～（３’）のプライマーセットは、大きなサイズの増幅産物を容易に生成することができる遺伝子増幅法において使用されることが好ましい。このような遺伝子増幅法としては、例えば、ＰＣＲ、ＳＤＡ（ＳＴＲＡＮＤ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、Ｈｙｂｒｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、Ｃｌｅａｖａｓｅ Ｉｎｖａｄｅｒが挙げられる。
本発明の１種以上のプライマーが上記２種の特定プライマーを含むプライマーセットである場合、１種の特定プライマーを含むプライマーセットに比し、標的遺伝子のＨＬＡアレルをより高度に網羅して増幅可能であり、しかも上記遺伝子の非翻訳領域を含む遺伝子全長も増幅可能である。
配列番号１、３、５、７、９もしくは１１、またはそれらの相補塩基配列を含むプライマーは、その５’末端または３’末端にさらなる塩基が付加されていてもよい。例えば、このような塩基としては、標的部位の該当塩基に対する相補塩基が挙げられる。相補塩基の数は特に限定されず、例えば１～１０個、好ましくは１～５個であってもよい。このような塩基がプライマーに付加される場合、標的部位に対してより安定的にアニーリングすることができ、検出または増幅効率を向上させることができる。しかし、配列番号１、３、５、７、９もしくは１１、またはそれらの相補塩基配列を含むプライマーは、それ自体、標的部位に対して良好にアニーリングできるので、その５’末端または３’末端にさらなる塩基が付加されていなくてもよい。また、プライマーは、化学修飾（例、アミノ基による修飾）されていてもよく、リンカーが付加されてもよい。
特定の実施形態では、５’末端または３’末端にさらなる塩基が付加された上記第１および第２プライマーは、以下であってもよい。
（１ａ）配列番号１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマーは、（１ａ’）配列番号２の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマーであってもよい。
（１ｂ）配列番号３の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーは、（１ｂ’）配列番号４の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーであってもよい。
（２ａ）配列番号５の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマーは、（２ａ’）配列番号６の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマーであってもよい。
（２ｂ）配列番号７の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーは、（２ｂ’）配列番号８の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーであってもよい。
（３ａ）配列番号９の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマーは、（３ａ’）配列番号１０の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマーであってもよい。
（３ｂ）配列番号１１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーは、（３ｂ’）配列番号１２の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーであってもよい。
（１ａ）配列番号１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマーは、（１ａ’）配列番号２の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマーであってもよい。
（１ｂ）配列番号３の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーは、（１ｂ’）配列番号４の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーであってもよい。
（２ａ）配列番号５の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマーは、（２ａ’）配列番号６の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマーであってもよい。
（２ｂ）配列番号７の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーは、（２ｂ’）配列番号８の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーであってもよい。
