CN113278687B - 用于hla-b1502和hla-a2402基因型检测的试剂盒 - Google Patents
用于hla-b1502和hla-a2402基因型检测的试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113278687B CN113278687B CN202110554377.1A CN202110554377A CN113278687B CN 113278687 B CN113278687 B CN 113278687B CN 202110554377 A CN202110554377 A CN 202110554377A CN 113278687 B CN113278687 B CN 113278687B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- hla
- downstream
- upstream
- bases
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 58
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims abstract description 37
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 108010021736 HLA-B15 Antigen Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 claims abstract description 3
- 102000011786 HLA-A Antigens Human genes 0.000 claims abstract 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 37
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 35
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 35
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 6
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 abstract description 3
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 6
- 206010042033 Stevens-Johnson syndrome Diseases 0.000 description 6
- 206010044223 Toxic epidermal necrolysis Diseases 0.000 description 6
- 102100028976 HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Human genes 0.000 description 5
- 108010058607 HLA-B Antigens Proteins 0.000 description 5
- 229960000623 carbamazepine Drugs 0.000 description 5
- FFGPTBGBLSHEPO-UHFFFAOYSA-N carbamazepine Chemical compound C1=CC2=CC=CC=C2N(C(=O)N)C2=CC=CC=C21 FFGPTBGBLSHEPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 206010012455 Dermatitis exfoliative Diseases 0.000 description 4
- 231100000168 Stevens-Johnson syndrome Toxicity 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 208000004526 exfoliative dermatitis Diseases 0.000 description 4
- 239000001961 anticonvulsive agent Substances 0.000 description 3
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 2
- 208000019502 Thymic epithelial neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 231100000087 Toxic epidermal necrolysis Toxicity 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 2
- 230000001037 epileptic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229960001848 lamotrigine Drugs 0.000 description 2
- PYZRQGJRPPTADH-UHFFFAOYSA-N lamotrigine Chemical compound NC1=NC(N)=NN=C1C1=CC=CC(Cl)=C1Cl PYZRQGJRPPTADH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 2
- 229960001816 oxcarbazepine Drugs 0.000 description 2
