JPH06505391A

JPH06505391A - Ｄｎａ配列化に基づくｈｌａタイピング

Info

Publication number: JPH06505391A
Application number: JP4507848A
Authority: JP
Inventors: サンタマリア，　ペドロ; ボイス・ハシノ，　マイケル　トーマス; バルボサ，　ホゼ　ジョアキム; リッチ，　スティーブン　サウル; ファラス，　アンソニー　ジェイムズ
Original assignee: リージェント　オブ　ザ　ユニバーシティー　オブ　ミネソタ
Priority date: 1991-03-06
Filing date: 1992-03-04
Publication date: 1994-06-23
Also published as: EP0577708A4; US5629149A; EP0577708A1; US5972604A; WO1992015711A1; CA2105585A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＤＮＡ配列化に基づ＜ＨＬＡタイピング技」Ｌ走！一本発明は、クラスＩおよびｎＨＬＡ遺伝子を含むヒト主要組織適合性遺伝子複合体などの高度な多型性の系の遺伝子型を決定するためのプロセスに関する。特に、本発明の方法は、与えられた個体の対立遺伝子を、維持または非維持オリゴヌクレオチドブライマーを用いたポリメラーゼチェーンリアクションにより、注目する遺伝子座で増幅することを包含する。このポリメラーゼチェーンリアクション生成物は直接配列化し、得られた核酸はしご（ｌａｄｄｅｒ）を評価してサンプル核酸の遺伝子型を決定する。

の主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＭＣ）としては、ヒト第６染色体短腕上に位置するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子複合体が挙げられる。この領域は、免疫応答の細胞−細胞相互作用を調節する細胞表層蛋白質をコードする。様々なＨＬＡクラス■の遺伝子座はＨＬＡ抗原、すなわち細胞表層でＢ−２ミクログロブリンと会合する４４，０００ダルトンのポリペプチドをコードする。このクラス■の分子は、細胞障害性Ｔリンパ球による標的細胞の認識に関与する。一方、ＨＬＡクラス■座は、それぞれ２９　、０００および３４　、０００ダルトンの蛋白的細胞の認識に関与する。

ＨＬＡクラスエ領域のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ座は、ＨＬＡクラス■領域のＨＬＡ−ＤＲＢ、ＨＬＡ−ＤＱＢ、ＨＬＡ−ＤＱＡ、ＨＬＡ、−ＤＰＢｉ３よびＨＬＡ−ＤＰＡ座と同様に、非常に高度な多型性を示す、ＨＬＡ系についてのＷＨＯ学術命名法委員会［Ｍａｒｓｈ　ａｎｄ　Ｂｏｄｍｅｒ、　Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ。

旦：１３１　（１９９０）］は、ＨＬＡ−Ａの２５の対立遺伝子（ＨＬＡ−Ａ− ０１０１，Ａ−０２０１等）、ＨＬＡ−Ｂの３２の対立遺伝子、およびＨＬＡ− Ｃのｌｌの対立遺伝子、４３のＨＬＡ−ＤＲＢ対立遺伝子、１３のＨＬＡ−ＤＱＢ対立遺伝子、８のＨＬＡ−ＤＱＡ対立遺伝子、４のＨＬＡ−ＤＰＡ対立遺伝子および１９のＨＬＡ−ＤＰＢ対立遺伝子を明示した。この高度な多型性はＨＬＡ分子の機能に関係すると考えられるので、その分子的基本原理およびその多型性の機能的関係の決定（すなわち、移植において）により多くの研究がなされている。特定のＨＬＡ遺伝子のクローニングを用いることにより、この研究はＤＮＡレベルにまで到達している。

ヒト第６染色体の短腕上に存在するＨＬＡ−Ｄ領域のクラス■遺伝子は、最も多型性である既知の系のうちの一つである［Ｂａｃｈ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｔｏｄａｙ、６：８９（１９８５）］、このＨＬＡクラス■分子（ＤＲ，ＤＱ、およびＤＰ）は、自己−非自己認識関係における名目上の抗原提示”Ｃ’（７）制御因子として［Ｚｉｎｋａｒｂａｇｅｌ　ａｎｄはアロ応答における外来抗原として［Ｂａｃｈ　ａｎｄ　ＶａｎＲｏｏｄ、　Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ−Ｍｅｄ、、　２９５：８０６（ｉ９７６）］作用する二つの非共有結合性会合鎖（αおよびβ）からなるヘテロニ量体の糖蛋白質である。

特異性がコードされたＨＬＡ−Ｄ９Ｒ域の対立遺伝子の多型性は２表現型タイピング（ｔｙｐｌｎｇ、型判定または型決定）、ホモ接合体タイピング細胞を用いた混合リンパ球組織、感作リンパ球テスト、制限フラグメント長条型性の決定、および、より近年においては、オリゴタイピングするための血清学的方法により決定することかで（１９８Ｂ）］。これらの試みは、その多くがＲＦＬ　Ｐおよびオリゴタイピングなどの型判定（型決定）への分子論的アプローチの開発に集中している［Ｂｉｄｗｅｌｌ。

Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８９）］。

いくつかのＨＬＡ−ＤＲ，ＤＱおよび一〇Ｐ対立遺伝子のクローニングおよび配列化は、それらのアミノ酸はいくつかの多型性が、ＤＲＢ　１．ＤＲＢ３／４１５、ＤＱＡＩおよびＤＱＢ　１．ＤＰＡＩおよびＤＰＢ　１遺伝子の第２エクソンでコードされるそれらのＮ末端ドメインの可変領域にあることを示している［Ｍａｒｓｈ　ａｎｄＢｏｄｍｅｒ、５ｕｐｒａ　（，１９９０）；　Ｔｏｄｄ　ａｔ　ａｌ、。

支持体上におけるＤＮＡへのハイブリダイゼーションによって既知のＨＬＡクラス■多型性の特徴付け（オリゴマータイピング）したり、あるいは配列化するために用いることができる対立遺伝子特異性オリゴヌクレオチドは迅速ではあるが、各遺伝子座に対してかなり多くのオリゴヌクレオチドを必要とし、非白色人種の集団の中に存在しているような予め確認されていない配列長型性を検出できず、さらには、そのアプローチがクラス■多型性の解析に容易に利用できないであろうし、実用的ではないかもしれない。一方、対立遺伝子特異性オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＨにより得られる一本鎖ＤＮＡの直接配列化が、ＤＱＡＩ遺伝子座における多型性をテストするためにうまく用いられている［Ｇｙｌｌｅｎｓｌｅ１ｎアプローチのＤＲＢ遺伝子への応用には、ＤＲＢＩ、ＤＲＢ３、ＤＲＢ４およびＤＲＢ５の間の強力な配列相同性、および多くの個体が有するこれらの遺伝子の各々４種以上の興なるバージョン（アイソタイプの複雑性）の故に問題がある。直接配列化により生じるこの非常に複雑なはしご（ｌ　ａｄｄｅｒ　）が、このプロセスを、正確かつ迅速なＨＬＡタイプの決定には非実用的なものにしている。したがって、ＨＬＡ−ＰＣＲ生成物の直接配列化は与えられた個体の、予めわかっているＨＬＡタイプに限定されるか、もしくは、それ自体慣例的なＨＬＡタイビ（１９８９）］。

現在、ＨＬＡタイピングは、多くの医学的操作、例えば器官移植等に関連して慣例的に行なわれている。提供者と受容者のＨＬＡ対立遺伝子が同一であれば、器官組織移植片の拒絶は軽減すると考えられる０個体群におけるＨＬＡ遺伝子の対立遺伝子が多くなることによっても、このＨＬＡタイピングが実父確定科学検査に有用なものとなる。しかしながら、現在用いつる技術は、クラスＩおよびクラスＩＩＨＬＡ遺伝子座に関連する全ての対立遺伝子による多型性を区別することが不可能である。

現在のＨＬＡタイピングのそれ以外の欠点は、血清学的テストを行なうのに必要な標準血清の入手の可能性、テスト結果が得られる速度（すなわち、ＭＬＣでは５〜７日間要する。）、および、これらの技術により検出されるのはすでに既知のＨＬＡタイプだけであり、Ｌ立上Ｊ型性のものは検出されないことである。器官移植片および比較的大量の遺伝学的評価（実父確定科学検査など）における組織タイピングの場合、現在のＨＬＡタイピング技術に関係する時間は不必要に長く、得られる結果がそれほど正確ではない可能性がある。

したがって、従来の方法では制限のある、ＨＬＡ遺伝子複合体などの高度に多環である系におけるゲノム情報を決定するための方法が必要とされている。ＨＬＡ遺伝子複合体の場合、それは、与えられた個体のＨＬＡタイプを他の方法により決定して予め知っておく必要なしに、その個体の遺伝子のヌクレオチド配列の決定が可能な系である。さらに、本発明は、それぞれの既知の対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドの使用を必要としない。我々が提示するこの技術は迅速で、かつ少量のオリゴヌクレオチドブライマーのみの使用を必要とするものであり、しかも、より通常のアプローチでは確認できない新しい配列変異体を容易に検出できる。この系はクラス■およびクラス■遺伝子だけでなくクラス■遺伝子の分析への利用可能性により実証され、しかも自動操作が可能である。

１」釦［［本発明は、維持または非維持（非対立遺伝子特異性）オリゴヌクレオチドブライマーを用いて、各対立遺伝子に対するゲノムまたは相補的ＤＮＡ分子を配列化されるべき各遺伝子座で増幅または直接配列化することにより被験者の一つ以上の多型性遺伝子の核酸配列を決定するための方法に関する。広義には、本発明の方法には、興味ある遺伝子座のゲノムＤＮＡまたは発現（ＲＮＡ）コピーの直接的な同時配列化分析により、その遺伝子座における遺伝学的評価性の明確な決定を提供する配列化に基づくタイピング（ＳＢＴ）をも包含するものである。

ＳＢＴは、注目する一つ以上の遺伝子座における遺伝的多型性を、これらの遺伝子座における多型性の複雑さに関係なく決定するために用いられ、例えば、（１）ＤＱＡ等により例示されるような、単一の遺伝子座の単なるホモ接合度またはへテロ接合度、（２）ＤＲＢ等に例示されるような、複数の、密接に関係しかつ密接に連結している遺伝子座のコピーに依存するアイソタイプの複雑性；および（３）クラスエ遺伝子等のような、遺伝子座的複雑性による、遺伝子座における対立遺伝子間複雑性を包含する。最もよく知られているヒト遺伝的多型性は、第１の、最も単純なタイプである。

このＳＢＴ法の使用により、ＨＬＡ遺伝子座の各タイプに例示されるような、注目する遺伝子座のコピーのみからなる重複配列データが得られる。このＳＢＴ実験計画は、特定の遺伝子座の両対立遺伝子の混合物の等しい増幅および直接配列化、および本アプローチにより生じる重複配列パターンの直接解読により、その遺伝子座の各コピーの同じ表現で遺伝子座を確実に選択するために設計される。

このように１本発明は、注目する一つ以上の遺伝子座における遺伝的多型性を決定するための方法を提供しており、これは鎌状赤血球貧血症、嚢胞性線維症、地中海貧血症等の遺伝的疾病のＨＬＡタイピング、検出、評価および／または特徴付は等、およびｐ５３、Ｒａｓ、ｍｙｃ等の様々な癌、癌腫、白血病、肉腫等に関係する遺伝子座における多型性の検出、評価および／または特徴付けに用いることが可能である。

本発明による方法の使用は、サンプルにおける被験者の主要組織適合性遺伝子複合体クラス遺伝子型（たとえばクラスＩまたはクラス■）の迅速かつ正確な決定用に提供される系により実証される。特に、本方法は、ＤＲＢｌ、ＤＲＢ３．ＤＲＢ４、ＤＲＢ５、ＤＱＢＩ。

ＤＱＡｌ、ＤＰＡＩおよびＤＰＢＩ遺伝子を含む少なくとも一つのＨＬＡクラス ■遺伝子座の決定に関する。クラスエ遺伝子型の場合、本方法はＡ、ＢおよびＣ座遺伝子の決定に有用であると考えられる。

遺伝子座核酸配列長型性を、本発明による方法を用いて決定するために、サンプルからの核酸（ＲＮＡまたはＤ　ＮＡ）を単離する。ＲＮＡの場合、少なくとも一つの配列化されるべき遺伝子座の各対立遺伝子に対するｃ　ＤＮＡ分子は、各遺伝子座の各対立遺伝子の維持領域にアニールする座持異性゛オリゴヌクレオチドプライマーを用いて合成される。本発明によれば、サンプル核酸配列は以下の操作により決定される。すなわり：ボリメラーゼチェーンリアクションによりｃＤＮＡ分子またはゲノムＤＮＡを増幅して、配列化されるべき各遺伝子座の各対立遺伝子に対して十分な生成物を生成し、この時、配列化されるべき各遺伝子座および染色体の全ての対立遺伝子が、少なくとも一つの維持オリゴヌクレオチドプライマー対で増幅され、かつ配列化されるべき各遺伝子座および染色体の少なくとも一つの対立遺伝子が。

少なくとも一つの非維持オリゴヌクレオチドプライマーおよび少なくとも一つの維持プライマーで増幅されていること：配列化（クリーン）のための各ＰＣＨの生成物を調製すること；Ｔａｑポリメラーゼ等のＤＮＡ配列に適当な酵素および配列化される多座に特異的な維持プライマーを用いて、各ポリメラーゼチェーンリアクションの生成物を直接配列化し、各対立遺伝子を各染色体の各遺伝子座で検出すること：および多座およびプライマーの組み合わせに対する各配列化生成物を分析して、被験者の遺伝子型を決定することにより、決定される。

本発明の好ましい具体例において、各遺伝子座の各対立遺伝子に対する各ポリメラーゼチェーンリアクション生成物の配列化は、各直接配列化ポリメラーゼチェーンリアクション生成物により生じる各核酸の一本および／または重複はしごを分析することにより決定される。この分析は、各遺伝子座配列の各対立遺伝子のヌクレオチド配列な多座の既知の配列と比較し、続いて非維持／維持オリゴヌクレオチドプライマー対を用いて増幅された各遺伝子座の配列を、維持オリゴヌクレオチドプライマー対で増幅された遺伝子座の各対立遺伝子のヌクレオチド配列と比較することにより行なわれる。配列化対立遺伝子に対する核酸はしごの比較は視覚的に、あるいはコンピューターソフトウェアを用いて行なうことができる。

好ましい具体例において、本発明のプロセスは、遺伝的疾病の治療を含む迅速な遺伝子型決定に使用できるように自動化される。このプロセスの自動操作には、ＲＮＡ／ＤＮＡ抽出装置によりサンプル核酸を単離すること：熱循環装置を用いたポリメラーゼチェーンリアクションにより合成されたｃＤＮＡ分子または単離されたＤＮＡ分子を増幅させて、ポリメラーゼチェーンリアクション生成物を得ること；そのポリメラーゼチェーンリアクション生成物を自動配列化装置中で配列化させること：および各配列化ポリメラーゼチェーンリアクション生成物を、維持オリゴヌクレオチドプライマー対で増幅された各対立遺伝子のポリメラーゼチェーンリアクション生成物配列を非維持／維持オリゴヌクレオチドプライマー対で配列化された各対立遺伝子の核酸配列と比較するための適当な計算を行なうための対立遺伝子配列情報およびキャパシティを有するデータペースを有するコンピューターで分析することが包含される。

本発明はさらに、ｃＤＮＡ合成、および増幅される各染色体の多座における各対立遺伝子のヌクレオチド配列決定のためのポリメラーゼチェーンリアクションとそのポリメラーゼチェーンリアクション生成物の直接配列化によるｃ　ＤＮＡ／ゲノムＤＮＡ増幅の工程において有用な、オリゴヌクレオチドブライマーの特異的な群に関する。有用な一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドブライマーを表１に記載する。

の　な！第１Ａ図は、ＤＲＢ　（ＤＲＢｌ、ＤＲＢ３、ＤＲＢ４およびＤＲＢ５）、ＤＱＡｌ、ＤＱＢＩ、ＤＰＡＩおよびＤＰＢ　ｌ遺伝子のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　／　Ｐ　ＣＲ／配列化実験の概略を示す。

