CN105339508B - Hla基因的多重dna分型方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
目的在于提供运用高通量测序仪排除了来源于相位模糊的不明确的高精度的DNA分型方法和试剂盒。本发明提供HLA的DNA分型方法，该方法的特征在于，包含：（1）制备分别特异性地与选自属于人基因组碱基序列中的HLA I类和II类的基因中的至少2种基因的上游区域和下游区域杂交、并且在相同的PCR条件下进行扩增的引物组的步骤；（2）使用前述引物组，以相同的PCR条件在相同容器内同时扩增被检试样（DNA）中的前述至少2种基因的步骤；（3）确定PCR产物的碱基序列的步骤；和（4）任选地，实施与数据库的同源性检索的步骤。
Description
技术领域
本发明涉及使用了高通量DNA测序仪的HLA基因的超高分辨率多重DNA分型方法。
背景技术
作为人的主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex；MHC）的人白细胞抗原（Human Leukocyte Antigen；HLA）通过向T细胞呈递来自病原体等外来蛋白质的肽以及来自自身蛋白质的肽而密切参与免疫应答的诱导，作为主要的HLA，已知有6种抗原。即是几乎在所有细胞中表达的I类抗原（HLA-A，HLA-B，HLA-C）与主要在免疫系统的细胞中表达的II类抗原（HLA-DR，HLA-DQ，HLA-DP）。
HLA I类抗原由表现高度多态性的α链和几乎没有多态性的β2-微球蛋白构成，HLAII类抗原由存在高度多态的β链与多态性低的α链构成。I类抗原的α链由HLA-A，HLA-B，HLA-C的各基因所编码，II类抗原的β链由HLA-DRB1，HLA-DRB3/4/5，HLA-DQB1，HLA-DPB1基因所编码，α链由HLA-DRA1，HLA-DQA1，HLA-DPA1基因所编码。在基因水平上，在HLA I类抗原中，编码α链的基因的外显子2和外显子3显示高度的多态性，在HLA II类抗原中，编码β链的基因的外显子2显示高度的多态性。
编码HLA的基因区域位于人第6染色体短臂6p21.3，从端粒侧朝向着丝粒侧，以I类区域（HLA-A，HLA-B，HLA-C等）、III类区域、II类区域（HLA-DRA，HLA-DRB1，HLA-DRB3/4/5，HLA-DQA1，HLA-DQB1，HLA-DPA1，HLA-DPB1等）的顺序排列，许多基因以非常高的密度编码，它们与输血、移植和各种疾病的关联性已被报道。在III类区域中不存在HLA基因，而存在补体成分、肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor；TNF）等的基因。
在编码HLA-DR抗原的β链的HLA-DRB基因区域中，确认了5种结构多态性。在DR1型、DR10型中，除了HLA-DRB1之外，HLA-DRB6、HLA-DRB9等假基因也位于同一单元型（haplotype）上。在DR2型中，除了HLA-DRB1之外，HLA-DRB5（DR51）基因、HLA-DRB6、HLA-DRB9等假基因也位于同一单元型上。在DR3、DR5和DR6型中，除了HLA-DRB1之外，HLA-DRB3（DR52）基因、HLA-DRB2、HLA-DRB9等假基因也位于同一单元型上。在DR4、DR7和DR9型中，除了HLA-DRB1之外，HLA-DRB4（DR53）基因、HLA-DRB7、HLA-DRB8、HLA-DRB9等假基因也位于同一单元型上。与它们相对，在DR8型中，HLA-DRB1以外的HLA-DRB基因并不位于同一单元型上（图1）。
各HLA基因的外显子中，存在多个多态性丰富的区域（多态区），某多态区的碱基序列（氨基酸序列）在多个HLA等位基因（HLA allele）中是共同的情况多。即，各HLA等位基因通过多个多态区的组合来规定。在HLA I类抗原中，不仅外显子内的多态区、而且具有同一碱基序列的外显子2或外显子3有时也在多个等位基因中是共同的。
由于HLA中存在高度多态，已知HLA等位基因的种类极多，它们的表示法也得到确定。即，辨别血清学HLA型的第1区域（2位数水平）、辨别同一血清学HLA型内伴有氨基酸替换的等位基因的第2区域（4位数水平）、辨别确认到不伴有氨基酸突变的碱基替换的等位基因的第3区域（6位数水平）、和辨别编码HLA分子的基因区域外（内含子）中伴有碱基替换的等位基因的第4区域（8位数水平）（图2）。
据称在骨髓移植之际，如果希望移植者与供体的HLA型（HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1）在4位数水平上完全匹配，则移植的成功率提高，重度的移植物抗宿主病（GraftVersus Host Disease；GVHD）频率降低。相反，如果HLA型在4位数水平上不一致则发生引起排斥反应等的不良情况的危险性变高。所以，准确且高精度地实施HLA分型在临床上也极其重要。
作为HLA基因中的DNA分型法，基于聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction；PCR）的SBT（基于序列分型）法、SSO（序列特异性寡核苷酸）-Luminex法是主流。
这些以往的DNA分型法具有能够对多数样品迅速进行分型的优势，但在多态区、I类基因的情况下，也有时不能准确确定外显子的染色体上的顺反位置关系，产生相位模糊（phase ambiguity），有时难以进行高精度的HLA分型。
另外，以往的方法是以各HLA基因的外显子区域为中心的采用了PCR的DNA分型法，因而会忽略内含子区域、启动子区域中的碱基替换，其结果是，有可能忽略虽然基因结构与其它的表达HLA基因一样但表达受抑制的无效（null）等位基因的检测。
例如，专利文献1中记载的方法中，由于各HLA基因的PCR条件并不相同，因而必须独立实施各HLA基因的PCR，而与操作的迅速化和简便化并无关系。
本发明人等提出了通过使用与HLA的各基因座的上游区域和下游区域分别特异性地退火的引物组而能够进行没有相位模糊的高精度的分型的方法（专利文献2和非专利文献2）。然而，在该方法中，各基因所采用的PCR条件未被完全统一，尚未达到同时实施所有基因座的PCR的多重法。
进而，对于在进行PCR的迅速化受到期待的PCR时使温度的上升或下降所需的时间大幅缩短的高速PCR装置并无研究。