- CTRLABGOLIVAIY-UHFFFAOYSA-N oxcarbazepine Chemical compound C1C(=O)C2=CC=CC=C2N(C(=O)N)C2=CC=CC=C21 CTRLABGOLIVAIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002790 phenytoin sodium Drugs 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- FJPYVLNWWICYDW-UHFFFAOYSA-M sodium;5,5-diphenylimidazolidin-1-ide-2,4-dione Chemical compound [Na+].O=C1[N-]C(=O)NC1(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FJPYVLNWWICYDW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 206010073508 Drug reaction with eosinophilia and systemic symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000030453 Drug-Related Side Effects and Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 206010037868 Rash maculo-papular Diseases 0.000 description 1
- 206010040914 Skin reaction Diseases 0.000 description 1
- 208000032509 Stevens-Johnson syndrome/toxic epidermal necrolysis spectrum Diseases 0.000 description 1
- 206010053615 Thermal burn Diseases 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 229960003965 antiepileptics Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000009743 drug hypersensitivity syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 231100000430 skin reaction Toxicity 0.000 description 1
- 230000035483 skin reaction Effects 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 206010044652 trigeminal neuralgia Diseases 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Abstract
本发明涉及用于HLA‑B*15:02和HLA‑A*24:02基因型检测的试剂盒,所述试剂盒是多重PCR扩增试剂盒,其包括针对HLA‑B*15:02和HLA‑A*24:02每个基因型的上游引物、上游封闭引物以及下游引物、下游封闭引物,本发明试剂盒在一管中同时检测HLA‑B*15:02和HLA‑A*24:02基因亚型,提高了多重PCR扩增的效率,检测灵敏度和检测特异性,并且较常规的单链引物多重扩增的荧光定量PCR方法显著性减少了假阳性的结果。
Description
技术领域
本发明涉及分子诊断领域,特别涉及用于HLA-B*15:02和HLA-A*24:02 基因型检测的试剂盒。
背景技术
癫痫是神经科第二常见疾病,我国癫痫患者过千万,每年新增约40万,药物治疗为癫痫的主要治疗方式,多数患者需要长期服药,但大约16%的患者出现皮肤型过敏反应,包括轻度的斑丘疹(maculopapular exanthema,MPE) 及重度的斯蒂文森-强生综合症(Stevens-Johnson syndrome,SJS)和中毒性表皮坏死松解症(toxic epidermalnecrolysis,TEN),明显影响生活质量,严重时出现剥脱性皮炎,通常全身粘膜(眼、嘴、生殖器)溃疡,皮肤起水疱,甚至出现全身表皮脱离,如同大面积烫伤,致死性高达40%。这种过敏在南方汉族人群,尤其是在广东及周边地区的汉族人群中发病率明显高于其它地区及人群。
卡马西平(CBZ)、拉莫三嗪(LTG)、奥卡西平(OXC)、苯妥英钠(PHT) 以及妥泰(PB)都具有相似的芳香族结构,是广泛使用的用于控制癫痫、三叉神经痛等的抗癫痫药物(AEDs)。然而,该类药物通常会导致皮肤不良反应(cADRs),长期困扰着临床医生。cADRs占所有报道的药物不良反应的 10%-30%,包括轻度的斑丘疹(MPE)、药物超敏反应综合症(HSS)到重型的有潜在致命性的Stevens-Johnson综合症(SJS)和/或中毒性表皮坏死松解症(Toxic epidermal necrolysis,TEN)。如能找到与其相关的基因标志,将对临床用药起到很大的指导作用。人类白细胞抗原(HLA)基因与人体免疫相关,包括数千个不同的基因型。HLA-B*15:02为我国南方汉族人群卡马西平导致剥脱性皮炎的遗传标记,HLA-A*24:02是卡马西平导致剥脱性皮炎的新的风险基因,两位点同时检测将卡马西平导致剥脱性皮炎的排除概率从69.6%提高到90%。两位点同时阳性时,芳香族抗癫痫药物引起的严重皮肤过敏风险值增大23倍。因此癫痫患者用药前通过这两个基因型筛查可降低甚至避免致死性皮肤型不良反应的发生。
HLA基因的不同基因亚型序列同源性高,因此一般多通过测序的方法来区分HLA基因的不同基因亚型;但测序的方法成本较高,实验周期较长,难以满足临床诊断的需求。而基于荧光定量PCR方法来检测HLA基因的不同基因亚型,由于序列同源性高的原因,经常会导致检测的假阳性。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供一种用于HLA-B*15:02和HLA-A*24:02 基因型检测的试剂盒,所述试剂盒是多重PCR扩增试剂盒,其包括针对HLA- B*15:02和HLA-A*24:02每个基因型的上游引物、上游封闭引物以及下游引物、下游封闭引物,其中每个上游引物一端包括至少3个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补,每个上游封闭引物一端包括与所述至少3个连续人工设计的碱基互补的碱基,每个上游引物和每个上游封闭引物连续互补碱基的数目比每个上游引物和待扩增靶序列连续互补碱基的数目至少少2个碱基;和每个下游引物一端包括至少3个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补,每个下游封闭引物一端包括与所述至少3个连续人工设计的碱基互补的碱基,每个下游引物和每个下游封闭引物连续互补碱基的数目比每个下游引物和待扩增靶序列连续互补碱基的数目至少少2个碱基。
在一种实施方式中,每个上游引物一端包括4个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补,在该端所述上游引物与所述上游封闭引物互补;在每个上游引物另一端,每个上游引物与所述待扩增靶序列连续互补碱基的数目比每个上游引物与所述上游封闭引物连续互补碱基的数目多6个;和,