第１Ｂ図は、ＤＲＢ、ＤＱＡｌ、ＤＱＢｌ、ＤＰＡＩおよびＤＰＢ１転写体上のプライマー結合部位の概略である。斑点のある枠はｃＤＮＡ合成反応において用いられるプライマーを表わし：黒い枠はＰＣＨに用いられる維持（あるいはタイプｌ）プライマーを表わし；格子模様の枠は同じ＜　ＰＣＨに用いられる非維持（あるいはタイプ２）プライマーを表わし；さらに白枠は配列化プライマーを表わす。

第１Ｃ図は、ＤＱＢｌ、ＤＲＢ、ＤＰＢＩおよびＤＰＡＩ遺伝子上のプライマー結合部位の概略を示す。

図中には、ゲノムＤＮＡサンプルに独占的に用いられるそれらのプライマーだけが示されている。

第２Ａ図は、末梢血液サンプルのための操作のフローチャートを示す。各反応は異なる試験管中で行なわれる。反応はカッコ内の大文字で名付け：これらの文字は表Ｈに示されるものに対応する。プライマーの「慣例的な」組み合わせだけをこの図に示す。

第２Ｂ図は、法律的（法医学的）なサンプルのための操作のフローチャートであり、ここにおいてＤＮＡは通常、作業上の唯一入手可能な遺伝的材料である。これらの場合におけるＤＮＡは、一般的に毛髪、精子、血痕などから単離される。

反応当たりのプライマーの組み合わせは「慣例的な」組み合わせだけに対応する図に示される。

第３図は、維持オリゴヌクレオチドを用いて得られるクラスＩＩ　ＨＬＡ　ｄｓＤＮＡの直接配列化を示す。

レーンは、Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃのように左から右へと読む。

１、ＤＱＢ１＊０２０１／ＤＱＢ１＊０３０２ヘテロ接合体用ＤＱＢＩはしご；２．ＤＱＡｌ＊０１０３ホモ接合体細胞系用ＤＱＡＩはしご：３゜ＤＲＢ１＊０３０１　、　ＤＲＢ３＊０　１０１／ＤＲＢｌ＊０４０１、ＤＲＢ４＊０１０１ヘテロ接合体用ＤＲＢはしご、一つ以上のバンドがある位置ははしごのわきに示され、それらが対応するテンプレートは図の上部に示される。はしごの少なくとも５０〜６０塩基対を明確に読むためには、さらに数時間その配列化ゲルを電気泳動にかけることが必要である。ＤＲＢ３またはＤＲＢ４座における遺伝子に対応するはしごは、ＤＲＢｌ座における遺伝子に対応するものに比べてぼんやりしたものであることに注意されたい、おそらくこれはそれらの発現が低レベルであることによる。これらの強度（程度）における差異は再現性があり、複鱈な重複パターンの読み取りを助ける。この図で読み取れる第１エクソン塩基対およびコドンの位置（カッコ内）は各はしごの底部に示す。

第４図は、非維持オリゴヌクレオチドを用いて得られるクラスＩＩＨＬＡ　ＤＲＢＩ　ｄｓＤＮＡの直接配列化を示す、レーンは、Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃのように左から右へと読む、レーン１．プライマーＤＲＢ１７（ＤＲＢ５＊０１０１　ｃＤＮＡを選択）（左）およびＤＲＢＩ　６　（ＤＲＢＩ　＊０１０１　ｃＤＮＡを選択）（右）で増幅されたＤＱＢｌ＊０１０１／ＤＱＢ１＊１５０１．ＤＲＢ５＊０１０１ヘテロ接合体のｃＤＮＡ；レーン２．５′プライマーＤＲＢＩ　Ｔ　（ＤＲＢＩ　＄０３０１およびＤＲＢ３＊０１０１　ｃＤＮＡを選択）　（左）およびＤＲＢＩ　６　（ＤＲＢＩ　＄０４０５およびＤＲＢ４＊０１０１を選択）（右）で増幅されたＤＲＢ１＊１４０５、ＤＲＢ４＊０１０１／ＤＲＢ１＊０３０１、ＤＲＢ３＊０１０１ヘテロ接合体のｃ　ＤＮＡ、一つ以上のバンド、またはそれぞれ異なるプライマーで得られる二つのはしごが存在する位置は、はしごのわきに示す。

の　なここおいて用いられているように、ｒ遺伝子Ｊという用語は、ＤＮＡのセグメントを意味するものであり、転写される領域および転写を可能にする調節配列からなる。「遺伝子座」という用語は、染色体上の遺伝子が位置する特定の空間を意味する。「対立遺伝子」という用語は、単一の染色体での単一の遺伝子座における遺伝子の複数の形態を意味し、表現型への影響を異にすること（特定の遺伝子型の検出可能な外面的な現われ）により他の考えられる対立遺伝子と区別できるものである。

「へプロタイプ」とは、同一染色体上の複数の座における遺伝子の特定の対立遺伝子の組み合わせを意味する。

ここで用いられる「遺伝子型」という用語は、各染色体における複数の連結した座における遺伝子の特定の対立遺伝子の組み合わせ（２ハブロタイブ）を意味する。

ここにおいて用いられる「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上のデオキシリボヌクレオチド、好ましくは３つ以上のデオキシツボヌクレオチドを有する分子を意味する。分子中の正確なヌクレオチド数は、特定のオリゴヌクレオチド分子の機能に依存するであろう。

ここにおいて用いられる「プライマー」という用語は。

コピーされるべき核酸ストランドに相補的なプライマー伸長生成物の合成の開始点として、あるいはＤＮＡ分子配列化の開始点として作用しつる一本鎖オリゴヌクレオチド配列、好ましくは合成的に得られるものを意味する＊　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの合成、あるいはポリメラーゼチェーンリアクション生成物によるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ分子の増幅で使用することを意図されるプライマーの場合、プライマーの長さおよび配列は、重合化酵素の存在下で伸長生成物の合成をプライムするのに十分なものでなければならない、プライマーの長さは、好ましくは約５〜５０ヌクレオチド、さらに好ましくは約５〜２０ヌクレオチドである。プライマーの具体的な長さおよび配列は、必要とされるＤＮＡまたはＲＮＡ標的テンプレートの複離さ、および温度、イオン強度、ＭｇＣ１，濃度などのプライマーの使用条件に依存するであろう、操り込まれたプライマーが配列化に使用される場合、増幅を分ける塩基対およびＤＮＡテンプレート上の配列プライマーの数も重要な条件である。

ここにおいて用いられる［維持オリゴヌクレオチドブライマー］　（タイプｌ）とは、ＤＮＡ配列が高度に維持されている領域（すなわち、１〜２ヌクレオチド未満のバラツキ）に対応するオリゴヌクレオチド分子を意味する。この維持プライマーはそれがアニールされるヌクレオチドテンプレートと正確に一致している必要はないが、維持プライマーは最小限の、好ましくは一つの標的ヌクレオチドテンプレートとのミスマツチを有する０機能としては、維持プライマーは標的ヌクレオチド（ｃＤＮＡ、ＰＣＲ生成物、等）を非常に厳しい条件で同じようにプライムすることが可能である。これとは対象的に、ここにおいて用いられる「非維持オリゴヌクレオチドブライマー」　（タイプ２）とは、予め決められた数の考えうるヌクレオチド配列とのミスマツチを有するオリゴヌクレオチド分子を意味する。この予め決められたミスマツチの数は、好ましくは約１〜１２の範囲内で変えることができる。非維持プライマーは、特定の座または高度に相同する座の両群における限定数の対立遺伝子へのその選択的な結合により特徴付けられる。この非維持プライマーは、より相補的な対立遺伝子または対立遺伝子群（２つ以下）に結合する（すなわち、プライマーと標的配列との間のより少数のミスマツチ）。ここにおいて用いられる維持および非維持プライマーのこの特異的な組み合わせ、および座当たりの反応数は、最少の消費時間およびコストで精度の高い結果が得られるように、特別に設計される。

本発明は、例えばヒトＨＬＡ系、鎌状赤血球貧血症、嚢胞性線維症等の異なるヒトの遺伝的障害に関する遺伝子系、およびｐ５３、ｍ　ｙ　ｃ等の様々な癌に関連する遺伝子系などの与えられた個体の多型性の遺伝子系の対立遺伝子の配列を決定するためのプロセスに関する。本発明は、限定数のプライマーを用い、かつオリゴヌクレオチドに特異的な対立遺伝子を極力用いない遺伝子ｃ　ＤＮＡ分子の酵素的増幅および直接配列化により、ＨＬ　Ａ座、特に今日知られている最も多型性であるヒト遺伝子座であるクラス■およびクラスエ遺伝子における多型性を決定するためのその利用により実証される。本方法は、特にクラスＩＩＨＬΔ 遺伝子の対立遺伝子配列の決定に好適であり、それにより、被験者の完全なＨＬＡクラス■遺伝子型の情報が提供される０本発明の方法を用いることにより、完全なりラスＩＩＨＬＡタイピング（ＤＲ，ＤＱおよびＤＰ）を約１６〜２４時間以内に行なうことが可能になる。

おおまかに、本発明の方法には：サンプル核酸の抽出、ＲＮＡの場合、ｃＤＮＡの生成；ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの増幅；増幅生成物の直接配列化；および直接配列化情報の分析が包含される＊　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの生成、該ｃＤＮＡの増幅、および該ｃＤＮＡ増幅生成物の直接配列化は、ここにおいて記載されているような特別な性質を有するオリゴヌクレオチドブライマーを用いることにより達成される。

Ａ０オ盲ゴヌクレオチ′プライマー本発明のオリゴヌクレオチドブライマーは、ホスフォトリエステルおよびホスフォジエステル法などの公知の適当な方法を用いて合成できる。　Ｎａｒａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、。

（１９７９）。オリゴヌクレオチドは、バイオサーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）８７５０　Ｄ　Ｎ　Ａ合成装置等の変形固体支持体用いて調製することができる。

有用なプライマーは、ＤＮＡはしごを注目するヌクレオチド配列またはその付近で切断する適当な１１１１１　限エンドヌクレアーゼを用いて生物学的入手源から単離し、それをプライマーとして使用することもできる。

Ｂ、＋＞プル　の本発明のプロセスにおいては、注目する核酸配列を含有する限り、いかなる核酸源でもサンプル核酸として用いることができる０例えば、本方法において用いつるサンプルとしては、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドである。代表的なサンプルは末梢血液単核細胞（ＰＢＭＭＣ）、リンパ芽球細胞系（ＬＣＬ）、毛髪細胞１等が挙げられる。ヒトＨＬＡクラス■およびクラスエ遺伝子多型性の決定には、ＬＣＬまたはＰＢＭＮＣが好ましい。単離される核酸（例えばＲＮＡまたはＤＮＡ）は遺伝的入手源（血痕、毛髪または末梢血液細胞）に依存する。しかしながら、ＤＲＢＩ〜５、ＤＱＢｌ、ＤＱＡＩ、ＤＰＡＩ、Ｄ　Ｐ　Ｉｊｌを含有するＨＬＡクラス■遺伝子の場合、タイピングが移植または実父確定科学検査を目的として行なわれるならば、好ましい単離核酸は全細胞ＲＮＡである。法律的使用において、ゲノムＤＮＡが好ましい遺伝的物質であり、この場合、異なるプライマーが用いられることが考えられる。

細胞質およびポリ（Ａ）＋ＲＮＡも用いることができる。本方法におけるサンプル核酸の単離はＤＮＡ／ＲＮＡ抽出装置（モデル３４１ＤＮＡ抽出装置、　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ。

ＣＡ製、等）を用いて自動化することができると考えられる。

Ｃ，ｃＤＮＡのサンプル核酸の相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）は、特別のオリゴヌクレオチドブライマーおよびクローン化逆転写酵素を用いて酵素製造メーカー（ＢｅｔｈａｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　１ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ。

ＭＤ）の示唆する条件に従って生成できる。用いられるプライマーのタイプと使用量における具体的な差異、ｄＮＴＰ濃度および伸長時間は、以下の実施例に基づいて当技術者には容易に理解されるであろう。

Ｄ、ボ１メラーゼチェーン１アクション注目する各遺伝子座に対するｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの増幅は、Ｍ１目」Ｓの米国特許第４，６８３．１９５号および同第４，６８３，２０２号ｌに通常記載されているようなポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）を用いて達成される。このＰＣＲは：　（ａ）変性工程（ＤＮＡ分子の両ストランドを解＜）；　（ｂ）アニーリング工程（プライマーをＤＮＡ分子の解けたストランドに特異的にアニールできるようにすることを目的とする）；および（Ｃ）伸長工程（プライマーがアニールされるＤＮＡのストランドのデオキシリボヌクレオチドに相補的なものをプライマーに取り込む）ことからなるサイクルの多くの繰り返しからなる。このＰＣＲプロセスは、実施例１：　オイテ示すように、熱循環装置（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｉｍｅｒ。

Ｃｅｔｕｓ、Ｒｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を用いて行なうことができる。

本発明は、例えば個体の多型性遺伝子座における冬型性の検出、評価、および／または特徴付けのために特別に設計されたＰＣＲ操作に非維持オリゴヌクレオチドの使用を導入するものである。ＨＬＡタイピングの場合。

非維持オリゴヌクレオチドの使用は、維持オリゴヌクレオチドまたは対立遺伝子特異性オリゴヌクレオチドを用いて独占的に増幅されたＤＮＡを配列化することによりＨＬＡタイピングを行なう際に直面するであろう問題を解決する（以下を参照）。

ＰＣＲプロセスは、増幅されるべき特定の遺伝子に特異性なオリゴヌクレオチドを用いることによる、特定の遺伝子の増幅用に設計されたものであると考えられる。

しかしながら、完全にマツチするプライマーを用いてでさえ、はとんどの場合、ＰＣＲは絶対的に特異的ではない。ＨＬＡタイピングの場合、ＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子およびクラスＩ遺伝子に対して維持プライマーをＰＣＨにおいて使用すれば、テンプレートの複雑な混合物を生じるであろうし、そこにおいて、説明するには厄介な重複配列はしごとしての直接配列化が見られるであろう。したがって、正確なヌクレオチド配列情報がわかっていない遺伝子では、適当なレベルの確実性が達成できない。

非常に厳しい条件下で遺伝子座または相同する座の群の２つ以下の対立遺伝子と選択的にアニールできる非維持オリゴヌクレオチドの使用は、複雑なヘテロ接合体の組み合わせにおける高度に相同する座での異なる遺伝子の配列情報の提供を可能にする。このように、本発明は、多型性遺伝子座に対する遺伝子型の決定に有用な方法を提供するものである。これは、ＨＬＡタイピングにおいて特に重要であり、クラス■タイピングだけでなく、クラスＩＨＬＡタイピングにも適用可能である。

非維持プライマーと対立遺伝子特異性オリゴヌクレオチドとの相違点は、後者が特定の対立遺伝子の存在がわかっている場合にのみ使用でき、かつ冬型性系の各対立遺伝子に対する特別のプライマーの使用を必要とすることにある。したがって、高度に相同する多型性遺伝子座の別々の対立遺伝子を増幅するために、非維持プライマーと維持プライマーの使用を組み合わせれば、適度な消費時間かつ経済的なコストで、遺伝子型決定のための各対立遺伝子の直接配列化はしごの明確な転写が可能で、より単純なりＮＡポリメラーゼチェーンリアクション生成物の組み合わせが提供できる。

このＰＣＲ反応に用いられる条件は、好ましくは、アニーリング工程で用いられる温度以外は同じであり、その温度は用いられるプライマーのタイプ、すなわち維持（タイプｌ）か非維持（タイプ２）かにより異なる。前者のタイプのプライマーを用いる反応では、好ましくはサイクルのアニーリング工程が３７℃で行なわれるが、一方、この工程は、後者のタイプのプライマーを用いる反応では、好ましくは約５５℃〜６０℃で行なわれる。