现有技术文献
专利文献
专利文献1 : 日本特开平11-216000号公报
专利文献2 : 国际公开WO2013/011734号小册子
非专利文献
非专利文献1 : Lind C.等、Human Immunology、第71卷、1033-1042页（2010年）
非专利文献2 : Shiina T.等、Tissue Antigens、第80卷、305-316页（2012年）。
发明内容
发明要解决的技术问题
本发明的课题在于：开发能够使新设计了基因特异性引物的包含HLA-DRB3/DRB4/DRB5的各HLA基因的PCR条件（退火温度）相同，并基于该条件将各HLA基因在同一容器内同时进行PCR扩增的多重PCR法；进而提供能够通过设定将该方法适用于高速PCR装置时的多重PCR法的条件（延伸反应所需的时间），而排除来源于相位模糊的不明确，并且实现迅速化和简便化的超高分辨率DNA分型方法。
用于解决技术问题的方法
为了解决上述的问题，本发明人等反复深入研究，结果发现，通过再设计用于各HLA基因的引物并选择使用的DNA聚合酶，能够在同一条件下进行PCR而不管HLA基因的种类如何，从而完成了本发明。
即，本发明提供包括以下步骤的HLA的DNA分型方法。
（1）制备分别特异性地与选自属于人基因组碱基序列中的HLA I类和II类的基因中的至少2种基因的上游区域和下游区域杂交、并且在相同的PCR条件下进行扩增的引物组的步骤；
（2）使用所述引物组，在相同的PCR条件下在相同容器内同时扩增被检试样（DNA）中的所述至少2种基因的步骤；
（3）确定PCR产物的碱基序列的步骤；和
（4）任选地实施与数据库的同源性检索的步骤。
发明效果
本发明是：特别是对于作为HLA I类抗原的HLA-A，HLA-B和HLA-C、HLA II类抗原即HLA-DRB1，HLA-DRB3/4/5、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1和HLA-DPB1，新设计能够特异性地并且在相同退火温度下扩增这些HLA基因的PCR引物；选择适宜于本DNA分型方法的DNA聚合酶；设定在使用该酶时能够以1台PCR装置1次进行所有HLA基因的DNA分型的优选PCR条件；开发基于该条件的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1的多重PCR法；进而设定使用高速PCR装置时的多重PCR法的延伸反应所需的时间；运用高通量测序技术，由此解决了上述现有技术的问题的发明。
本发明的方法可得到来自1分子的HLA基因的DNA分型所需的全部碱基序列，因此是确认不到顺反位置关系不清楚的相位模糊的终极DNA分型法，例如，移植时的希望移植者与供体候补之间的高精度的HLA的一致得以实现。
因为HLA基因的包括启动子区域、外显子区域、内含子区域等周边区域的基因全部碱基序列被确定，因而可以检测出表达受到抑制的无效等位基因和新等位基因。
本发明中，由于设定了能够以1台PCR装置1次进行多个至全部HLA基因的DNA分型的适宜PCR条件，因而操作上的迅速化和简便化得到实现。
本发明中，由于提供多个HLA基因的多重PCR法，因而希望移植者与供体候补之间的HLA型的更高精度并且更迅速的HLA分型得到实现。
附图说明
[图1] 是示出HLA-DR基因区域的图。引用自猪子英俊、笹月健彦、十字猛夫 主编，“移植・输血検査学”，講談社サイエンティフィック，2004年，第48页。
[图2] 是示出HLA等位基因的分类法的图。引用自IMGT-HLA数据库（www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/）。
[图3] （a）是示出HLA I类基因结构与分子结构的关联性的图。（b）是示出HLA I类基因的启动子区域的结构的图。引用自猪子英俊、笹月健彦、十字猛夫 主编，“移植・输血検査学”，講談社サイエンティフィック，2004年，第35页。
[图4] 是示出各HLA基因的结构的模式图。
[图5] （a）是示出HLA II类基因结构与分子结构的关联性的图。（b）是示出HLA II类基因的启动子区域的结构的图。引用自猪子英俊、笹月健彦、十字猛夫 主编，“移植・输血検査学”，講談社サイエンティフィック，2004年，第46页～第47页。
[图6] 是示出表示试验例1中扩增的HLA-DRB1基因的扩增状况的琼脂糖凝胶电泳图像的图。
[图7] 是示出表示实施例1中扩增的HLA基因的PCR状况的琼脂糖凝胶电泳图像的图。
[图8] 是示出表示实施例2中扩增的HLA基因的PCR状况的琼脂糖凝胶电泳图像的图。
[图9] 是示出表示实施例3中扩增的HLA基因的PCR状况的琼脂糖凝胶电泳图像的图。
[图10] 是示出表示实施例4中扩增的HLA基因的PCR状况的琼脂糖凝胶电泳图像的图。
[图11] 是示出表示实施例5中扩增的HLA-A，HLA-B，HLA-C，HLA-DRB1基因的PCR状况的琼脂糖凝胶电泳图像的图。
[图12] 是示出对实施例5中扩增的HLA-A，HLA-B，HLA-C，HLA-DRB1基因的多重PCR产物通过生物分析仪测定PCR产物的长度的结果的图。
[图13] 是示出表示比较例1中扩增的HLA-A，HLA-B，HLA-C，HLA-DRB1基因的PCR状况的琼脂糖凝胶电泳图像的图。
[图14] 是示出对比较例1中扩增的HLA-A，HLA-B，HLA-C，HLA-DRB1基因的多重PCR产物通过生物分析仪测定PCR产物的长度的结果的图（上图）和示出其电泳图像的图（下图）。
具体实施方式
以下，对本发明的DNA分型方法按步骤进行详细说明。
（1）引物组制备步骤
本发明的DNA分型方法中，首先，制备用于对人基因组碱基序列中的HLA-A，HLA-B，HLA-C，HLA-DQA1，HLA-DQB1和HLA-DPA1的各基因的上游区域至下游区域、HLA-DRB1和HLA-DPB1的各基因的5’非翻译区域至外显子2和外显子2至3’侧的非翻译区域以及HLA-DRB3/4/5的外显子2至3’侧的非翻译区域全面地进行PCR的、能够在相同条件下进行退火的引物组。
包含HLA基因存在的区域的人第6染色体（6p21.3）的基因组碱基序列已被阐明，其基因结构和表达产物（HLA抗原）的结构的关联也是已知的（参照图3和图5）。