每个下游引物一端包括4个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补,在该端所述下游引物与所述下游封闭引物互补;在每个下游引物另一端,每个下游引物与所述待扩增靶序列连续互补碱基的数目比每个下游引物与所述下游封闭引物连续互补碱基的数目多6个。
在一种实施方式中,每个上游引物一端包括4个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补,在该端所述上游引物与所述上游封闭引物互补;在每个上游引物另一端,每个上游引物与所述待扩增靶序列连续互补碱基的数目比每个上游引物与所述上游封闭引物连续互补碱基的数目多7个;和,每个下游引物一端包括4个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补,在该端所述下游引物与所述下游封闭引物互补;在每个下游引物另一端,每个下游引物与所述待扩增靶序列连续互补碱基的数目比每个下游引物与所述下游封闭引物连续互补碱基的数目多7个。
在一种实施方式中,每个上游引物一端包括5个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补,在该端所述上游引物与所述上游封闭引物互补;在每个上游引物另一端,每个上游引物与所述待扩增靶序列连续互补碱基的数目比每个上游引物与所述上游封闭引物连续互补碱基的数目多7个;和,每个下游引物一端包括5个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补,在该端所述下游引物与所述下游封闭引物互补;在每个下游引物另一端,每个下游引物与所述待扩增靶序列连续互补碱基的数目比每个下游引物与所述下游封闭引物连续互补碱基的数目多7个。
在一种实施方式中,针对HLA-A*24:02基因型的上游引物是SEQ ID NO:2:GAGAC-GGAGTATTGGGACGAG-GAGACAG,上游封闭引物是SEQ ID NO:3:CTCGTCCCAATACTCC-GTCTC,下游引物是SEQ ID NO:5: CAGGT-GAGCGCGATC-CCAGGTT,下游封闭引物是GATCGCGCTC-ACCTG(SEQ ID NO:6);和,针对HLA-B*15:0基因型的上游引物是SEQ ID NO:9:GATGG-GCGAGTCCG-AGATGGC,上游封闭引物是SEQ ID NO:10:CGGACTCGC-CCATC,下游引物是SEQ ID NO:12:TCTTG- GTAAGTCTGTGTGTTG-GTCTTGG,下游封闭引物SEQ ID NO:13:CAACACACAGACTTAC-CAAGA。
在一种实施方式中,针对HLA-A*24:02基因型的探针序列是SEQ ID NO:7:GACAGGGAAAGTGAAGG-BHQ1,和针对HLA-B*15:0基因型的探针序列是SEQ ID NO:14:AGATCTGTGTGTTCCGGTCCCAA-BHQ1(),上述二个探针5’端标记不同的荧光。
在本发明多重PCR反应中利用具有封闭非特异性反应的封闭引物,降低了非特异反应,从而提高了多重PCR反应的灵敏度和提高了多重PCR扩增反应的扩增效率。相应地,使得本发明的qPCR扩增体系的特异性得到了明显的改善,提高了试剂盒检测的准确率,减少了假阳性发生。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例,对于本领域普通技术人员来说,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是本发明的试剂盒反应基本原理示意图。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案,下面将结合以下实施例对本发明作进一步说明,显然,所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例,都应当属于本申请保护的范围。
实施例一本发明的试剂盒反应基本原理
如图1所示,本发明利用上游封闭引物和上游引物先形成双链,防止非特异性扩增。只有上游引物和模板DNA完全匹配后,双链引物才能逐步解开,从而降低非特异性扩增。本发明上游引物和上游封闭引物上5’端人工设计的碱基(方框点表示)与模板DNA不匹配的碱基数目为5个碱基;封闭引物3’较上游引物少6个和模板DNA匹配的碱基。上游引物和封闭引物这种5’端5个不匹配碱基和3’端6个减少的匹配碱基的方式我们称为“5+6”模式。
在一管中同时检测HLA-B*15:02和HLA-A*24:02基因亚型,提高了多重PCR扩增的效率,检测灵敏度和检测特异性,并且较常规的单链引物多重扩增的荧光定量PCR方法显著性减少了假阳性的结果。
实施例二本发明用于HLA-B*15:02和HLA-A*24:02基因型检测的试剂盒
如表1所示,本发明所用的引物和对比普通qPCR引物。下划线斜体碱基是和基因组DNA模板序列完全匹配的碱基。本表格举例的是本发明上游引物、下游引物和各自的封闭引物是“5+7”模式。
表1.检测HLA-B*15:02和HLA-A*24:02基因型的引物和探针
表2本发明qPCR反应体系
qPCR组分名称 | 反应终浓度 |
HLA-A*24:02本发明上游引物 | 200nM |
HLA-A*24:02本发明上游封闭引物 | 400nM |
HLA-A*24:02探针 | 400nM |
HLA-A*24:02本发明下游引物 | 200nM |
HLA-A*24:02本发明下游封闭引物 | 400nM |
HLA-B*15:02本发明上游引物 | 200nM |
HLA-B*15:02本发明上游封闭引物 | 400nM |
HLA-B*15:02探针 | 400nM |
HLA-B*15:02本发明下游引物 | 200nM |
HLA-B*15:02本发明下游封闭引物 | 400nM |
PCR mix(包括酶) | 1Х |
补水到 | 20ul |
表3普通qPCR反应体系
qPCR组分名称 | 反应终浓度 |
HLA-A*24:02普通上游引物 | 200nM |
HLA-A*24:02探针 | 400nM |
HLA-A*24:02普通下游引物 | 200nM |
HLA-B*15:02普通上游引物 | 200nM |
HLA-B*15:02探针 | 400nM |
HLA-B*15:02普通下游引物 | 200nM |
PCR mix(包括酶) | 1Х |
补水到 | 20ul |
表4 qPCR反应程序
在本实验中比较了不同引物的扩增效率,在本发明中首先使用HLA- B*15:02和HLA-A*24:02基因亚型的普通上游引物和普通下游引物分别进行单独扩增,然后使用HLA-B*15:02和HLA-A*24:02基因亚型的普通上游引物和普通下游引物在一起进行二重PCR扩增,以及HLA-B*15:02和HLA- A*24:02基因亚型的本发明扩增引物对进行二重扩增,具体扩增效率结果如表5所示。