用いられるプライマーおよび緩衝液の濃度、以下の実施例に記載されているプロセスパラメーターの範囲内で明白である。

Ｅ、ＰＣＲの　タＰＣＨにより生じる二本鎖ＤＮＡの直接配列化は、Ｔａｑポリメラーゼ等のＤＮＡ配列化に適当な酵素、および特別な組み合わせの試薬を適当濃度で用いて達成される。配列化操作は、３７３ＡモデルＤＮＡシークエンサー（Ｂｉｏｓｉｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、　（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）製）などの自動配列化装置中で行なうことができる。配列プライマーおよび核酸ターミネーション混合物を含む試薬は、当技術者には以下の実施例に明記されている直接配列化操作に基づいて理解されるであろう。

Ｆ、ダＰＣＨの注目する各遺伝子座に対するｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを直接配列化することにより得られる核酸はしごは、オートラジオグラムから視覚的に、あるいは全てのハブロタイブの全ての対立遺伝子に対するヌクレオチド配列情報がプログラムされたコンピューターおよび注目する遺伝子座の配列化された対立遺伝子と既知の対立遺伝子を比較するための操作を用いることにより評価できる。本発明の好ましい具体例において、遺伝子座対立遺伝子の評価は二つの工程、すなわち＝　（ａ）配列化以外の方法によって非常によく特徴付けられる相同する細胞系において得られる情報などの既知の遺伝子型情報のライブラリーを用いた個々の対立遺伝子の配列化、および各ポリメラーゼチェーンリアクション生成物（すなわち、維持および非維持プライマー生成物）の遺伝子配列オチドプライマー対で増幅される遺伝子座の対立遺伝子のポリメラーゼチェーンリアクション生成物、および維持／非維持プライマー対で増幅される遺伝子座の対立遺伝子のポリメラーゼチェーンリアクション生成物に対する。直接配列情報の比較からなる。この比較において、遺伝子座の各対立遺伝子に対する特異的な配列情報を得るために１重複配列はしごの情報の置換アルゴリズムまたは視覚的削除が用いられる。

本発明のプロセスは、既知および未知の高度に多型性である系（例えば、遺伝的疾病に関する遺伝子、癌に関する遺伝子、およびクラスＩ、クラス■およびクラスｍＨＬＡタイピングを含むＨＬ　Ａクイピング、等）を増幅および配列化するために用いることができる、と考えられる０本プロセスは、実父確定科学検査や法医学に有用であり、制限フラグメント長条型性（ＲＦＬＰ）、検出系よりも精度が高しνと考えられる。後者においてはハイブリダイゼーションパターンのみが観察されるのに対して、増幅された生成物の直接配列化では増幅された遺伝子の正確なヌクレオチド配列が示されるので、さらに正確で確実である。

この方法は、特にクラスＩ［ＨＬＳＡタイピングに好適であり、そのコストを下げ、その速度を上げ、特にはその精度を向上させる。以下の実施例から明らかなように、限定数の維持および非維持オリゴヌクレオチドを用いたクラス■遺伝子の酵素的増幅および直接配列化により、ＤＲＢＩ、ＤＲＢ３、ＤＲＢ４、ＤＲＢ５、ＤＱＢｌ、ＤＱＡｌ、ＤＰＡＩおよびＤＰＢＩ遺伝子の配列多型性分析が、未知のＨＬＡ型のいかなる被験者においても迅速に行なうことができる。ここにおいて記載されるアプローチは、現在利用可能な技術を用いて完全に自動化でき、かつ、先に記載したオリゴヌクレオチドプローブおよびトッドプロットを用いた方法とは逆に、新しい対立遺伝子配列または微量異種配列の存在を個体群レベルで検出するという有利点を有する。本発明の方法は。

異なるクラスＵＨＬＡ座における配列対立性の異質遺伝子的移植後の移植片生存に対する影響を詳細に分析することに有用であると考えられる。本発明の方法は、ヒト疾病の研究におけるクラスＩＩ　ＨＬ　Ａ冬型性の迅速かつ正確な配列分析を可能にするものであり、非常に大きな個体群の被験者における新しいクラス ■配列変体の探索には興味深いものであろう。

本発明は以下の実施例によりさらに詳細に説明されるが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。

ＬＬ ■、クラス■ＨＬＡ゛　のｃＤＮＡ　ＰＣＲＪｆ、−に　うよ　なオリゴデオキシリボヌクレオチドブライマーの　およＵ　プライマーの　飢１拡艶ここにおいて記載されるオリゴデオキシリボヌクレオチドブライマーは全て以下のようにして合成された。

オリゴデオキシリボヌクレオチドブライマーの自動合成＝　ｂ−シアノエチルホスフォアミデイテ（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　（Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）より入手）を、Ｂｔｏｓｅａｒｃｈ　８７５０ＤＮＡシンセサイザーを用いて連続的に縮合してヌクレオシドとし、礼状ガラス支持体に誘導した。この縮合サイクルには、ジクロロメタン中でのジクロロ酢酸による脱トリチル化、続いてベンゾトリアゾールによるデカンテーションおよびテトラヒドロフランおよびピリジン中での無水酢酸および１−メチルイミダシリンによるキャッピングが含まれ、各サイクル時間は約９分間であった。ジメトキシトリチルアルコール遊離の測定による各工程における収率は〉９９％であった。オリゴデオキシリボヌクレオチド合成のための方法は、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　ａｔ　ａｌ、。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、１５４：２８７　（１９８７）に記載されている。

オリゴデオキシリボヌクレオチドブライマーの脱保護および精製：　オリゴデオキシリボヌクレオチドブライマーの脱保護および精製は、５ｃｈｕｌｈｏｆ　ａｔ　ａｌ、。

Ｎｕｃｌ　、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、１５：　３９７　（１９８７）ｉ：記載の操作を用いて行なった。簡単に説明すると、室温で約１時間、濃水酸化アンモニウムにさらすことによりオリゴデオキシリボヌクレオチドを固体支持体から除去した６部分的に脱保護されたオリゴデオキシリボヌクレオチドを含有する溶液を６゛５℃で１６時間維持した。アンモニアを除去し、その残りを０．１モルのアンモニア／トリエチルアミン（ｐＨ７，０）中の１４〜２０％アセトニトリルの直線勾配を用いてＣ１８逆相カラム（ＲＰ３０４゜ＢｉｏＲａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）でのり０７１−グラフィーにかけた。ジメトキシトリチル基を、７０％酢酸を用いた処理により、ＨＰＬＣで精製されたオリゴデオキシリボヌクレオチドから除去した。脱トリチル化オリゴデオキシリボヌクレオチドを、エーテル中に沈殿させることにより回収し、真空遠心分離して乾燥させ、水に懸濁し、２６０ｎｍにおけるその吸光度を測定することにより定量した。

上記の操作を用いて、ＨＬＡクラスＩ［ＤＱＡ、’ＤＱＢ、ＤＲＢ、ＤＰＢおよびＤＰＡ座の記載の領域に相当する以下のオリゴヌクレオチドブライマーを合成しく下記表１を参照のこと）、徹底的にテストした。

２、ｃＤＮＡ　ＰＣＲプライマーの　みｃＤＮＡ合成、ＰＣＲ増幅および直接配列化を含む各反応、および多座に対するオリゴヌクレオチドプライマーに対する特殊な組み合わせがあり、それらは、高い精度で、速く、かつ安価にタイピング結果を得るために必要なあらゆる配列情報を提供するために設計されている。これらの組み合わせは下記の表■に「慣例的」組み合わせとして一覧している。さらに、表Ｈには５例えば既知のハブロタイブの地図によっては予想できない特別な座に対する「慣例的」組み合わせを用いて得られた結果を確認するために用いられる、多座に対するオリゴヌクレオチドの「それ以外」の組み合わせの一覧も記載されている。これらの「予想外」の結果は、通常新しい対立遺伝子および／またはハブロタイブの存在を示すものであり、それらはオリゴヌクレオチドのそれ以外の組み合わせを用いて確認できる。いずれにしても、これらのオリゴヌクレオチドの組み合わせは、各々、裸眼での正確な読み取り、あるいは適切なソフトウェア下で操作されるコンピューターによる処理に適するその最終生成物（配列化はしご）の生成能により特徴付けられる。

この方法は、移植のような臨床的背景におけるタイピングを目的とする場合、出発物質として末梢血液単核細胞から単離されたＲＮＡを用いるが、法律的な目的の場合は、ＤＮＡが唯一の入手可能なテンプレートとしてしばしば用いられる。

各テンプレート（ＲＮＡまたはＤ　ＮＡ）に対して異なる組み合わせのオリゴヌクレオチドが用いられるが（表■参照）、結果として得られた物寅の転写を包含する通常のタイピングの実験計画は本質の各プライマーの特定の組み合わせは、以下に詳細に記載されている。ＨＬＡタイピング実験計画の一般的な概説は第１および第２図に示されており、さらに実施例２および３で議論されている。

表呈ＣＤＮＡ　ＰＣＲに　マー　せｎ凹　伏Ｍ　醒　Ａ、Ｔ、　鋏とＤＲＢ３０　／ＤＲＢ１２　／ＤＲＢ２２拳中Ｂ、　２　ＤＲＢ２０　ＤＲＢ２３　６６℃　ＤＲＢ３０　／ＤＲＢ１２Ｃ，２ＤＲＢ２０　ＤＲＢ２４　５５℃ 　ＤＢ８３０　／ＤＲＢ１２Ｄ、　２　ＤＲＢ２０　ＤＲＢＺＳ　５＋℃　ＤＲＢ３０　／ＤＲＢ１２Ｅ、　Ｉ　ＤＱＢ７　ＤＲＢ１３　３７℃　ＤＱＢ３（１／ＤＱＢ５Ｆ、　ｌ　ＤＱＡ９　ＤＱＡＩＯ３７℃　ＤＱＡ３Ｇ　／ＤＡＱ２９　＊孝傘Ｇ、　Ｉ　ＤＰＢＩＩ　ＤＰＢｌｏ　３７℃　ＤＰＢ１２　／ＤＰＢ１３Ｈ，Ｉ　ＤＰＡ１４　ＤＰＡ１６　３７℃　ＤＰＡ１６　／ＤＰＡ１７１、　Ｉ　ＤＰＡ１９　ＤＰＡ１８　３７℃　ＤＰＡ２０　／ＤＰＡ２１　＊＊＊Ｊ、　Ｚ　ＥＩＲＢ２０　ＤＲＢ１６　５５℃　ＤＲＢ３Ｑ　／ＤＲＢ１２に、　２　ＤＲＢ２０　ＤＲＢ１７　５５℃　ＤＲＢ３０　／ＤＲＢ１２Ｌ、　ｌ　ＤＲＢ２０　ＤＲＢ２２　３７℃　ＤＲＢ３０　／ＤＲＢ１２賛、Ｉ　ＤＱＢ７　ＤＱＢ６　３７℃　ＤＱＢ１３Ｎ、　２　ＤＱＢ７　ＤＱＢ６　６５℃　ＤＱＢ３０　／ＤＱＢ５Ｄ、　２　ＤＱＢ７　ＤＱＢ１４　５５℃　ＤＱＢ３０　／ＤＱＢＳＰ、　２　ＤＱＢ７　ＤＱＢＩＳ　５５℃　ＤＱＢ３Ｇ　／ＤＱＢ５Ｑ、　Ｉ　ＤＰＢ１２　ＤＰＢＩＯ３７℃　ＤＰＢ１３Ｒ，ｌ　ＤＰＡ１６　ＤＰＡ１６　３７℃　ＤＰＡｌ？２、Ｄｌ値ｎ匹　二　二　ＬＬ　胎Ｓ、　Ｉ　ＤＲＢ１４０６　ＤＲＢ２２　３７℃ＤＲＢ１２　／ＤＲＢ１４００　Ｉ幸＊會幸Ｔ、　２　ＤＲＢ１４０６　ＤＲＢ２４　５５℃　ＤＲＢ１２　／ＤＲＢ１４００Ｕ、　２　ＤＲＢ１４０６　ＤＲＢＺＳ　５５℃　ＤＲＢ１２１０Ｒ８１４０ＧＶ、　２　ＤＲＢ１４０６　ＤＲＢ２３　５５℃　ＤＲＢ１２　／ＤＲＢ１４００冑、　Ｉ　ＤＱＢ９３２　ＤＱＢ９３１　３７℃　ＤＱＢＳＸ、　Ｉ　ＤＰＢ１４　ＤＰＢＩＳ　３７℃　ＤＰＢｌＢ　／ＤＰＢ１７Ｙ、　Ｉ　ＤＰＡＩＯＤＰＡＩＩ　３７℃　ＤＰＡ１２Ｚ、　Ｉ　ＤＲＢ１２　ＤＲＢ２４　３７℃　ＤＲＢ８２ＳＡ＾、　２　ＤＲＢ１４０１　ＤＲＢ１４０２　５５ ℃　ＤＲＢ１４（１３＃ＡＢ、２　ＤＲＢ１４０６　ＤＲＢ１６　５５℃　ＤＲＢ８２Ｓ／ＤＲＢ１２ＡＣ，２ＤＲＢ１４０６　ＤＲＢＩ６　５５℃　ＤＲＢδ ２５／ＤＲＢ１２＾Ｄ、　ｌ　ＤＰＢ１４　ＤＰＢｌＧ　３７℃　ＤＲＢ１７（＄Ｉ　ＤＲＢおよびＤＱＢの配列決定に際し、二つの選択すべき配列決定プライマーを示す１両プライマーとも、正鎖を配列決定している。

（＊＊）新たに対立配列が認められる場合には、常に、プライマーＤＲＢ２２を使用して負鎖を配列決定する。

（本本本）各ＤＱＡＩ配列決定プライマーのアニーリングは、異なる鎖に対するものである。ハブσタイプの残部によって同型接合性が期待できない仮定的状況では、反応物りには選択すべき増幅プライマー（ＤＲＢＩＩの変わりにＤＲＢ２２）を使用する。対立配列が認められる状況では１反応物Ｍを使用してＤＱＢ　ｌの負鎮を配列決定する。

（＊＊＊＊＊第３のエキランの配列決定は、特定のＤＰＡＩ対立遺対立遺伝区間をつけるために必要である。

（＊＊＊＊＊）プライマーＤＲＢ１４００を使用すると、ゲノムＤＮＡからＤＲＢ遺伝子を増幅した配列決定時に、３′末端増幅プライマーに直後の配列を読むことができる０反応物Ｑ、Ｒ，Ｚ！３よびＡＤは、残部のクラスＨへプロタイプによって期待できないと考えられる対応座で、同型接合性を確認するために選択すべき組合せである。

（＃）このプライマーの組合せは、ＤＲＢ１＊０７０１とＤＲＢＩネ０７０２を区別するための使用する。ＤＲＢ１＊０７０２は、それらの第３のエキランに右いて１つの塩基対だけが異なる。

！」Ｌ匠」Ｌロトコール：ＣＲＢ、ＤＱＢ、ＤＱＡおよびＤＰＢ゛　の　によるＨＬＡ　ラス ■　イビング１、　、および第１Ｏ回　国際組織適合性研究会［Ｄｕｐｏｎｔ、　Ｈｕｍ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、２６：３　（１９８９）］で定義された既知の各クラス■ハブロタイブを表わすリンパ芽球細胞系（ＬＣＬ）はＤｒ、Ｍｉｒｉａｍ　Ｓｅｇａｌｌ　（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ　Ｍｉｎｎａｓｏｔａ）により提供された。予め血清学的にクラス■およびクラス■抗原にタイプ付けされた４０人の無関係な被験者についても研究した。研究対象である各被験者の血清学的タイプは、分析が行なわれる時点では配列分析を行なう研究員には知らされていなかった。

これらの被験者には健康な者も病気（インシュリン依存性糖尿病および自己免疫性甲状腺疾患）を持つ者も含まれていた。配列化ハブロタイブは、ヘテロ接合体の組み合わせに多く、ＤＲ７（ｎ＝３）、ＤＲｗｌ　７（Ｎ＝２６）、ＤＲ４（ｎ＝１６）、ＤＲｗｌｌ　（ｎ＝８）、ＤＲｗ８　（Ｎ＝４）、ＤＲＩ　（Ｎ＝６）、ＤＲｗｌ５　（Ｎ＝６）、ＤＲｗｌ６　（ｎ＝２）、ＤＲｗｌ３　（ｎ＝２）、ＤＲｗｌ４　（ｎ＝２）、ＤＲ２１２（ｎ＝３）、ＤＲ５ｘ６　（ｎ＝３）が含まれる。テストされる細胞系およびヘテロ接合体の組み合わせは表■に示されている。ＤＰＡおよびＤＰＢ座における複雑さはＤＱ遺伝子とＷ４似しているので、ＤＰＡおよびＤＰＢタイピングのためのプライマーの組み合わせはホモ接合体およびヘテロ接合体の被験者のより小さな群において最適化された。