即，规定经典HLA I类抗原的HLA-A，HLA-B和HLA-C的基因含有8个外显子（图3（a）），外显子1的外侧有2种增强子和启动子区域调节表达（图3（b））。
进而，还已知在外显子2、3和4中存在大量多态区，因而在以往的DNA分型方法中，使用尤其是基于外显子2和3制作的引物进行PCR，随之产生如上所述的问题（图4）。
另外，规定经典HLA II类抗原的HLA-DR，HLA-DQ和HLA-DP由α链与β链构成，各基因含有5个或6个外显子（图5（a）），外显子1的外侧有启动子区域调节表达（图5（b））。
进而，还已知在外显子2和3中存在大量多态区，因而在以往的DNA分型方法中，使用尤其是基于外显子2制作的引物进行PCR，随之产生如上所述的问题（图4）。
本发明中，制备能够对经典I类抗原（HLA-A，HLA-B，HLA-C）以及经典II类抗原（HLA-DRB1，HLA-DQA1，HLA-DQB1，HLA-DPA1，HLA-DPB1）的全部基因区域（不仅包括外显子，而且还包括内含子、5’侧与3’侧的非翻译区域、启动子区域）和HLA-DRB3/4/5的外显子2至3’侧的非翻译区域进行PCR的引物组，并将用其扩增得到的PCR产物供后述高通量测序，因而可以排除相位模糊等的不确定性，还可以准确检测无效等位基因的有无。
具体地，制备下述表1～表3中揭示的PCR引物组中与至少2种基因对应的引物组。
至少2种基因意指选自HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1、HLA-DRB1、和HLA-DPB1中的至少2种基因，包括选自HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1、HLA-DRB1、和HLA-DPB1中的2种、3种、4种、5种、6种和7种的全部组合、以及8种全部基因的组合。
与各基因对应的引物组如下所述。
表1中的序列编号1～3是特异性地扩增作为MHCI类α链的HLA-A基因的PCR引物组。这些引物组是在下列位置存在的碱基序列，该位置将人基因组碱基序列（参考序列：hg19）中HLA-A基因的全部区域（包括启动子、外显子和内含子）从上游侧和下游侧夹入。
序列编号1和2具有相当于人基因组碱基序列（参考序列：hg19）中第29,909,483位至第29,909,514位的碱基序列。
序列编号3具有与相当于人基因组碱基序列（参考序列：hg19）中第29,914,925位至第29,914,954位的碱基序列互补的碱基序列。
使用这些引物组得到的PCR产物的预测长度为约5,500个碱基（bp）。
表1中的序列编号4和5是特异性地扩增作为MHCI类α链的HLA-B基因的PCR引物组。这些引物组是在下列位置存在的碱基序列，该位置将人基因组碱基序列（参考序列：hg19）中HLA-B基因的全部区域（包括启动子、外显子和内含子）从上游侧和下游侧夹入。
序列编号4具有与相当于人基因组碱基序列（参考序列：hg19）中第31,325,796位至第31,325,824位的碱基序列互补的碱基序列。
序列编号5具有相当于人基因组碱基序列（参考序列：hg19）中第31,321,210位至第31,321,235位的碱基序列。
使用这些引物组得到的PCR产物的预测长度为约4,600个碱基（bp）。
表1中的序列编号6～8是特异性地扩增作为MHCI类α链的HLA-C基因的PCR引物组。这些引物组是在下列位置存在的碱基序列，该位置将人基因组碱基序列（参考序列：hg19）中HLA-C基因的全部区域（包括启动子、外显子和内含子）从上游侧和下游侧夹入。
序列编号6和7具有与相当于人基因组碱基序列（参考序列：hg19）中第31,240,868位至第31,240,896位的碱基序列互补的碱基序列。
序列编号8具有相当于人基因组碱基序列（参考序列：hg19）中第31,236,075位至第31,236,114位的碱基序列。
使用这些引物组得到的PCR产物的预测长度为约4,800个碱基（bp）。
表2中的序列编号9和10是特异性地扩增作为MHC II类β链的HLA-DRB1基因的HLA-DR2（DR15）、HLA-DR2（DR16）亚型的PCR引物组。这些引物组是在下列位置存在的碱基序列，该位置将人基因组碱基序列（参考序列：hg19）中HLA-DRB1基因的外显子2至3’非翻译区域从上游侧和下游侧夹入。
序列编号10具有相当于人基因组碱基序列（参考序列：hg19）中第32,546,609位至第32,546,629位的碱基序列。
序列编号9具有与相当于人基因组碱基序列（参考序列：hg19）中第32,552,130位至第32,552,153位的碱基序列互补的碱基序列。
使用这些引物组得到的PCR产物的预测长度为约5,600个碱基（bp）。
表2中的序列编号11和12是特异性地扩增作为MHC II类β链的HLA-DRB1基因的HLA-DR3、HLA-DR5（DR11）、HLA-DR5（DR12）、HLA-DR6（DR13）、HLA-DR6（DR14）、HLA-DR8亚型的PCR引物组。这些引物组是在下列位置存在的碱基序列，该位置将人基因组碱基序列（参考序列：hg19）中HLA-DRB1基因的外显子2至3’非翻译区域从上游侧和下游侧夹入。
序列编号12具有相当于人基因组碱基序列（参考序列：hg19）中第32,546,608位至第32,546,629位的碱基序列。
序列编号11具有与相当于人基因组碱基序列（参考序列：hg19）中第32,552,137位至第32,552,162位的碱基序列互补的碱基序列。
使用这些引物组得到的PCR产物的预测长度为约5,600个碱基（bp）。
表2中的序列编号13～15是特异性地扩增作为MHC II类β链的HLA-DRB3基因的PCR引物组。这些引物组是在下列位置存在的碱基序列，该位置将人基因组碱基序列（参考序列：6＿cox＿hap2）中HLA-DRB3基因的外显子2至3’非翻译区域从上游侧和下游侧夹入。
序列编号13和14具有与相当于人基因组碱基序列（参考序列：6＿cox＿hap2）中第3,939,356位至第3,939,379位的碱基序列互补的碱基序列。
序列编号15具有相当于人基因组碱基序列（参考序列：6＿cox＿hap2）中第3,934,187位至第3,934,207位的碱基序列。
使用这些引物组得到的PCR产物的预测长度为约5,200个碱基（bp）。
表2中的序列编号16和17是特异性地扩增作为MHC II类β链的HLA-DRB4基因的PCR引物组。这些引物组是在下列位置存在的碱基序列，该位置将人基因组碱基序列（参考序列：chr6＿mamn＿hap4）中HLA-DRB4基因的外显子2至3’非翻译区域从上游侧和下游侧夹入。
序列编号16具有与相当于人基因组碱基序列（参考序列：chr6＿mann＿hap4）中第3,851,270位至第3,851,293位的碱基序列互补的碱基序列。
序列编号17具有相当于人基因组碱基序列（参考序列：chr6＿mann＿hap4）中第3,846,108位至第3,846,128位的碱基序列。
使用这些引物组得到的PCR产物的预测长度为约5,200个碱基（bp）。
表2中的序列编号18和19是特异性地扩增作为MHC II类β链的HLA-DRB5基因的PCR引物组。这些引物组是在下列位置存在的碱基序列，该位置将人基因组碱基序列（参考序列：hg19）中HLA-DRB5基因的外显子2至3’非翻译区域从上游侧和下游侧夹入。
序列编号18具有与相当于人基因组碱基序列（参考序列：hg19）中第32,489,933位至第32,489,956位的碱基序列互补的碱基序列。
序列编号19具有相当于人基因组碱基序列（参考序列：hg19）中第32,485,256位至第32,485,276位的碱基序列。
使用这些引物组得到的PCR产物的预测长度为约4,700个碱基（bp）。
表3中的序列编号20和21是特异性地扩增作为MHC II类α链的HLA-DQA1基因的PCR引物组。这些引物组是在下列位置存在的碱基序列，该位置将人基因组碱基序列（参考序列：hg19）中HLA-DQA1基因的全部区域（包括启动子、外显子和内含子）从上游侧和下游侧夹入。
序列编号20具有相当于人基因组碱基序列（参考序列：hg19）中第32,604,465位至第32,604,488位的碱基序列。
序列编号21具有与相当于人基因组碱基序列（参考序列：hg19）中第32,611,936位至第32,611,960位的碱基序列互补的碱基序列。
使用这些引物组得到的PCR产物的预测长度为约7,500个碱基（bp）。
表3中的序列编号22～26是特异性地扩增作为MHC II类β链的HLA-DQB1基因的PCR引物组。这些引物组是在下列位置存在的碱基序列，该位置将人基因组碱基序列（参考序列：hg19）中HLA-DQB1基因的全部区域（包括启动子、外显子和内含子）从上游侧和下游侧夹入。
序列编号22具有相当于人基因组碱基序列（参考序列：hg19）中第32,627,406位至第32,627,433位的碱基序列。
序列编号23和25具有相当于人基因组碱基序列（参考序列：hg19）中第32,635,612位至第32,635,643位的碱基序列。
序列编号24和26具有与相当于人基因组碱基序列（参考序列：hg19）中第32,635,612位至第32,635,640位的碱基序列互补的碱基序列。
使用这些引物组得到的PCR产物的预测长度为约8,200个碱基（bp）。
表3中的序列编号27～29是特异性地扩增作为MHC II类α链的HLA-DPA1基因的PCR引物组。这些引物组是在下列位置存在的碱基序列，该位置将人基因组碱基序列（参考序列：hg19）中HLA-DPA1基因的全部区域（包括启动子、外显子和内含子）从上游侧和下游侧夹入。
序列编号27具有与相当于人基因组碱基序列（参考序列：hg19）中第33,041,573位至第33,041,600位的碱基序列互补的碱基序列。
序列编号28具有与相当于人基因组碱基序列（参考序列：hg19）中第33,041,573位至第33,041,598位的碱基序列互补的碱基序列。
序列编号29具有相当于人基因组碱基序列（参考序列：hg19）中第33,031,885位至第33,031,912位的碱基序列。
使用这些引物组得到的PCR产物的预测长度为约9,700个碱基（bp）。
表3中的序列编号30和31是特异性地扩增作为MHC II类β链的HLA-DPB1基因的PCR引物组。这些引物组是在下列位置存在的碱基序列，该位置将人基因组碱基序列（参考序列：hg19）中HLA-DPB1基因的外显子2至3’非翻译区域从上游侧和下游侧夹入。
序列编号30具有相当于人基因组碱基序列（参考序列：hg19）中第33,048,182位至第33,048,207位的碱基序列。
序列编号31具有与相当于人基因组碱基序列（参考序列：hg19）中第33,055,428位至第33,055,453位的碱基序列互补的碱基序列。
使用这些引物组得到的PCR产物的预测长度为约7,300个碱基（bp）。
这些引物可以通过本领域通常所用的手法制备。另外，表1～表3中记载的引物组表示最优选的例子，本发明的方法中，只要是可以在将HLA的各基因全部区域从上游侧和下游侧夹入的位置进行退火的正义（Sense）侧引物和反义（Anti-sense）侧引物的组，则可以同样地使用。
应予说明，本说明书中，即使是相当于参考序列的相同位置的碱基序列（或与之互补的碱基序列），对于相差1个～数个碱基的引物也分别赋予单独的序列编号。这些1个～数个碱基的差别导致多态性。
（2）PCR步骤
本发明的方法中，使用前述步骤（1）中制备的引物组，对被检试样（DNA）进行PCR。
PCR依照通常的方案实施。具体如下所述。
1.取决于被检试样的形式，从该试样提取DNA。
2.对提取的DNA定量，设定适宜的引物浓度制备反应液。
3.设定反应条件实施PCR。
例：热变性步骤（通常为92～98℃）
退火步骤（通常为55～72℃）
延伸步骤（通常为65～80℃）
本发明的方法中，优选将前述退火和延伸步骤的温度设为约65～70℃。更优选设为65℃～68℃。通过在约65～70℃下进行退火和延伸，能够以等比率（均一地）生成HLA等位基因。
4.对所得PCR产物进行纯化，供于随后的碱基序列确定步骤。
本发明中通过使用新设定的引物组，可以在1个试管内的反应中以相同条件并且同时扩增多个不同的基因。
应予说明，本发明中所用的酶（DNA聚合酶）没有特别限定，例如，还可以使用市售品。可举出例如：TaKaRA社制的PrimeSTAR GXL DNA Polumerase、Tks Gflex DNAPolymerase、TaKaRa LA Taq、Thermo SCIENTIFIC社制的Long PCR Enzyme Mix等。
（3）碱基序列确定步骤。
接着，确定前述步骤（2）中生成的PCR产物（扩增DNA）的碱基序列。该步骤优选使用被称为所谓高通量测序（或超高速测序、大量并列测序）的手法来实施。关于高通量测序，参照例如：“実験医学”第27巻、第1号、2009年（羊土社）等。
本说明书中，以下说明基于ロシュ（Roche）的454 GS系统来确定序列的方法。应予说明，Life Technologies公司（Life Technologies）的基因组测序仪Ion Torrent PGM系统和Illumina公司（illumina）的MiSeq系统也同样可以确定碱基序列。
1.将前述步骤（2）所得的PCR产物通过雾化器片段化为约500碱基左右。
2.在该经片段化的DNA片段的末端附加DNA衔接子。
3.将附加了DNA衔接子的DNA片段制为单链DNA片段后，通过衔接子与珠子结合，将所得的珠子包埋于油包水型乳液（形成1个珠子上结合有1个DNA片段的微反应器环境）。
4.实施乳液PCR，在各珠子上形成各DNA片段的拷贝（各DNA片段在各微反应器内克隆扩增，因而能够不与其它序列竞争地同时平行实施许多片段的扩增）。接着，破坏乳液并回收具有进行了扩增的DNA片段的珠子。
5.浓缩珠子，并装载于Pico Titer板中（1个孔中放入1个珠子的尺寸）。
6.对于各珠子，利用荧光素酶的荧光反应检测聚合酶发生酶反应时产生的焦磷酸，根据发光的强度和模式确定DNA的碱基序列。以一定的顺序加入4种核酸（A、C、G、T），记录相应于添加的核酸的化学发光模式，根据其信号强度和位置信息的组合来确定碱基序列。
（4）DNA分型步骤
接着，将前述步骤（3）中所得的sff文件按照MID标签分类后，与已知HLA等位基因的碱基序列数据库的数据进行比较，由此确定被检试样中所含的DNA的第4区域水平的HLA等位基因（8位数水平）。
本发明的方法以前述表1～表3中记载的引物组为代表例。本发明具有在夹入HLAI类和HLA II类的各基因全部区域的位置设定引物，确定跨越几乎全部区域扩增的DNA的序列的特征，藉此，还可以排除模糊（不确定性），得到关于无效等位基因的信息。
本发明中，通过新设定各HLA基因的PCR时的退火温度相同的引物组，可以以1台PCR装置同时进行多个基因的PCR。
另外本发明中，通过上述新引物组的设定，可以进行在1个试管内同时多个HLA基因的多重PCR法。
进而，确认到本发明中使用的引物组和酶的组合还能够适用于高速PCR装置。因此，可以比以往更加迅速并且高精度地进行PCR。
实施例
以下列举具体例更详细地说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。
（试验例1）
［目的］
选定适于本发明方法的PCR酶。
［方法］
将具有DR9和DR15作为杂合子的已提取的基因组DNA的2个样品作为模板，使用从HLA-DRB1的启动子区域特异性地扩增外显子2的引物组（非专利文献2参照）进行PCR。
应予说明，该基因组DNA的选择基于下述原因：由于DR9的PCR产物的长度为11.2kb、DR15的PCR产物的长度为6.1kb，因而容易确认两HLA等位基因以等量进行扩增，DR9的PCR产物在本发明中最长，若得到DR9的PCR产物，则认为对于其它的HLA基因也同样能够扩增。
（1）PCR中使用了表4所示的23种市售的Long range PCR酶。即，在50ng的基因组DNA溶液中，加入1.5～3μL（4pmol/μL）的PCR引物、各酶的根据方案的PCR Buffer、dNTP和Long range PCR酶，将反应液的总量用灭菌水调整为20μL。
（2）将其在94℃保温2分钟后，接着将98℃下10秒钟、68℃下5分钟的2个步骤作为1个工序，将其重复30次。应予说明，该PCR中使用了GeneAmp PCR System 9700（LifeTechnologies公司）。PCR后通过琼脂糖凝胶电泳确认了PCR产物的扩增状况。其电泳图像示于图6。
［结果和考察］
根据依照标准方案的PCR以及这些PCR产物的琼脂糖凝胶电泳，利用4种酶，即PrimeSTAR GXL DNA Polymerase（TaKaRa）、TaKaRa LA Taq（TaKaRa）、Tks Gflex DNAPolymerase（TaKaRa）和Long PCR Enzyme Mix（Thermo SCIENTIFIC），2个样品均在目标的分子量位置得到来自两HLA等位基因的PCR产物（图6）。
然而，根据以下所示的试验例1的结果，判明上述4种之中，PrimeSTAR GXL DNAPolymerase（TaKaRa）、TaKaRa LA Taq（TaKaRa）和Tks Gflex DNA Polymerase（TaKaRa）的3种酶能够大致均等地扩增来自各HLA基因的等位基因的PCR产物，确认了上述3种酶特别适于本发明的方法。
（实施例1）
［目的］
使用PrimeSTAR GXL DNA Polymerase（TaKaRa）作为酶，确认各HLA基因中的扩增状况。
［方法］
使用PrimeSTAR GXL DNA Polymerase（TaKaRa），将已提取的基因组DNA作为模板，使用HLA I类和HLA II类的各基因特异性引物组（参照表1～表3：序列编号1～31）进行PCR。具体步骤如下所述。
（1）在50ng的基因组DNA溶液中，加入4μL的5xPrimeSTAR GXL缓冲液、1.6μL的dNTP溶液、分别1～3μL（4pmol/μL）的PCR引物、0.4μL的Prime STAR GXL聚合酶，将反应液的总量用灭菌水调整至20μL。
（2）将其在94℃保温2分钟后，接着将98℃下10秒钟、70℃下5分钟的2个步骤作为1个工序，将其重复30次。应予说明，该PCR中使用了GeneAmp PCR System 9700 （LifeTechnologies公司）。PCR后通过琼脂糖凝胶电泳确认了PCR产物的扩增状况。其电泳图像示于图7。
［结果和考察］
根据PrimeSTAR GXL DNA Polymerase（TaKaRa）中的PCR条件的研究以及这些PCR产物的琼脂糖凝胶电泳，在HLA I类和HLA II类的各基因的PCR产物中，在目标分子量的位置得到了单一PCR产物（图7）。
（实施例2）
［目的］
目的在于使用Tks Gflex DNA Polymerase（TaKaRa）作为酶，确认各HLA基因中的扩增状况。
［方法］
使用Tks Gflex DNA Polymerase（TaKaRa），将已提取的基因组DNA作为模板，使用HLA I类和HLA II类的各基因特异性引物组（参照表1～表3：序列编号1～31）进行PCR。具体步骤如下所述。
（1）在50ng的基因组DNA溶液中，加入10μL的2x Gflx PCR Buffer、1～3μL（4pmol/μL）的PCR引物、0.2μL的Tks Gflex DNA Polymerase，将反应液的总量用灭菌水调整为20μL。
（2）将其在94℃保温2分钟后，接着将98℃下10秒钟、68℃下5分钟的2个步骤作为1个工序，将其重复10次。然后，将98℃下10秒钟、65℃下5分钟的2个步骤作为1个工序，将其重复20次。应予说明，该PCR中使用了GeneAmp PCR System 9700（Life Technologies公司）。PCR后通过琼脂糖凝胶电泳确认了PCR产物的扩增状况。其电泳图像示于图8。
［结果和考察］
根据Tks Gflex DNA Polymerase（TaKaRa）中的PCR条件的研究以及这些PCR产物的琼脂糖凝胶电泳，在HLA I类和HLA II类的各基因的PCR产物中，在目标分子量的位置得到了单一PCR产物（图8）。
与比较例1的结果相比，使用Tks Gflex DNA Polymerase（TaKaRa）的情形中，各HLA基因均能同等均一地进行扩增。
（实施例3）
［目的］
对通用的PCR装置、GeneAmp PCR System 9700（Life Technologies公司）和特定用于PCR的高速化的扩增装置、PCR Thermal Cycler Fast（TaKaRa）之间的PCR状况的差异进行确认，研究PCR所需的时间。
［方法］
使用Tks Gflex DNA Polymerase（TaKaRa），将已提取的基因组DNA作为模板，使用HLA I类和HLA II类的各基因特异性引物组（参照表1～表3：序列编号1～31）进行PCR。具体步骤如下所述。
（1）在50ng的基因组DNA溶液中，加入10μL的2x Gflex PCR Buffer、1～3μL（4pmol/μL）的PCR引物、0.2μL的Tks Gflx DNA Polymerase，将反应液的总量用灭菌水调整为20μL。
（2）将其在94℃保温2分钟后，接着将98℃下10秒钟、68℃下5分钟的2个步骤作为1个工序，将其重复10次。然后，将98℃下10秒钟、65℃下5分钟的2个步骤作为1个工序，将其重复20次。应予说明，该PCR中使用了GeneAmp PCR System 9700（Life Technologies公司）和PCR Thermal Cycler Fast（TaKaRa）。PCR后通过琼脂糖凝胶电泳确认了PCR产物的扩增状况。其电泳图像示于图9。
［结果和考察］
根据使用了2个机种的PCR装置的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳，在两机种间条带的出现状况没有大的差异，在HLA I类和HLA II类的各基因的PCR产物中，在目标分子量的位置得到了单一PCR产物（图9）。
GeneAmp PCR System 9700（Life Technologies公司）的情形中，PCR所需的时间为3小时10分钟，与之相对，PCR Thermal Cycler Fast（TaKaRa）中为2小时45分钟。
因此，确认本发明的方法可适用于PCR Thermal Cycler Fast（TaKaRa）等高速PCR装置，有助于PCR的高速化。
（实施例4）
［目的］
为了确认使用了Tks Gflex DNA Polymerase（TaKaRa）以及GeneAmp PCR System9700（Life Technologies公司）的PCR产物的再现性、同时证明本发明中设定的PCR条件适于HLA基因的超高分辨率DNA分型，使用多个DNA样品进行PCR产物的碱基序列确定。
［方法］
1.使用Tks Gflex DNA Polymerase（TaKaRa），将已经提取、HLA类型已经清楚、包含以往的DNA分型法中观察到相位模糊的等位基因的组合的4个样本（Sample1～4）的基因组DNA作为模板，使用HLA I类和HLA II类的各基因特异性引物组（参照表1～表3：序列编号1～31）进行PCR。具体步骤如下所述。
（1）在50ng的基因组DNA溶液中，加入10μL的2xGflxPCR Buffer、1～3μL（4pmol/μL）的PCR引物、0.2μL的Tks GflexDNA Polymerase，将反应液的总量用灭菌水调整为20μL。
（2）将其在94℃保温2分钟后，接着将98℃下10秒钟、68℃下5分钟的2个步骤作为1个工序，将其重复10次。然后，将98℃下10秒钟、65℃下5分钟的2个步骤作为1个工序，将其重复20次。应予说明，该PCR中使用了GeneAmp PCR System 9700（Life Technologies公司）。PCR后通过琼脂糖凝胶电泳确认了PCR产物的扩增状况。其电泳图像示于图10。
2.确定了PCR产物的碱基序列。具体如下所述进行。
（1）将PCR产物按照QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN）的标准方案进行纯化。
（2）依照PicoGreen dsDNA Quantitation Kit（Invitrogen）的标准方案测定浓度。
（3）将纯化的PCR产物调整为500ng/100μL的浓度，依照Genome Sequencer（GS）Junior（Roche）的标准方案制作rapid文库，进行乳液PCR、测序，得到相对于1个样品为2万个读码（read）的碱基序列。
（4）将这些序列与登记于IMGT HLA数据库中的全部HLA等位基因数据在全部读码间进行同源性解析，选择候补HLA等位基因序列。
（5）以该候补HLA等位基因序列作为参考，使用GS Reference Mapper（Roche），在使参考和读码100%一致的条件下进行基因定位（mapping），目视确认基因定位状况，由此鉴定HLA等位基因。
［结果和考察］
1.根据PCR产物的琼脂糖凝胶电泳，HLA I类和HLA II类的各基因的PCR产物均在目标分子量的位置得到了单一扩增产物（图10）。另外，通过桑格法确定PCR产物的碱基序列，结果得到了与现有报道并不矛盾的HLA等位基因，因此认为本PCR系统能够用于HLA分型。
2.使用包括现有的DNA分型法中观察到相位模糊的等位基因的组合的4个样本，将来自HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1的5’非翻译区域至外显子2、HLA-DRB1的外显子2至3’非翻译区域、HLA-DRB3/4/5、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1、HLA-DPB1的5’非翻译区域至外显子2和HLA-DPB1的外显子2至3’非翻译区域的各基因的PCR产物通过Genome Sequencer（GS）Junior（Roche）进行HLA分型。结果，对于HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DRB3/4/5、HLA-DQB1，可以进行全部基因区域的分型。对于HLA-DQA1、HLA-DPA1、HLA-DPB1，仅可以进行外显子部分的分型。进而，在HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1的各基因中，检测出了新的等位基因（表5）。所以认为本方法能够进行没有相位模糊的8位数水平的HLA分型，同时是用于高效检测作为无效等位基因的原因的启动子、内含子内的碱基替换或插入・缺失的优异工具。
（实施例5）
［目的］
使用Tks Gflex DNA Polymerase（TaKaRa）、以及GeneAmp PCR System 9700（LifeTechnologies公司）验证HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1的多重PCR法的可能性。
［方法］
1.使用Tks Gflex DNA Polymerase（TaKaRa），将已经提取、HLA类型已经清楚、包含以往的DNA分型法中观察到相位模糊的等位基因的组合的4个样本（Sample1～4）的基因组DNA作为模板，与HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1的各基因特异性引物组（参照专利文献3、表1和表2：序列编号1～12）在1根试管中混合，使用混合物进行PCR。具体步骤如下所述。
（1）在50ng的基因组DNA溶液中，加入10μL的2xGflxPCR Buffer、1～3μL（4pmol/μL）的PCR引物、0.2μL的Tks GflexDNA Polymerase，将反应液的总量用灭菌水调整为20μL。
（2）将其在94℃保温2分钟后，接着将98℃下10秒钟、68℃下5分钟的2个步骤作为1个工序，将其重复10次。然后，将98℃下10秒钟、65℃下5分钟的2个步骤作为1个工序，将其重复20次。应予说明，该PCR中使用了GeneAmp PCR System 9700（Life Technologies公司）。PCR后通过琼脂糖凝胶电泳确认了PCR产物的扩增状况。其电泳图像示于图11。另外，使用生物分析仪（DNA12000 Chips）准确地测定PCR产物的长度。其电泳图像示于图12。
2.确定了PCR产物的碱基序列。具体如下所述进行。
（1）将PCR产物按照QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN）的标准方案进行纯化。
（2）依照PicoGreen dsDNA Quantitation Kit（Invitrogen）的标准方案测定浓度。
（3）将纯化的PCR产物调整为500ng/100μL的浓度，依照Genome Sequencer（GS）Junior（Roche）的标准方案制作rapid文库，进行乳液PCR、测序，得到相对于1个样品为2万个读码（read）的碱基序列。
（4）将这些序列与登记于IMGT HLA数据库中的全部HLA等位基因数据在全部读码间进行同源性解析，选择候补HLA等位基因序列。
（5）以该候补HLA等位基因序列作为参考，使用GS Reference Mapper（Roche），在使参考和读码100%一致的条件下进行基因定位（mapping），以目视确认基因定位状况，由此鉴定HLA等位基因。
［结果和考察］
使HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1的各基因独立地进行PCR时，根据PCR产物的琼脂糖凝胶电泳，在目标分子量的位置得到了单一扩增产物（图11的泳道1～4）。另一方面，将这些引物混合并进行PCR时，观察到被认为反映各基因的PCR产物的多个条带（图11的泳道5）。其中使用生物分析仪（Agilent DNA12000试剂盒）详细测定PCR产物的长度，结果确认扩增了来自各基因的PCR产物（图12）。进而，将来自各基因的PCR产物用Genome Sequencer（GS）Junior（Roche）进行HLA分型，结果任意样品均无矛盾地判定为实施例4中所得的HLA等位基因。因此，使用了高速PCR装置的本发明的多重法可认为是有助于临床现场的PCR的繁杂操作的简化和迅速化的优异手段。
（比较例1）
［目的］
确认本发明的引物组适于多重扩增。
［方法］
进行下述实验：在与实施例5相同的条件下，使用针对专利文献2中公开的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1的各基因的引物组进行PCR。
［结果和考察］
PCR后通过琼脂糖凝胶电泳确认了PCR产物的扩增状况。其电泳图像示于图13（左侧）。另外，使用生物分析仪（Agilent DNA12000试剂盒）准确地测定了PCR产物的长度。其电泳图像示于图14（左侧）。
为了比较，将使用本发明中新设定的引物组时的结果示于同图的右侧。
由图14可知，使用以往（专利文献2）记载的引物组（前开发引物组）的情形中，特别是在相同容器内同时扩增HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1的各基因时，特异HLA-B和HLA-C未得到充分扩增，与之相对，使用本发明的新引物组（新开发引物组）时，则任意基因均得到相同扩增。
序列表
<110> GenoDive Pharma Inc.
<120> HLA基因的多重DNA分型方法和试剂盒
<130> PC1198GDP
<150> JP 2013-99547
<151> 2013-5-9
<160> 31
<170> Patent In 版本 3.1
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 1
CAGAA ACTCA GAGCT AAGGA ATGAT GGCAA AT 32
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 2
CAGAA ACTCA GAGCT ATGGA ATGAT GGTAA AT 32
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 3
GCATA TAACC ATCAT CGTGT CCCAA GGTTC 30
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 4
GGTTC CCGGT TGCAA TAGAC AGTAA CAAA 29
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 5
ACGGG TCCAA TTTCA CAGAC AAATG T 26
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 6
ACACT GCTTA GATGT GCATA GTTCA CGAA 29
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 7
ACACT GCTTA GATGT GCATA GTTCC GGAA 29
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 8
GAACA ATTCT AGACT ATGGA CCCAA TTTTA CAAAC AAATA 40
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 9
CGTTT CCTGT GGCAG CCTAA GAGG 24
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 10
ATGCA CGGGA GGCCA TACGG T 21
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 11
CCCAC AGCAC GTTTC TTGGA GTACT C 26
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 12
GATGC ACAGG AGGCC ATAGG GT 22
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 13
CGCAG CACGT TTCTT GGAGC TGCG 24
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 14
CGCAG CACGT TTCTT GGAGC TGCT 24
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 15
ATGCA CAGGA GGCCA TAGGG T 21
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 16
CACAG CACGT TTCTT GGAGC AGGC 24
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 17
ATGCA TGGGA GGCAG GACAG T 21
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 18
CACAG CACGT TTCTT GCAGC AGGA 24
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 19
ATGCA TGGGA GGCCG TAGGG T 21
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 20
GACTG CCAGG GAGGG AAATC RACT 24
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 21
GCGAA TCCAG TGGAG GACAC AGCAC 25
<210> 22
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 22
CAAAC CAGAA GAGAG GCTGG GATAT TCT 28
<210> 23
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 23
AACCA TTAGT ATTGC CCCTA GTCAC TGTCA AG 32
<210> 24
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 24
CATTA GTACT GCCCC TAGTC ACTGC CAAG 29
<210> 25
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 25
AACCA TTAGT ACTGT CCCTA GTCAC TGCCA AG 32
<210> 26
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 26
CATTA GTACT GCCCC TAGTC ACTGG CAAG 29
<210> 27
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 27
GGAGC TCTCT TAACC ACGCT GGTAC CTA 28
<210> 28
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 28
AGCTC TCTTG ACCAC GCTGG TACCT A 26
<210> 29
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 29
CCATT GGCCT CTTGG CTATA CCTCT TTT 28
<210> 30
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 30
CTCAG TGCTC GCCCC TCCCT AGTGA T 26
<210> 31
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 31
GCACA GTAGC TTTCG GGAAT TGACC A 26
Claims (4)
1.用于进行HLA的DNA分型的非诊断方法，其特征在于，包括：
（1）制备分别特异性地与选自人基因组碱基序列中HLA-A、HLA-B、HLA-C和HLA-DRB1这4种基因的上游区域和下游区域杂交，并且在相同的PCR条件下进行扩增的引物组的步骤，
其中，HLA-A基因由序列编号1或2所示的碱基序列构成的寡核苷酸和序列编号3所示的碱基序列构成的寡核苷酸所构成的引物组扩增，
HLA-B基因由序列编号4所示的碱基序列构成的寡核苷酸和序列编号5所示的碱基序列构成的寡核苷酸所构成的引物组扩增，
HLA-C基因由序列编号6或7所示的碱基序列构成的寡核苷酸和序列编号8所示的碱基序列构成的寡核苷酸所构成的引物组扩增，
HLA-DRB1基因由序列编号9所示的碱基序列构成的寡核苷酸和序列编号10所示的碱基序列构成的寡核苷酸所构成的引物组、和/或序列编号11所示的碱基序列构成的寡核苷酸和序列编号12所示的碱基序列构成的寡核苷酸所构成的引物组扩增；
（2）使用所述引物组，在相同的PCR条件下在相同容器内同时扩增作为被检试样的基因组DNA中的所述4种基因的步骤；
（3）确定PCR产物的碱基序列的步骤；和
（4）任选地实施与数据库的同源性检索的步骤。
2.权利要求1所述的方法，所述PCR的温度条件是下述条件：94℃下保温2分钟后，接着将98℃下10秒钟、68℃下5分钟的2个步骤作为1个工序并将其重复10次，然后，将98℃下10秒钟、65℃下5分钟的2个步骤作为1个工序并将其重复20次。
3.用于基因组DNA的HLA基因的DNA分型用引物组，其包含下列的用于扩增4种HLA基因的引物组：
用于扩增HLA-A基因的引物组，其由下述引物构成：作为序列编号1或2所示的碱基序列构成的寡核苷酸的引物、和作为序列编号3所示的碱基序列构成的寡核苷酸的引物，
用于扩增HLA-B基因的引物组，其由下述引物构成：作为序列编号4所示的碱基序列构成的寡核苷酸的引物、和作为序列编号5所示的碱基序列构成的寡核苷酸的引物，
用于扩增HLA-C基因的引物组，其由下述引物构成：作为序列编号6或7所示的碱基序列构成的寡核苷酸的引物、和作为序列编号8所示的碱基序列构成的寡核苷酸的引物，和
用于扩增HLA-DRB1基因的引物组，其由下述引物构成：作为序列编号9所示的碱基序列的寡核苷酸的引物、和作为序列编号10所示的碱基序列构成的寡核苷酸的引物；和/或用于扩增HLA-DRB1基因的引物组，其由下述引物构成：作为序列编号11所示的碱基序列构成的寡核苷酸的引物、和作为序列编号12所示的碱基序列构成的寡核苷酸的引物。
4.HLA基因的DNA分型用试剂盒，其包含权利要求3所述的用于扩增4种HLA基因的引物组和选自下列的1种以上的DNA聚合酶：TaKaRa公司制造的PrimeSTAR GXL DNAPolymerase、TaKaRa公司制造的TaKaRa LA Taq、TaKaRa公司制造的Tks Gflex DNAPolymerase和Thermo SCIENTIFIC公司制造的Long PCR Enzyme Mix。
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