表5 PCR扩增效率结果
根据上述实验结果可知,使用本发明的双引物扩增体系的双重扩增的效率与单独的PCR扩增相比,扩增效率基本保持不变,而普通引物的二重扩增的扩增效率有了明显降低。
依照上述相同的实验设计,将待测样本、浓度梯度标准品(10copies/μ l,100copies/μl,1000copies/μl,10000copies/μl)、阴性对照分别加入PCR 反应管中,盖好PCR反应管盖,振荡混匀后瞬时离心,进行PCR扩增反应。在本实验中比较了不同引物的扩增灵敏度,具体扩增灵敏度结果如表6所示。
表6 PCR扩增灵敏度结果
根据上述实验结果可知,单独的PCR扩增、使用本发明的双引物扩增体系的双重扩增和普通引物的二重扩增的扩增灵敏度对于HLA-B*15:02基因型的分别是100、200和500copies/μl,对于HLA-A*24:02基因型的分别是200、250和500copies/μl。
发明人同时使用本发明的双引物扩增体系的双重扩增和普通引物的二重扩增检测了30例真实样本,具体检测结果如下表所示:
表7 HLA-A*24:02基因型检测结果
在检测HLA-A*24:02基因亚型时,以测序的基因型结果为标准,常规的 qPCR扩增体系的灵敏度为100%,特异性为90%;而本发明的qPCR扩增体系(“5+7”模式)的灵敏度为100%,特异性为100%;可见本发明的qPCR 扩增体系的特异性得到了明显的改善。
表8 HLA-B*15:02基因型检测结果
在检测HLA-B*15:02基因亚型时,以测序的基因型结果为标准,常规的 qPCR扩增体系的灵敏度为100%,特异性为86.7%;而本发明的qPCR扩增体系(“5+7”模式)的灵敏度为100%,特异性为100%;可见本发明的qPCR 扩增体系的特异性得到了明显的改善。
同样我们测试了引物和封闭引物以“4+6”模式、“4+7”模式模,发现检测HLA-A*24:02和HLA-B*15:02基因亚型的特异性都较普通多重引物检测提高了10%~25%,灵敏度和扩增效率结果与上述“5+7”模式结果类似。而在引物和封闭引物以“4+5”模式、“5+6”和“3+4”模式时,检测HLA- A*24:02和HLA-B*15:02基因亚型的特异性、灵敏度和扩增效率与普通引物多重检测结果类似。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质,因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的,而不是意欲限制本发明的范围,本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到,或者能够确认使用不超过常规实验,在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
序列表
<110> 广州医科大学附属第二医院
<120> 用于HLA-B1502和HLA-A2402基因型检测的试剂盒
<130> PF2122
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggagtattgg gacgaggaga cag 23
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagacggagt attgggacga ggagacag 28
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctcgtcccaa tactccgtct c 21
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gagcgcgatc cgcaggtt 18
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caggtgagcg cgatcccagg tt 22
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gatcgcgctc acctg 15
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gacagggaaa gtgaagg 17
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcgagtccga ggatggc 17
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gatgggcgag tccgagatgg c 21
<210> 10
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cggactcgcc catc 14
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtaagtctgt gtgttggtct tgg 23
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcttggtaag tctgtgtgtt ggtcttgg 28
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caacacacag acttaccaag a 21
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
agatctgtgt gttccggtcc caa 23
Claims (1)
1.用于HLA-B*15:02和HLA-A*24:02基因型检测的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒是多重PCR扩增试剂盒,其包括针对HLA-B*15:02和HLA-A*24:02每个基因型的上游引物、上游封闭引物以及下游引物、下游封闭引物,
其中每个上游引物一端包括至少3个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补,每个上游封闭引物一端包括与所述至少3个连续人工设计的碱基互补的碱基,每个上游引物和每个上游封闭引物连续互补碱基的数目比每个上游引物和待扩增靶序列连续互补碱基的数目至少少2个碱基;和
每个下游引物一端包括至少3个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补,每个下游封闭引物一端包括与所述至少3个连续人工设计的碱基互补的碱基,每个下游引物和每个下游封闭引物连续互补碱基的数目比每个下游引物和待扩增靶序列连续互补碱基的数目至少少2个碱基;