２、および　第１ゴヌクレオチド　いたＨＬＡ−ＤＲＢ、ＤＱＢおよびＤＱＡ　の全細胞質ＲＮＡを、５〜ｌ　Ｏｘ　１０’の末梢血液単核細胞（ＰＢＭＮＣ）またはリンパ芽球細胞系（ＬＣＬ）（１μｇ）から塩化セシウム遠心分離により調製した［Ｃｈｉｒｇｗｉｎ　ａｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈａｍｉｓｔｒｙ、１Ｂ。

５２４９　（１９７９）］。一方、末梢血液（２〜１０ｍ１）からの全ＲＮＡを、より速いプロトコールを用いて一部精製した［Ｇｏｕｕｈ、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈａｍ、、１７３．９３（１９８Ｂ）］、　１　ｕ　ｇの全細胞質ＲＮＡを、最終体積２０ｍ１中に７５μＭの各ｄ　ＮＴＰおよび１０ピコモルの特定のナンセンスブライマー（表■）を含有する溶液中のりボヌクレアーゼ阻害ＲＮＡ（１０ユニツト。

Ｆｒｏｍｅｇａ）　ｃ）存在下、５０　ｍ　Ｍ　）リス−ＭＣＩ（ｐＨ８，３）、７５ｍＭ　ＫＣｌ、１０ｍＭ　ＤＴＴ、３　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　Ｈ中で、モｏ　ニー　（Ｍｏｌｏｎｅｙ）白血病ウィルス逆転写酵素（ＭＬＶＲＴ）（２００ｕ。

Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で、３０〜４５分間、３７℃で逆転写した。インキュベート後、８μｌのｌｏｘ　ＰＣＲ緩衝液（５００ｍＭＫＣＩ、ｌｏｏｍＭ　トリス−ＣＩ、ｐＨ８，３，７゜５−１５ｍＭ　ＭｇＣｌ、、０．１％ゼラチン）を添加した。５′−プライマー（２０ピコモル）（タイプＩまたはタイプＨの各プライマー、表■参照）に１０ピコモルのナンセンスブライマーおよび２ユニツトのＴａｑポリメラーゼを加えたものをさらに添加し、最終体積を蒸留水で１００μｍに調整した。この反応混合物を、パーキン−エルマー　セタス　サーモサイクラ−（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）を用いて、９４℃で３０秒、３７℃ または５５℃で３０秒および７２℃で３０秒の３５サイクルに供した［５ａｉｋｉ　ａｔ　ａｌ、。

５ｕｐｒａ　（１９８５）；　Ｍｕｌｌｉｇ　ａｎｄ　Ｆａｌｏｏｎａ、５ｕｐｒａ（１９８７）；　５ａｉｋｉ　ｅｔ　ａｔ、、５ｕｐｒａ　（１９８６）；５ｃｈａｒｆ　ａｔ　ａｌ、、ａｕｐｒａ　（１９８６）を参照〕。こコテ用いられるプライマー、それらが対応する配列およびそれらがアニールする領域は表Ｈに示されている。多座に対する反応は、通常は別々のマイクロッエージチューブ中で行なわれる。しかしながら、維持プライマーを用いる場合、全ての座（ＤＲＢ、ＤＱＡ、ＤＱＢ、ＤＰＡおよびＤＰＢ）に対するｃＤＮＡおよびＰＣＲ反応は、同じチューブ内で同時にうまく行なうことができる。

３、Ｔａ　ボ１メラーゼを　いた　の　ダ化− 反応混合物（１００μｌ）を、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）−１００（Ａｍｉｃｏｎ）またはウルトラフリー（Ｕｌｔｒａｆｒｅａ）−１００（ｍｉｌｌｉｐｏｒａ）ｖイクロコンセントレーターを用いたスピン透析により、取り込まれていないｄ　ＮＴＰおよび過剰のオリゴヌクレオチドを含まない状態にした。その結果得られたものの半分（２０ｕｌ）を乾燥し、１５ｍ１のｌｘ　Ｔａｑ配列化緩衝液（５０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ９゜１０　ｒｎ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃ１ｓ　）に再懸濁した。ＤＱＢ、ＤＲＢ、ＤＱＡ、ＤＰＢおよびＤＰＡ遺伝子の配列化をプライムするために、それぞれ内部オリゴヌクレオチドを用いた（表 ■）、各ストランドを配列化するためのプライマーは表■に一覧されている。たった一つのストランドのみが、タイピング用に慣例的に配列化され、一方、それ以外のストランドの配列化は、新しい対立遺伝子配列が示唆される場合に行なわれる。８０〜１１００ｎのプライマーを、最終体積が１０ｕｌである１　ｏｐｍｏ　１のγ−Ｐ３２ラベル化ＡＴＰ　（５０００Ｃｉ／ｍｏｌ。

１０μＣＩ／μＬ）および５ユニツトのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂ、１ｏｔｅｃ）を含む溶液で３末端ラベル化した。取り込まれていないラベル化ＡＴＰを抽出することなく、１０ｎＨのプライマー（ｌｕｌ）を配列化混合物に添加し、５分間沸騰させ、室温で１５分間放置した。８ユニツトのりコンビナンドＴａｑポリメラーゼ（ＬＩＳＢ）をその混合物に添加した１次いで、４μｌのアニール化プライマー／テンプレート混合物を、４μｌの各ストップヌクレオチドミックス、すなわち＝ａ）タームミックス（Ｔｅｒｍ　ｍ１ｘ）ｄ　ｄ　Ｇ　：各１５μＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ。

４５μＭのｄｄＧＴＰ；ｂ）タームミックスｄｄＡ：各１５μＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ。

６００μＭのｄｄＡＴＰ；ｃ）タームミックスｄｄＴ：各１５μＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ　；　１２００μＭのｄｄＣＴＰ；ｄ）タームミックスｄｄＣ：各１５μＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ　、４５０μＭのｄｄＣＴＰに添加した０反応は、７２〜７４℃で１０分間を２回続けて進行させた。２回目のサイクルの後、各反応を２μｌのＡＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ、ＣＴＰの混合物（７，５μＭ）で追跡し、５分間進行させた。遠心後、４ｍｌの９５％（ｖ　／　ｖ　）ホルムアルデヒド／２０ｍＭ　ＥＤＴＡを添加して反応をストップさせ、５分間加熱して８０℃にし、４ｍｍ厚の６％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルにかけた。２５００Ｖで２時間電気泳動を行ない、５％（ｖ　／　ｖ　）氷酢酸１５％（ｖ　／　ｖ　）メタノール中で１５分間固定シ、コダック（ＫＯｄａＫ）　Ｘ−０７ツト（Ｘ−Ｏｍａｔ　）フィルムに４〜１２時間さらした。

゛　の　ダ　に基づくタイピング第１０回国際組織適合性研究会のパネルからのホモ接合体のリンパ芽球細胞系（ＬＣＬ）（表■）を、実験計画の初期テストとして用いた。全体として、これらの細胞系は、この分析が行なわれる時点ではほとんどの既知のＤＲおよびＤＱ対立遺伝子を代表するものであった。

ホモ接合体のＬＣＬから単離された全細胞質ＲＮＡは逆転写され、その結果得られたｃＤＮＡは、先のプロトコールに記載されているようなりＲＢＩ／ＤＲＢ３／ＤＲＢ４ＤＲＢ５またはＤＱＢＩ遺伝子に特異性である維持オリゴヌクレオチドを用いて増幅した。維持またはタイプ１オリゴヌクレオチドブライマーは、維持ＤＮＡ配列の領域にアニールするが、これらの領域は凸座における既知の対立遺伝子間で同一であり、クラス■遺伝子の第２エクソンを迂回する。これらの維持プライマーは、非維持またはタイプ２プライマーとは逆に、ＤＲＢ、ＤＱＡＩおよびＤＱＢＩ座における全ての既知の対立遺伝子を、従って、特定のへテロ接合体におけるこれらの対立遺伝子の考えつる全ての組み合わせを増幅するために設計されている。タイプｌのオリゴヌクレオチドはテンプレートをオリゴヌクレオチドにより明確になっているもの以外の座で交差増幅せず（すなわち、ＤＱＡＩプライマーはＤＲＢまたはＤＱＢ１転写体を増幅せず、またその逆も起こらなかりた。）、予想されたように、ＤＲＢプライマーはさらにＤＲＢＩ以外に存在するＤＲＢ３、ＤＲＢ４またはＤＲＢ５転写体を増幅した。

これらの増幅されたテンプレートの配列化は、増幅プライマーによりｃＤＮＡの維持領域の内部から認識される配列へとアニールしているタイプニプライマーを用いて行なわれた。第１Ａ図は、この方法（ＳＥＴ）のための一般的な実験計画を、第１Ｂ図は成熟ＤＲＢ、ＤＱＡおよびＤＱＢのｍＲＮＡ分子上におけるｃＤＮＡ、ＰＣＲおよび配列化反応に用いられる各オリゴヌクレオチドの相対位置を示している。

これらのプライマーの配列化、それらが特異的である座、それらがアニールする特異的部位（コドン）およびそれらが用いられる反応は表Ｈに示されており、そこにおいて、凸座に対するｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　／　Ｐ　ＣＢ　／配列化反応に用いることができるプライマーの特異的な組み合わせが確認される。表■の説明文に注意書きされているように、示されているプライマーの組み合わせの内のいくつかは、通常ハブロタイブの残りと共に見いだされる予想される配列と合致しない特別な座に対する結果の確認において有用であろう別の組み合わせを表わす。各ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　／　Ｐ　ＣＲ反応は、通常側々のチューブ内で行なわれる。しかしながら、タイプ１のプライマーを用いる場合、全ての座（ＤＲＢ、ＤＱＡ、ＤＱＢ、ＤＰＡぼよびＤＰＢ）に対するｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　／　Ｐ　ＣＲ反応は同時に同じチューブ内で行なうことができる。凸座の生成物は別々のチューブ内で配列化される。上記のプロトコールに記載の条件に従って、配列プライマーと５ ′増幅プライマーの間の配列化はしごは、配列プライマー結合部位からの２〜１４塩基から始まって明確に読み取ることができるであろう。テストされた４３のホモ接合体細胞系からは、増幅されたＤＲＢ、ＤＱＢＩおよびＤＱＡＩのｃ　ＤＮＡの直接配列化分析において、例外的な増幅生成物または配列はしごは全く検出できなかった（表［［１ａ）。これらの細胞の各々によるハブロタイブからなる各クラスｎＨＬＡ座における特異的な対立遺伝子は表ｍｂに示されている。各細胞系に対して生じるはしごの数は常に、増幅プライマーの特異性により予想される数である（全ての細胞系に対して１つのＤＱＢＩおよび１つのＤＱＡ　ｌはしご、ＤＲＩおよびＤ’Ｒｗ８細胞系に対して１つのＤＲＢはしご、およびＤＲｗ５２およびＤ　Ｒｗ５３超定型群のハブロタイブに対して２つのＤＲＢはしご）。したがって、ホモ接合体タイピング系の分析から、ｃＤＮＡ合成、ＰＣＲおよび配列化反応に用いられるタイプ１のプライマーは全てのテスト対立遺伝子のそれらの凸座における正確な増幅および配列化を可能にすることが示された。

表ｌ１１ａに　た　、およ　Ａ　の　Ａ　せＣｅ１ｌ　Ｃ１ａｓｓ　ＩＩ　Ｃ１ａｓｓ　ＩＩＬｉｎｅ　ＨＬＡ−二ｒｍ　互兄ｈｊ旦立ふ　■ＬＡ１シ！傘傘ＳＡ　ＤＲＩ−Ｄｗｌ　３１　ＤＲＩ−Ｄｗｌ／ＤＲｗ１７ＭＺ０７０７８２　ＤＲＩ−０ｗ２０　Ｓ２　ＤＲＩ−Ｄｗｌ／ＤＲ４−０ｗ４ＫＡＳＯＬＩ　ＤＲｗｌ６−Ｄ胃２１　Ｓ３　ＤＲＩ−Ｄｗｌ／ＤＲｗ８．１傘ＣＡＬＯＧＥＲＯＤＲｗｌ６−Ｄｗ−Ｓ４　０８ｗ１５−Ｄｗ２／ＤＲｗ１７＊ＷＪＲＯ７６ＤＲｗｌ６−０ｗ２１　Ｓ５　０８ｗ１５−０ｗ２／ＤＲ４−０ｗ４＊ＤＭＥ　ＤＲｗｌ６−０ｗ２１／ＤＲ４Ｓ６　ＤＲｗｌ６−Ｄｗ２１／ＤＲｗ１７ＷＴ２４　ＤＲｗｌ６−０ｗ２１　Ｓ７　ＤＲ５ｘ６＠／ＤＲｗ１７ＲＭＬ　ＤＲｗｌ６−０ｗ２２　Ｓ８　申ＤＲｗ１３−ＤＷ１ｇ／ＤＲＷ１７ＳＣＨＵ　０８ｗ１５−０ｗ２　Ｓ９　ＤＲｗｌ３−Ｄｗ１９／ＤＲｗ１７ＷＴ８　０８ｗ１５−０ｗ２　ＳＩＯＤＲ４−Ｄｗ４／ＤＲｗ１７申ＡＭＡＩ　０８ｗ１５−０ｗ２　Ｓｌｌ　ＤＲ４−Ｄｗ４／ＤＲｗ１２Ｅ４１８１３２４　０８ｗ１５−０ｗ１２　Ｓ１２　ＤＲ４−Ｄ貰１３／ＤＲＩ−０ｗ１ＭＴ１４Ｂ　ＤＲ４−０ｗ１４　Ｓ１３　ＤＲ４−Ｄｗ１３／ＤＲｗ１７ＥＪ３２Ｂ　ＤＲｗ１７’５ＹＤ３　Ｓ１４　ＤＲ４−Ｄｗ１４／ＤＲｗ１５−０ｗ２ＲＳＨＤＲｗｌ８−ＤｗＲＳＨＳ１５　申ＤＲ４−Ｄｗ１５／ＤＲｗ１７ＤＥＵ　ＤＲ４−０ｗ４　Ｓ１６　ＤＲｗｌｌ−Ｄｗ５／ＤＲｗ１７ＷＴ５１　ＤＲ４ −０ｗ４　ＳＩＴ　０８ｗ１２／ＤＲＩ−ＤｗｌＪＢＡＦ　ＤＲ４−０ｗ１３　Ｓ１８　ＤＲｗ１２／ＤＲｗ８．ＩＹＡＲＤＲ４−ＤｗｌＯＳ１９　傘ＤＲｗ１４−Ｄｗ９／ＤＲｗ１７ＫＴ１７　ＤＲ４−ＤＫＴ２　Ｓ２０　ＤＲ７／ＤＲｗ１７ＳＰＯＯＩＯＤＲｗｌｌ−ＤＢ２　Ｓ２１　ＤＲ４−Ｄｗ４／ＤＲ７ＪＢＵＳＨＤＲｗｌｌ−０ｗ５　Ｓ２２　ＤＲｗ８．１／ＤＲ７ＴＩＳＩ　ＤＲｗｌｌ −ＤｗＴＩＳＩ　Ｓ２３　ＤＲｗ８．１／ＤＲ５ｘ６＠ＪＶＭ　ＤＲｗｌｌ−ＤｗＪＶＭ　Ｓ２４　ＤＲｗ８．２／ＤＲｗｌｌ−０ｗ５８Ｍ１６　ＤＲｗｌ　２ −ＤＲＢ　Ｓ２５　ＤＲｗ８．３／ＤＲＩ−Ｄｗｌ申ＨＯ３０１ＤＲｗｌ３−０ｗ１９　Ｓ２６　ＤＲｗ８．３／ＤＲｗ１５−Ｄｗ２ＷＤＶ　ＤＲｗｌ３−Ｄｗｌ８　Ｓ２７　ＤＲ９／ＤＲＩ−Ｄｗｌ’１１７４７　ＤＲｗｌ３−Ｄｗ１９ＴＥＭ　ＤＲｗｌ４−０ｗ９ＥＫ　ＤＲｗｌ４−Ｄｗ９ＡＭＡＬＡ　ＤＲｗｌ４−０ｗ１６ＬＢＦ　ＤＲ７−ＤＢＩＢＨＤＲ７−ＤＢＩＣＦ９６　ＤＲ７−０ｗ７ＢＥＲＤＲ７−０ｗ７ＤＢＢ　ＤＲ７−ＤｗｌｌＭＯＵ　ＤＲ７−Ｄｗ１７ＢＴＢ　ＤＲｗ８−０ｗ８．１０ＬＧＡ　ＤＲｗ８−０ｗ８．２ＬＵＹ　ＤＲｗ８−０ｗ８．３ＴＡＢＯ８９ＤＲｗ８−０ｗ８．３ＤＫＢ　ＤＲ９−Ｄｗ２３配列決定したハブロタイブに対するＤＲＢ、ＤＱＡＩおよびＤＱＢｌ座における対立組成は、別途記載がない場合には、十分に特性づけられた同型接合細胞系統から読み取った配列情報に従って、期待したものと一致した（＊）。