（３ａ）配列番号９の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマーは、（３ａ’）配列番号１０の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマーであってもよい。
（３ｂ）配列番号１１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーは、（３ｂ’）配列番号１２の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーであってもよい。
配列番号１～１２の塩基配列の概要は、以下のとおりである（詳細は、表５を参照）。
配列番号２、４、６、８、１０もしくは１２、またはそれらの相補塩基配列を含むプライマーは、その５’末端または３’末端にさらなる塩基が付加されていてもよい。例えば、このような塩基としては、標的部位の塩基に対する相補塩基が挙げられる。相補塩基の数は特に限定されず、例えば１～１０個、好ましくは１～５個であってもよい。このような塩基がプライマーに付加される場合、標的部位に対してより安定的にアニーリングすることができ、検出または増幅効率を向上させることができる。しかし、配列番号２、４、６、８、１０もしくは１２、またはそれらの相補塩基配列を含むプライマーは、それ自体、標的部位に対して非常に良好にアニーリングできるので、その５’末端または３’末端にさらなる塩基が付加されていなくてもよい。また、プライマーは、化学修飾（例、アミノ基による修飾）されていてもよく、リンカーが付加されてもよい。
配列番号１～１２、またはそれらの相補塩基配列を含むプライマーは、その５’末端に、識別を可能にする標識部分等の機能性部分（例、バーコード配列等の非相補塩基含有塩基配列）が付加されていてもよい。このような機能性部分としては、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＰａｃＢｉｏ社）、Ａｄａｐｔｅｒ Ｏｖｅｒｈａｎｇ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）が挙げられる。
本発明で用いられる上述したようなプライマーは、特定の塩基数（ヌクレオチド長）を有するように設計することができる。このような塩基数は、例えば１５個以上、好ましくは１６個以上、より好ましくは１７個以上、さらにより好ましくは１８個以上、特に好ましくは２０個以上であってもよい。このような塩基数はまた、例えば５０個以下、好ましくは４５個以下、より好ましくは４０個以下、さらにより好ましくは３５個以下、特に好ましくは３０個以下であってもよい。より具体的には、このような塩基数は、例えば１５～５０個、好ましくは１６～４５個、より好ましくは１７～４０個、さらにより好ましくは１８～３５個、特に好ましくは２０～３０個であってもよい。
本発明はまた、ＨＬＡ遺伝子の検出方法を提供する。本発明の方法は、本発明の１種以上のプライマーを用いて、ヒト被験体から得られた試料において、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子、ＨＬＡ－Ｅ遺伝子、およびＨＬＡ－Ｆ遺伝子からなる群より選ばれる１種以上のＨＬＡ遺伝子を検出することを含む。
ヒト被験体から得られた試料としては、本発明の１種以上のプライマーの標的を含む任意の試料を使用することができる。したがって、ヒト被験体から得られた試料としては、ゲノムおよび／または標的ＨＬＡ遺伝子の転写物を含有する限り特に限定されず、例えば、ヒトから採取された試料、ヒトから採取された試料から調製された試料（例、細胞試料）が挙げられる。好ましくは、試料としては、ゲノム含有試料が使用される。ゲノム含有試料としては、低侵襲性の試料が好ましい。このような試料としては、毛髪、唾液、血液（例、全血、血漿または血清）、粘膜（例、口腔粘膜、鼻腔粘膜）が挙げられる。
試料におけるＨＬＡ遺伝子の検出では、試料からゲノムＤＮＡまたはＨＬＡ遺伝子の転写物が抽出されてもよい。このような抽出は、任意の方法により行うことができる。抽出されたゲノムＤＮＡまたはＨＬＡ遺伝子の転写物は、意図される増幅産物のサイズに応じた適切な遺伝子増幅法（例、ＰＣＲ、またはＬＡＭＰ）に供することができる。あるいは、試料は、遺伝子増幅法に直接供されてもよい（例、ダイレクトＰＣＲ）。
本発明の方法は、例えば、移植、癌治療薬・治療法（例、癌ワクチン）の選択、または疾患リスクの判定のためのＨＬＡ検査に有用である。
本発明はまた、本発明の１種以上のプライマーを含む、ＨＬＡ遺伝子の検出試薬を提供する。本発明の試薬によれば、本発明の方法を簡便に行うことができる。