针对HLA-A*24:02基因型的上游引物是SEQ ID NO:2:GAGAC-GGAGTATTGGGACGAG-GAGACAG,上游封闭引物是SEQ ID NO:3:CTCGTCCCAATACTCC-GTCTC,下游引物是SEQ ID NO:5:CAGGT-GAGCGCGATC-CCAGGTT,下游封闭引物是SEQ ID NO:6:GATCGCGCTC-ACCTG;和
针对HLA-B*15:0基因型的上游引物是SEQ ID NO:9:GATGG-GCGAGTCCG-AGATGGC,上游封闭引物是SEQ ID NO:10:CGGACTCGC-CCATC,下游引物是SEQ ID NO:12:TCTTG-GTAAGTCTGTGTGTTG-GTCTTGG,下游封闭引物SEQ ID NO:13:CAACACACAGACTTAC-CAAGA;
针对HLA-A*24:02基因型的探针序列是SEQ ID NO:7:GACAGGGAAAGTGAAGG-BHQ1,和针对HLA-B*15:0基因型的探针序列是SEQ ID NO:14: AGATCTGTGTGTTCCGGTCCCAA-BHQ1,上述二个探针5’端标记不同的荧光。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110554377.1A CN113278687B (zh) | 2021-05-20 | 2021-05-20 | 用于hla-b1502和hla-a2402基因型检测的试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110554377.1A CN113278687B (zh) | 2021-05-20 | 2021-05-20 | 用于hla-b1502和hla-a2402基因型检测的试剂盒 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113278687A CN113278687A (zh) | 2021-08-20 |
CN113278687B true CN113278687B (zh) | 2023-11-24 |
Family
ID=77280388
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110554377.1A Active CN113278687B (zh) | 2021-05-20 | 2021-05-20 | 用于hla-b1502和hla-a2402基因型检测的试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113278687B (zh) |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101921842A (zh) * | 2010-06-30 | 2010-12-22 | 深圳华大基因科技有限公司 | Hla-a,b基因分型用pcr引物及其使用方法 |
WO2012083240A2 (en) * | 2010-12-16 | 2012-06-21 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Oligonucleotide array for tissue typing |
CN106399503A (zh) * | 2016-09-20 | 2017-02-15 | 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 | 用于检测AEDs引起的SJS/TEN的引物、试剂盒及方法 |
CN109097463A (zh) * | 2018-09-15 | 2018-12-28 | 西北大学 | 一种用于检测hla-a*24:02等位基因的特异性引物探针组合、试剂盒及检测方法 |
CN110853708A (zh) * | 2019-11-13 | 2020-02-28 | 上海仁东医学检验所有限公司 | 用于hla分型的核酸捕获探针的设计方法 |
CN111235266A (zh) * | 2020-03-10 | 2020-06-05 | 广州医科大学附属第二医院 | Hla亚型检测试剂盒及其应用 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9523121B2 (en) * | 2013-01-13 | 2016-12-20 | Uni Taq Bio | Methods and compositions for PCR using blocked and universal primers |
JP6308724B2 (ja) * | 2013-05-09 | 2018-04-11 | ジェノダイブファーマ株式会社 | Hla遺伝子のマルチプレックスdnaタイピング方法及びキット |
-
2021
- 2021-05-20 CN CN202110554377.1A patent/CN113278687B/zh active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101921842A (zh) * | 2010-06-30 | 2010-12-22 | 深圳华大基因科技有限公司 | Hla-a,b基因分型用pcr引物及其使用方法 |
WO2012083240A2 (en) * | 2010-12-16 | 2012-06-21 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Oligonucleotide array for tissue typing |
CN106399503A (zh) * | 2016-09-20 | 2017-02-15 | 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 | 用于检测AEDs引起的SJS/TEN的引物、试剂盒及方法 |
CN109097463A (zh) * | 2018-09-15 | 2018-12-28 | 西北大学 | 一种用于检测hla-a*24:02等位基因的特异性引物探针组合、试剂盒及检测方法 |
CN110853708A (zh) * | 2019-11-13 | 2020-02-28 | 上海仁东医学检验所有限公司 | 用于hla分型的核酸捕获探针的设计方法 |