＊　ハブロタイブは新たな対立配列（ＤＲＢＩ、ＤＲＢ３、ＤＱＡｌまたはＤＱＢＩ座）を保持する。

本　試験を行った異型接合体の組合せだけを記載した。試験を行った４０対象の残部は、同型接合体であるか、または、この表記載のハブロタイブを保持していた。

＠　血清学的情報、ＲＦＬＰ情報および配列情報に従って、このＤＲＢ特異性（ＤＲ５Ｘ６）を、任意に指定したものに与えた。

ｈｓ　篭　蔽　− ９１Ｋ　＊　ｇ　Φ ＨｉｊｔＭ　−、ｘ情ａ’ａ’ｘｉ　唖司く　ロ　帳　馴ａ博　＜　Ｃ’Ｓ　ロロ！ｌ１２ａ　むし　Ｏｂ！Ｉ　＋：１　−〇　ラｊＮ匂　、Ｓ＊。

祷　栃！ＩＩｃＱ　瓢き　レロ扁　、１１へ　置０馴−ロ　Ｕ９　ｂｕ＋１　倒　０９　！！！ａＱｈ　、ＡＪ　實　１ｊ　へρ ｔ！々Ｗｉ　マ　Ｃる　；似２、ＨＬＡタイプが　で　る　にお番るＤＱＡＩ通常のＨＬＡタイピング技術により定義されるほとんどのＨＬＡクラスＨ対立遺伝子特異性に対して、ＤＮＡ配列が決定されてきた［Ｍａｒｃｈ、　Ｓ、Ｇ、Ｅ、、　Ｂｏｄｍａｒ。

Ｊ、Ｇ、　ＨＬＡ−ＤＲＢ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｃｌｏ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ。

１９９０、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　３１：１４１，１９９０；Ｔｏｄｄ、Ｊ＋Ａ、、Ｂｅ１ｌ、Ｊ、１．、ＭｃＤｓｆｖｉｔｔ。

Ｈ，Ｏ，：　ＨＬＡ−ＤＱＢ　ｇａｎｅｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ　ｔ。

５ｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔ。

１ｎＳｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｄｉａｂｅｔｅｓ　ｍｅｌｌｉｔｕｓ。

Ｎａｔｕｒｅ　３２９：５９９．１９８９］。これらの配列を比較することにより、特定のＤＱＡＩまたはＤＱＢＩホモ接合体またはへテロ接合体対立遺伝子の組み合わせが特異的な配列化はしごにより特徴付けられることが示される。

４０人の異なる被験者のＰＢＭＮＣから得られる全ＲＮＡをテストし、ＤＱＡＩおよびＤＱＢ　１ホモおよびヘテロ接合体の対立遺伝子の組み合わせが、タイプ１のプライマーを用いた直接増幅化および配列化により正しく決定できるかかどうかを評価した。これらの被験書違は予め血清学的にタイプ付けされていたが、このタイピング情報は、配列結果からのクラス■対立遺伝子特異性テストを担当する研究員には知らせなかった。これら４０人の被験書違は２７の異なるヘテロ接合体の組み合わせからなっていた（表■）。全ての個体について、血清学的表現型と一致するＤＱＡＩおよびＤＱＢＩ対立遺伝子配列を調べた。テストされる全てのへテロ接合体において、両対立遺伝子の配列が混成配列パターンがら明確に読み取ることができた。特定のＲＦＬＰ結合パターンがあるヘテロ接合体対立遺伝子組み合わせに対応するのと同様に、特殊なヘテロ接合体の組み合わせ毎に独特なパターンが見いだされる。例えば、ＤＱＢ２／ＤＱＢ１．ｌへテロ接合体においては、特殊な対立遺伝子の組み合わせによるものであるとされるコドン４５〜４９において配列ＧＧＧ　（Ａ／Ｔ）Ｔ（Ｔ／Ａ）ＣＣＣＧＧＣ（Ａ／Ｇ）が見出されるであろう。実際に、ヘテロ接合体配列化はしごの転写は、例えばコドン４６の第２塩基（そこでは、ＤＱＢｌｌｋ０２０１が唯一のＡを有する対立遺伝子である）のように対立遺伝子特異性塩基が見いだされると考えられる特定の冬型性部位を読み取ることから始まる。

２種の可能なテンプレートの配列は、そこで推定され、異なる座において全ての既知の対立遺伝子の配列と比較される。ｉｆ！３Ｗにおいて、我々は、ＤＱＢ１＊０２０１／ＤＱＢ１＊０３０２ヘテロ接合体に対応する重複はしごを示すが、そのパターンの転写ははしごのわきに示される。

したがって、特定の対立遺伝子または対立遺伝子の組み合わせに対する予想したバンドが存在しないこと、あるいは予想しないバンドが存在することは、配列異質性、すなわち新しい対立遺伝子の存在を示唆する。適当なプライマーの組み合わせが用いられる場合（表■）、ＤＰＡＩおよびＤＰＢＩタイピングにおいても同じことが言える。例えば、コドン４６の第２塩基におけるＡの置換は、ＤＱＢｌ＊０２０１の配列変体の存在を強く示唆する。一度検出されれば、その変体の配列は、その選択的増幅の後に、あるいは増幅された生成物のサブクローニングによつて確認できる。

上記したように、タイプ１プライマーを使用することにより、ＤＱＡＩおよびＤＱＢ対立遺伝子の全てのへテロ接合体の組み合わせの明確な配列化が可能になる。適当なプライマーの組み合わせが用いられる場合（表ＩＩ）、ＤＰＡＩおよびＤＰＢ　１タイピングに対しても同じことが言える。ＤＲＢ遺伝子のアイソタイプの複雑さく特定のハブロタイブによる一つ以上のＤＲＢ座の発現）により、タイプニプライマーを用いたＤＲＢヘテロ接合体から得られるｃＤＮＡの増幅および配列化が、４以上の重複はしごを生じ、それゆえ、複雑な配列パターンを生じるのである。

上記においてテストされた同じ４０人からのＤＱＡＩおよびＤＱＢＩ遺伝子に対するＤＲＢ　ｃＤＮＡが増幅され、ＤＲＢ特異性タイプ１プライマーを用いて配列化された。上記したように、これらの４０人は２７の異なるヘテロ接合体の組み合わせからなり、４以上の配列化はしごを生じるであろう複雑なりＲＢ対立遺伝子群の各々からい（つかずつの例を含有している。タイプ１プライマーを用いて生じるＤＲＢ配列化はしごは、ＤＱＡＩおよびＤＱＢ　ｌ座ついて上記したようにして分析した。高度に冬型性である部位は、まず、特異的な対立遺伝子または対立遺伝子群（すなわち、ＤＲ４）に独特なバンドの存在を分析し、配列を推定し、全ての座における全ての既知の対立遺伝子の配列と比較した。例えば、第３図において、複雑なりＲＢヘテロ接合体を配列化することにより生じるはしご（４種の重複はしご）をされ、複雑な配列パターンからなる各対立遺伝子タイプとして定めた。一つ以外の全てのサンプルについてこれらの配列化実験から推測される情報は、上記したように、遺伝子の直接配列化によって得られる対象である被験者のＤＱＡＩおよびＤＱＢ　１対立遺伝子タイプとだけでなく、これとは別に決定したその被験者の血清学的表現型とも合致した。合致しないサンプルは、血清学的にはＤＲｗ１３／ＤＲ４としてタイプ付けされてきたが、配列化分析によりＤＲｗ１３／ＤＲｗ８−Ｄｗ８．１とタイプ付けされた。実験を繰り返すことにより、ＤＲＢ１＊０４０１対立遺伝子の代わりにＤＲＢｌ＊０８０１対立遺伝子が存在することが確認され、従って、我々は血清学的タイピングは誤りであると考える。４０の全ての場合において、全てのＤＱＢ　ｌ、ＤＱＡＩおよびＤＲＢ　ｌテンプレートは、タイプ１プライマーを用いることにより、同じような効率で等しく増幅、配列化されていた。ＤＲＢ３、ＤＲＢ４およびＤ　ＲＢ５配列化はしごは、一つの場合を除いて全て読み取ることができた（ＤＲ８３＊０１０１［ＤＲｗ５２ａｌ配列は、最初はＤＲｗ１３／ＤＲｗ１７ヘテロ接合体には観察されなかった。）。ＤＲＢ３＊０ＩＯＬはＤＲＢｌｌｋ０３０１と不安定に連結しているので、前者の対立遺伝子は重複はしごにも見いだされると予想された。誤りをできるだけ除外するために、配列化はしごからのＨＬＡタイピングを担当する研究書違はこの個体のタイピングを繰り返し行なったが、この繰り返し行なわれた実験において、ＤＲＢ３＊０１０１は読み取ることができた。

タイプｌプライマーの使用により得られた結果は血清学的表現型と一致したが、タイプ１プライマーの独占的な使用は、考えつる全てのへテロ接合体において発現された多座に特異的なはしごの各々に対応するためのあらゆる場合に許されるものではないだろう。以下に、タイプｌプライマーを独占的に使用することにより処理できない最も複雑な場合を記す。すなわち、ｌ）あるヘテロ接合体における興なるＤＲ４対立遺伝子配列間の区別（それらは、数個のヌクレオチド塩基対が異なるだけであり、そのような差異は補追的なはしごの存在により隠蔽することができる−　）；２）ＤＲＢｌ＊１６０１とＤＲＢｌ＊１５０２とを区別すること（それらの配列はの差異はそれらの連結したＤＲＢ５対立遺伝子により隠蔽されるであろう、）；３）ＤＲＢ１＊１３０１とＤＲＢ１＊１３０２　（それらはコドン８６においてのみ異なる）を区別すること（この差異は他のはしごにより隠蔽することができる）；そして最後に、４）特異的なヘテロ接合体の組み合わせにおけるＤＲＢ１＊０３０１とＤＲＢＩＩｋ０３０２の区別が挙げられる。

このようにして、我々は、ＤＲＢを処理するためのより有益な実験法を開発してきた。この実験法は非維持（タイプ２）プライマーの追補的な使用からなるものであるが、個体が有するであろう４つのＤＲＢ配列の最も複雑な組み合わせでさえも明確に解明することができる。これらの非維持プライマーは、対立遺伝子特異性プライマーとは逆に、タイプ１プライマーを用いた反応と同時に行なわれる反応に用いられるために設計され、かつ、タイピングの予備情報なしに、特定のはしごを複雑な配列パターンから選択的に増幅することを目的としている。

ＤＲＢ遺伝子の第２エクソンの配列の変異性の分析は、非維持（タイプ２）プライマーを設計するために用いられるであろう二つの領域：１）コドン５〜１３および２）コドン２９〜３５の同定を可能なものにしてくれる。前者の領域の配列は群特異的配列パターン、すなわち、個人の座における対立遺伝子の群により共有される配列に従う、後者の領域はＤＲＢＩおよびＤＲＢ　３、ＤＲＢ４およびＤＲＢ５遺伝子においてバラバラなヌクレオチド多型性を示す。我々は、これら二つの冬型性領域にアニールしている５種の異なる非維持プライマーを設計した。すなわち、１）ＤＲＢ２３　（ＤＲ２−ＤＲＢＩはしごに特異的）；　２）ＤＲＢ２４（ＤＲｗ１７−５ＤＲｗ１８−１ＤＲｗ１３−１ＤＲｗ１４　＋、　ＤＲｗ　１１−１Ｄ１−１ＤＲおよびＤＲｗ８−ＤＲＢＩはしごに特異的）；　３）ＤＲＢ２５　（ＤＲ４−ＤＲＢＩはしごに特異的）；４）ＤＲＢｌ６；および５）ＤＲＢｌ７であり、後ろ２つのプライマーは適度な冬型性の第２の領域（多座に対する既知の対立遺伝子間で異なる１〜５ヌクレオチド）にアニールする（表工および■）。これらのプライマー間では性質およびミスマツチの分布が異なり、ＤＲＢテンプレートも異なるので、これらのプライマーにより選択的に増幅されるテンプレートのタイプは異なるであろう、初めの３つのプライマーは、与えられたどのようなヘテロ接合体においても、２つ以上のＤＲＢＩ　ｃＤＮＡを増幅し、ＤＲＢ３、ＤＲＢ４またはＤＲＢ５　ｃＤＮＡは全く増幅しないであろう、これとは対照的に、プライマーＤＲＢ１６およびＤＲＢｌ７を使用すれば、はとんどのへテロ接合体の組み合わせにおける、特定の転写体のＤＲＢｌ、ＤＲＢ３、ＤＲＢ４および／またはＤＲＢ５座からのランダムな選択的増幅が可能になるであろう。

したがって、我々は、その組み合わせがＤＲＢタイピングに対して最もよく区別できる結果を与えることができるか決定するために、これらのプライマーをテストした。さらに、これらのプライマーの配列は、既知のＤＲＢ対立遺伝子の配列と異なるＤＲＢ座において０〜１２のミスマツチを有するので、それらを使用することにより、プライマーとＤＲＢ転写体のそのような選択的増幅が必要とされる可能な各ｃ　ＤＮＡとのミスマツチの数が決定できる。ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　／　Ｐ　ＣＲ／配列化反応に用いられる特異的なプライマーの組み合わせは上記表Ｈに示す。この分析による結果を以下に示す。

表Ｖ２のオ雪ゴヌ　レオ　０　＃に　）　ＲＢＣＤＮＡ　Ｄ　ＢＩＣＤＮＡの７　５ｅｌｅｃｔｅｄ　Ａ１１ｅｌｅｓ　助」二匡虹ＤＲＢ１＊１３０１．ＤＲＢ３拳０１０１／ＤＲＢＩ・１６０１．ＤＲＢ５傘０２０１　ＤＲＢｌｌｌｌｉｏｌ　ＤＲＢｌｌ＋ＤＲＢＩ傘１３０１．ＤＲＢ３◆０１０１／ＤＲＢＩ傘０８０１　ＤＲＢ１＊０ＪＩＯＩ　ＤＲＢ１６ＤＲＢ１＊０３０１．ＤＲＢ３申０１０１／ＤＲＢＩ拳１６０１．ＤＲＢ５傘０２０１　ＤＲＢ１＊１６０１　ＤＲＢ１６ＤＲ５ｘ６．ＤＲＢ３＊０１０１／ＤＲＢｌ傘０８０１　ＤＲＢｌ傘０８０１　ＤＲＢｌＧＤＲ５ｘ６．ＤＲＢ３傘０１０１／ＤＲＢ１＊０８０１１　ＤＲＢ３傘０１０１　ＤＲＢ１７ＤＲ５ｘ６．ＤＲＢ３＊０１０１／ＤＲＢＩ　中０３０１．ＤＲＢ３ＬＯ１０ｆ　ＤＲ５Ｘ６　ＤＲＢ１６ＤＲＢＩψ１１０１．ＤＲ１１３−０２０１７ＤＲ８１１１５０１，ＤＲＢ５◆０１０１　ＤＲＢ３傘０２０１　ＤＲ１１２８ＤＲＢ１＊１１０１．ＤＲＢ３牟０２０１／ＤＲＢ１＊１６０１．ＤＲＢＳ＊０ＩＯＩ　ＤＲＢ６牟０１０１　ＤＲＢ１７牟ＤＲＢ１＊１２Ｄ１．ＤＲＢ３拳１１２０１／ＤＲＢ１＊１１０１．ＤＲＢ３・０２０１　ＤＪＩＢ１＊１１０１　ＤＲＢ１６ＤＲＢＩ傘１２０１．ＤＲＢ３傘０２０１／ＤＲＢＩ傘１１（１１，ＤＲＢ３＊０２０１　ＤＲＢ１＊１２０１＋ＤＲＢ３傘０２０１　ＤＲaＩ？ＤＲＢＩ傘０４０Ｓ、ＤＲＢ４傘０１０１／ＤＲＢＩ拳０３０１．ＤＲＢ３傘０１０１　ＤＲＢ１＊０４Ｏ５＋ＤＲＢ４＊１１１０１　ＤＲa１６ＤＲ５ｘ６．ＤＲＢ３＊０１０１／ＤＲＢｌ傘１１０１．ＤＲＢ３＊０２０１　ＤＲＢ１傘１１Ｑ１＋ＤＲ５ｘ６　ＤＲＢｌＧＤＲＢＩ・１５０１．ＤＲＢ５＊０ＩＯＩ　ＤＲＢＩ傘１５０１　ＤＲＢ１１ｉＤＲＢＩ中１６０１，０ＲＢＳ傘０２０１／ＤＲＢＩＩ０４０１．ＤＲＢ４ψ０１０１　ＤＲＢ１１０４０１＋ＤＲＢＳ中０２０１　０ＲＢP７ＤＲＢ１１１６０１．ＤＲＢ５傘０２０１／ＤＲＢ１１０４０１．ＤＲＢ４傘０１０１　ＤＲＢＩ傘１６Ｑ１＋ＤＲＢｉ中０４０１　ＤＲＢP６傘＄ＤＲＢ１＊１６０１．　ＤＲＢＳ＊０２０１　ＤＲＢＩ傘１６０１　ＤＲＢ１６ＤＲＢＩ傘１６０１．ＤＲＢＳ＊０２０１　ＤＲＢＳ＊０２０１　ＤＲＢＩ）ＤＲ８１＊１６０２．ＤＲＢＳ＊０２０２　ＤＲＢ１＊１６０２　ＤＲＢ１ｇＤＲＢＩ参０４０１．ＤＲＢ４傘０１０１　ＤＲＢ４傘０１０１　ＤＲＢ１６ＤＱＢｌ傘０６０４／ＤＱＩｌｆ＊０５０２　ＤＱＢＩ会＋１６０４　ＤＣ１８５ＤＱＢｌ傘０３０１／ＤＱＢｌ＊０１０１　ＤＱＢｌ傘０３０１　ＤＱＢ６ＤＱＢ１傘０３０１／Ｄ０８１参０１０１　ＤＯＢＪＩＳＯＩ　ＤＯＢ１４ＤＱＢｌ＊０２０１／ＤＱ！１１＊０６０３　ＤＱＢ１傘０２０１　ＤＱＢ６ＤＱＢＩ中０６０４／ＤＱＢＩ中０３０１　ＤＱＢＩ中０６０４　０ＱＢ１５ＤＱＢ１＊ｌ＋３０１／ＤＱＢＩ中Ｏ５［１２ＤＱ！１１＊０３０ｔ　ＤＱＢ８ＤＱＢＩ中０６０３／ＤＱＢＩ傘０１０１　ＤＱＢｌ＊０６０３　ＤＱＢ６ＤＱＢ１＊０６０３／ＤＱＢＩＩＯＩＯＩ　ＤＱＢＩ傘０５０１　ＤＱＢ１４ＤＱＢ１＊０２０１／ＤＱＢＩＩＯＩＯＩ　ＤＱＢＩ命０５０１　０ＱＢ１４０ＱＢＩＩ０２０１／ＤＱＢＩ傘０３０２　ＤＱＢＩ傘０２０１／ＤＱＢＩ傘０３０２　ＤＱＢＩｉ傘傘傘ＤＱＢ１＊０２０１／ＤＱＢＩ傘０＋０２　ＤＱＢＩ傘０２０１　ＤＯＢ６簡潔さを図るため、この表では、プライマーが十分に対合する上述の対立遺伝子を欠いているハブロタイブの代表的な例しか示していない（表４１１照）、これらのプライマーが特に認識する対立遺伝子を保持する同型接合体に使用された場合は、常に、これらの対立遺伝子が選択的に増幅された。上述の表中に示した例において、非保存プライマーは、そのプライマーに対する配列に近い鋳型を選択的に増幅した。上述のハブロタイブから成るＤＲＢ対立遺伝子とＤＱＢＩ対立遺伝子は、後述の「ハブロタイブ」に示した９選択された対立遺伝子および使用したプライマーは、別の欄に記載した。２以上の固体をこの表記載の異型接合体の組合せのいくつかに対して試験した。

＊鋳型ＤＲＢ５＊０１０１Ｊ３よび鋳型ＤＲＢ３＊０２０１は、プライマーＤＲＢ　Ｉ　１７と−か所誤対合している。このプライマーに関しては、鋳型ＤＲＢ５＊０１０１を選択することによって、誤対合という差別的な位置決定に関連したのではないかと考えられる。

木本弱い鋳型ＤＲＢ４＋ｋＯ１０１も認められた。

木本＊上述の２つの対立遺伝子ＤＱＢ　１間の誤対合が存在するにも係わらず、プライマーＤＯＤＱＢ６はそれら２つの対立遺伝子を選択することができなかった。

これらのプライマーは、特定のＤｉ’（Ｂテンプレートを、テストされる全てのへテロ接合体の組み合わせにおいて選択的に増幅できた。これらのプライマーがマツチする対立遺伝子を有するヘテロ接合体において、これらの対立遺伝子は選択的に増幅されたが、一方、これらのプライマーによって特異的に認識される対立遺伝子を有さないヘテロ接合体においては、プライマーとのねじりのある塩基対ミスマツチを有するＤＲＢテンプレートがＰＣＨにおいて選択的に増幅した。

後者の具体例は表Ｖおよび第４図に示す０表Ｖに示されるように、タイプ２プライマーは、対立遺伝子のｃＤＮＡの組み合わせ（互いに１ヌクレオチド置換程度に異なっている）からのＤＲＢ転写体を特異的に増幅できたが、ＰＣＲでは非常に厳しいアニーリング条件（５５℃でのアニーリング）が用いられることを規定した０例えば、ヘテロ接合体の組み合わせＤＲｗｌ　３／ＤＲｗ８−Ｄｗ８．１に２いては、ＤＲ８１６オリゴヌクレオチドブライマーにより、ＤＲＢ１＊０８０１対立遺伝子（プライマーと３つのミスマツチ〕がＤＲＢ１＄１３０１およびＤＲＢ３＊０１０１遺伝子（それぞれ、プライマーと４つのミスマツチを有する。）に対して選択された。

ＤＲＢ３＊０１０１またはＤＲＢ３本０２０１およびＤＲＢ５＊０１０１遺伝子にはプライマーＤＲＢ１７どの一つのミスマツチが潜んでおり、このオリゴヌクレオチドはＤＲｗｌｌ／ＤＲｗ１５ヘテロ接合体においてＤＲＢ５本０１０１配列を選択した（表ｖ）、このオリゴヌクレオチドにより認識される配列内のミスマツチの特異的な配置も、プライマー／　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ複合体の安定性に影響し、従って、ＰＣＨの結果にも影響する、と言うことができる。

ＤＱＢＩ遺伝子について、非維持プライマーの、ペテロ接合体の組み合わせにおける特定の対立遺伝子の選択能についてもテストした（表Ｖ）、ＤＲＢ特異性タイプ２プライマーについて、非維持プライマーを用いたベテロ接合体における単一のＤＱＢＩ対立遺伝子の選択的な増幅を達成するためには、ＰＣＨのアニーリング工程において高温（５５℃）を採用することが必要でｂりた。

例えば、プライマーＤＱＢ６のアニーリングがＤＱＢ１＊０３０１／ＤＱＢ１＊０５０１およびＤＱＢ　１　＊０２０１／ＤＱＢ　１本０６０３ヘテロ接合体からのｃＤＮＡにおいて３７℃で進行できる場合、両へテロ接合体における両対立遺伝子は等しく増幅された。

５５℃では、５′プライマーと最も相同性のある配列を有する対立遺伝子はＰＣＲ以上に増幅された。プライマーとは２つのヌクレオチドだけでな（相対位置も異なる対立遺伝子の組み合わせも、非維持プライマーで特異的に増幅される０例えば、プライマーＤＱＢ６は一１ＤＱＢＩ　＊０６０４／ＤＱＢ　ｌ＊０５０２ヘテロ接合体においてＤＱＢ　１本０６０４配列を選択した（表ｖ）。

５つのヌクレオチドがＤＱＢｌ＊０６０４対立遺伝子とＤＱＢ６プライマーとの２つのミスマツチを分け、わずか２つのヌクレオチドがＤＱＢｉ＊０５０２とプライマーとのミスマツチを分けた。

この結果から、標的ｃＤＮＡの５′末端で冬型性領域にアニーリングするオリゴヌクレオチドプライマーは、複雑なペテロ接合体の組み合わせにおける限定数のＤＲＢまたはＤＱＢテンプレートの複写可能な選択的増幅が達成できるように仕立てることができることが明確に示されている。タイプ１プライマーの使用は、全ての可能なりＱＡ％ＤＱＢ、ＤＰＡおよびＤＰＢヘテロ接合体の明白な配列化を可能にするが、そのようなアプローチでは、全てのＤＲＢヘテロ接合体に対する完全な識別化情報は得られないであろう、我々は、ＤＲＨに対してタイプｌとタイプ２のプライマーを同時に使用することにより、全てのＤＲＢヘテロ接合体の組み合わせの最も複雑なものでさえも明確に解明されることを示してきた。タイピングするためにＤＲＢ−３ＢＴが用いられる場合には、３つのタイプ２の反応（ＤＲＢ２３．２４および２５を用いる）をタイプ１の反応と同時に行なう（表■）、これらのプライマーを用いたこれらの反応を同時に使用すれば、−通りの操作で完全なりＲＢタイピングに対して最大の識別力が発揮され、しかも、新規な配列化へテロ接合体の同定が可能になる。たった一つのタイプｌの反応がＤＱＢＩ、ＤＱＡｌ、ＤＰＡＩおよびＤＰＢＩそれぞれに必要とされる（表■）。

個体の大きな個体群の配列串型性に対する慣例的なＨＬＡタイピングは、ここで報告されている実験計画（これは、未知の対立遺伝子変体を予め同定することもできる。）を使用することにより行なうことができる。

第２Ａ図および第２Ｂ図は、ＨＬＡタイプがわかっていない個体の配列の対立性を決定するために用いられる慣例的なプロトコールのフローチャートを示す。

１、ＲＮＡ　テンプレートとして　いたｃＤＮＡ、ＰＣＲおよ　におｌるブラ　マーの　わ艶ｍｃＤＮＡ分子を合成するために、本発明では、逆転写、増幅および配列化されるべき遺伝子ｍ　ＲＮＡの維持領域とアニールする一本鎖ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。これらのオリゴヌクレオチドブライマーとしては：　（１）全てのＤＲＢ座において全ての対立遺伝子が共有する維持領域（コドン１０５〜１１１）とアニールし、後者がそレソレＤＲＢ１．ＤＲＢ３、ＤＲＢ４およびＤＲＢ５であるオリゴヌクレオチド配列（例えば、プライマーＤＲＢ２０）（但し、ＤＲＢタイピング用に、４つ同時のｃＤＮＡ反応（チューブ当たり１反応）を行なう力５、全ての反応がプライマーＤＲＢ２０を用しＡる。）（表■および第２Ａ図における反応Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）；（２）ＤＱＢ座において全ての対立遺伝子カ５共有する維持領域（コドン１０５〜１１１）にアニールするオリゴヌクレオチド配列（例えばプライマーＤＱＢ７）（表■いて全ての対立遺伝子が共有する維持領域（コドン１４７〜１５７）にアニールするオリゴヌクレオチド配列（例えばプライマーＤＱＡ９）（表■および第２Ａ図における反応Ｆ）；　（４）ＤＱＢ座におし飄て全ての対立遺伝子が共有する維持領域（コドン１０５〜１１１）ｌこアニールするオリゴヌクレオチド配列（例えばプライマーＤＰＢＩＩ）（表■および第２Ａ図における反応Ｇ）ｉ　（５）ＤＰＡ座において全ての対立遺伝子が共有する維持領域（コドン１０４〜１１０）にアニールするオリゴヌクレオチド配列（例えばプライマーＤＰＡ１４）（表■および第２Ａ図における反応Ｈ）；（６）ＤＰＡ座において全ての対立遺伝子が共有する維持領域（コドン２２２〜２２８）にアニールするオリゴヌクレオチド配列（例えばプライマーＤＰＡ１９）（表■および第２Ａ図における反応工）が挙げられる。これらの各反応に一度特異的なオリゴヌクレオチドを添加した。増幅および配列化を行なうためにｃＤＮＡ合成を行ない、その生成物を表■および第２図、さらに以下に記載する。

各染色体の発現されたＤＲＢ座の各々に相当するｃ　ＤＮＡ分子（ＤＲＢＩおよびＤＲＢ３またはＤＲＢ４またはＤＲＢ５．ハブロタイブルアイソタイプの複雑さ〜に対応）を増幅するために、コドン−３２〜−２０にアニールする維持オリゴヌクレオチドブライマー（例えばオリゴヌクレオチドＤＲＢ　１１）を、ＤＲＢ遺伝子に対応するｃＤＮＡ合成反応が行なわれている４本のチューブの内の一つに添加する。ｃ　ＤＮＡ合成反応プライマーと新たに添加した維持プライマーを組み合わせることが、与えられた個体により発現される全てのＤＲＢ座における全ての対立遺伝子を増幅するために採用される。ＤＲＢ　ｃＤＮＡ生成物を含有する残り３本のチューブは各々は、コドン７〜１３に対して（例えばプライマーＤＲＢ２３）、５〜１１に対して（例えばプライマーＤＲＢ２４）、６〜１３に対して（例えばプライマーＤＲＢ２５）それぞれアニールしている３つの異なる非維持オリゴヌクレオチド（タイプ２とも呼ばれる。）の内のそれぞれ一つを受け取る。各非維持プライマーは、ＤＲＢｌ座における対立遺伝子の興なる群に対応するｃＤＮＡの増幅を容易にするために設計される。

これら４つの反応により生じる配列化はしごの比較により、与えられた個体により発現される４つの可能な各ＤＲＢ遺伝子に対応する配列の完全かつ正確な転写が可能になる（各父系染色体に対して１つまたは２つ）。

ＤＱＢＩ座について、与えられた個体内で発現される各ＤＱＢ　１遺伝子の増幅にはＤＱＢ　ｃＤＮＡのコドンｌ〜７にアニールする維持オリゴヌクレオチドブライマー（例えばプライマーＤＱＢ　１３）が用いられる（各父系染色体に対して一つ）、ＤＱＡＩ座の場合、与えられた被験者内で発現さ−れる各ＤＱＡＩ遺伝子の増幅に有用な維持−木調ＤＮＡオリゴヌクレオチドブライマーが、ＤＱＡＩ　ｃＤＮＡのコドン−１０〜−４にアニールする（例えばプライマーＤＱＡＩ　Ｏ）、ＤＰＢ　ｌ座については、コドン−１９〜−１３にアニールしている維持オリゴヌクレオチド（例えばプライマーＤＰＢＩＯ）が、与えられた被験者内で発現される各ＤＰＢＩ遺伝子２３〜−１７にアニールしている維持オリゴヌク、レオチド（例えばプライマーＤＰＡ　１５）が、与えられた被験者内で発現される各ＤＰＡＩ遺伝子の増幅に用いられる。別々の反応において、個体中で発現された各ＤＰＡＩ遺伝子を増幅するために、ＤＰＡＩ　ｃＤＮ、Ａのコドン５９〜６５のアニールしている維持プライマーＤＰＡ１８が、ｃＤＮＡプライマーＤＰＡ　ｌ　９と組み合わせて用いられる。この第２のＤＰＡＩ反応はこの遺伝子の第２の多型性領域を標的とする。

ＤＲＢ座に対応するポリメラーゼチェーンリアクション生成物の直接配列化において有用なプライマーとしては、ＤＲＢ座において全ての対立遺伝子のコドン８７〜９４にアニールしているアンチセンスオリゴヌクレオチドブライマー（例えばＤＲＢ１２）が挙げられ、このプライマーは第１の４つのＤＲＢ反応による生成物の配列化に用いられる。他の３つのＤＲＢ反応により生じるポリメラーゼチェーンリアクション生成物の直接配列化について、ＤＲＢ　ｌ座において全ての対立遺伝子のコドン９７〜１３０にアニールしているアンチセンスオリゴヌクレオチドが用いられる（例えばプライマーＤＲＢ３０）、これら３つのＤＲＢ反応において異なる配列化オリゴヌクレオチドを使用することにより、実施例の配列化プライマーＤＲＢ１２を用いる第１のＤＲＢ反応においては見られないＤＲＢＩ遺伝子の下流の多型性領域の読み取りが可能になる。ＤＱＢＩ座に対応するポリメラーゼチェーンリアクション生成物の直接配列化に有用なプライマーとしては、この座において全ての対立遺伝子のコドン７８〜８３にアニールしているアンチセンスオリゴヌクレオチドブライマー−（例えばプライマー〇ＱＢ５）が挙げられる。ＤＱＡＩ座に対応するポリメラーゼチェーンリアクション生成物の直接配列化には、この座において全ての対立遺伝子のコドン８８〜９５にアニールしているアンチセンスオリゴヌクレオチドブライマー（例えばプライマーＤＱＡ２９）が含まれる。ＤＱＢＩ座に対応するポリメラーゼチェーンリアクション生成物の直接配列化には、この座において全ての対立遺伝子のコドン１２／−５にアニールしているセンスオリゴヌクレオチドブライマー（例えばプライマーＤＱＢ　１３）が含まれる。プライマーＤＰＡ１４およびＤＰＡＩ５を用いるＤＰＡＩ反応に対するポリメラーゼチェーンリアクション生成物の直接配列化については、この座において全ての対立遺伝子のコドン８８〜９４にアニールしているアンチセンスオリゴヌクレオチドが用いられる（例えばプライマーＤＰＡ１６）。

プライマーＤＰＡ１９およびＤＰＡＩ８を用いるＤＰＡ　１反応に対するポリメラーゼチェーンリアクション生成物の直接配列化については、この座において全ての対立遺伝子のコドン２１４〜２２０にアニールしているアンチセンスオリゴヌクレオチドが用いられる（例えばプライマーＤＰＡ２０）。

２、ＤＮＡテンプレート　いたＰＣＲおよびにおするプライマーの　わせの各染色体の各ＤＲＢ座に対応するＤＮＡ分子を増幅させるために、イントロン３の塩基対１８〜３８にアニールしている維持アンチセンスオリゴヌクレオチドブライマー（例えば、オリゴヌクレオチドＤＲＢ１４０６）を、４本の各ＰＣＲ反応チューブに添加する（表■および第２Ｂ図における反応Ｓ、Ｖ、ＴおよびＵ）、これら４本のチューブの各々は、コドン−４〜＋３に対して（例えばプライマーＤＲＢ２２）、　コドン７〜１３に対して（例えばプライマーＤＲＢ２３）、５〜１１に対して（例えばプライマーＤＲＢ２４）、６〜１３に対して（例えばプライマーＤＲ８２５）それぞれアニールしている異なる追補オリゴヌクレオチド（例えば、プライマーを受け取る。第１の反応は、与えられる個体が有する全てのＤＲＢ座における全ての対立遺伝子を増幅するために用いられる。残り３つの反応はそれぞれ、ＤＲＢＩ座における対立遺伝子の異なる群に対応するＤＮＡの増幅を容易にするために設計される。ＲＮＡテンプレートについては、これら４つの反応により生じる配列化はしごの比較により、与えられた個体により発現される４つの可能な各ＤＲＢ遺伝子に対応する配列の完全かつ正確な転写が可能になる（各父系染色体に対して１つまたは２つ）。

ＤＱＢＩ座について、与えられた個体が有する各ＤＱＢＩ遺伝子の増幅には、コドン８８〜９４に対して（例えばプライマーＤＱＢ９３２）、またはコドン１１〜１７に対して（例えばプライマーＤＰ８９３１）アニールする二つの維持オリゴヌクレオチドブライマーが用いられる（各父系染色体に対して一つ）　（表■ および第２Ｂ図における反応Ｗ）、ＤＱＢｌ座については、与えられた被験者が有する各ＤＰＢＩ遺伝子を増幅するために、二つの維持オリゴヌクレオチド（例えばイントロン２の塩基対−４２〜−６２にアニールするＤＰＢ１４のようなプライマー、および例えばイントロン３の塩基対３９〜５９にアニールするＤＰＢ１５のようなプライマー）が用いられる（表■および第２Ｂ図における反応Ｘ）、ＤＰＡＩ座については、与えられた被験者が有する各ＤＰＡ　１遺伝子を増幅するために、ＤＰＡＩＯ（イントロン２の塩基対−６９〜−５０にアニールする）やＤＰＡＩＩ（イントロン３の塩基対５５〜７１にアニールする）のような維持オリゴヌクレオチドが用いられる（表■および第２Ｂ図における反応Ｙ）。

ＤＲＢ座に対応するＤＮＡテンプレートからのポリメラーゼチェーンリアクション生成物の直接配列化において有用なプライマーとしては、ＤＲＢ座において全ての対立遺伝子のコドン８７〜９４にアニールしているアンチセンスオリゴヌクレオチドブライマー（例えばＤＲＢＩ２）が挙げられ、このプライマーは第１の４つのＤＲＢ反応による生成物の配列化に用いられる。他の３つのＤＲＢ反応により生じるポリメラーゼチェーンリアクション生成物の直接配列化については、ＤＲＢＩ座において全ての対立遺伝子のコドン３９〜４６にアニールしているセンスオリゴヌクレオチドが用いられる（例えばプライマーＤＲＢ１４００）、これら３つのＤＲＢ反応において異なる配列化オリゴヌクレオチドを使用することにより、実施例の配列プライマーＤＲＢ１２を用いる第１のＤＲＢ反応においては見られないＤＲＢＩ遺伝子の下流の多室性領域の読み取りが可能になる。

ＤＱＢｌ座に対応するポリメラーゼチェーンリアクション生成物の直接配列化に有用なプライマーとしては、この座において全ての対立遺伝子のコドン７８〜８３にアニールしているアンチセンスオリゴヌクレオチドブライマー（例えばプライマーＤＱＢ５）が挙げられる。

ＤＱＢｌ座に対応するポリメラーゼチェーンリアクション生成物の直接配列化には、この座において全ての対立遺伝子のイントロン３の塩基対１〜２１にアニールしているアンチセンスオリゴヌクレオチドブライマー（例えばプライマーＤＱＡ１Ｂ）が含まれる。ＤＱＡｌ座に対応するポリメラーゼチェーンリアクシミン生成物の直接配列化には、この座において全ての対立遺伝子のコドン７６〜８２にアニールしているセンスオリゴヌクレオチドブライマー（例えばプライマーＤＰＡ１２）が含まれる。

のＨＬＡタ　′　るためのＨＬＡタイプがわかっていない被験者（疾病を有する者またはそうでない者）のクラスｎＨＬＡ多型性をタイプ付けする。１０〜５ｍＬの末梢血液を採血する。

末梢血液単核細胞を遠心分離によりフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）−ハイバーケ（Ｈｙｐａｑｕｅ）勾配にかけて調製する。この細胞をグアニジウムイソチオシナーゼに溶解し、通常の方法（あるいは塩化セシウム勾配において遠心分離する（約１６時間続ける）か、あるいはグアニジウムイソチオシナーゼーフェノールークロロフォルム抽出法（４時間未満で行なうことができる））を用いて全細胞質Ｊｐｈｎｓ　ａｔ　ａｌ、、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈａｍ、、１８０：２７６（１９８９３を参照のこと、あるいは、これらの細胞または他の入手源（毛髪、血痕、精子、′等）からのゲノムＤＮＡが、Ｈｌｇｕｃｈｉ、　Ｒ，、ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。

Ｅｒ１ｉｃｈ、　Ｍ、　（ａｄ）、　５ｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒａｓｓ＝　３１（１９８９）により提供されるような通常の方法を用いて調製される。ＤＱＢｌ、ＤＱＡｌ、ＤＲＢ　（ＤＲＢＩ、ＤＲＢ３／４１５）、ＤＰＡＩおよびＤＰＢＩｃ　ＤＮＡは全ＲＮＡから座持異性プライマーを用いて合成される。およそＩμ ｇのＲＮＡがＭｏＬＶＲＴ　（逆転写酵素）ｆｉＪ：びＤＲＢ　（ＣＯＤＲＢ２０）、ＤＱＢ（ＣＯＱＢ７）、ＤＱＡ　（ＣＯＤＱＡ９）、ＤＰＢ　（ＤＰＢＩＩ）およびＤＩ’Ａ　（ＤＰＡＩ　４．ＤＰＡＩ　９）（場合によって］−特異性ナンセンスブライマーでの、２０ｕＬ最終体積反応（３０〜６０分間のインキュベートを行なう）において逆転写される。各クラス■遺伝子に対する反応は異なるチューブ内で行なわれるが、好ましいのであれば同じチューブ内で行なうことができる。

慣例的な目的においては、ＤＲＢ遺伝子に対しては４つの、ＤＱＢ遺伝子に対しては１つの、ＤＱＡＩ遺伝子に対しては１つの、そしてＤＰＡＩ遺伝子に対しては２つの同時反応が行なわれる。

これらの反応が一旦終了したら、２０ｕＬ逆転写反応に直接添加することにより各ｃＤＮＡ分子の酵素的増幅を行なうが、この際、増幅をストップさせるための試薬が必要である。一方、ＤＮＡが用いられる場合、ＰＣＨに用いられるプライマーの組み合わせは表■において示されるものを採用する（センスプライマー同様、アンチセンスプライマーが異なるであろう、）。これにはＰＣＲ試薬および適当な維持および非維持オリゴヌクレオチドブライマーが含まれる。この実施例では、ＤＲＢに対する４つの反応（チューブｌ、２．３および４）。

ＤＱＢに対する１つの反応（チューブ５）、ＤＱＡに対する１つの反応（チューブ６）、ＤＰＢに対する１つの反応（チューブ７）およびＤＰＡに対する２つの反応（チューブ８および９）を用いる。反応２．３および４はプライマーＤＲＢ２３、ＤＲＢ２４およびＤＲＢ２５をそれぞれ取り込む、迅速なタイピング（２４時間以内）を行なうためには、後者が好ましい組み合わせである。用いうるプライマーの他の組み合わせを表■に示す。

一旦終了したら、得られたものをセントリコン（Ｃｅｎｔｒｌｃｏｎ、Ａｍ１ｃｏｎ）、ウルトラフリー（υ１ｔｒａｆｒｅｅ、ｍ１１１１ｐｏｒａ）または類似のカラムを用いて約１５分間スピン透析して、取り込まれていないプライマーおよびｄＮＴ　Ｐを除去する。各反応当たり、得られたもの、あるいは得られたものの１７２をＴ　ａ　ｑポリメラーゼおよびＰ−３２末端ラベル化（１０分間）した座持異性配列化プライマーを用いたｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　／　Ｐ　ＣＲ反応において用いられる各プライマーの組み合わせについて１表■に記載のプライマーを用いて直接配列化する（３５分間）。

配列化反応生成物はアクリルアミドゲルにかけ、２〜３時間電気泳動し、４〜１２時間Ｘ線フィルムにさらす、そのゲルを読み取り、ゲルから得られた結果をあらゆる考えつる対立遺伝子のヌクレオチド配列と比較する。

比較は裸眼で視覚的に、または八−ソナルコンビエータ−および全てのハブロタイブの全ての対立遺伝子のヌクレオチド配列を包含するソフトウェアパッケージ、さらに、どのようにして比較を行なうべきかを指示するルーチンと新しい対立遺伝子配列の同定を可能にするであろうサブルーチンを用いて行なうことができる。

配列旦ΔΣ ＧＯＴ　ＯＡＧ　ＧＴｒ　ＡＣｒ　ＧＡＴ　ＣｒＴ　ＧＡＡ　Ｇ　２２（ｘｉ）　配列種類：　５ＥＱＩＤＮ０．１１ＡＧＧ　ＡＴＡ　ＣＡＣＡＧＴ　ＣＡＣＣＴＴ　ＡＧＧ　２１（ｘｌ）配列種類：　５ＥＱＩＤＮ０．１３Ｇ　ＣＣＧ　ＣｒＧ　ＣＡＣＴＧＴ　ＧＡＡ　ＧＣｒ　Ｃ２０ＯＡＧ　ＯＴＧ　ＡＣｒ　ＧＴＯＴＡＴ　ＣＣｒ　ＧＡＣ２１（１ｖ）アンチセンス：　イエスＡｓｎ　Ｌｚｕ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　ｎｅ　ＧｌｎＦＩＧ、２ＢＦｆＧ、２Ａ末梢血電気永動ＮＡＰＲＩＭＥＲ＃２　２２　２３　２３　２４　９３１　１５　ＩＩ１０１０＊１９８Ｇ”υ←（ぐ補正書の翻訳文提出書昏平成５年　９月　６日

Claims

【特許請求の範囲】

１．（ａ）核酸を被験者の核酸を含有するサンプルから単離すること：（ｂ）ポリメラーゼチェーンリアクションにより前記核酸を増幅して、配列化されるべき前記遺伝子座の各対立遺伝子に対して十分なポリメラーゼチェーンリアクション生成物を生成し、配列化されるべき各遺伝子座および染色体に対するすべての前記対立遺伝子が少なくとも一つの維持オリゴヌクレオチドプライマー対で増幅され、かつ配列化されるべき各遺伝子座に対する前記対立遺伝子の少なくとも一つが少なくとも一つの維持オリゴヌクレオチドプライマーおよび少なくとも一つの非維持オリゴヌクレオチドプライマーで増幅されていること；（ｃ）各対立遺伝子に対する各ポリメラーゼチェーンリアクション生成物を、各染色体の各遺伝子座で、Ｔａｑポリメラーゼおよび配列化される各座に特異的な維持プライマーを用いて直接配列化すること；および（ｄ）各配列化ポリメラーゼチユーンリアクション生成物を分析して、前記被験者の遺伝子型を決定することからなる、被験者の核酸を含有するサンプル中の被験者の主要組織適合性遺伝子後合体遺伝子型を決定するための方法。
２．前記の単離される核酸がゲノムＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
３．前記の単離される核酸がＲＮＡであり、さらに前記核酸を増幅する前に（ａ）配列化されるべき各遺伝子座の各対立遺伝子に対するｃＤＮＡ分子を合成し、そこにおいて前記合成が、各前記遺伝子座の各対立遺伝子の維持領域にアニールする座特異性オリゴヌクレオチドプライマーを用いる工程を行うことからなる、請求項１に記載の方法。
４．決定されるべき前記主要組織適合性遺伝子型がＨＬＡクラスＩＩ遺伝子型である、請求項１に記載の方法。
５．配列化されるべき前記クラスＩＩ遺伝子座がＤＱＢ１である、請求項４に記載の方法。
６．配列化されるべき前記クラスＩＩ遺伝子座がＤＱＡ１である、請求項４に記載の方法。
７．配列化されるべき前記クラスＩＩ遺伝子座がＤＲＢ１／３／４／５である、請求項４に記載の方法。
８．配列化されるべき前記クラスＩＩ遺伝子座がＤＰＡ１である、請求項４に記載の方法。
９．配列化されるべき前記クラスＩＩ遺伝子座がＤＰＢ１である、請求項４に記載の方法。
１０．前記の配列化されるポリメラーゼチェーンリアクション生成物の分析が、配列化される各遺伝子座の各対立遺伝子のヌクレオチド配列とそのような各遺伝子座に対する既知の配列との比較、続いて、維持／非維持オリゴヌクレオチドプライマー対で増幅される各遺伝子座の各対立遺伝子の配列と維持オリゴヌクレオチドプライマー対で対立されるそのような遺伝子座の各対立遺伝子のヌクレオチド配列との比較を包含する、請求項１に記載の方法。
１１．遺伝子型を決定するための各ポリメラーゼチェーンリアクション生成物の分析が、ＨＬＡクラスＩＩ座に対するすべてのハプロタイプのすべての対立遺伝子のヌクレオチド配列を含むプログラムを有するコンピュータで行われる、請求項１に記載の方法。
１２．前記のｃＤＮＡ分子の前記維持オリゴヌクレオチドプライマーによる増幅が、約３７℃における前記維持オリゴヌクレオチドプライマーの前記ｃＤＮＡへのアニーリングを包含する、請求項１に記載の方法。
１３．前記のｃＤＮＡ分子の非維持プライマーによる増幅が、約５５℃における前記非維持プライマーの前記ｃＤＮＡへのアニーリングを包含する、請求項１に記載の方法。
１４．（ａ）核酸を被験者の核酸を含有するサンプルから単離すること：（ｂ）ポリメラーゼチェーンリアクションにより前記核酸を増幅して、配列化されるべき前記クラスＩＩ遺伝子座の各対立遺伝子に対して十分なポリメラーゼチェーンリアクション生成物を生成し、配列化されるべき各クラスＩＩ遺伝子座および染色体に対するすべての前記対立遺伝子が少なくとも一つの維持オリゴヌクレオチドプライマー対で増幅され、かつ配列化されるべき各クラスＩＩ遺伝子座に対する前記対立遺伝子の少なくとも一つが少なくとも一つの維持オリゴヌクレオチドプライマーおよび少なくとも一つの非維持オリゴヌクレオチドプライマーで増幅されていること；（ｃ）各対立遺伝子に対する各ブリメラーゼチェーンリアクション生成物を、各染色体の各クラスＩＩ遺伝子座でＴａｑポリメラーゼおよび配列化される各クラスＩＩ座に特異性である維持プライマーを用いて直接配列化すること；および（ｄ）配列化されるクラスＩＩ座における各対立遺伝子のヌクレオチド配列を各クラスＩＩ座に対する既知の配列と比較し、続いて、退化オリゴヌクレオチドプライマーで増幅された各クラスＩＩ座の各対立遺伝子の配列を、維持オリゴヌクレオチドプライマーで増幅されたクラスＩＩ座の各対立遺伝子のヌクレオチド配列と比較することにより、前記被験者の遺伝子型を決定することからなる、被験者の核酸を含有するサンプル中の被験者のクラスＩＩ組織適合性遺伝子型を決定する方法。
１５．前記の単離される核酸がＲＮＡであり、さらに前記核酸を増幅する前に、（ａ）配列化されるべき各クラスＩＩ遺伝子座の各対立遺伝子に対するｃＤＮＡ分子を合成し、そこにおいて、前記合成が各前記クラスＩＩ遺伝子座の各対立遺伝子の維持領域にアニールする座特異性オリゴヌクレオチドプライマーを用いる工程を行うことからなる、請求項１４に記載の方法。
１６．（ａ）全細胞性ＲＮＡを被験者の核酸を含有するサンプルから単離すること；（ｂ）少なくとも一つの配列化されるクラスＩＩ遺伝子座の各対立遺伝子に対するｃＤＮＡ分子を合成し、そこにおいて、各前記クラスＩＩ遺伝子座の各対立遺伝子の維持領域にアニールする座特異性オリゴヌクレオチドプライマーを用いること；（ｃ）前記ｃＤＮＡをブリメラーゼチェーンリアクションにより増幅して、配列化されるべき前記クラスＩＩ遺伝子座の各対立遺伝子に対するブリメラーゼチェーンリアクション生成物を生成し、そこにおいて配列化されるべき各クラスＩＩ遺伝子座および染色体に対するすべての前記対立遺伝子が少なくとも一つの維持オリゴヌクレオチドプライマーで増幅され、かつ配列化されるべき各クラスＩＩ遺伝子座および染色体に対する前記対立遺伝子の少なくとも一つが少なくとも一つの維持オリゴヌクレオチドプライマーおよび少なくとも一つの非維持オリゴヌクレオチドプライマーで増幅されること；（ｄ）Ｔａｑポリメラーゼおよび配列化される各クラスＩＩ座に特異性である維持プライマーを用いて、各対立遺伝子に対する各ブリメラーゼチェーンリアクション生成物を各染色体の各クラスＩＩ遺伝子座で直接配列化し、各対立遺伝子に対する核酸配列化はしごを生成すること；および（ｅ）各核酸はしごを分析して、配列化される各クラスＩＩ座に各対立遺伝子のヌクレオチド配列を各クラスＩＩ座に対する既知の配列と比較し、続いて、維持／非維持オリゴヌクレオチドプライマー対で増幅される各クラスＩＩ座の各対立遺伝子の配列を維持オリゴフクレオチドプライマー対で増幅されたクラスＩＩ座の各対立遺伝子のヌクレオチド配列と比較することにより、前記被験者の遺伝子型を決定することからなる、被験者の核酸を含有するサンプル中の被験者のクラスＩＩＨＬＡ遺伝子型を決定する方法。
１７．決定されるべき前記クラスＩＩＨＬＡ遺伝子型が、前記被験者のＤＲＢ１、ＤＲＢ３、ＤＲＢ４、ＤＲＢ５、ＤＱＢ１、ＤＱＡ１、ＤＰＡ１およびＤＰＢ１遺伝子に対するヌクレオチド配列を含有する、請求項１６に記載の方法。
１８．ＤＱＢ転写体の１０５〜１１１コドンにアニールする一本鎖ＤＮＡからなる、オリゴヌクレオチドプライマー。
１９．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ：１）
２０．ＤＱＢの１〜７コドンにアニールする一本鎖ＤＮＡからなる、オリゴヌクレオチドプライマー。
２１．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ：４）
２２．ＤＱＡ転写体の１４８〜１５５コドンにアニールする一本鎖ＤＮＡからなる、オリゴヌクレオチドプライマー。
２３．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ：３）
２４．ＤＱＡ　ｃＤＮＡの−１０〜−４コドンにアニールする一本鎖ＤＮＡからなる、オリゴヌクレオチドプライマー。
２５．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ：７）
２６．ＤＲＢ１転写体の１０５〜１１１コドンにアニールする一本鎖ＤＮＡからなる、オリゴヌクレオチドプライマー。
２７．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ：２）
２８．ＤＲＢ１転写体の−３３〜−２６コドンにアニールする一本鎖ＤＮＡからなる、オリゴヌクレオチドプライマー。
２９．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ：６）
３０．ＤＲＢ１転写体の７〜１３コドンにアニールする一本鎖ＤＮＡからなる、オリゴヌクレオチドプライマー。
３１．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ：４２）
３２．ＤＲＢ１転写体の５〜１１コドンにアニールする一本鎖ＤＮＡからなる、オリゴヌクレオチドプライマー。
３３．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ：４３）
３４．ＤＲＢ１転写体の６〜１３コドンにアニールする一本鎖ＤＮＡからなる、オリゴヌクレオチドプライマー。
３５．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ．け４４）
３６．ＤＰＢ転写体の１０５〜１１１コドンにアニールする一本鎖ＤＮＡからなる、オリゴヌクレオチドプライマー。
３７．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ．：２４）
３８．ＤＰＡ転写体の２２２〜２２８コドンにアニールする一本鎖ＤＮＡからなる、オリゴヌクレオチドプライマー。
３９．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ．：３９）
４０．ＤＰＢ転写体の−１９〜−１３コドンにアニールする一本鎖ＤＮＡからなる、オリゴヌクレオチドプライマー。
４１．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ．：２３）
４２．ＤＰＡ転写体の−２３〜−１７コドンにアニールする一本鎖ＤＮＡからなる、オリゴヌクレオチドプライマー。
４３．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ．：３２）
４４．ＤＰＡ転写体の５９〜６５コドンにアニールする一本鎖ＤＮＡからなる、オリゴヌクレオチドプライマー。
４５．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ．：３８）
４６．ＤＰＡ転写体の１０４〜１１０コドンにアニールする一本鎖ＤＮＡからなる、オリゴヌクレオチドプライマー。
４７．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ．：３１）
４８．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ．：１３）
４９．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ．：１１）
５０．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ．：１２）
５１．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ．：１４）
５２．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ．：２５）
５３．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ．：３３）
５４．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ．：４０）
５５．ＤＲＢ座のイントロン３の塩基対１８〜３８にアニールする一本鎖ＤＮＡからなる、オリゴヌクレオチドプライマー。
５６．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ．：２０）
５７．ＤＲＢ転写体の−４〜＋３コドンにアニールする一本鎖ＤＮＡからなる、オリゴヌクレオチドプライマー。
５８．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ．：５）
５９．ＤＱＢ転写体の８８〜９４コドンにアニールする一本鎖ＤＮＡからなる、オリゴヌクレオチドプライマー。
６０．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ．：８）
６１．ＤＱＢ転写体の１１〜１７コドンにアニールする一本鎖ＤＮＡからなる、オリゴヌクレオチドプライマー。
６２．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ．：９）
６３．ＤＰＢ座のイントロン２の塩基対−４２〜−６２にアニールする一本鎖ＤＮＡからなる、オリゴヌクレオチドプライマー。
６４．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ．：２７）
６５．ＤＰＢ遺伝子のイントロン３のイントロン３９〜５９にアニールする一本鎖ＤＮＡからなるオリゴヌクレオチドプライマー。
６６．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ．：２８）
６７．ＤＰＡ１座のイントロン２の塩基対−６９〜−５０にアニールする一本鎖ＤＮＡからなる、オリゴヌクレオチドプライマー。
６８．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ．：３５）
６９．ＤＰＡ１座のイントロン３の塩基対５５〜７１にアニールする一本鎖ＤＮＡからなる、オリゴヌクレオチドプライマー。
７０．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ．：３６）
７１．ＤＲＢ転写体の８７〜９４コドンにアニールする一本鎖ＤＮＡからなる、オリゴヌクレオチドプライマー。
７２．ＤＲＢ転写体の３８〜４５コドンにアニールする一本鎖ＤＮＡからなる、オリゴヌクレオチドプライマー。
７３．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ．：１６）
７４．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ．：２９）
７５．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ：３７）
７６．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ：２６）
７７．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ：３０）
７８．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ：３４）
７９．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ：４１）
８０．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ：１０）
８１．配列【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマー。（配列識別番号Ｎｏ：１５）
８２．（ａ）ＲＮＡ／ＤＮＡ抽出装置で被検者の核酸を含有するサンプルから核酸を単離すること；（ｂ）熱循環装置を用いたポリメラーゼチェーンリアクシヨンにより前記核酸を増幅して、配列化されるべき各遺伝子座の各対立遺伝子に対するポリメラーゼチェーンリアクション生成物を生成し、配列化されるべき各遺伝子座および染色体に対する全ての前記対立遺伝子が少なくとも一つの維持オリゴヌクレオチドプライマー対で増幅され、かつ配列化されるべき各遺伝子座および染色体に対する少なくとも一つの前記対立遺伝子が少なくとも一つの維持オリゴヌクレオチドプライマーおよび少なくとも一つの非維持オリゴヌクレオチドプライマーで増幅されること；（ｃ）各対立遺伝子に対する各ポリメラーゼチェーンリアクション生成物を、自動配列化装置中で、Ｔａｑポリメラーゼおよび配列化されるべき各座に特異性な維持プライマーで、各染色体の各遺伝子座において直接配列化すること；および（ｄ）配列化された各ポリメラーゼチェーンリアクション生成物を分析して、各遺伝子座の各対立遺伝子の配列を各遺伝子座に対する既知の配列と比較、続いて維持／非維持オリゴヌクレオチドプライマー対で増幅された各遺伝子座の各対立遺伝子の配列を維持オリゴヌクレオチドプライマー対で増幅された該遺伝子座の各対立遺伝子のヌクレオチド配列と比較するための遺伝子座配列情報のデータベースを有するコンピュータで前記被検者の遺伝子型を決定することからなる、前記の被検者の核酸を含有するサンプル中の被検者の主要組織適合性遺伝子複合体のクラス遺伝子型の迅速な自動決定方法。
８３．（ａ）核酸を被検者の核酸を含有するサンプルから単離すること：（ｂ）ポリメラーゼチェーンリアクションにより前記核酸を増幅して、配列化されるべき前記遺伝子座の各対立遺伝子に対して十分なポリメラーゼチェーンリアクション生成物を生成し、配列化されるべき各遺伝子座および染色体に対する全ての前記対立遺伝子が少なくとも一つの維持オリゴヌクレオチドプライマー対で増幅され、かつ配列化されるべき各遺伝子座および染色体に対する前記対立遺伝子の少なくとも一つが少なくとも一つの維持オリゴヌクレオチドプライマーおよび少なくとも一つの非維持オリゴヌクレオチドプライマーで増幅されていること；（ｃ）各対立遺伝子に対する各ポリメラーゼチェーンリアクション生成物を、各染色体の各遺伝子座で、配列化酵素および配列化される各座に特異性である維持プライマーを用いて直接配列化すること：および（ｄ）各配列化ポリメラーゼチェーンリアクション生成物を分析して、前記被検者の遺伝子型を決定することからなる、前記の被検者の核酸を含有するサンプル中の被検者の一つ以上の多型性遺伝子座における遺伝子型を決定するための方法。
８４．前記の単離された核酸がゲノムＤＮＡである、請求項８３に記載の方法。
８５．前記の単離された核酸がＲＮＡであり、さらに前記核酸を増幅する前に（ａ）配列化すべき各遺伝子座の各対立遺伝子に対するｃＤＮＡ分子を合成し、そこにおいて前記合成が各前記遺伝子座の各対立遺伝子の維持領域にアニールする座特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いることの工程からなる、請求項８３に記載の方法。
８６．（ａ）ＲＮＡ／ＤＮＡ抽出装置を用いて被検者の核酸を含有するサンプルから核酸を単離すること；（ｂ）熱循環装置を用いたポリメラーゼチェーンリアクションで前記核酸を増幅して、配列化されるべき各遺伝子座の各対立遺伝子に対するポリメラーゼチェーンリアクション生成物を生成し、各遺伝子座および染色体に対する全ての前記対立遺伝子が少なくとも一つの維持オリゴヌクレオチドプライマー対で増幅され、かつ配列化されるべき各遺伝子座および染色体に対する少なくとも一つの前記対立遺伝子が少なくとも一つの維持オリゴヌクレオチドプライマーおよび少なくとも一つの非維持オリゴヌクレオチドプライマーで増幅すること；（ｃ）各対立遺伝子に対するポリメラーゼチェーンリアクション生成物を、自動配列化装置を用いて、配列化酵素および配列化されるべき各座に特異性な維持プライマーで、各染色体の各遺伝子座において直接配列化すること；および（ｄ）配列化された各ポリメラーゼチェーンリアクション生成物を分析して、各遺伝子座の各対立遺伝子の配列を各遺伝子座に対する既知の配列の比較、かつ続いて維持／非維持オリゴヌクレオチドプライマー対で増幅された各遺伝子座の各対立遺伝子の配列を維持オリゴヌクレオチドプライマー対で増幅された該遺伝子座の各対立遺伝子のヌクレオチド配列と比較するための遺伝子座配列情報のデータベースを有するコンピュータで前記被検者の遺伝子型を決定することからなる、前記の被検者の核酸を含有するサンプル中の被検者の一つ以上の多型性遺伝子座における遺伝子型の迅速な自動決定方法。