本発明の試薬は、本発明の１種以上のプライマーを粉末（例、凍結乾燥）または溶液の形態で含むことができる。溶液は、水溶液が好ましい。水溶液としては、例えば、水（例、滅菌蒸留水）、緩衝液が挙げられる。緩衝液としては、例えば、ＴＥ（Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ）緩衝液、塩酸－塩化カリウム緩衝液、グリシン－塩酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸－リン酸緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液、グリシン－水酸化ナトリウム緩衝液、炭酸－重炭酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液が挙げられる。本発明の試薬が本発明の１種以上のプライマーを含む溶液である場合、溶液中のプライマーの濃度は、プライマーの用途およびプライマーの使用の際の希釈倍率等の因子によって変動するが、例えば０．１～１００ｍＭ、好ましくは１～１０ｍＭであってもよい。溶液は、安定化剤等の他の成分を含んでいてもよい。
本発明はまた、（ａ）本発明の１種以上のプライマー、ならびに（ｂ）ポリメラーゼを含む、ＨＬＡ遺伝子の検出キットを提供する。本発明のキットによれば、本発明の方法を簡便に行うことができる。
ポリメラーゼとしては、遺伝子増幅法の種類に応じた適切なポリメラーゼを使用することができる。例えば、ＰＣＲであれば耐熱性ポリメラーゼの使用が好ましく、ＬＡＭＰであれば鎖置換型ポリメラーゼの使用が好ましい。ポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。
本発明のキットは、（ａ）および（ｂ）に加えて、さらなる構成成分を含んでいてもよい。このような構成要素としては、デオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）混合物、反応緩衝液、分子量マーカー、コントロール（例、各種ＨＬＡアレルの増幅産物の標品）が挙げられる。本発明のキットがさらなる構成成分を含む場合、各構成成分は、互いに隔離された形態、例えば、異なる容器（例、チューブ）に格納された形態で提供されてもよいが、予め混合された形態（例、ＰｒｅＭｉｘ）等で提供されてもよい。
特定の実施形態では、検出は、リアルタイムで行われてもよい（例、リアルタイムＰＣＲ）。この場合、リアルタイムでの検出を可能にする方法としては、例えば、インターカレーター法、蛍光物質標識プローブ法が挙げられる。したがって、リアルタイムでの検出が意図される場合、本発明のキットは、さらなる構成成分として、蛍光物質または蛍光物質標識プローブをさらに含んでいてもよい。蛍光物質としては、例えば、インターカレーター法に用いられる蛍光物質（例、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｉ）が挙げられる。蛍光物質標識プローブとしては、例えば、５’末端または３’末端の一方に蛍光物質が結合し、かつ５’末端または３’末端の他方にクエンチャーが結合しているプローブ（例、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）が挙げられる。
以下の実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
３種のＨＬＡクラスＩｂ遺伝子（ＨＬＡ－Ｅ，ＨＬＡ－Ｆ，ＨＬＡ－Ｇ）に対し、遺伝子特異的ＰＣＲを行うためのプライマー設計手順および評価について記述する。
＜プライマーの設計＞
ヒトゲノムリファレンス配列（ゲノムアセンブリバージョンｈｇ３８）とＡｌｔｅｒｎａｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（ｃｈｒ６＿ＧＬ０００２５０ｖ２＿ａｌｔ、ｃｈｒ６＿ＧＬ０００２５１ｖ２＿ａｌｔ、ｃｈｒ６＿ＧＬ０００２５２ｖ２＿ａｌｔ、ｃｈｒ６＿ＧＬ０００２５３ｖ２＿ａｌｔ、ｃｈｒ６＿ＧＬ０００２５４ｖ２＿ａｌｔ、ｃｈｒ６＿ＧＬ０００２５５ｖ２＿ａｌｔ、ｃｈｒ６＿ＧＬ０００２５６ｖ２＿ａｌｔ、ｃｈｒ６＿ＧＬ３８３５３３ｖ１＿ａｌｔ）に保存されている領域に対してＰＣＲプライマー設計ツール Ｐｒｉｍｅｒ３を実行することにより、各遺伝子１セットのプライマーを設計した（ＨＬＡ－Ｇ＿ｖ１、ＨＬＡ－Ｅ＿ｖ１、ＨＬＡ－Ｆ＿ｖ１）。
ヒトゲノムリファレンス配列（ゲノムアセンブリバージョンｈｇ３８）とＡｌｔｅｒｎａｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（ｃｈｒ６＿ＧＬ０００２５０ｖ２＿ａｌｔ、ｃｈｒ６＿ＧＬ０００２５１ｖ２＿ａｌｔ、ｃｈｒ６＿ＧＬ０００２５２ｖ２＿ａｌｔ、ｃｈｒ６＿ＧＬ０００２５３ｖ２＿ａｌｔ、ｃｈｒ６＿ＧＬ０００２５４ｖ２＿ａｌｔ、ｃｈｒ６＿ＧＬ０００２５５ｖ２＿ａｌｔ、ｃｈｒ６＿ＧＬ０００２５６ｖ２＿ａｌｔ、ｃｈｒ６＿ＧＬ３８３５３３ｖ１＿ａｌｔ）に保存されている領域に対してＰＣＲプライマー設計ツール Ｐｒｉｍｅｒ３を実行することにより、各遺伝子１セットのプライマーを設計した（ＨＬＡ－Ｇ＿ｖ１、ＨＬＡ－Ｅ＿ｖ１、ＨＬＡ－Ｆ＿ｖ１）。
＜ＨＬＡアレル網羅性の確認＞
設計したプライマーセットがＨＬＡアレルを網羅的にＰＣＲ増幅可能かどうか、公開されている全ゲノムシーケンス（ＷＧＳ）データを用いてｉｎ ｓｉｌｉｃｏにて確認した。
設計したプライマーセットがＨＬＡアレルを網羅的にＰＣＲ増幅可能かどうか、公開されている全ゲノムシーケンス（ＷＧＳ）データを用いてｉｎ ｓｉｌｉｃｏにて確認した。
公開されているＨｉｐＳｃｉ Ｒｅｓｏｕｒｃｅの１４５例分のＷＧＳデータをＥｕｒｏｐｅａｎ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｒｃｈｉｖｅ（ＥＮＡ，ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｎａ，ｓｔｕｄｙ ＰＲＪＥＢ１５２９９）からダウンロードし、ＢＷＡ ０．７．１７とｓａｍｔｏｏｌｓ １．１０を用いてＨＬＡ遺伝子とその近傍由来の可能性があるリードのみが含まれるＦＡＳＴＱファイルを作成した。
作成した各サンプルのＦＡＳＴＱファイル対して、ＨＬＡＨＤ １．２．１を用いてＨＬＡアレルのコーリングを実施した（表２、表３、表４）。
作成した各サンプルのＦＡＳＴＱファイルに対して、ｆｒｅｅｂａｙｅｓ １．３．１、ｗｈａｔｓｈａｐ １．０、ｂｃｆｔｏｏｌｓ １．１０．２を用いてＨＬＡクラスＩｂ遺伝子とその近傍配列のコンセンサス配列を作成し、各サンプルのＨＬＡアレル情報と対応させた。
設計したプライマーのコア配列となる結合部位が、ＨｉｐＳｃｉ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ １４５例すべてのコンセンサス配列に存在するか、Ｂｏｗｔｉｅ２ ２．３．５．１を用いて評価したところ、コンセンサス配列に存在することが確認された。
＜ＨＬＡ－Ｇ遺伝子プライマーのＨＬＡアレル網羅性の比較＞
公知のＨＬＡ－Ｇ遺伝子プライマー（非特許文献２）について、ＨｉｐＳｃｉ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ １４５例のコンセンサス配列に対する網羅性をＢｏｗｔｉｅ２ ２．３．５．１を用いて評価した。その結果、１４５例（アレル数としては２９０）中、１４アレルでミスマッチが存在することから、ＰＣＲ増幅が認められない、または均一な増幅に影響が生じる可能性が高い可能性が示唆された。
これに対し、設計したプライマーセットＨＬＡ－Ｇ＿ｖ１のフォワードプライマー及びリバースプライマーは何れも、２９０アレル全てでミスマッチが存在しないことから、アレル網羅性が非常に高いことが確認された。
公知のＨＬＡ－Ｇ遺伝子プライマー（非特許文献２）について、ＨｉｐＳｃｉ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ １４５例のコンセンサス配列に対する網羅性をＢｏｗｔｉｅ２ ２．３．５．１を用いて評価した。その結果、１４５例（アレル数としては２９０）中、１４アレルでミスマッチが存在することから、ＰＣＲ増幅が認められない、または均一な増幅に影響が生じる可能性が高い可能性が示唆された。
これに対し、設計したプライマーセットＨＬＡ－Ｇ＿ｖ１のフォワードプライマー及びリバースプライマーは何れも、２９０アレル全てでミスマッチが存在しないことから、アレル網羅性が非常に高いことが確認された。
＜実験による特異的なＰＣＲ増幅の確認＞
表５に示すプライマーセットが特異的にＰＣＲ増幅可能か実験的に確認するため、アフリカ系集団より樹立された細胞株（Ｄａｕｄｉ：Ｄ）、日本人集団より樹立された細胞株（ＡＫＩＢＡ：Ａ）、ヒスパニック系アメリカ人由来ヒト末梢血単核球（Ｌ７）より抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型として、各ＨＬＡクラスＩｂ遺伝子特異的プライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行った。Ｎｏｎ－ｔｅｍｐｌａｔｅ ｃｏｎｔｒｏｌとして、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ（Ｎ）を用いた。
表５に示すプライマーセットが特異的にＰＣＲ増幅可能か実験的に確認するため、アフリカ系集団より樹立された細胞株（Ｄａｕｄｉ：Ｄ）、日本人集団より樹立された細胞株（ＡＫＩＢＡ：Ａ）、ヒスパニック系アメリカ人由来ヒト末梢血単核球（Ｌ７）より抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型として、各ＨＬＡクラスＩｂ遺伝子特異的プライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行った。Ｎｏｎ－ｔｅｍｐｌａｔｅ ｃｏｎｔｒｏｌとして、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ（Ｎ）を用いた。
ＰＣＲ反応は、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ株式会社）を用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ Ｐｒｅｍｉｘ（２Ｘ） １２．５μＬ、フォワードプライマー（２μＭ） ２．５μＬ、リバースプライマー（２μＭ） ２．５μＬ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ ５μＬ、ゲノムＤＮＡ溶液（５ｎｇ） ２．５μＬの合計２５μＬ溶液を調整した。これを９４度で１分間の保温後、続いて９８度で１０秒間、６８度で８分間の２ステップを１工程として、この工程を３０回繰り返した。なお、このＰＣＲにはＶｅｒｉｔｉ ９６－Ｗｅｌｌ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いた。
次に、ＰＣＲ反応後に、Ｓｅｒａ－Ｍａｇ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｃｙｔｉｖａ）を用いてＰＣＲ増幅産物を精製し、Ｂｕｆｆｅｒ ＥＢ（ＱＩＡＧＥＮ）２５μＬで溶出した。
精製後のＰＣＲ増幅産物をＧｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ システム（アジレント・テクノロジー株式会社）を用いて電気泳動を行い、ＰＣＲ増幅の状況を確認した（図１）。
＜ロングリードシーケンサーを用いた配列決定＞
ＰＣＲ増幅産物について、Ｓｅｑｕｅｌシステム（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， Ｉｎｃ．）を用いて配列決定を行った。
ＰＣＲ増幅産物について、Ｓｅｑｕｅｌシステム（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， Ｉｎｃ．）を用いて配列決定を行った。
表５に記載のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行い、ＳＭＲＴｂｅｌｌ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ２．０を用いて、測定機器の設定、反応条件および試薬の添加量はＰａｃＢｉｏ社により提供されているＰｒｏｃｅｄｕｒｅ ＆ Ｃｈｅｃｋｌｉｓｔ Ｐａｒｔ Ｎｕｍｂｅｒ １０１－７９１－７００ ｖｅｒｓｉｏｎ ０２に基本的に従い実施した。
Ｓｅｑｕｅｌシステムにより得られたコンセンサス配列について、ＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベースを参照配列としてＨＬＡアレルタイピングを実施した。
アフリカ系集団より樹立された細胞株（Ｄａｕｄｉ：Ｄ）、日本人集団より樹立された細胞株（ＡＫＩＢＡ：Ａ）、ヒスパニック系アメリカ人由来ヒト末梢血単核球６例（Ｌ７，Ｌ２２２，Ｌ２５５，Ｌ２７５，Ｌ３４０，Ｌ３６５）より抽出されているゲノムＤＮＡを鋳型として解析を行った。
その結果、今回絞り込んだプライマーセットは、新規と推定されるＨＬＡアレルを含む多数のＨＬＡアレル群を高度に網羅して増幅可能であることが確認された（表６）。
＜コア配列の特定＞
フォワードプライマーまたはリバースプライマーのコアとなる配列を特定するため、設計したプライマーの５‘側と３’側から１塩基ずつ短くし、ヒトゲノムリファレンス配列（ゲノムアセンブリバージョンｈｇ３８）上に完全一致するかの確認を行い、ターゲットとしている遺伝子の上流と下流にユニークに一致するコア配列を特定した（表５における太字下線部の配列）。このコア配列について、ＨｉｐＳｃｉ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ １４５例すべてのプライマーのターゲット遺伝子のコンセンサス配列に結合部位がユニークに完全一致することを確認した。
フォワードプライマーまたはリバースプライマーのコアとなる配列を特定するため、設計したプライマーの５‘側と３’側から１塩基ずつ短くし、ヒトゲノムリファレンス配列（ゲノムアセンブリバージョンｈｇ３８）上に完全一致するかの確認を行い、ターゲットとしている遺伝子の上流と下流にユニークに一致するコア配列を特定した（表５における太字下線部の配列）。このコア配列について、ＨｉｐＳｃｉ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ １４５例すべてのプライマーのターゲット遺伝子のコンセンサス配列に結合部位がユニークに完全一致することを確認した。
Claims (7)
- 下記（１）～（３）からなる群より選ばれる１種以上のＨＬＡ遺伝子用プライマー：
（１）１種以上のＨＬＡ－Ｇ遺伝子用プライマーであって、
１種以上のＨＬＡ－Ｇ遺伝子用プライマーが、（１ａ）配列番号１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および／または（１ｂ）配列番号３の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーである、プライマー；
（２）１種以上のＨＬＡ－Ｅ遺伝子用プライマーであって、
１種以上のＨＬＡ－Ｅ遺伝子用プライマーが、（２ａ）配列番号５の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および／または（２ｂ）配列番号７の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーである、プライマー；ならびに
（３）１種以上のＨＬＡ－Ｆ遺伝子用プライマーであって、
１種以上のＨＬＡ－Ｆ遺伝子用プライマーが、（３ａ）配列番号９の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および／または（３ｂ）配列番号１１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーである、プライマー。 - 前記１種以上のＨＬＡ遺伝子用プライマーが、下記（１’）～（３’）からなる群より選ばれるＨＬＡ遺伝子増幅用プライマーセットである、請求項１記載の１種以上のＨＬＡ遺伝子用プライマー：
（１’）ＨＬＡ－Ｇ遺伝子増幅用プライマーセットであって、
ＨＬＡ－Ｇ遺伝子増幅用プライマーセットが、（１ａ）配列番号１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および（１ｂ）配列番号３の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーを含む、プライマーセット；
（２’）ＨＬＡ－Ｅ遺伝子増幅用プライマーであって、
ＨＬＡ－Ｅ遺伝子増幅用プライマーが、（２ａ）配列番号５の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および（２ｂ）配列番号７の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーを含む、プライマーセット；ならびに
（３’）ＨＬＡ－Ｆ遺伝子増幅用プライマーであって、
ＨＬＡ－Ｆ遺伝子増幅用プライマーが、（３ａ）配列番号９の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマー、および（３ｂ）配列番号１１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーを含む、プライマーセット。 - （１ａ）配列番号１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマーが、（１ａ’）配列番号２の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマーであり、
（１ｂ）配列番号３の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーが、（１ｂ’）配列番号４の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーであり、
（２ａ）配列番号５の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマーが、（２ａ’）配列番号６の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマーであり、
（２ｂ）配列番号７の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーが、（２ｂ’）配列番号８の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーであり、
（３ａ）配列番号９の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマーが、（３ａ’）配列番号１０の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第１プライマーであり、
（３ｂ）配列番号１１の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーが、（３ｂ’）配列番号１２の塩基配列もしくはその相補塩基配列を含む第２プライマーである、請求項１または２記載の１種以上のＨＬＡ遺伝子用プライマー。 - ＨＬＡ遺伝子の検出方法であって、
請求項１～３のいずれか一項記載の１種以上のＨＬＡ遺伝子用プライマーを用いて、ヒト被験体から得られた試料において１種以上のＨＬＡ遺伝子を検出することを含み、
１種以上のＨＬＡ遺伝子が、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子、ＨＬＡ－Ｅ遺伝子、およびＨＬＡ－Ｆ遺伝子からなる群より選ばれる、方法。 - １種以上のＨＬＡ遺伝子の検出が、１種以上のＨＬＡ遺伝子の増幅により行われる、請求項４記載の方法。
- 請求項１～３のいずれか一項記載の１種以上のＨＬＡ遺伝子用プライマーを含む、ＨＬＡ遺伝子の検出試薬。
- 下記（ａ）および（ｂ）を含む、ＨＬＡ遺伝子の検出キット：
（ａ）請求項１～３のいずれか一項記載の１種以上のＨＬＡ遺伝子用プライマー；ならびに
（ｂ）ポリメラーゼ。
Priority Applications (4)
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|---|---|---|---|
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Patent Citations (2)
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