CN111235266A (zh) * | 2020-03-10 | 2020-06-05 | 广州医科大学附属第二医院 | Hla亚型检测试剂盒及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Blocking primers reduce co-amplification of plant DNA when studying bacterial endophyte communities;Brett E. Arenz等;《Journal of Microbiological Methods》;第117卷;全文 * |
HLA-B*5801等位基因检测方法的建立以及与别嘌呤醇诱发重症药疹的相关性研究;张心菊等;《第一次全国中西医结合检验医学学术会议暨中国中西医结合学会检验医学专业委员会成立大会》;225-226 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113278687A (zh) | 2021-08-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Fan et al. | HLA association with drug-induced adverse reactions | |
Bandera et al. | The NLRP3 inflammasome is upregulated in HIV-infected antiretroviral therapy-treated individuals with defective immune recovery | |
WO2009151628A2 (en) | Monitoring tcr-b to determine hiv therapy and disease progression | |
Profaizer et al. | HLA alleles and drug hypersensitivity reactions | |
US9758828B2 (en) | Methods to detect, treat and prevent acute cellular rejection in kidney allografts | |
Stocchi et al. | The pharmacogenomic HLA biomarker associated to adverse abacavir reactions: comparative analysis of different genotyping methods | |
CN108866207B (zh) | 新型hiv-1耐药检测方法的建立及其应用 | |
Ghoshal et al. | Intestinal microsporidiosis in renal transplant recipients: Prevalence, predictors of occurrence and genetic characterization | |
US20210254165A1 (en) | Method for determining in vitro or ex vivo the immune status of an individual | |
CN106282328A (zh) | 一种人类白细胞抗原基因检测试剂盒及用途 | |
Santoro et al. | A pilot study of lncRNAs expression profile in serum of progressive multiple sclerosis patients. | |
CN106834434B (zh) | 用于检测COX-1、COX-2和GPIIIa基因多态性的核酸、试剂盒及方法 | |
Gupta et al. | Diminished humoral responses against and reduced gene expression levels of human endogenous retrovirus-K (HERV-K) in psoriasis | |
CN113278687B (zh) | 用于hla-b1502和hla-a2402基因型检测的试剂盒 | |
CN109554467A (zh) | 一种基于FBN1基因c.3617G>A位点的马凡综合征筛查试剂盒 | |
JPWO2013129542A1 (ja) | Hla−a*31:01アレルの検出方法 | |
Smith et al. | Pleocytosis is associated with disruption of HIV compartmentalization between blood and cerebral spinal fluid viral populations | |
CN111235266B (zh) | Hla亚型检测试剂盒及其应用 | |
CN110100001B (zh) | 评估磺胺甲基异噁唑及/或甲氧苄氨嘧啶引发药物过敏反应风险的方法 | |
Roelandse-Koop et al. | Rapid HLA-B27 screening with real-time TaqMan PCR: a clinical validation in the Dutch population | |
WO2015140793A1 (en) | Markers for diagnosing multiple sclerosis and predicting responsiveness to interferon treatment | |
Tani et al. | Polymorphism analysis of the upstream region of the human N-methyl-D-aspartate receptor subunit NR1 gene (GRIN1): implications for schizophrenia | |
Selvaraj et al. | HLA-DQB1 and-DPB1 allele profile in HIV infected patients with and without pulmonary tuberculosis of south India | |
CN101135666B (zh) | 基于线粒体dna c3970t单核苷酸多态性检测高原肺水肿易感性的试剂盒 | |
WO2012006534A4 (en) | Methods, compositions and kits for diagnosing and treating alzheimer's disease using mitochondrial co3 gene mutations |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |